CN111929274A - 一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，涉及氨基酸发酵分析技术领域。该基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，包括以下步骤：S1、制备氨基酸发酵主要指标标准混合溶液，进行梯度稀释；S2、采集近红外光全光谱图，测定标准混合溶液中主要指标吸光度；S3、吸光度结合主要指标含量回执多元回归方程；S4、通过生成代表性批次发酵过程指标制定时间节点个指标参数；S5、通过生产取样进近红外光谱分析，通过与制定的额指标参数偏差进行相应原料流加调整。本发明简单有效，可提高生成效率。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸发酵分析技术领域，具体为一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法。
背景技术
在氨基酸的发酵中，氨基酸是主要的代谢产物，其含量是判断发酵水平的重要指标；氨基酸的发酵主要是通过发酵菌种将糖转化为目的氨基酸，发酵菌种的生长情况直接影响着目的氨基酸的产量，发酵过程中通常通过发酵菌种的OD值来了解发酵菌种在发酵液中的密度分布情况，并以此判断发酵菌种的生长阶段，以调整供氧和营养，所以发酵菌种的OD值是衡量发酵菌种生长状况的重要指标；还原糖、溶磷、氨基氮在发酵液中一般作为发酵菌种的碳源和氮源等必须的营养元素的充足情况，以保证生产的稳定，并达到高产目的氨基酸。在目的氨基酸发酵过程中，总有一些其它氨基酸的含量的变化，有些氨基酸对发酵有促进作用，有的氨基酸则对发酵起到抑制作用，通过检测对比不同氨基酸的含量以及对应目的氨基酸的产量，来判断哪些氨基酸积累是对发酵有利的，哪些氨基酸是抑制的，来指导通过分子改造手段来改变菌种的代谢通路，并达到高产目的氨基酸的目的。
目前，现有技术中对发酵液中各个氨基酸、还原糖、溶磷、氨基氮及OD值的检测方案如下：
1、OD值测定主要通过样品的光密度反映菌体的密度情况，而对于发酵菌种的OD值测定，通常将发酵液按照一定的倍数稀释，并测定稀释后样品中发酵菌种的OD值，而不同的稀释倍数下测定的发酵菌种中OD值在换算为发酵原液中的发酵菌种的OD值后也有所不同。
2、还原糖的含量的测定采用的是费林氏滴定法，原理是在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，糖本身被氧化为糖酸及其他产物，然而，费林法测定还原糖含量，耗时长，同时由于要在沸腾的条件进行，操作过程危险性大。
3、氨基氮的检测，采用的是凯氏定氮法或简易定氮装置法，所需试剂种类多，操作时间长，产生的废液量大，耗时长，且需加入浓碱，并在沸腾状态下蒸煮，危险性大。
4、溶磷的检测，一般采用磷钼酸比色法，所需试剂种类多，操作时间长，试剂有毒性，产生的废液量大，并在沸腾状态下蒸煮，危险性大。
5、各氨基酸的测定方法不一样，例赖氨酸含量的检测，采用的是茚三酮比色法，即通过将样品稀释、定容、蒸煮、再定容、冷却、测吸光度等步骤进行测定，每次测定均需制作标准曲线，操作繁琐、耗时长、所用试剂杂多且配制过程繁琐。
由上述可知，现有技术均采用单独分析，存在操作繁琐、耗时长，所需试剂较多，危险性大等缺点。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，解决了现有技术中存在的缺陷与不足。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、制备氨基酸发酵液主要组分氨基酸、发酵菌种、还原糖、溶磷和氨基氮的初始标准样品混合溶液，初始标准混合溶液按10倍浓度梯度进行9次稀释，依次标记为P1、P2、P3...P10；
S2、对SI配置的浓度梯度样品混合溶液进行近红外光谱分析，采集近红外光全光谱图，得到相应样品中氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度，设定氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度分别为A、B、C、D、E，则P1、P2、P3...P10对应的氨基酸的含量分别为A1、A2、A3...A10，对应的发酵菌种的OD值分别为B1、B2、B3...B10，对应的还原糖含量分别为C1、C2、C3...C10，对应的溶磷含量分别为D1、D2、D3...D10，对应的氨基氮的含量分别为E1、E2、E3...E10；
S3、根据获得的吸光度值和对应的氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，分别绘制氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量的多元线性回归方程；
S4、选取生产实际最优一批氨基酸产率的发酵控制，根据发酵周期，每一小时取样一次，采用近红外光谱分析检测法和多元线性回归方程测得氨基酸发酵过程中氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，作为各发酵时间节点的指标标准。
S5、氨基酸发酵过程中成分含量检测，利用近红外光谱图与多元线性回归方程，计算得到氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量，分析发酵过程中各时间节点的指标与步骤S4制定的植保标准偏差，通过相应原料流加，使发酵过程指标向步骤S4制定的指标标准靠近。
