CN113777087B - 一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法 - Google Patents

一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，其包括以下步骤：S1.石墨烯量子点的合成：S2.标准曲线的建立；S3.样品中亚硝酸盐的测定。本发明通过利用亚硝酸钠与邻苯二胺(OPD)在酸性条件下发生衍生化反应生成苯并三唑(BPA)，苯并三唑(BPA)在碱性介质中产生强烈荧光。而BPA同时作为一种良好的荧光猝灭剂和响应信号，在450nm处有特征吸收，可高效猝灭石墨烯量子点(Ex:350nm,Em:578nm)的荧光(参比信号)，从而实现了比率荧光分析方法来对痕量亚硝酸盐进行检测。本方法具有操作简单、灵敏度高(最低检测限可低至1.29×10‑5mg/kg)、快速方便(反应时间15min)等优势，可用于亚硝酸盐快速检测，应用前景广阔。

Description

一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法
技术领域
本发明属于荧光分析术领域，具体地是涉及一种基于石墨烯量子点检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法。
背景技术
亚硝酸盐普遍存在于环境、食物、工业和生理系统中，特别是生物体内时刻进行着亚硝酸盐的合成与代谢。近年来，农业氮肥的滥用及自然资源的管理不善，导致局部和全球氮循环发生扰动。亚硝酸根离子在土壤中具有高溶解度和流动性，加上农业中对无机肥料的持续依赖，导致亚硝酸根离子持续流失，严重污染邻近水体。加之工业废水的排放，地下饮用水资源亚硝酸盐污染现象日趋严重。同时亚硝酸盐还是食品加工中一种常用的添加剂，它能够抑制某些微生物的生长，防止食品变质，尤其是能够抑制肉毒芽孢杆菌的生长和繁殖，从而明显降低肉毒芽孢杆菌的中毒概率。此外，亚硝酸盐还具有使肉制品发色、抗氧化及增强风味的作用，因此香肠、酱腌菜和罐头等食品中常添加亚硝酸盐作为着色剂和防腐剂。但过量亚硝酸根离子的摄入将危害人类的健康，导致人体疾病的产生。亚硝酸根离子进入血液中会导致血红蛋白不可逆地转变为高铁血红蛋白，导致氧的摄取和运输受到影响。亚硝酸盐在胃中酸性环境下与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等胺类化合物发生反应，生成具有致癌作用的N-亚硝胺，后者可引起机体发生癌变；同时N-亚硝胺能透过胎盘途径进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。在流行病学和生态学研究中，饮用水或食物中亚硝酸盐或硝酸盐的摄入与I型儿童糖尿病，甲状腺功能紊乱以及生殖和发育毒性有关。目前各国对食品中亚硝酸盐含量及添加量都有严格的限度要求，因此开发简单便捷、可靠和灵敏的亚硝酸盐测定方法对食品工业、环境安全等许多领域都有重要意义。
鉴于此，构建能快速准确检测亚硝酸盐的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报道的检测亚硝酸盐的分析方法包括色谱法、电化学法和化学发光法等，这些方法虽然灵敏度高，但是需要昂贵的大型仪器，方法操作繁琐或是重复性差，易受其他离子干扰，不适用于现场快速检测。
荧光分析法具有操作简便、灵敏度度高、选择性好、经济实用等特点，比一般的比色分析法和紫外吸收分光光度方灵敏度高2-3个数量级，适合微量和痕量检测。目前已经被广泛用于痕量检测、荧光标记等领域。但是，传统的荧光探针主要由有机染料分子构成，具有荧光亮度低，光稳定性和耐光漂白能力差等缺点，限制了荧光检测技术的进一步发展与应用。近年来出现的纳米荧光探针包括碳量子点、金纳米簇、聚合物荧光纳米微球等，具有较高的荧光量子产率，良好的光稳定性和抗光漂白能力，生物相容性好、合成与修饰简单等优点，成为替代传统荧光探针的新型荧光探针。如Yang等人构建了基于三元ZnCdS量子点的荧光传感器用于亚硝酸盐的检测，其线性检测范围为180μmol/L～700μmol/L，检测限达18.45mg/kg(A novel fluorescent sensors for sensitive detection of nitriteions,Yang et al.Materials Chemistry and Physics,2020,239,https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2019.122121)；Zan等制备了对亚硝酸盐有高敏感性和高选择性的磷氮掺杂碳量子点的荧光传感器，线性范围为10nmol/L～90nmol/L，检测限3.3nmol/L(Astrong green fluorescent nanoprobe for highly sensitive and selectivedetection of nitrite ions based on phosphorus and nitrogen co-doped carbonquantum dots,Zan et al.Sensors&Actuators:B.Chemical,2018,262.https://doi.org/10.1016/j.snb.2017.12.177)。Wei等人构建了N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺和M-苯二胺修饰的绿色荧光硅量子点的亚硝酸盐传感器，线性范围为0.1μmol/L～6.0μmol/L，检测限25nmol/L(One-pot Facile Synthesis of Green-emitting FluorescentSilicon Quantum Dots for the Highly Selective and Sensitive Detection ofNitrite in Food Samples,Wei et al.Dyes and Pigments,2020.https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2020.108848)。然而，当前亚硝酸盐荧光传感器大都是基于单一荧光强度比值测定的非比率荧光模式，这种方法容易受到检测仪器以及测试环境的干扰。
