CN108680545B - 一种食源性致病菌现场快速检测方法 - Google Patents

一种食源性致病菌现场快速检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108680545B
CN108680545B CN201810397550.XA CN201810397550A CN108680545B CN 108680545 B CN108680545 B CN 108680545B CN 201810397550 A CN201810397550 A CN 201810397550A CN 108680545 B CN108680545 B CN 108680545B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
ucnps
pathogenic bacteria
fluorescence
cdna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810397550.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108680545A (zh
Inventor
俞樟森
钱沁清
张建华
孙爱静
张衡
方剑
张小娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Shaoxing
Original Assignee
University of Shaoxing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Shaoxing filed Critical University of Shaoxing
Priority to CN201810397550.XA priority Critical patent/CN108680545B/zh
Publication of CN108680545A publication Critical patent/CN108680545A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108680545B publication Critical patent/CN108680545B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Abstract

本发明涉及一种食源性致病菌现场快速检测方法，纳米FRET探针合成：利用高温共沉淀法合成上转换荧光纳米微粒AReF4:Yb,Er，利用偶联剂EDC、sulfo‑NHS将AReF4:Yb,Er与待检测食源性治病菌的适配体、适配体的互补寡核苷酸单链cDNA与Alexa Fluor 546荧光染料分别进行共价偶联，并将两种偶联产物共孵育得到纳米FRET探针。该发明构建AReF4:Yb,Er‑Aptamer/cDNA‑Alexa Fluor 546纳米FRET探针的方法工艺简单，建立的定性检测方法快速、简便，定量检测方法快速、灵敏度高、特异性强。该发明适用于食源性致病菌现场快速检测领域，对食品安全的控制具有积极意义。

Description

一种食源性致病菌现场快速检测方法
技术领域
本发明涉及食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种基于Aptamer/上转换荧光纳米探针实现荧光共振能量转移的现场快速、高灵敏度和高特异性的食源性致病菌检测方法。
背景技术
近年来，由于食源性致病菌引起的食物中毒事件不断发生，这给人们的健康生活造成极大影响，同时造成巨大的经济损失，由病原微生物引起的食品安全问题已被世界各国广泛关注。细菌性食物中毒常致病菌主要有副溶血性弧菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、致泻性大肠埃希菌等。因此，建立一种现场快速、准确、便捷、灵敏度高、特异性强的食源性致病菌检测技术，是确保食品安全的有效方法和关键技术。
食源性致病菌的传统检测方法主要有微生物培养法、电阻电导测定法、细菌直接计数法、分子生物学法、免疫学方法、液相色谱法、气质联用法等。但是传统微生物检测方法，不仅样品前处理复杂，而且耗时费力、成本过高、特异性和灵敏度均不高，只能作为疑似样品的确证方法，无法满足食品安全督查现场检测的需求。近年来，现代生物技术在微生物检测领域也得到了广泛应用，如DNA探针、聚合酶链式反应、生物芯片等方法，具有对靶标分子特异性高、快速检测等优点。但这些技术存在样品前处理复杂、检测微环境要求高、抗体制备困难且容易失效等缺点。因此，建立一种适用于现场快速准确检测食品中食源性致病菌的技术具有广阔的应用前景和巨大的现实意义。
上转换纳米微粒 (Upconversion Nanoparticles, UCNPs) 可实现在低能的近红外光激发下发射高能可见光，UCNPs的反Stokes位移特征使得其在生物及医学检测领域应用中具有独特的优势。第一，近红外光激发可以完全避免生物分子产生的背景荧光干扰，从而实现更高的检测灵敏度。第二，UCNPs具有多个窄波段的荧光峰，可以实现多组分同时检测并能避免出现串色干扰。第三，UCNPs易于通过多种方法进行表面修饰并与不同生物靶分子偶联，实现靶标分子的高特异性检测。
寡核苷酸适配体 (Aptamer) 是由指数富集的配体系统进化 (systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX) 技术筛选得到的能够与相应配体特异性结合的一小段DNA或RNA分子。适配体具有亲和力高、特异性强、靶标广泛、易于修饰、成本低、稳定性好等优点。因此，通过SELEX技术筛选得到能与食源性致病菌特异性结合的适配体作为识别元件，以实现更高特异性的检测。
本发明基于荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)原理，通过SELEX技术筛选常见食源性致病菌的适配体，并将适配体与UCNPs纳米微粒偶联得到Aptamer-UCNPs纳米探针作为能量供体，另外将致病菌适配体的互补寡核苷酸单链（cDNA）与Alexa Fluor 546 (AF546)荧光染料偶联cDNA-AF546作为能量受体，发展一种均相体系中针对食源性致病菌的现场快速检测方法。
