CN108613954B

CN108613954B - 一种多菌灵的检测方法

Info

Publication number: CN108613954B
Application number: CN201810393433.6A
Authority: CN
Inventors: 侯长军; 杨奕霞; 霍丹群; 侯经洲; 刘自山
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-04-27
Also published as: CN108613954A

Abstract

本发明公开了一种多菌灵的检测方法，本发明基于绿色发光的荧光碳点和贵金属纳米金来检测待测物溶液中多菌灵的浓度，其中纳米金可以通过荧光共振能量转移作用淬灭碳点的荧光，多菌灵能与纳米金结合从而恢复碳点淬灭的荧光。本发明在检测多菌灵的过程中，具有操作简单，检测专一性好，检测灵敏度高，检测限低，下限为0.45ppb，检测速度快，大大的提高了检测效率，稳定性好，成本低，能够实现实时在线的快速和特异性检测，可以用于水果和蔬菜中多菌灵农药残留的简单快速检测。本发明在检测分析领域具有良好的应用前景和潜在应用价值。

Description

一种多菌灵的检测方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种多菌灵的检测方法。

背景技术

多菌灵 (carbendazim)，是一种苯并咪唑类药物，同时也是苯菌灵(benomyl)在哺乳动物体内的主要代谢产物和在环境中的降解产物。多菌灵作为一种广谱高效的杀菌剂广泛应用于防治蔬菜和水果等各类农产品的白粉病和霜霉病等，其对人、畜低毒，但是若长期摄入，会在体内积累，从而导致慢性或急性毒性而影响人体健康，可通过食道引起兴奋、抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、头昏头疼、胸闷、上腹压痛等中毒症状。

目前多菌灵检测手段多依赖于气相、液相色谱及其与质谱联用技术，荧光光谱法，电化学传感器，化学分析法。虽然色谱检测方法具有准确性高，分离效果、结果稳定性和操作重复性好的优点，但样品处理操作较为繁琐，并且对实验设备和实验操作人员的专业性要求也较高，不适合大规模样品的检测，并且需要大型且昂贵的设备，检测成本高；荧光光谱法目前使用的碳点大多数为发蓝光，这样不仅导致其背景干扰大而且它们的量子产率都很低，不利于实际应用；电化学传感器检测方法操作复杂，周期长，耗时耗力，所以在应用中具有一定限制；现有化学分析法简单易行，但均存在灵敏度低，检测范围小的问题。因此，这些传统的方法难以实现实时在线的快速、专一性检测。所以有必要找到一种新的检测方法来解决这些问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种多菌灵的检测方法，解决现有检测方法样品前处理时间长、操作复杂、灵敏度低、检测范围小且检测成本高的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种多菌灵的检测方法，包括以下步骤：

1）碳点的合成：

将间苯二胺和二乙烯三胺五甲叉膦酸加入水中，然后超声混合均匀得到反应液，将所述反应液倒入反应釜中200~300℃反应2~6h后取出，自然冷却至室温，然后将其离心得到上清液，再将所述上清液进行透析，即得到碳点原液，避光保存；

2）纳米金的合成：

将氯金酸水溶液加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，搅拌均匀，待混合溶液颜色由黑色变成红色时，再继续加热30~60min后，自然冷却至室温，即得到纳米金溶液，避光保存；所述柠檬酸三钠水溶液的固液比为1~2g：100ml；所述氯金酸水溶液的浓度为20~30mM；

3）绘制标准曲线：

取步骤2）制备的纳米金溶液平均分成若干份，分别向每份纳米金溶液中加入相同体积浓度梯度的多菌灵标准溶液得混合溶液，并在室温下孵育，充分反应后，向所述的混合溶液中加入碳点检测液得到标样总反应液，反应完成后，检测荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的标样总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度，绘制荧光恢复强度与多菌灵浓度关系的标准曲线，所述纳米金的加入量相对于待测样品中多菌灵的量是过量的，所述碳点检测液为所述碳点原液经B-R缓冲溶液稀释得到；

4）待测样品测定：

取步骤2）制备的纳米金溶液，向所述纳米金溶液加入待测样品溶液得混合溶液，并在室温下孵育，充分反应后，然后向所述混合溶液中加入步骤3）所述碳点检测液得到待测样总反应液，反应完成后，检测荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的待测样总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度，再根据步骤3）得到的标准曲线，即可获得待测样品中多菌灵的含量；所述纳米金的加入量相对于待测样品中多菌灵的量是过量的；所述纳米金、待测样品和碳点检测液加入体积量分别与步骤3）所述纳米金、多菌灵标准液和碳点检测液的加入体积量相同。