为了克服此问题，提出了比率荧光分析方法，其采用基于两种不同发射波长的荧光强度比值对目标物进行检测，利用比率荧光的自校准作用能够有效排除所述外部干扰因素，可以更加准确地对亚硝酸盐进行痕量检测。Guo等人研究了一种基于碳点的双发射二氧化硅纳米粒子，可以用于食品样品中亚硝酸盐测定的比率荧光方法，其介绍了：通过将碳点和罗丹明B涂覆到染料掺杂的二氧化硅纳米粒子，结果可以监测到两个荧光发射峰。当环境中存在NO2 -，可以在酸性介质中选择性催化溴酸钾(KBrO3)的氧化反应猝灭双发射二氧化硅纳米粒子的荧光，产生双发射二氧化硅纳米粒子的比例荧光响应。制备的比率荧光传感器可以灵敏的检测亚硝酸盐，其检测范围10μg/L～160μg/L，但检测限为1.0μg/L，并且荧光探针(基于碳点的双发射二氧化硅纳米粒子)需要多步骤合成与修饰，操作繁琐。(Carbondots based dual-emission silica nanoparticles as ratiometric fluorescentprobe for nitrite determination in food samples,Guo et al.Food Chemistry,2018,260.https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.03.150)。Li等人开发了一种基于MoS2 QDs和AuNCs之间的荧光能量共振转移(FRET)的新型比率荧光传感器，可以用于香肠中亚硝酸盐的检测。MoS2 QDs在紫外光的激发下能发射强烈的蓝色荧光，并且AuNC因其强烈的荧光、理想的斯托克斯位移和生物相容性，AuNCs具有巨大的构建双发射纳米材料的潜力。MoS2 QDs和AuNCs在365nm激发下在430nm和615nm处表现出双发射荧光峰，随着亚硝酸盐的增加，由于AuNCs的聚集而荧光猝灭，MoS2 QDs的荧光强度增强，其线性范围为0.5mg/L～20mg/L，但是检测限为46.2ng/L，且需要分别合成MoS2 QDs和AuNCs两种荧光材料，增加检测成本。(Visual detection of nitrite in sausage based on a ratiometricfluorescent system,Li et al.Food Control,2019,106.https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2019.06.030)。
目前尚未有关于基于石墨烯量子点与邻苯二胺衍生化检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的报道。
发明内容
为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供了一种基于石墨烯量子点检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法。本发明是通过利用亚硝酸钠与邻苯二胺(OPD)在酸性条件下发生衍生化反应生成苯并三唑(BPA)，苯并三唑(BPA)在碱性介质中产生强烈荧光。而BPA同时作为一种良好的荧光猝灭剂和响应信号，在450nm处有特征吸收，可高效猝灭石墨烯量子点(Ex:350nm,Em:578nm)的荧光(参比信号)，从而实现了比率荧光分析方法来对痕量亚硝酸盐进行检测。本方法采用石墨烯量子点仅需一步水溶法就能合成、操作简单、灵敏度高(最低检测限可低至12.9ng/kg)、快速方便(反应时间15min)等优势，可用于亚硝酸盐快速检测，应用前景广阔。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，其包括以下步骤：
S1.石墨烯量子点的合成：将无水柠檬酸加入到烧杯中，加热到一定温度并保温一段时间，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入一定量的氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌，最后用氢氧化钠中和溶液，得到石墨烯量子点水溶液，于冰箱避光保存，使用时稀释一定倍数；
S2.标准曲线的建立：用一定浓度的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液与邻苯二胺溶液，等体积混合使其充分反应一段时间，再使用饱和氢氧化钠溶液调节pH至碱性，加入步骤S1制备的石墨烯量子点，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
