CN101701911A - 一种检测发酵物料中还原糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测发酵物料中还原糖含量的方法，包括以下步骤：a)利用近红外分析仪检测待测样品，获得所述待测样品的近红外光谱图；b)所述近红外分析仪根据预先建立的定标模型分析所述近红外光谱图，得到所述待测样品中还原糖的含量。本发明采用近红外分析技术，结合化学计量学和计算机软件技术，通过建立定标模型对发酵物料中还原糖的含量进行检测，无需对分析样品进行预处理，分析过程中不消耗其他材料，也不破坏样品，减少了物料消耗。采用本发明提供的检测方法，能够在2-3分钟之内完成用传统化学分析方法需要一个小时以上的样品分析任务，提高了检测效率。

Description

一种检测发酵物料中还原糖含量的方法

技术领域

本发明涉及一种糖含量的检测方法，尤其涉及一种发酵物料中还原糖含量的检测方法。

背景技术

由于具有反应条件温和、生产原料来源广泛、代谢产物单一等诸多优点，发酵工艺广泛应用于食品酿造、化工、制药等行业，且随着生物技术、基因工程的发展，发酵工艺发挥着越来越重要的作用。

发酵工艺是通过控制发酵物料中的一系列工序实现的，既包括液化、糖化、发酵工序，在淀粉完全转换成还原糖之后，利用酵母的生化能力，将还原糖进一步转化成酒精。因此，发酵物料中还原糖的含量是发酵过程控制的关键指标。在发酵前期，为使生产成本最小，发酵物料中投入酵母数量要与还原糖的含量保持在合理范围之内；随着发酵过程的深入进行，发酵物料中还原糖的逐渐消耗，酒精含量逐渐增加；而在发酵后期，物料中还原糖降低到最低水平，达到最高的转化水平。因此，对发酵物料中还原糖含量进行检测的频率较高。

常规测定发酵物料中还原糖含量的方法是斐林(Fehling)试剂法，即利用还原糖的还原性，通过氧化还原反应，采用斐林(Fehling)试剂滴定，从而计算出还原糖的含量。但是，斐林(Fehling)试剂法存在滴定终点不易判断、其他还原物质干扰等问题，会影响分析结果的准确性。同时，采用斐林(Fehling)试剂法步骤多、过程繁琐、耗时长，影响检测效率，尤其对于检测频率较高还原糖含量的检测来说，大大增加了工作量。此外，斐林(Fehling)试剂法需要较多的试剂、设备以及实验室配套设施，增加了物料、能源消耗。因此，如何在物料消耗较小的情况下，快速、准确地对发酵物料中还原糖的含量进行检测成为急需解决的问题。

近红外光的波长范围约为780nm-2500nm，是介于可见光区与中红外光区之间的电磁波，能够与有机分子的含氢基团中的X-H键作用形成有机分子的倍频和合频吸收光谱。根据这些近红外吸收频谱出现的位置、吸收强度等信息特征，通过与化学计量学算法和软件技术相结合，能够对物质进行定性和定量分析。随着计算机技术的发展、化学计量学研究的深入及近红外光谱仪器制造技术的日益完善，近红外光谱分析技术得到了广泛的应用。因此，可以考虑使用近红外分析技术对发酵物料中的还原糖含量进行检测。

发明内容

有鉴于此，本发明解决的技术问题在于提供了一种检测发酵物料中还原糖含量的方法，通过该方法，在物料消耗较小的状态下提高检测效率。

本发明提供了一种检测发酵物料中还原糖含量的方法，包括以下步骤：

a)利用近红外分析仪检测待测样品，获得所述待测样品的近红外光谱图；

b)所述近红外分析仪根据预先建立的定标模型分析所述近红外光谱图，得到所述待测样品中的还原糖含量。

优选的，所述定标模型的建立过程包括以下步骤：

采集发酵物料样品；

用常规化学方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得化学值；

采集所述发酵物料样品的近红外光谱图；

对所述近红外光谱图进行预处理，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

根据所述化学值和所述近红外预测值，建立发酵物料中还原糖含量的定标模型。

优选的，采用附加散射校正与导数法对所述近红外光谱图进行预处理。

优选的，采用偏最小二乘法根据所述化学值和所述近红外预测值建立所述定标模型。

优选的，所述定标模型的建立过程还包括对所述定标模型进行优化的步骤，具体为：

采用偏最小二乘法选择最佳定标因素；

根据所述最佳定标因素，进行内部交叉检验，使所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值的相关系数R²最大且交叉验证标准偏差RMSECV最小。