进一步，所述间苯二胺和二乙烯三胺五甲叉膦酸的质量比为1:5~6。

进一步，所述反应液中固液比为10~15g：100ml。

进一步，所述透析过程中透析袋的截留分子量为1000MWCO，透析时间为24~48h。

进一步，所述B-R缓冲溶液的pH值为5~7。

其中，B-P（Britton-Robinson）缓冲溶液为是由磷酸、硼酸和醋酸混合而成，向其中加入不同量的氢氧化钠可以组成pH范围很宽的缓冲溶液，pH1.8~11.9，属于广域缓冲溶液。

进一步，所述纳米金溶液的浓度为0.17~0.24nM。

进一步，所述反应釜中反应温度为200℃，反应时间为5h。

进一步，所述氯金酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液的体积比为15~20:1。

本发明提出了基于绿色发光的荧光碳点和贵金属纳米金来检测待测物溶液中多菌灵的浓度。本发明水热法合成的碳点在512nm处有最大激发峰，且具有较强的绿色荧光。纳米金能通过荧光共振能量转移作用淬灭碳点的荧光，而多菌灵分子中含有1个苯环和1个含2个N的杂环，其中含N杂环对纳米金颗粒（AuNPs）具有很强的亲和力，使多菌灵能与纳米金结合，再者多菌灵分子中的苯环也能通过π-π作用促使纳米金（AuNPs）聚集，从而减少纳米金通过荧光共振能量转移作用淬灭碳点的荧光强度（图1）。因此，根据待测样品中多菌灵的浓度不同，碳点的荧光也会发生不同程度的恢复，表现出荧光强度不同。即多菌灵的浓度与碳点荧光恢复强度呈线性关系。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过碳点的荧光恢复强度与多菌灵的浓度呈线性关系，实现了对待测溶液中多菌灵的浓度的快速检测。在检测多菌灵的过程中，样品不需要前处理，不需要大型仪器，大大的降低了成本，操作简单，检测专一性好，避免其它常见农药和金属阳离子影响，抗干扰能力强，检测灵敏度高，检测限低，下限为0.45ppb，检测速度快，整个反应过程只需要5分钟，大大的提高了检测效率，稳定性好，能够实现实时在线的快速、专一性检测，用途广泛，可以用于水果和蔬菜中多菌灵农药残留的简单快速检测。本发明在检测分析领域具有良好的应用前景和潜在应用价值。

2、本发明通过水热法制备的碳点，量子产率高，能发绿色光，能有效的消除背景干扰。

3、本发明合成方法简单，原料廉价易得，合成条件温和可控，其合成过程不需要添加有机或无机化学试剂，也不会产生污染物，绿色环保。

附图说明

图1是多菌灵的检测原理图；

图2是纳米金浓度对碳点荧光淬灭强度的影响；

图3是不同pH值的B-P缓冲溶液对碳点荧光恢复强度的影响；

图4是孵化时间对碳点荧光恢复强度的影响；

图5是不同浓度多菌灵的荧光强度曲线图；

图6是检测多菌灵的标准曲线图；

图7是不同农药和金属阳离子对检测多菌灵方法的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

一、一种多菌灵的检测方法

实施例1

1）将0.5g间苯二胺和2.84g二乙烯三胺五甲叉膦酸加入30ml水中得到反应液，然后超声5min，使反应液混合均匀，再将所述反应液倒入50ml反应釜中200℃反应5h后取出，自然冷却至室温，10000rpm离心10min得到上清液，再将上清液倒入1000 MWCO的透析袋子透析24h，即得到碳点原液，将碳点原液用B-R缓冲溶液（pH=6）稀释800,000倍得到碳点检测液用于检测，待用。

2）将2g四水氯金酸加入200ml水中，加热至沸腾，然后加入新鲜配制的6ml 1%柠檬酸三钠水溶液，搅拌均匀，待混合溶液颜色由黑色变成红色时，再继续加热30min后取出，自然冷却至室温，即得到纳米金溶液，最后置于4℃冰箱储存。