S3.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按步骤S2的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述步骤S2得到的标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S1中无水柠檬酸的加热温度为200℃，保温0.5～6h。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S1中石墨烯量子点使用时稀释倍数为4～16倍。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S1中所用氢氧化钠的体积为100mL，氢氧化钠的浓度为5～10mg/mL。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S1中氢氧化钠中和溶液至pH＝6.5～7.5。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S2中所用盐酸浓度为0.01M～0.5M。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S2中反应时间为1min～30min。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式所述步骤S2中pH的范围为9.5～13。
作为本发明提供的所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的一种优选实施方式该分析方法具体包括以下步骤：
步骤S10.石墨烯量子点的合成：称取2.0g无水柠檬酸于250mL烧杯中，置于电化学烘箱中加热至200℃，保温30min，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入100mL浓度为10mg/mL氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌；最后用氢氧化钠中和至pH＝7.0得到石墨烯量子点水溶液；于4℃冰箱避光保存，使用时稀释8倍；
步骤S11.标准曲线的建立：用浓度为0.1M的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液与浓度为100mM的邻苯二胺溶液，等体积混合使其充分反应15min，再使用氢氧化钠溶液调节pH＝11.0加入步骤S1制备的石墨烯量子点，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S12.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按上述步骤S11的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述步骤S2得到的标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
本发明具有如下有益效果：
本发明以无水柠檬酸作为碳源制备的发蓝色荧光的石墨烯量子点为参比荧光团，亚硝酸钠与邻苯二胺(OPD)在酸性条件下发生衍生化反应生成苯并三唑(BPA)，苯并三唑(BPA)在碱性介质中产生强烈的黄色荧光(响应荧光团)。同时，由于BPA特征吸收光谱与石墨烯量子点的发射光谱大部分重叠，BPA可以高效猝灭石墨烯量子点，进而实现了双发射比率荧光分析法来对痕量亚硝酸盐进行检测。
本发明基于比率荧光测定可排除光漂白、荧光团浓度、环境条件(温度、pH、极性)、光稳定性等因素的干扰，检测的精密度与灵敏度更高。该方法对亚硝酸盐的检测限可低至12.9ng/kg，显著低于现有检测方法，灵敏度更高。而且本方法具有操作简单、荧光探针合成简便，快速方便(反应时间15min)等优势，可用于亚硝酸盐快速检测，应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明基于石墨烯量子点检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法的原理示意图；
图2A是本发明步骤S11制备的石墨烯量子点的透射电镜图；
图2B是本发明步骤S11制备的石墨烯量子点的荧光光谱图；
图3是本发明亚硝酸钠与过量OPD衍生化反应后的质谱图；
图4A是响应基团与参比基团荧光光谱随亚硝酸盐浓度变化关系图；
图4B检测亚硝酸盐标准曲线。
具体实施方式
如上述背景技术中所述的，现有已有采用比率荧光分析方法对亚硝酸盐进行痕量检测，但是现有基于碳点的双发射二氧化硅纳米粒子的荧光探针需要多步骤合成与修饰，操作繁琐；还有的需要分别合成MoS2 QDs和AuNCs两种荧光材料，增加检测成本。而且也暂未有报道基于石墨烯量子点与邻苯二胺衍生化检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法。
为此，本发明人进行大量试验，开发出一种基于石墨烯量子点与邻苯二胺衍生化检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，该方法对亚硝酸盐的检测限可低至12.9ng/kg，显著低于现有检测方法，灵敏度更高(最低检测限可低至12.9ng/kg)。而且本方法具有操作简单、仅需一步水溶法就能合成石墨烯量子点即荧光探针合成简便，快速方便(反应时间15min)等优势，可用于亚硝酸盐快速检测，应用前景广阔。
具体地，本发明提供的一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，其包括以下步骤：