优选的，所述内部交叉检验具体为：

a)在M个样品光谱中，取出第一个样品光谱，用M-1个样品光谱根据所述最佳定标因素建立基本校正模型，再将取出的样品光谱用于检验，并计算取出的样品中的还原糖含量的化学值与近红外预测值之差；

b)将第一个样品光谱放回，取出另一个样品光谱，重复步骤a)，直至每个样品光谱都被检验分析；

c)根据步骤b)的分析结果计算样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值之间的相关系数R²和交叉验证标准偏差RMSECV，R²和RMSECV的计算公式为：

$R^2=\{1-\frac{{\mathrm{\Σ}\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2}\}*100$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{M}}$

其中，Differ_i表示第i个样品中还原糖含量的化学值和近红外预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品中还原糖含量的化学值，y_m是m个样品中还原糖含量的近红外预测值的平均值；

优选的，所述定标模型的建立过程还包括对所述定标模型进行外部检验的步骤，具体为：

采集发酵物料样品；

根据所述定标模型，采用近红外分析方法检测所述发酵物料样品，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

采用常规化学分析方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得相应的化学值；

根据所述近红外预测值和所述化学值计算统计学F值和t值。

优选的，所述常规化学方法为斐林试剂法。

优选的，所述发酵物料样品的数量不少于75个。

优选的，所述发酵物料样品中还原糖的含量分布范围为0.20g/100mL-9.00g/100mL。

与现有技术相比，本发明采用近红外分析技术，结合化学计量学和计算机软件技术，通过建立定标模型对发酵物料中还原糖的含量进行检测，无需对分析样品进行预处理，分析过程中不消耗其他材料，也不破坏样品，减少了物料消耗。采用本发明提供的检测方法，能够在2-3分钟之内完成用传统化学分析方法需要一个小时以上的样品分析任务，提高了检测效率，大大减少了检测频率较高的指标的工作量。此外，本发明提供的方法不受其他因素影响，对批量样品进行检测时，结果准确，重现性好。实验表明，将发酵物料中还原糖含量的近红外检测结果与使用传统方法的检测结果相比较，统计学F值和t值均小于临界值，说明近红外检测结果与使用传统方法的检测结果无显著差异，但能够将检测时间从一小时缩短至2-3分钟，提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明提供的检测发酵物料中还原糖含量方法中建立定标模型的流程图；

图2为本发明提供的发酵物料中还原糖含量的近红外分析预测值与化学值之间的相关图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测发酵物料中还原糖含量的方法，包括以下步骤：

a)利用近红外分析仪检测待测样品，获得所述待测样品的近红外光谱图；

b)所述近红外分析仪根据预先建立的定标模型分析所述近红外光谱图，得到所述待测样品中的还原糖含量。

按照本发明，所述待测样品中还原糖的含量范围优选为0.10g/100mL-10.00g/100mL，更优选为0.15g/100mL-9.50g/100mL，最优选为0.20g/100mL-9.00g/100mL。为了使检测结果更准确，优选将所述待测样品放入敞口式样品盒中，冷却到室温后，按照本领域技术人员熟知的方法搅拌均匀。利用近红外分析仪检测所述待测样品，获得所述待测样品的近红外光谱图，然后用预先建立的定标模型对所述近红外光谱图进行分析，获得所述待测样品中还原糖的含量。本发明优选采用固定光栅近红外分析仪，优选采用漫反射方式采集所述样品的近红外光谱图。采集近红外光谱图的光谱扫描范围优选为10000cm^-1-4000cm^-1，更优选为9500cm^-1-3500cm^-1，最优选为9000cm^-1-3000cm^-1；分辨率优选为8cm^-1或更高。