发明内容
本发明提供了一种食源性致病菌现场快速检测方法。第一，通过SELEX技术筛选并合成常见食源性致病菌的适配体，同时合成适配体对应的互补寡核苷酸单链。第二，通过高温共沉淀法合成UCNPs，并采用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，将适配体与UCNPs共价偶联得到Aptamer-UCNPs纳米荧光探针。AF546荧光染料与适配体的互补寡核苷酸单链共价偶联得到AF546-cDNA。再将两者通过碱基互补配对双联杂交方式连接，形成AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物。利用980 nm便携式半导体激光器激发纳米复合物，AF546吸收UCNPs的510-560 nm波段的荧光，进而实现荧光共振能量转移。肉眼观察纳米复合物发射荧光的颜色，并使用荧光光谱仪测定纳米复合物的荧光光谱，分别积分计算510-560 nm、640-680 nm波段的荧光强度G510-560和R640-680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680。第三，在检测体系中，加入对应致病菌，同时加入适量AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物在37℃条件下共孵育20-40 min。由于致病菌与cDNA同时竞争Aptamer，且Aptamer更易于与致病菌结合，从而导致检测体系中cDNA与Aptamer解离，使得Aptamer-UCNPs的上转换荧光恢复。同样，使用980 nm便携式半导体激光器激发检测体系，肉眼观察检测体系发射荧光的颜色，并使用荧光光谱仪测定检测体系的荧光光谱，分别积分计算荧光强度G510-560、R640-680和荧光强度比值GRR。在一定范围内，检测体系中的致病菌数量与检测体系在980 nm便携式半导体激光器激发下，发射的荧光颜色、荧光强度G510-560和荧光强度比值GRR的变化趋势呈正相关。根据检测体系发射荧光的颜色变化，可以建立通过肉眼直接现场、快速定性检测致病菌的方法。根据检测体系荧光强度G510-560、荧光强度比值GRR与致病菌浓度建立标准曲线，可以实现灵敏度高、特异性强的均相、快速常见致病菌检测方法。
具体实现过程包括如下步骤：
步骤一：利用whole-bacteria SELEX技术筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线。合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。
步骤二：利用高温共沉淀法，将1.0 mmol ReCl3·6H2O (Re：Y/Gd/Lu；Yb；Er )加入到按一定比例混合的油酸、十八烯反应体系中，反应体系抽真空并加热至140-160℃保温40-90 min。反应体系冷却至25-50℃，加入溶解于甲醇中的NH4F、AOH (A：Li/Na)溶液，室温搅拌反应30-120 min。反应体系加热至80-120℃，通大气流量的惰性气体（Ar、N2）排甲醇20-40 min。甲醇排尽后反应体系持续升温至300℃，保温60-120 min。冷却至室温，加入适量无水乙醇沉淀，6000-10000 rpm离心，洗涤，获得AReF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒。
步骤三：利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，将一定量聚丙烯胺加入到10-20mL二甘醇中，通氩气保护并加热至100℃以上，聚丙烯胺充分溶解。再逐滴加入10 mL分散有适量UCNPs的环己烷分散液。保温20-40 min排尽环己烷后，持续升温至220-240℃，保温60-240 min。冷却至室温，加入适量0.1 M的HCl溶液，12000-15000 rpm离心10-30 min，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2-4次。
步骤四：利用EDC/Sulfo-NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30-60min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16-24 h。离心、洗涤得到Aptamer-UCNPs纳米探针。采用相同的方法将与适配体对应的互补寡核苷酸单链与AF546荧光染料进行共价偶联得到AF546-cDNA。
步骤五：将一定量Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA加入到1-3 mL杂交缓冲液中，室温搅拌20-60 min，通过碱基互补配对获得AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物。使用980 nm便携式半导体激光器激发纳米复合物溶液，利用普通数码相机拍照记录纳米复合物荧光发光图片。利用荧光光谱仪测定纳米复合物荧光光谱，分别积分计算510-560nm、640-680 nm波段的荧光强度G510-560和R640-680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680。
构建致病菌检测体系，在6组一定浓度的AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物分散液中，分别以一定浓度梯度加入与Aptamer对应的食源性致病菌，室温共孵育20-40min。由于竞争关系，致病菌与Aptamer-UCNPs结合，AF546-cDNA从AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物脱离下来，使得AF546-cDNA与Aptamer-UCNPs之间的荧光共振能量转移现象不存在，UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G510-560得到恢复，且荧光强度G510-560恢复的程度与致病菌浓度呈正相关。同样，在检测过程中，由于UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G510-560与致病菌浓度相关，而640-680 nm 波段的荧光强度R640-680在致病菌检测过程中基本保持不变。因此，UCNPs的两个波段荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680也与致病菌浓度呈正相关，肉眼观察时即表现为检测体系的荧光颜色变化与致病菌浓度相关。基于此，本检测方法既可利用肉眼观察检测体系荧光颜色变化来定性判断致病菌浓度，又可利用荧光光谱仪测定检测体系荧光强度变化，建立荧光强度G510-560或GRR与致病菌浓度的标准曲线，用以定量测定待测样品中的致病菌浓度。