S1.石墨烯量子点的合成：将无水柠檬酸加入到烧杯中，加热到一定温度并保温一段时间，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入一定量的氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌，最后用氢氧化钠中和溶液，得到石墨烯量子点水溶液，于冰箱避光保存，使用时稀释一定倍数；
S2.标准曲线的建立：用一定浓度的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液与邻苯二胺溶液，等体积混合使其充分反应一段时间，再使用饱和氢氧化钠溶液调节pH至碱性，加入步骤S1制备的石墨烯量子点，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
S3.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按步骤S2的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述步骤S2得到的标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
如图1所示，本发明是通过利用亚硝酸钠与邻苯二胺(OPD)在酸性条件下发生衍生化反应生成苯并三唑(BPA)，苯并三唑(BPA)在碱性介质中产生强烈荧光。而BPA同时作为一种良好的荧光猝灭剂和响应信号，在450nm处有特征吸收，可高效猝灭石墨烯量子点(Ex:350nm,Em:578nm)的荧光(参比信号)，从而实现了比率荧光分析方法来对痕量亚硝酸盐进行检测。
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本技术领域常规的试剂、方法和仪器。
其中，在本发明中涉及到的单位“M”表示物质的量浓度，还可以表示为mol/L，常见的有nM(nmol/L)、uM(umol/L)、mM(mmol/L)、M(mol/L)。
实施例1
本实施例提供了一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S11.石墨烯量子点的合成：称取2.0g无水柠檬酸于250mL烧杯中，置于电化学烘箱中加热至200℃，保温30min，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入100mL浓度为10mg/mL氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌；最后用氢氧化钠中和至pH＝7.0得到石墨烯量子点水溶液；于4℃冰箱避光保存，使用时稀释8倍；
从图2A可以看出，所制备的石墨烯量子点的粒径约分布较均一，在365nm紫外灯下有强的蓝色荧光。该石墨烯量子点的最佳激发波长为350nm，最大发射波长在450nm(如图2B)。
步骤S12.标准曲线的建立：用浓度为0.1M的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液(1.29×10-5～6900mg/kg)与浓度为100mM的邻苯二胺溶液，将200μL不同浓度的亚硝酸盐标准溶液和200μL邻苯二胺溶液混合使其充分反应15min，再使用浓度为3M饱和氢氧化钠溶液调节pH＝11.0，加入200μL步骤S11的石墨烯量子点(稀释8倍)，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
如图4所示，随着亚硝酸盐浓度增加，生成的苯并三唑增加(如图3通过质谱证明亚硝酸钠与OPD反应可以生成苯并三唑)，I578强度逐渐增强，同时石墨烯量子点的荧光I450逐渐减弱。荧光强度比值I578/I450与亚硝酸盐浓度(1.29×10-5～215.63mg/kg)呈现很好的线性关系：I578/I450＝0.1974+0.0301C[NO2-](R2＝0.99)，对亚硝酸盐的检出下限是1.29×10- 5mg/kg，显著低于背景技术以及现有技术中所报道的比率荧光分析方法。
步骤S13.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按上述步骤S12的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
对实际样品火腿肠、酱腌菜、自来水的检测：取按25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg水平添加的火腿肠、酱腌菜、自来水样品，按步骤S11所述步骤对亚硝酸盐进行测定。按公式：回收率(％)＝(添加后测定值-空白值)/添加量×100％计算回收率。结果如表1所示，本次添加回收率在80.4％～117.3％之间，变异系数低于9.7％，说明该方法测定亚硝酸盐具有很好的准确性及稳定性。
表1
Figure BDA0003282542790000071
Figure BDA0003282542790000081
实施例2
本实施例提供了一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S21.石墨烯量子点的合成：称取2.0g无水柠檬酸于250mL烧杯中，置于电化学烘箱中加热至200℃，保温1h，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入100mL浓度为8mg/mL氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌；最后用氢氧化钠中和至pH＝6.5得到石墨烯量子点水溶液；于4℃冰箱避光保存，使用时稀释10倍；