按照本发明，所述定标模型的建立过程优选包括以下步骤：

采集发酵物料样品；

用常规化学方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得化学值；

采集所述发酵物料样品的近红外光谱图；

对所述近红外光谱图进行预处理，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

根据所述化学值和所述近红外预测值，建立发酵物料中还原糖含量的定标模型。

请参考图1，为本发明提供的检测发酵物料中还原糖含量方法中建立定标模型的流程图。

按照本发明，首先选择时间和空间分布多样化、各组分含量分布均匀、跨度大的具有代表性的发酵物料作为建立定标模型的样品。所述样品的数量优选为75个以上，更优选为80个以上，最优选为90个以上。所述样品中还原糖的含量分布范围优选为0.10g/100mL-10.00g/100mL，更优选为0.15g/100mL-9.50g/100mL，最优选为0.20g/100mL-9.00g/100mL。所述发酵物料样品中还可以包括挥发酸、类脂物等其他组分，本发明没有特殊限制，所述样品中其他组分浓度分布均匀。

由于样品处于较为黏稠的悬浮液状态，为使分析结果更准确，本发明优选将所述样品放入敞口式样品盒中，冷却到室温后，按照本领域技术人员熟知的方法搅拌均匀。

按照本发明，需要对所述样品中还原糖的含量分别进行常规化学方法分析和近红外分析，以获得所述样品中还原糖含量的化学值和近红外预测值。本发明对进行常规化学方法分析和近红外分析的顺序没有限制，可以先进行常规化学方法分析，也可以先进行近红外分析，还可以同时进行，本发明优选同时进行。

所述常规化学方法包括本领域技术人员熟知的斐林(Fehling)试剂法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法或3，5-二硝基水杨酸法，本发明优选为斐林(Fehling)试剂法。采用斐林试剂法测量样品中的还原糖含量时，优选先将样品进行预处理，预处理方法优选为：先将样品冷却到室温，搅拌均匀，然后倒入离心管中离心分离，吸取上层清液作为分析样品，然后以次甲基蓝为指示液，以所述上层清液滴定煮沸的、由斐林(Fehling)溶液和还原糖组成的混合溶液，根据样品消耗量求得样品中还原糖的含量，将所得的化学值作为建立定标模型的参考值。

按照本发明，进行常规化学方法分析的同时，对搅拌均匀的样品进行近红外分析。首先获得所述样品的近红外光谱图，可以使用本领域技术人员熟知的固定波长滤光片近红外分析仪、光栅色散近红外分析仪、傅立叶近红外分析仪、声光可调滤光器近红外分析仪或阵列检测近红外分析仪，利用本领域技术人员熟知的漫反射、透射或光纤测量的方式采集所述近红外光谱图，本发明优选采用固定光栅近红外分析仪，优选采用漫反射方式采集所述样品的近红外光谱图。采集近红外光谱图的光谱扫描范围优选为10000cm^-1-4000cm^-1，更优选为9500cm^-1-3500cm^-1，最优选为9000cm^-1-3000cm^-1；分辨率优选为8cm^-1或更高。

为了消除各种干扰因素，本发明使用本领域技术人员所熟知的化学计量软件对所述近红外光谱图进行预处理。进行预处理的方法可以为一阶导数法、二阶导数法、多元散射校正法、矢量归一化法、消除常数偏移法、减去一条直线法、附加散射校正法、一阶导数加直线差减法、附加散射校正加导数法、一阶导数加乘法散射校正法等。本发明优选使用附加散射校正加导数法对所述近红外光谱图进行预处理，获得样品中还原糖含量的近红外预测值。

按照本发明，获得所述近红外预测值之后，输入样品对应的化学值，结合光谱图采用本领域技术人员熟知的偏最小二乘法建立发酵物料中还原糖含量的近红外光谱与化学值之间的定标模型。所述定标模型为具有定量功能的检测模型。将所述定标模型装入近红外分析仪，即可实现对发酵物料样品中还原糖含量的检测。

