CN112683840A - 一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法。步骤如下：收集小麦单籽粒样本；置于近红外光谱下进行透射扫描，采集近红外漫反射光谱；采用试剂盒酶解程序测定样品总淀粉含量及直支链淀粉比值；对所得近红外光谱光学数据进行预处理，滤除无用及干扰信号；建立数学模型；构建小麦单籽粒的直链淀粉含量化学值与近红外光谱之间的预测模型并进行验证实验；采集待测样品的近红外光谱，用构建的近红外预测模型快速无损测定待测样品直链淀粉含量。本发明方法为小麦单籽粒直链淀粉的定量测定提供一种便捷、快速、无损、准确的标准化检测方法，为小麦的育种、选种及淀粉的深入研究及应用提供方法支撑。
Description
技术领域
本发明涉及谷物分析检测技术领域，具体涉及一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法。
背景技术
淀粉是植物界中存在的极为丰富的有机化合物，是人类粮食、动物饲料和工业原料的重要来源。淀粉从分子结构上可分为直链淀粉（amylose，主要是淀粉颗粒质）和支链淀粉（amylopectin，主要是淀粉皮质）两大类。原料中淀粉的直链淀粉与支链淀粉的比值直接影响其品质。因此，快速、准确地测定原料中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量，对评价原料的品质、应用方向及价值具有重要意义。目前，国内外研究直、支链淀粉含量的测定方法主要有：电位滴定法、高效粒径排阻色谱法、碘亲和毛细管电泳法、单粒度切粒浸渍法、双波长分光光度计法、拉曼光谱和多元校准分析法、正交函数分光光度法、三波长比色法等及其他方法。以上可以大致总结为方法研究以及比色法测定。其中直、支链淀粉的方法研究主要侧重在开发可以测定淀粉含量的方法，但实际操作复杂，且成本较高，对仪器耗材要求较高，不易成为常规检测方法。各种比色法原理都是利用淀粉与电络合形成显色反应，在特定波长光波下有较大吸收度，从而测定直、支链淀粉及总淀粉含量，但存在的缺陷也比较明显。首先是前处理过程不易控制，脱脂脱糖以及淀粉糊化等过程条件须严格控制，这也是数据不稳定的原因。其次，比色法只能通过总淀粉含量和质量淀粉含量计算得到支链淀粉含量，不能同时得到三个数据。因此，目前的研究热点是探寻一种便捷的、准确测定原料中直、支链淀粉的方法。一些学者在这方面做出了一些尝试，比如Atcharaporn K.等研制了一种简易便携式碾米直链淀粉含量速测仪和Sumiko N等基于粳稻精米和淀粉RVA测定的糊化特性估算直链淀粉含量和抗性淀粉含量的公式，但这些方法前处理操作复杂、模型的使用范围窄。
近红外光谱分析技术主要是反映与含有C-H、N-H、O-H、S-H等氢基团的样品的组分和性质信息，是一种现代光谱分析技术，是现代电子技术、光谱分析技术、计算机技术和化学计量技术的集合体，具有样品前处理简单、快速，可同时测定一种或多种化学成分含量的，而且其无损伤，无污染，是一种典型的绿色分析技术，十分符合现代发展要求，被美国食品化学家协会、美国谷物化学家协会推荐为标准分析方法。近红外光谱分析技术的分析范围几乎覆盖了所有化合物，还有其独特的优点，使它被应用到各个领域。目前，近红外光谱技术主要应用于小麦营养价值（常规化学成分、氨基酸及物理指标等）的快速预测、品种鉴别以及品质安全监控方面。邵春甫等科研人员用近红外光谱法对贵州当地酿酒用高粱原料进行直、支链及总淀粉含量，但其使用的淀粉检测标准方法为已被淘汰的国标方法，并且直、支链及总淀粉含量的检测方法不同，建模数据来源不准确。
与传统化学和物理分析技术相比，近红外光谱分析技术的突出优点是：①检测速度快、效率高；②适合于多种状态的分析对象；③可以实现在线分析；④结果准确、重现性好；⑤可以实现样品无损分析；⑥检测分析成本低。为保证近红外光谱法预测结果的准确性，需要获取足够多数量的样品数据。前期投入大、建模成本较高，近红外光谱技术需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型，对小批量样品的分析不切实际。同时，需要对定标模型不断的进行更新和优化。
发明内容
要解决的技术问题：本专利拟采用爱尔兰的Megazyme试剂盒酶解程序测定样品总淀粉含量及直支链淀粉比值，并计算样品直链淀粉含量，获得较为准确的小麦单籽粒直链淀粉含量。采用近红外分析测定仪对小麦单籽粒进行透射扫描，收集光谱数据。对光谱数据进行预处理，并用偏最小二乘法建立校正模型，比较所建模型的各项性能指标（相关系数、校正均方差、预测均方差、内部交叉检验均方差），从而确定最合适的基线校正方法与光谱平滑方法；用逐步多元线性回归（SMLR）、主成分回归（PCR）、偏最小二乘回归（PLS）等定量分析方法对经预处理后的光谱建立校正模型，比较所建模型的各项性能指标（相关系数、校正均方差、预测均方差、内部交叉检验均方差），选出最佳模型，同时采用外部验证法对模型的稳健性进行评价；对未知样品进行检测时，先对待测样品进行扫描，再根据扫描光谱结合建立的数学模型计算出待测样品的直、支链及总淀粉含量。本专利将为小麦单籽粒的直链淀粉的定量测定提供一种操作简单、快速、无损的标准化检测方法，为淀粉的深入研究及应用提供方法支撑，因此具有重要的研究意义。