3）将碳点检测液平均分成10份，然后向每份碳点检测液中分别加入一定量的纳米金，得到反应液，使纳米金在反应液中的终浓度分别为0、0.07、0.10、0.14、0.17、0.22、0.24、0.28、0.36、0.43nM，最后再加入水使反应液体积为3ml，用荧光分光光度计测定反应液在512nm处的荧光强度，得到的荧光强度与纳米金终浓度为0的反应液的荧光强度的比值，即为荧光淬灭强度。以荧光淬灭强度为纵坐标，纳米金的终浓度为横坐标，绘制曲线图。结果如图2所示。

从图2可以看出，在其它因素均相同的条件下，随着纳米金浓度的升高，反应液中碳点的荧光淬灭强度不断的增强，当纳米金终浓度为0.22nM时，荧光淬灭强度趋于稳定；当纳米金终浓度为0.24nM时，荧光淬灭强度不再增加，反应液中的多菌灵络合的纳米金已达到饱和。为了提高灵敏度，优选纳米金终浓度为0.22nM。

实施例2

1）将0.5g间苯二胺和2.84g二乙烯三胺五甲叉膦酸加入30ml水中得到反应液，然后超声5min，使反应液混合均匀，再将反应液倒入50ml反应釜中200℃反应5h后取出，自然冷却至室温，10000rpm离心10min得到上清液，再将上清液倒入1000 MWCO的透析袋子透析24h，即得到碳点原液，将碳点原液分别用不同pH值B-R缓冲溶液稀释800,000倍得到碳点检测液用于检测，待用，其中pH值分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8和9。

3）制备多菌灵标准液，使其平均分成9份，每份100μL，然后向每份多菌灵标准液中分别加入150μL浓度为0.22nM的纳米金溶液，混合均匀，室温孵育5min，再向上述混合溶液中分别加入2.75ml不同pH值的碳点检测溶液得到总反应液，混合均匀，多菌灵在总反应液的终浓度为100ppb，用荧光分光光度计测定总反应液在512nm处的荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度。以荧光恢复强度为纵坐标，pH值为横坐标，绘制曲线图。结果如图3所示。

从图3可以看出，在其它因素均相同的条件下，随着缓冲溶液pH值不断的增大，碳点的荧光恢复强度也在不断的增强，当缓冲溶液pH值大于6时，荧光恢复强度反而在不断的减弱，即缓冲溶液pH值为6时，总反应液中的多灵菌与纳米金的相互作用效果最佳。

实施例3

试验方法同实施例2，其中B-R缓冲溶液的pH值为6，孵育时间为变量，分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10min。以荧光恢复强度为纵坐标，孵育时间为横坐标，绘制曲线图，结果如图4所示。

从图4可以看出，在其它因素均相同的条件下，随着孵化时间的增长，碳点的荧光恢复强度也在不断的增强，当孵化时间为5min以上，荧光恢复强度变化不大趋于稳定，即孵化时间为5min时，混合溶液中的多菌灵能与纳米金充分反应完全，再增加孵化时间也不会增加荧光恢复强度。

实施例4

1）将0.5g间苯二胺和2.84g二乙烯三胺五甲叉膦酸加入30ml水中得到反应液，然后超声5min，使反应液混合均匀，再将反应液倒入50ml反应釜中200℃反应5h后取出，自然冷却至室温，10000rpm离心10min得到上清液，再将上清液倒入1000MWCO的透析袋子透析24h，即得到碳点原液，将碳点原液用B-R缓冲溶液（pH=6）稀释800,000倍得到碳点检测液用于检测，待用。

3）绘制标准曲线：

取步骤2）制备的纳米金溶液，平均分成13份，每份150uL，向每份纳米金溶液中加入100μl不同浓度梯度的多菌灵标准溶液，然后分别在室温下孵育5min保证其充分反应；再向上述混合溶液中加入2.75ml的碳点检测液得到总反应液，其中纳米金在总反应液中的终浓度为100ppb，多菌灵在总反应液中的终浓度分别为0、1ppb、2ppb、3ppb、10ppb、20ppb、30ppb、80ppb、100ppb、200ppb、300ppb、350ppb和400ppb。再用荧光分光光度计分别测定总反应液在512nm处的荧光强度，如图5所示。

由图5可以看出，随着多菌灵浓度的增加，荧光强度随之增加。当多菌灵浓度为300ppb时，荧光强度趋于稳定，荧光强度不再增加，总反应液中的多菌灵与纳米金的相互作用已达到饱和。