2.步骤S1中初始标准样品混合溶液中氨基酸含量为40g/L,发酵菌种浓度为1亿CFU/mL,还原糖150g/L、磷酸镁10g/L。
3.步骤S2中所述的氨基酸为亮氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸中的一种，发酵菌种为相应氨基酸常规发酵菌种，还原糖为葡萄糖。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法。具备以下有益效果：
1、本发明，通过标准混合溶液的配置，通过吸光度和各梯度浓度的标准溶液中氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量建立的回归方程，一起算出各物质的含量，减少检测的独立性，以解决发酵过程营养物质的流加控制及营养物质的即时补充。
2、本发明，可以检测发酵液中各个氨基酸的含量变化，以及各个氨基酸对发酵的影响，便于调整配方，便于菌种的代谢通路的分子水平的改造。
3、本发明，能够快速检测发酵液指标，检测时间快，安全性高，减少了繁琐的过程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，该方法包括以下步骤：
1、制备赖氨酸发酵液初始标准混合溶液，赖氨酸含量为40g/L,嗜热芽孢杆菌菌种浓度为1亿CFU/mL,葡萄糖150g/L、磷酸镁10g/L，初始标准混合溶液按10倍浓度梯度进行9次稀释，依次标记为P1、P2、P3...P10；
2、对步骤I配置的浓度梯度样品混合溶液进行近红外光谱分析，采集近红外光全光谱图，得到相应样品中赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度，设定赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度分别为A、B、C、D、E，则P1、P2、P3...P10对应的赖氨酸的含量分别为A1、A2、A3...A10，对应的发酵菌种的OD值分别为B1、B2、B3...B10，对应的还原糖含量分别为C1、C2、C3...C10，对应的溶磷含量分别为D1、D2、D3...D10，对应的氨基氮的含量分别为E1、E2、E3...E10；
3、根据获得的吸光度值和对应的赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，分别绘制赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量的多元线性回归方程；
4、选取生产实际最优一批赖氨酸产率的发酵控制，根据发酵周期，每一小时取样一次，采用近红外光谱分析检测法和多元线性回归方程测得赖氨酸发酵过程中赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，作为各发酵时间节点的指标标准。
5、赖氨酸发酵过程中成分含量检测，利用近红外光谱图与多元线性回归方程，计算得到赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量，分析发酵过程中各时间节点的指标与步骤S4制定的植保标准偏差，通过相应原料流加，使发酵过程指标向步骤4制定的指标标准靠近。
实施例2
1、制备亮氨酸发酵液初始标准混合溶液，亮氨酸含量为40g/L,黄色短杆菌菌种浓度为1亿CFU/mL,葡萄糖150g/L、磷酸镁10g/L，初始标准混合溶液按10倍浓度梯度进行9次稀释，依次标记为P1、P2、P3...P10；
2、对步骤I配置的浓度梯度样品混合溶液进行近红外光谱分析，采集近红外光全光谱图，得到相应样品中亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度，设定亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度分别为A、B、C、D、E，则P1、P2、P3...P10对应的亮氨酸的含量分别为A1、A2、A3...A10，对应的发酵菌种的OD值分别为B1、B2、B3...B10，对应的还原糖含量分别为C1、C2、C3...C10，对应的溶磷含量分别为D1、D2、D3...D10，对应的氨基氮的含量分别为E1、E2、E3...E10；
3、根据获得的吸光度值和对应的亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，分别绘制亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量的多元线性回归方程；
4、选取生产实际最优一批氨基酸产率的发酵控制，根据发酵周期，每一小时取样一次，采用近红外光谱分析检测法和多元线性回归方程测得亮氨酸发酵过程中亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，作为各发酵时间节点的指标标准；
5、亮氨酸发酵过程中成分含量检测，利用近红外光谱图与多元线性回归方程，计算得到亮氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量，分析发酵过程中各时间节点的指标与步骤S4制定的植保标准偏差，通过相应原料流加，使发酵过程指标向步骤4制定的指标标准靠近。
实施例3
1、制备聚赖氨酸发酵液初始标准混合溶液，聚赖氨酸含量为40g/L,白色链霉菌菌种浓度为1亿CFU/mL,葡萄糖150g/L、磷酸镁10g/L，初始标准混合溶液按10倍浓度梯度进行9次稀释，依次标记为P1、P2、P3...P10；