技术方案：一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）收集小麦单籽粒样本；
（2）将未经处理的小麦单籽粒样品直接置于近红外光谱下进行透射扫描，采集每个样品近红外漫反射光谱；
（3）采用爱尔兰的Megazyme试剂盒酶解程序测定样品总淀粉含量及直支链淀粉比值，并计算样品直链淀粉含量；
（4）对所得近红外光谱光学数据进行预处理，滤除无用及干扰信号；
（5）对预处理后的近红外光谱光学数据与检测数据通过化学计量学方法进行关联，将光谱数据进行转换，与化学测定值进行回归计算，然后得出定标方程，建立数学模型；
（6）构建小麦单籽粒的直链淀粉含量化学值与近红外光谱之间的预测模型并进行验证实验；（7）采集待测样品的近红外光谱，用构建的近红外预测模型快速无损测定待测样品直链淀粉含量。
进一步的，所述小麦单籽粒样本在113个，要求是不同产地的小麦籽粒、颜色及颗粒形状有差异。
进一步的，所述应用近红外谷物品质分析仪采集玉米单籽粒样品近红外光谱，扫描谱区范围为950~1650 nm，分辨率2 nm，采用单籽粒镜面样品盘装载样品，籽粒需水平放置在样品盘中心，每个样品重复装样3次，每次装样扫描次，保存平均光谱。
进一步的，所述爱尔兰的Megazyme试剂盒酶解程序包含两个部分。首先，采用爱尔兰的Megazyme总淀粉测定试剂盒，按照葡萄糖苷酶/α-淀粉酶方法对样品的总淀粉含量进行测定。然后采用爱尔兰的Megazyme直支链淀粉比值测定试剂盒，按照凝集素伴刀豆球蛋白 A（Con A）结合法测定样品淀粉的直支比。最后，按照下列公式计算样品的直链淀粉含量：
。
进一步的，所述主要采用无预处理方法、标准正态变化（Standard NormalVariate，SNV）和多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）对所得近红外光谱光学数据进行预处理。
进一步的，所述采用化学计量学分析软件Unscrambler v10.1进行偏最小二乘回归分析（PLS），并建立最佳数学模型。
附图说明
图1是本发明一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法的操作流程。
图2为本发明实施例中原始近红外光谱图。
图3为本发明实施例中PLS模型的预测集的预测值与参比值散点图。
具体实施方式
本发明提出了一种在有机相中全酶法制备亲水性植物甾醇二元酸糖酯的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下将配合实施例来对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、材料
收集商丘市113份小麦籽粒样本，其粒形不同，品种多样，具有广泛的代表性。其中，91份为定标样品，进行模型的建立，剩余22份作为验证样品。
2、仪器
使用的仪器有：紫外-可见分光光度计，近红外光谱仪，电热恒温水浴锅，离心机。
3、化学实验方法
3.1 总淀粉测定：爱尔兰Megazyme试剂盒AACC 76.13法。
3.2 直支链淀粉比值测定：按照爱尔兰Megazyme试剂盒酶解程序进行。
（1）样品预处理
将小麦单籽粒样品研磨过筛至100~200目。准确地称取0.0200-0.025 g样品（精确到0.0001 g）于10 ml螺旋盖样品管，准确记录样品质量。吸取1 ml DMSO加入样品管中，盖上盖子，在涡旋混合器上混合后，放入沸水浴中加热约1分钟，使样品完全分散。继续高速混合样品溶液，再放入沸水浴中加热15分钟，期间间歇高速搅拌。
加热完成后，于室温下放置5分钟，在涡旋混合器连续搅拌下加入2 ml 95%（v/v）乙醇溶液，继续加4 ml乙醇溶液，盖上盖子后混匀。静置样品管15分钟以上形成淀粉沉淀。
沉淀好的淀粉溶液于离心机上2850 rpm下离心5分钟，倾去上清液，在纸巾上倒扣沥干10分钟，确保乙醇全部排出。向沉淀中加入2mlDMSO，混合均匀后于沸水浴中加热15分钟，间歇搅拌，确保没有凝胶块。从沸水浴中取出后立即加入4ml Con A溶液，充分混合后完全转移至25 ml容量瓶，用Con A溶液定容。（全麦粉或其他有需要的样品需过滤）定容后的溶液需在2小时内分析。
（2）支链淀粉的Con A沉淀和直链淀粉的测定
吸取1.0 ml上述溶液于2.0 ml离心管中，加0.5 ml的Con A溶剂后轻轻混匀，静置1小时后于14200 rpm下离心10分钟。将1 ml上清液转移至15 ml螺旋盖样品管中，加入3 ml乙酸钠缓冲液，盖上盖子，混匀后于沸水浴中加热5分钟。将样品管置于40℃水浴中平衡5分钟，加入0.1 ml α-淀粉酶和葡萄糖苷酶的混合溶剂，继续在40 ℃孵育30分钟，之后再2850rpm下离心5分钟。