得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度。以荧光恢复强度为纵坐标，多菌灵浓度为横坐标，绘制标准曲线。如图6所示。

通过图6可以得出，标准曲线的线性范围是1-30ppb，线性方程为：Y=0.1381X+1.464，R²=0.9945，检测线为0.45ppb，低于国际标准。可见，本发明线性范围宽，检测灵敏度高，能够实现对低浓度多菌灵的检测。

二、多菌灵的检测方法的专一性

1）碳点的合成：

将0.5g间苯二胺和2.84g二乙烯三胺五甲叉膦酸加入30ml水中得到反应液，然后超声5min，使反应液混合均匀，再将反应液倒入50ml反应釜中200℃反应5h后取出，自然冷却至室温，10000rpm离心10min得到上清液，再将上清液倒入1000MWCO的透析袋子透析24h，即得到碳点溶液，将碳点原液用B-R缓冲溶液（pH=6）稀释800,000倍得到碳点检测液用于检测，待用。

2）纳米金的合成：

将2g四水氯金酸加入200ml水中，加热至沸腾，然后加入新鲜配制的6ml 1%柠檬酸三钠水溶液，搅拌均匀，待混合溶液颜色由黑色变成红色时，再继续加热30min后取出，自然冷却至室温，即得到纳米金溶液，最后置于4℃冰箱储存。

2）取步骤2）制备的纳米金溶液，使纳米金在总反应液中的终浓度为100ppb，平均分成19份，每份150uL，向每份纳米金溶液中分别加入100μl其它常见农药或金属阳离子：K⁺、Na⁺、Ca²⁺、NH₄ ⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、氟啶胺、三唑酮、草甘膦、敌百虫、杀螟硫磷、毒死蜱、涕灭威、溴氰菊酯、水（空白对照）和多菌灵（阳性对照），使其它常见农药、金属阳离子和多菌灵在总反应液中的终浓度分别为1000ppb、2000ppb和200ppb，室温孵育5min，再向上述混合溶液中分别加入2.75ml的碳点检测液得到总反应液，再用荧光分光光度计分别测定总反应液在512nm处的荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度。如图7所示。

从图7可以看出，其它常见农药或金属阳离子加入后对总反应液中荧光变化均不大，其影响可忽略，可见，本方法对检测多菌灵具有很好的特异性，对其它常见农药或金属阳离子具有很好的抗干扰能力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种多菌灵的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）碳点的合成：

2）纳米金的合成：

3）绘制标准曲线：

取步骤2）制备的纳米金溶液平均分成若干份，分别向每份纳米金溶液中加入相同体积浓度梯度的多菌灵标准溶液得混合溶液，并在室温下孵育，充分反应后，向所述的混合溶液中加入碳点检测液得到标样总反应液，反应完成后，检测512nm处的荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的标样总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度，绘制荧光恢复强度与多菌灵浓度关系的标准曲线，所述纳米金的加入量相对于标准溶液中多菌灵的量是过量的，所述碳点检测液为所述碳点原液经B-R缓冲溶液稀释得到；

4）待测样品测定：

取步骤2）制备的纳米金溶液，向所述纳米金溶液加入待测样品溶液得混合溶液，并在室温下孵育，充分反应后，然后向所述混合溶液中加入步骤3）所述碳点检测液得到待测样总反应液，反应完成后，检测512nm处的荧光强度，得到的荧光强度与多菌灵浓度为0的标样总反应液的荧光强度的比值，即为荧光恢复强度，再根据步骤3）得到的标准曲线，即可获得待测样品中多菌灵的含量；所述纳米金的加入量相对于待测样品中多菌灵的量是过量的；所述纳米金、待测样品和碳点检测液加入体积量分别与步骤3）所述纳米金、多菌灵标准溶液和碳点检测液的加入体积量相同。

2.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤1）所述间苯二胺和二乙烯三胺五甲叉膦酸的质量比为1:5~6。

3.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤1）所述反应液中固液比为10~15g：100ml。

4.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤1）所述透析过程中透析袋的截留分子量为1000MWCO，透析时间为24~48h。

5.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，所述B-R缓冲溶液的pH值为5~7。

6.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤3）和步骤4）所述纳米金溶液的浓度为0.17~0.24nM。

7.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤1）所述反应釜中反应温度为200℃，反应时间为5h。

8.根据权利要求1所述多菌灵的检测方法，其特征在于，步骤2）所述氯金酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液的体积比为15~20:1。