利用Aptamer-上转换荧光纳米探针现场快速检测食源性致病菌的方法具有如下有益效果：
1．本发明方法利用近红外半导体激光激发UCNPs发射的荧光作为检测信号源，能完全去除其他生物分子背景荧光，提高检测信噪比和检测灵敏度。所用激光器成本低。采用适配体识别对应食源性致病菌，提高检测方法的特异性。
2．本发明基于UCNPs与AF546之间的荧光共振能量转移来实现致病菌检测，既可以通过肉眼观察检测前后体系发射的荧光颜色变化，定性判断样品中致病菌浓度，做到现场快速检测；又能通过荧光光谱仪测定检测前后体系荧光强度值，借助标准曲线精确定量计算得到致病菌浓度。
附图说明
图1 基于Aptamer-上转换荧光纳米探针现场快速检测食源性致病菌方法的原理图；
图2 本发明实施1中LiLuF4:Yb,Er的TEM (a)；XRD (b)；LiLuF4:Yb,Er与AF546发生荧光共振能量转移示意图(c)；LiLuF4:Yb,Er的上转换荧光光谱及AF546的激发光谱和发射光谱；
图3 本发明实施1中LiLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546 FRET检测探针在不同浓度E. coli O157:H7下测得的荧光光谱 (a)；LiLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546 FRET检测探针在不同E. coli O157:H7浓度下对应的色坐标 (b)；
图4 本发明实施例2中NaGdF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546 FRET检测探针测定沙门氏菌的荧光光谱强度变化 (a) 及荧光强度G510-560与对应菌液浓度的标准曲线 (b)。
具体实施方式
下面，通过实施例来详细说明本发明的内容，但本发明并不限定于此。
实施例1：利用LiLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546 FRET纳米FRET探针检测大肠杆菌E. coli O157:H7
首先，利用SELEX技术筛选得到大肠杆菌E. coli O157:H7的适配体，同时合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。利用高温共沉淀法合成粒径小于10 nm的LiLuF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒，并通过配体交换法在LiLuF4:Yb,Er表面修饰氨基。利用EDC、Sulfo-NHS作为偶联剂，分别得到Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA。
其次，配置已知浓度的大肠杆菌E. coli O157:H7标准液，按比例梯度稀释成1-105 cfu/mL不同浓度的菌液。将制备好的等量LiLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor546纳米FRET探针分别加入到不同浓度的待测菌液中，37℃孵育30 min。孵育完成后，利用980 nm激光器分别激发不同浓度菌液的检测体系，利用数码相机拍摄上转换荧光图片，制作上转换荧光颜色与菌液浓度对应关系的标准比色卡。同时，利用荧光光谱仪测定不同浓度菌检测体系的上转换荧光光谱，测定检测体系在510-560 nm、640-680 nm波段的上转换荧光强度G510-560和R640-680，计算得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680，建立荧光强度G510-560、GRR与大肠杆菌E. coli O157:H7浓度的标准曲线，用以肉眼定性和荧光光谱仪定量测定待测样品中的细菌浓度。
最后，取500 μL LiLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针加入到未知浓度的待测大肠杆菌E. coli O157:H7菌液中，37℃孵育30 min。利用980 nm激光器激发检测体系，根据标准比色卡对照检测体系荧光颜色，基于肉眼直接实现大肠杆菌E. coli O157:H7菌液的定性检测。同时，利用荧光光谱仪测定检测体系的上转换荧光光谱，测定G510-560、GRR的值，通过标准曲线，精确定量得到待测菌液的浓度。
实施例2：利用NaGdF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针检测沙门氏菌
首先，利用SELEX技术筛选得到沙门氏菌的适配体，同时合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。利用高温共沉淀法合成粒径小于10 nm的NaGdF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒，并通过配体交换法在NaGdF4:Yb,Er表面修饰氨基。利用EDC、Sulfo-NHS作为偶联剂，分别得到Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA。