取1.0 ml的上清液（一式两份）于新样品管中，另取一样品管加入1.0 ml乙酸钠缓冲液，作为空白对照，再取一样品管加入0.1 ml D-葡萄糖标准液和0.9 ml乙酸钠缓冲液，作为D-葡萄糖控制。向各样品管中加4ml GOPOD试剂，于40 ℃水浴下孵育20分钟。孵育结束后，于510 nm处，扣除空白值，读取D-葡萄糖控制和各样品吸光度。
（3）总淀粉的测定
取上述容量瓶中溶液0.5 ml于样品管，加入4 ml乙酸钠缓冲液，混合均匀，于40℃孵育10分钟。取1.0 ml的上清液（一式两份）于新样品管中，加入4 ml GOPOD试剂并混合均匀，于40 ℃水浴中孵育20分钟，于510 nm处，扣除空白值后读取各样品吸光度。
3.3 直链淀粉含量的测定
4、收集近红外光谱数据
采用英国Porten 近红外谷物分析仪，扫描谱区范围为950~1650 nm，分辨率2 nm，采用单籽粒镜面样品盘装载样品，籽粒需水平放置在样品盘中心，每个样品重复装样3次，每次装样扫描次，保存平均光谱，如图2所示。
5、近红外定标模型的建立
采用无预处理方法、标准正态变化（Standard Normal Variate，SNV）和多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）对所得近红外光谱光学数据进行预处理。利用化学计量学分析软件Unscrambler v10.1进行偏最小二乘回归分析（PLS），结果如下表所示。在不同光谱数据的预处理条件下，所建小麦单籽粒直链淀粉近红外定量分析模型的决定系数（R2）均＞0.8，交互验证均方根误差（RMSEC）和预测均方根误差（RMSEP）在0.8左右，适用范围在11.1~15.5之间。
6、外部验证
图3为PLS模型的预测集的预测值与参比值散点图。采用未参与定标模型的已知样品对所建定标模型的实际预测效果进行评价，淀粉直、支链淀粉预测值与化学值间绝对误差小于0.5 %。对于小麦单籽粒的预测，化学法和近红外仪器法测定间无显著差异，因此基本可认定近红外光谱测定结果是准确可靠的。说明采用近红外光谱分析技术能够满足对小麦单籽粒常规品质成分的检测。
Claims (6)
1.一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）收集小麦单籽粒样本；
（2）将未经处理的小麦单籽粒样品直接置于近红外光谱下进行透射扫描，采集每个样品近红外漫反射光谱；
（3）采用爱尔兰的Megazyme试剂盒酶解程序测定样品总淀粉含量及直支链淀粉比值，并计算样品直链淀粉含量；
（4）对所得近红外光谱光学数据进行预处理，滤除无用及干扰信号；
（5）对预处理后的近红外光谱光学数据与检测数据通过化学计量学方法进行关联，将光谱数据进行转换，与化学测定值进行回归计算，然后得出定标方程，建立数学模型；
（6）构建小麦单籽粒的直链淀粉含量化学值与近红外光谱之间的预测模型并进行验证实验；（7）采集待测样品的近红外光谱，用构建的近红外预测模型快速无损测定待测样品直链淀粉含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中小麦单籽粒样本为113个，为不同产地的小麦籽粒、颜色及颗粒形状有差异。
3.根据权利要求1所述的一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述步骤（2）中应用近红外谷物品质分析仪采集玉米单籽粒样品近红外光谱，扫描谱区范围为950~1650 nm，分辨率2 nm，采用单籽粒镜面样品盘装载样品，籽粒需水平放置在样品盘中心，每个样品重复装样3次，每次装样扫描次，保存平均光谱。
4.根据权利要求1所述的一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述步骤（3）中爱尔兰的Megazyme试剂盒酶解程序包含两个部分：首先，采用爱尔兰的Megazyme总淀粉测定试剂盒，按照葡萄糖苷酶/α-淀粉酶方法对样品的总淀粉含量进行测定；然后采用爱尔兰的Megazyme直支链淀粉比值测定试剂盒，按照凝集素伴刀豆球蛋白 A（Con A）结合法测定样品淀粉的直支比；最后，按照下列公式计算样品的直链淀粉含量：
。
5.根据权利要求1所述的一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，主要采用无预处理方法、标准正态变化和多元散射校正对所得近红外光谱光学数据进行预处理。
6.根据权利要求1所述的一种利用近红外光谱技术快速无损测定小麦单籽粒直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述步骤（5）中采用化学计量学分析软件Unscrambler v10.1进行偏最小二乘回归分析，并建立最佳数学模型。
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