2、对SI配置的浓度梯度样品混合溶液进行近红外光谱分析，采集近红外光全光谱图，得到相应样品中聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度，设定聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度分别为A、B、C、D、E，则P1、P2、P3...P10对应的聚赖氨酸的含量分别为A1、A2、A3...A10，对应的发酵菌种的OD值分别为B1、B2、B3...B10，对应的还原糖含量分别为C1、C2、C3...C10，对应的溶磷含量分别为D1、D2、D3...D10，对应的氨基氮的含量分别为E1、E2、E3...E10；
3、根据获得的吸光度值和对应的聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，分别绘制聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量的多元线性回归方程；
4、选取生产实际最优一批聚赖氨酸产率的发酵控制，根据发酵周期，每一小时取样一次，采用近红外光谱分析检测法和多元线性回归方程测得聚赖氨酸发酵过程中聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，作为各发酵时间节点的指标标准。
5、聚赖氨酸发酵过程中成分含量检测，利用近红外光谱图与多元线性回归方程，计算得到聚赖氨酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量，分析发酵过程中各时间节点的指标与步骤S4制定的植保标准偏差，通过相应原料流加，使发酵过程指标向步骤4制定的指标标准靠近。
本发明中，近红外光主要是对物质中的含氢基团X-H(X＝C、N、O)振动的倍频和合频吸收，其中包含了大多数类型的有机化合物的组成和分子结构信息，由于不同的有机物含有不同的基团，不同的基团有不同的能级，不同的基团和同一基团在不同物理化学环境中对近红外光的吸收波长都有明显差别，因此近红外光谱可作为获取信息的一种有效的载体，近红外光照射时，频率相同的光线和基团将发生共振现象，光的能量通过分子偶极矩的变化传递给分子；而近红外光的频率和样品的振动频率不相同，该频率的红外光就不会被吸收，因此，选用连续改变频率的近红外光的选择性吸收，通过样品后的近红外光线在某些波长范围内会变弱，透射出来的红外光线就会携带所测物质的组分和结构的信息，所测物质在不同频率的近红外光处的一系列吸光度值，当选取含量变化的大量的某样品作为标准样品结合，便可得到出该物质的含量和其近红外吸光度值得多元线性回归方程，然后再通过测定待测物质的近红外光谱信息以及根据所拟合的多元线性回归方程，便可计算得出待测物质的含量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
S1、制备氨基酸发酵液主要组分氨基酸、发酵菌种、还原糖、溶磷和氨基氮的初始标准样品混合溶液，初始标准混合溶液按10倍浓度梯度进行9次稀释，依次标记为P1、P2、P3...P10；
S2、对SI配置的浓度梯度样品混合溶液进行近红外光谱分析，采集近红外光全光谱图，得到相应样品中氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度，设定氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量对应的吸光度分别为A、B、C、D、E，则P1、P2、P3...P10对应的氨基酸的含量分别为A1、A2、A3...A10，对应的发酵菌种的OD值分别为B1、B2、B3...B10，对应的还原糖含量分别为C1、C2、C3...C10，对应的溶磷含量分别为D1、D2、D3...D10，对应的氨基氮的含量分别为E1、E2、E3...E10；
S3、根据获得的吸光度值和对应的氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，分别绘制氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量的多元线性回归方程；
S4、选取生产实际最优一批氨基酸产率的发酵控制，根据发酵周期，每一小时取样一次，采用近红外光谱分析检测法和多元线性回归方程测得氨基酸发酵过程中氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮含量，作为各发酵时间节点的指标标准。
S5、氨基酸发酵过程中成分含量检测，利用近红外光谱图与多元线性回归方程，计算得到氨基酸的含量、发酵菌种的OD值、还原糖含量、溶磷含量和氨基氮的含量，分析发酵过程中各时间节点的指标与步骤S4制定的植保标准偏差，通过相应原料流加，使发酵过程指标向步骤S4制定的指标标准靠近。
2.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，其特征在于：所述步骤S1中初始标准样品混合溶液中氨基酸含量为40g/L,发酵菌种浓度为1亿CFU/mL,还原糖150g/L、磷酸镁10g/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析检测氨基酸发酵过程指标的方法，其特征在于：所述步骤S2中所述的氨基酸为亮氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸中的一种，发酵菌种为相应氨基酸常规发酵菌种，还原糖为葡萄糖。
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