其次，配置已知浓度的沙门氏菌标准液，按比例梯度稀释成1-106 cfu/mL不同浓度的菌液。将制备好的等量NaGdF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针分别加入到不同浓度的待测菌液中，37℃孵育30 min。孵育完成后，利用980 nm激光器分别激发不同浓度菌液的检测体系，利用数码相机拍摄上转换荧光图片，制作上转换荧光颜色与菌液浓度对应关系的标准比色卡。同时，利用荧光光谱仪测定不同浓度菌检测体系的上转换荧光光谱，测定检测体系在510-560 nm、640-680 nm波段的上转换荧光强度G510-560和R640-680，计算得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680，建立荧光强度G510-560、GRR与沙门氏菌浓度的标准曲线，用以肉眼定性和荧光光谱仪定量测定待测样品中的细菌浓度。
最后，取500 μL NaGdF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针加入到未知浓度的待测沙门氏菌菌液中，37℃孵育30 min。利用980 nm激光器激发检测体系，根据标准比色卡对照检测体系荧光颜色，基于肉眼直接实现沙门氏菌菌液的定性检测。同时，利用荧光光谱仪测定检测体系的上转换荧光光谱，测定G510-560、GRR的值，通过标准曲线，精确定量得到待测菌液的浓度。
实施例3：利用LiYF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针检测副溶血性弧菌
首先，利用SELEX技术筛选得到副溶血性弧菌的适配体，同时合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。利用高温共沉淀法合成粒径小于10 nm的LiYF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒，并通过配体交换法在LiYF4:Yb,Er表面修饰氨基。利用EDC、Sulfo-NHS作为偶联剂，分别得到Aptamer-LiYF4:Yb,Er纳米探针和AF546-cDNA。
其次，配置已知浓度的副溶血性弧菌标准液，按比例梯度稀释成1-107 cfu/mL不同浓度的菌液。将制备好的等量LiYF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针分别加入到不同浓度的待测菌液中，37℃孵育30 min。孵育完成后，利用980 nm激光器分别激发不同浓度菌液的检测体系，利用数码相机拍摄上转换荧光图片，制作上转换荧光颜色与菌液浓度对应关系的标准比色卡。同时，利用荧光光谱仪测定不同浓度菌检测体系的上转换荧光光谱，测定检测体系在510-560 nm、640-680 nm波段的上转换荧光强度G510-560和R640-680，计算得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680，建立荧光强度G510-560、GRR与副溶血性弧菌浓度的标准曲线，用以肉眼定性和荧光光谱仪定量测定待测样品中的细菌浓度。
最后，取500 μL LiYF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针加入到未知浓度的待测副溶血性弧菌菌液中，37℃孵育30 min。利用980 nm激光器激发检测体系，根据标准比色卡对照检测体系荧光颜色，基于肉眼直接实现副溶血性弧菌菌液的定性检测。同时，利用荧光光谱仪测定检测体系的上转换荧光光谱，测定G510-560、GRR的值，通过标准曲线，精确定量得到待测菌液的浓度。
实施例4：利用LiGdF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针检测金黄色葡萄球菌
首先，利用SELEX技术筛选得到金黄色葡萄球菌的适配体，同时合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。利用高温共沉淀法合成粒径小于10 nm的LiGdF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒，并通过配体交换法在LiGdF4:Yb,Er表面修饰氨基。利用EDC、Sulfo-NHS作为偶联剂，分别得到Aptamer-LiGdF4:Yb,Er纳米探针和AF546-cDNA。
其次，配置已知浓度的金黄色葡萄球菌标准液，按比例梯度稀释成1-108 cfu/mL不同浓度的菌液。将制备好的等量LiGdF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针分别加入到不同浓度的待测菌液中，37℃孵育30 min。孵育完成后，利用980 nm激光器分别激发不同浓度菌液的检测体系，利用数码相机拍摄上转换荧光图片，制作上转换荧光颜色与菌液浓度对应关系的标准比色卡。同时，利用荧光光谱仪测定不同浓度菌检测体系的上转换荧光光谱，测定检测体系在510-560 nm、640-680 nm波段的上转换荧光强度G510-560和R640-680，计算得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680，建立荧光强度G510-560、GRR与金黄色葡萄球菌浓度的标准曲线，用以肉眼定性和荧光光谱仪定量测定待测样品中的细菌浓度。
最后，取500 μL LiGdF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针加入到未知浓度的待测金黄色葡萄球菌菌液中，37℃孵育30 min。利用980 nm激光器激发检测体系，根据标准比色卡对照检测体系荧光颜色，基于肉眼直接实现金黄色葡萄球菌菌液的定性检测。同时，利用荧光光谱仪测定检测体系的上转换荧光光谱，测定G510-560、GRR的值，通过标准曲线，精确定量得到待测菌液的浓度。
实施例5：利用NaLuF4:Yb, Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针检测溶血性链球菌
首先，利用SELEX技术筛选得到溶血性链球菌的适配体，同时合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链。利用高温共沉淀法合成粒径小于10 nm的NaLuF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒，并通过配体交换法在NaLuF4:Yb,Er表面修饰氨基。利用EDC、Sulfo-NHS作为偶联剂，分别得到Aptamer-NaLuF4:Yb,Er纳米探针和AF546-cDNA。