为了使所述定标模型更精确，本发明优选对所述定标模型进行优化，具体包括以下步骤：

采用偏最小二乘法选择最佳定标因素；

根据所述最佳定标因素，进行内部交叉检验，使所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值的相关系数最大且交叉验证标准偏差最小。

按照本发明，利用本领域技术人员熟知的化学软件根据偏最小二乘法选择最佳定标因素，所述最佳定标因素为评价所述定标模型性能的最佳指标，包括最佳主成分数、最佳谱区等。获得最佳定标因素后，在所述最佳定标因素作为参数的情况下，对所述定标模型进行内部交叉验证，所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值的相关系数R²最大且交叉验证标准偏差RMSECV最小的定标模型为最优定标模型。

按照本发明，所述内部交叉检验的具体为：

a)在M个样品光谱中，取出第一个样品光谱，用M-1个样品光谱根据所述最佳定标因素建立基本校正模型，再将取出的样品光谱用于检验，并计算取出的样品中的还原糖含量的化学值与近红外预测值之差；

b)将第一个样品光谱放回，取出另一个样品光谱，重复步骤a)，直至每个样品光谱都被检验分析；

c)根据步骤b)的分析结果计算样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值之间的相关系数R²和交叉验证标准偏差RMSECV，R²和RMSECV的计算公式为：

$R^2=\{1-\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2}\}*100$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{M}}$

其中，Differ_i表示第i个样品中还原糖含量的化学值和近红外预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品中还原糖含量的化学值，y_m是m个样品中还原糖含量的近红外预测值的平均值。

经过内部交叉检验后，确定R²最大、RMSECV最小为最优的定标模型，将所述模型预装入近红外分析仪，即可实现对发酵物料中还原糖含量进行快速、环保、准确地分析。

为了确定经过优化的定标模型能够对发酵物料中还原糖的含量进行定量分析，本发明优选包括对所述定标模型进行外部检验，具体包括以下步骤：

采集发酵物料样品；

根据所述定标模型，采用近红外分析方法检测所述发酵物料样品，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

采用常规化学分析方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得相应的化学值；

根据所述近红外预测值和所述化学值计算统计学F值和t值。

按照本发明，进行外部验证所使用的样品数量优选为20个以上，更优选为30个以上，最优选为40个以上。所述样品中还原糖的含量分布范围优选为0.10g/100mL-10.00g/100mL，更优选为0.15g/100mL-9.50g/100mL，最优选为0.20g/100mL-9.00g/100mL。

按照本发明，为使外部检验结果准确，在进行外部验证过程中，使用与建立定标模型过程中相同的常规化学分析方法获得所述样品的化学值。

本发明优选采用应用统计学的F检验和t检验对近红外检测结果和常规化学检测结果进行分析，考察定标模型能否进行定量检测。如果F值和t值均小于临界值，说明所述近红外预测值和所述化学值没有显著性差异，所述定标模型可以实现定量检测，可以取代传统化学分析方法。

由上述实施例可以看出，本发明采用近红外分析技术，结合化学计量学和计算机软件技术，通过建立定标模型对发酵物料中还原糖的含量进行检测，无需对分析样品进行预处理，分析过程中不消耗其他材料，也不破坏样品，减少了物料消耗。采用本发明提供的检测方法，能够在2-3分钟之内完成用传统化学分析方法需要一个小时以上的样品分析任务，提高了检测效率，大大减少了检测频率较高的指标的工作量。此外，本发明提供的方法不受其他因素影响，对批量样品进行检测时，结果准确，重现性好。

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明提供的发酵物料中还原糖含量的检测方法进行描述。

实施例1

收集80个发酵物料样品作为标准样品，还原糖含量分布范围在0.20-9.00g/100mL之间，将所述80个样品冷却至室温搅拌均匀，倒入离心管中离心分离，吸取离心后上层清液作为常规分析样品。用斐林(Fehling)试剂法测定所述常规分析样品的还原糖含量，得到化学值。