步骤S22.标准曲线的建立：用浓度为0.05M的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液(1.29×10-5～6900mg/kg)与浓度为100mM的邻苯二胺溶液，将200μL不同浓度的亚硝酸盐标准溶液和200μL邻苯二胺溶液混合使其充分反应5min，再使用浓度为3M饱和氢氧化钠溶液调节pH＝9.5，加入200μL步骤S21的石墨烯量子点(稀释10倍)，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S23.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按上述步骤S22的步骤操作，将得到的I578/I450代入所述标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
实施例3
本实施例提供了一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，具体包括以下步骤：
步骤S31.石墨烯量子点的合成：称取2.0g无水柠檬酸于250mL烧杯中，置于电化学烘箱中加热至200℃，保温30min，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入100mL浓度为5mg/mL氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌；最后用氢氧化钠中和至pH＝7.5得到石墨烯量子点水溶液；于4℃冰箱避光保存，使用时稀释6倍；
步骤S32.标准曲线的建立：用浓度为0.5M的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液(1.29×10-5～6900mg/kg)与浓度为100mM的邻苯二胺溶液，将200μL不同浓度的亚硝酸盐标准溶液和200μL邻苯二胺溶液混合使其充分反应30min，再使用浓度为3M饱和氢氧化钠溶液调节pH＝13，加入200μL步骤S31的石墨烯量子点(稀释6倍)，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S33.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按上述步骤S32的步骤操作，将得到的I578/I450代入所述标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1.石墨烯量子点的合成：将无水柠檬酸加入到烧杯中，加热到一定温度并保温一段时间，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入一定量的氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌，最后用氢氧化钠中和溶液，得到石墨烯量子点水溶液，于冰箱避光保存，使用时稀释一定倍数；
S2.标准曲线的建立：用一定浓度的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液与邻苯二胺溶液，等体积混合使其充分反应一段时间，再使用饱和氢氧化钠溶液调节pH至碱性，加入步骤S1制备的石墨烯量子点，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
S3.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按步骤S2的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述步骤S2得到的标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度；
所述步骤S1中无水柠檬酸的加热温度为200℃，保温0.5～6h；
所述步骤S1中石墨烯量子点使用时稀释倍数为4～16倍；
所述步骤S1中所用氢氧化钠的体积为100mL，氢氧化钠的浓度为5～10mg/mL；
所述步骤S1中氢氧化钠中和溶液至pH为6.5～7.5；
所述步骤S2中所用盐酸浓度为0.01M～0.5M；
所述步骤S2中反应时间为1min～30min；
所述步骤S2中pH的范围为9.5～13。
2.根据权利要求1所述的检测亚硝酸盐的比率荧光分析方法，其特征在于，该分析方法具体包括以下步骤：
步骤S10.石墨烯量子点的合成：称取2.0g无水柠檬酸于250mL烧杯中，置于电化学烘箱中加热至200℃，保温30min，观察到柠檬酸变成淡黄色液体，取出，逐滴加入100mL浓度为10mg/mL氢氧化钠，在滴加的同时剧烈搅拌；最后用氢氧化钠中和至pH＝7.0得到石墨烯量子点水溶液；于4℃冰箱避光保存，使用时稀释8倍；
步骤S11.标准曲线的建立：用浓度为0.1M的盐酸配制不同浓度的亚硝酸钠标准溶液与浓度为100mM的邻苯二胺溶液，等体积混合使其充分反应15min，再使用氢氧化钠溶液调节pH＝11.0加入步骤S1制备的石墨烯量子点，测定在350nm激发下，记录380nm～680nm范围内的荧光发射光谱，计算荧光强度比值I578/I450，以亚硝酸钠浓度为横坐标，I578/I450为纵坐标绘制标准曲线；
步骤S12.样品中亚硝酸盐的测定：将等体积处理好的样品代替亚硝酸钠标准品溶液，按上述步骤S11的步骤操作，将测到的I578/I450代入所述步骤S2得到的标准曲线，以得到样品中亚硝酸钠浓度。
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