其次，配置已知浓度的溶血性链球菌标准液，按比例梯度稀释成1-105 cfu/mL不同浓度的菌液。将制备好的等量NaLuF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针分别加入到不同浓度的待测菌液中，37℃孵育30 min。孵育完成后，利用980 nm激光器分别激发不同浓度菌液的检测体系，利用数码相机拍摄上转换荧光图片，制作上转换荧光颜色与菌液浓度对应关系的标准比色卡。同时，利用荧光光谱仪测定不同浓度菌检测体系的上转换荧光光谱，测定检测体系在510-560 nm、640-680 nm波段的上转换荧光强度G510-560和R640-680，计算得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680，建立荧光强度G510-560、GRR与溶血性链球菌浓度的标准曲线，用以肉眼定性和荧光光谱仪定量测定待测样品中的细菌浓度。
最后，取500 μL LiGdF4:Yb,Er-Aptamer/cDNA-Alexa Fluor 546纳米FRET探针加入到未知浓度的待测溶血性链球菌菌液中，37℃孵育30 min。利用980 nm激光器激发检测体系，根据标准比色卡对照检测体系荧光颜色，基于肉眼直接实现溶血性链球菌菌液的定性检测。同时，利用荧光光谱仪测定检测体系的上转换荧光光谱，测定G510-560、GRR的值，通过标准曲线，精确定量得到待测菌液的浓度。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。

Claims (3)

1.一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：
步骤一、筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线；并合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链；
步骤二、利用高温共沉淀法，获得AReF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒；将1.0 mmolReCl3·6H2O加入到按一定比例混合的油酸、十八烯反应体系中，反应体系抽真空并加热至140-160℃保温40-90 min；反应体系冷却至25-50℃，加入溶解于甲醇中的NH4F、AOH溶液 ，其中A为Li/Na，室温搅拌反应30-120 min；反应体系加热至80-120℃，通大气流量的惰性气体Ar、N2排甲醇20-40 min；甲醇排尽后反应体系持续升温至300℃，保温60-120 min；冷却至室温，加入适量无水乙醇沉淀，6000-10000 rpm离心，洗涤；步骤三、利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2-4次；
其中Re为Y/Gd/Lu；Yb；Er；
步骤四、利用EDC/Sulfo-NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30-60 min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16-24 h；离心、洗涤得到Aptamer-UCNPs纳米探针；采用相同的方法将与适配体对应的互补寡核苷酸单链与AF546荧光染料进行共价偶联得到AF546-cDNA；
步骤五、将一定量Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA加入到1-3 mL杂交缓冲液中，室温搅拌20-60 min，通过碱基互补配对获得AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物；使用980 nm便携式半导体激光器激发纳米复合物溶液，利用普通数码相机拍照记录纳米复合物荧光发光图片；
利用荧光光谱仪测定纳米复合物荧光光谱，分别积分计算510-560 nm、640-680 nm波段的荧光强度G510-560和R640-680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680；构建致病菌检测体系，在6组一定浓度的AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物分散液中，分别以一定浓度梯度加入与Aptamer对应的食源性致病菌，室温共孵育20-40 min；由于竞争关系，致病菌与Aptamer-UCNPs结合，AF546-cDNA从AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物脱离下来，使得AF546-cDNA与Aptamer-UCNPs之间的荧光共振能量转移现象不存在，UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G510-560得到恢复，且荧光强度G510-560恢复的程度与致病菌浓度呈正相关；在检测过程中，由于UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G510-560与致病菌浓度相关，而640-680 nm 波段的荧光强度R640-680在致病菌检测过程中基本保持不变；因此，UCNPs的两个波段荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680也与致病菌浓度呈正相关，肉眼观察时即表现为检测体系的荧光颜色变化与致病菌浓度相关；又可利用荧光光谱仪测定检测体系荧光强度变化，建立荧光强度GRR与致病菌浓度的标准曲线，用以定量测定待测样品中的致病菌浓度。
2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤一，利用whole-bacteria SELEX技术筛选得到常见食源性致病菌适配体。