采用配备有大面积漫反射检测面积的固定光栅近红外光谱仪采集所述常规分析样品的光谱数据，扫描范围：10000cm^-1-4000cm^-1，分辨率8cm^-1。每个样品平行测定3次，取平均值，获得常规分析样品的近红外光谱。使用Grams32软件，采用附加散射校正与导数法对光谱图进行预处理以避免导数处理提高噪声值。

使用Grams32软件，依据所述校正集样品中还原糖含量的化学值与相应的近红外预测值，结合光谱图，用偏最小二乘法建立定标模型，并根据偏最小二乘法确定的最佳定标因素、利用内部交叉检验对所述定标模型进行优化，得到发酵物料中还原糖含量的近红外预测值与化学值的交叉检验图，见图2。其中，决定系数R²＝0.9771，交叉验证标准偏差RMSECV＝0.441。

另取30个发酵物料样品作为验证样品，用上述固定光栅近红外光谱仪采集所述验证样品的红外光谱图，然后根据所述定标模型分析得到所述验证样品的含糖量(近红外检测值)，结果列于表1。再将所述验证样品按照与标准样品同样的预处理方法离心分离得到上层清液后，用斐林试剂法测定还原糖含量(化学值)，列于表1。统计学检测临界F值F_0.95(30，30)＝1.89，双边临界值t_0.05，30＝2.04，而本实施例中F＝1.098，t＝0.919，均小于所述临界值。实验结果表明，近红外预测还原糖含量结果与化学方法结果无显著差异，所述模型用于发酵物料中还原糖的检测是准确可靠的。

表1还原糖近红外预测值与化学实测值结果比较

单位：g/100mL

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测发酵物料中还原糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)利用近红外分析仪检测待测样品，获得所述待测样品的近红外光谱图；

b)所述近红外分析仪根据预先建立的定标模型分析所述近红外光谱图，得到所述待测样品中还原糖的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定标模型的建立过程包括以下步骤：

采集发酵物料样品；

用常规化学方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得化学值；

采集所述发酵物料样品的近红外光谱图；

对所述近红外光谱图进行预处理，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

根据所述化学值和所述近红外预测值，建立发酵物料中还原糖含量的定标模型。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用附加散射校正与导数法对所述近红外光谱图进行预处理。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用偏最小二乘法根据所述化学值和所述近红外预测值建立所述定标模型。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定标模型的建立过程还包括对所述定标模型进行优化的步骤，具体为：

采用偏最小二乘法选择最佳定标因素；

根据所述最佳定标因素，进行内部交叉检验，使所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值的相关系数R²最大且交叉验证标准偏差RMSECV最小。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述内部交叉检验具体为：

a)在M个样品光谱中，取出第一个样品光谱，用M-1个样品光谱根据所述最佳定标因素建立基本校正模型，再将取出的样品光谱用于检验，并计算取出的样品中的还原糖含量的化学值与近红外预测值之差；

b)将第一个样品光谱放回，取出另一个样品光谱，重复步骤a)，直至每个样品光谱都被检验分析；

c)根据步骤b)的分析结果计算样品中还原糖含量的近红外预测值与化学值之间的相关系数R²和交叉验证标准偏差RMSECV，R²和RMSECV的计算公式为：

$R^2=\{1-\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{\mathrm{\Σ}{(y_i-y_m)}^2}\}*100$

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{Differ}}_i\right)}^2}{M}}$

其中，Differ_i表示第i个样品中还原糖含量的化学值和近红外预测值之差，M为样品数，y_i为第i个样品中还原糖含量的化学值，y_m是m个样品中还原糖含量的近红外预测值的平均值。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定标模型的建立过程还包括对所述定标模型进行外部检验的步骤，具体为：

采集发酵物料样品；

根据所述定标模型，采用近红外分析方法检测所述发酵物料样品，获得所述发酵物料样品中还原糖含量的近红外预测值；

采用常规化学分析方法检测所述发酵物料样品中还原糖的含量，获得相应的化学值；

根据所述近红外预测值和所述化学值计算统计学F值和t值。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述常规化学方法为斐林试剂法。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵物料样品的数量不少于75个。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵物料样品中还原糖的含量分布范围为0.20g/100mL-9.00g/100mL。

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