3.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤三，将聚丙烯胺加入到10-20 mL二甘醇中，通氩气保护并加热至100℃以上，聚丙烯胺充分溶解；再逐滴加入10 mL分散有适量UCNPs的环己烷分散液；保温20-40 min排尽环己烷后，持续升温至220-240℃，保温60-240 min；冷却至室温，加入适量0.1 M的HCl溶液，12000-15000 rpm离心10-30 min。
CN201810397550.XA 2018-04-28 2018-04-28 一种食源性致病菌现场快速检测方法 Active CN108680545B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810397550.XA CN108680545B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种食源性致病菌现场快速检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810397550.XA CN108680545B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种食源性致病菌现场快速检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108680545A CN108680545A (zh) 2018-10-19
CN108680545B true CN108680545B (zh) 2021-06-29

Family

ID=63802610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810397550.XA Active CN108680545B (zh) 2018-04-28 2018-04-28 一种食源性致病菌现场快速检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108680545B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004148B (zh) * 2019-04-09 2020-10-20 北京农业质量标准与检测技术研究中心 链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN111707824B (zh) * 2020-07-08 2022-11-25 深圳技术大学 一种癌胚抗原的检测方法
CN112505029B (zh) * 2020-11-26 2022-12-09 北京市农林科学院 一种病原菌比色传感检测方法及其应用
CN113588758B (zh) * 2021-09-01 2023-10-13 集美大学 一种基于AgBiS2的光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法
CN114058721B (zh) * 2021-11-18 2024-04-16 江苏大学 一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用
CN114689523A (zh) * 2022-03-25 2022-07-01 江苏省农业科学院 光学检测食源性致病菌的系统和方法
CN115078716A (zh) * 2022-06-22 2022-09-20 合肥工业大学 一种荧光猝灭型探针对副溶血性弧菌的检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017580A (zh) * 2014-06-18 2014-09-03 东南大学 超小NaYF4: Yb3+, Er3+上转换发光材料的制备方法
CN105372213A (zh) * 2015-09-29 2016-03-02 江南大学 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
CN106086173A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 西安交通大学 一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法
CN107525937A (zh) * 2017-08-25 2017-12-29 苏州优函信息科技有限公司 基于上转换发光标记物、蛋白芯片及检测方法
CN107629792A (zh) * 2017-09-30 2018-01-26 华南师范大学 上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017580A (zh) * 2014-06-18 2014-09-03 东南大学 超小NaYF4: Yb3+, Er3+上转换发光材料的制备方法
CN105372213A (zh) * 2015-09-29 2016-03-02 江南大学 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
CN106086173A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 西安交通大学 一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法
CN107525937A (zh) * 2017-08-25 2017-12-29 苏州优函信息科技有限公司 基于上转换发光标记物、蛋白芯片及检测方法
CN107629792A (zh) * 2017-09-30 2018-01-26 华南师范大学 上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108680545A (zh) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108680545B (zh) 一种食源性致病菌现场快速检测方法
Li et al. Designing an aptamer based magnetic and upconversion nanoparticles conjugated fluorescence sensor for screening Escherichia coli in food
CN106086173B (zh) 一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法
CN108196044B (zh) 一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法
Wu et al. Aptamer-functionalized magnetic nanoparticle-based bioassay for the detection of ochratoxin a using upconversion nanoparticles as labels
Wu et al. A highly sensitive fluorescence resonance energy transfer aptasensor for staphylococcal enterotoxin B detection based on exonuclease-catalyzed target recycling strategy
Yi et al. A composite prepared from carboxymethyl chitosan and aptamer-modified gold nanoparticles for the colorimetric determination of Salmonella typhimurium
Guo et al. A novel fluorescence method for the rapid and effective detection of Listeria monocytogenes using aptamer-conjugated magnetic nanoparticles and aggregation-induced emission dots
Ouyang et al. Upconversion nanoparticles-based FRET system for sensitive detection of Staphylococcus aureus
CN111175266A (zh) 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法
Ren et al. A novel fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based paper sensor with smartphone for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus
Chen et al. A fluorescence biosensor for Salmonella typhimurium detection in food based on the nano-self-assembly of alendronic acid modified upconversion and gold nanoparticles
Zheng et al. Rapid and selective detection of Bacillus cereus in food using cDNA-based up-conversion fluorescence spectrum copy and aptamer modified magnetic separation
Wang et al. Homogeneous time-resolved FRET assay for the detection of Salmonella typhimurium using aptamer-modified NaYF 4: Ce/Tb nanoparticles and a fluorescent DNA label
WO2017088214A1 (zh) 荧光生物检测系统
Wang et al. High-throughput, highly sensitive and rapid SERS detection of Escherichia coli O157: H7 using aptamer-modified Au@ macroporous silica magnetic photonic microsphere array
US20230358741A1 (en) Method for preparing dual-channel visual multicolor fluorescent probe and detection method
CN109239037A (zh) 基于MOFs作为能量受体的生物传感器及其制备方法和应用
Xu et al. Ultrasensitive hairpin mediated upconversion fluorescence biosensor for Staphylococcus aureus detection in foods and waters exploiting g–C3N4–assisted catalysis
CN116482357A (zh) 一种用于检测单增李斯特菌的荧光淬灭型生物传感器及其制备方法
CN112129732B (zh) 一种基于上转换磁分离的快速检测蜡样芽孢杆菌的方法
CN110501494A (zh) 一种基于二氧化锰纳米花和荧光材料的微生物检测方法
CN113466201B (zh) 一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法
Li et al. Upconversion nanoparticle-based aptasensor for rapid and ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus by low-speed centrifugation
TWI830913B (zh) 使用金奈米粒子之精胺的直接比色法檢測

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant