CN108196044B - 一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法 - Google Patents

一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法，属于环境检测和食品安全检测技术领域。通过在上转换荧光颗粒表面修饰能特异性的识别目标物的核酸适配子，在NC膜表面修饰与适配子互补配对核酸序列(cDNA)。当没有目标物时，上转换探针与cDNA通过碱基互补配对原则结合并在检测线上形成荧光条带，当加入目标物后，目标物会与cDNA竞争性与适配子结合，从而导致上转换纳米颗粒探针不能与cDNA结合，从而导致检测线上的荧光强度变低。根据检测线上不同的荧光值，可以实现对目标物的定量测量。本发明方法对设备要求低，检测结果只需相机拍照即可获得，灵敏度高，特异性强，操作简便，通过适配子序列的改变可以测定各种目标物，也可采用三色荧光颗粒与三种适配体进行三种目标物的同时检测，在环境监测及食品分析等方面具有十分重要的意义。

Description

一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法
技术领域
本发明属于环境检测和食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法。
背景技术
快速、灵敏、便携的检测方式在疾病诊断、环境监测和食品安全检测领域中得到越来越多的关注。例如，病原体、重金属离子等有毒物质都是水质评价的重要指标；此外，作为全球公共卫生最关注的问题之一，食源性疾病常由不同种类的污染物(如细菌、抗生素、非法添加剂和农药残留)污染食物引起的，这造成每年有十分之一的人口因此而生病；另外，在疾病检测中，此外，医生通常需要在血液样本中对细菌、真菌等目标物的含量进行评估，以精确诊断其症状是否由炎症、真菌感染或毒素积累引起。因此，以快速、低成本、可靠的方式同时检测同一样品中的多目标是非常必要的。
现有分析方法面临的最大挑战在于，它很难同时实现敏感、快速、低成本和多目标检测的要求。如液相或气相色谱、质谱和聚合酶链反应常被用作分析样品的金标准，能够在高灵敏度和选择性下进行检测，然而，这些方法既费时又费钱，需要训练有素的操作员。
免疫侧流试纸是一种快速检测的常规方法，具有特异性、灵敏、快速且便携的优点，广泛应用于食品中毒素、病原微生物以及抗生素残留的筛查。在检测中，利用抗原抗体特异性结合的特点，形成抗原-抗体-有色颗粒复合物而富集在检测线上，形成肉眼可见的有色沉淀线。这种方法目前在不少研究中通过多检测线的方式实现了多种目标物的同时检测，但依然无法避免多目标物之前的交叉反应。另外，由于该类检测多以抗原-抗体反应作为检测基础。其最大的局限性在于：抗体制备昂贵、价格高昂且不稳定、对于有毒或非免疫性目标物无能为力。因此，大大限制了其在检测中的应用。适配体，作为抗体的替代品，有着不输抗体的灵敏度与特异性并且更廉价、更稳定、更易修饰。相关工作者基于适配体进行了大量的研究，但基于适配体的快速、灵敏、便携的多目标物检测方式依然没有出现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法，该方法具有高灵敏度、高特异性、多目标物检测、操作简便及测试成本低等优势。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法，包括以下步骤：
1)采用热分解法制备稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒；
2)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对步骤1)制得的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒进行水溶性修饰；
3)合成待检测目标的适配子及与该适配子碱基互补配对的cDNA单链；
4)采用缩合反应，将cDNA单链在步骤2)制得的水溶性修饰后的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒的表面进行再次修饰，制得上转换荧光探针；
5)采用生物素-链霉素反应，将生物素修饰的cDNA单链以点状固定于在测流试纸的NC膜表面形成检测线；
6)将步骤4)制得的上转换荧光探针溶解在标准缓冲液中后，滴加在步骤5)制得的测流试纸的结合垫上，烘干备用；
7)制备已知浓度的检测体系，用步骤6)制备好的侧流试纸检测，反应30min，用相机测定980nm激发下检测线的照片，分析其灰度值并绘制标准曲线；
8)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值，检查目标浓度对数值与对应的荧光值标准曲线，求得样品中目标物的数量。
优选地，步骤1)中，所述稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒为掺杂镧系金属的上转换荧光纳米颗粒。
优选地，所述稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒中包含了NaYF4、Er、Yb或Tm。
优选地，待检测目标包括细菌、毒素和金属离子。
优选地，步骤7)中，绘制标准曲线的具体操作是：分别将不同浓度的目标液与上转换荧光探针混合，并流过步骤5)制得的侧流试纸上，反应30min，检测线的荧光转化成灰度值，并将该度值与加入的目标物浓度一一对应绘制得到标准曲线。
优选地，步骤8)中，制备样品检测体系的具体操作是：取不同浓度的样品加入自来水中，加入上转换荧光探针进行检测，根据测得的待测样品荧光灰度值，检查目标物浓度对数值与对应的灰度值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。
优选地，当不存在目标物时，上转换荧光探针将直接通过碱基互补配对与检测线上的cDNA单链序列结合；
当存在目标物时，目标物将竞争性的结合上转换荧光探针上的适配体序列，导致与检测线上cDNA单链序列结合的上转换荧光探针变少，从而检测线上的信号减弱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法，通过在上转换荧光颗粒表面修饰能特异性的识别目标物的核酸适配子，在NC膜表面修饰与适配子互补配对核酸序列(cDNA)。当没有目标物时，上转换探针与cDNA通过碱基互补配对原则结合并在检测线上形成荧光条带，当加入目标物后，目标物会与cDNA竞争性与适配子结合，从而导致上转换纳米颗粒探针不能与cDNA结合，从而导致检测线上的荧光强度变低。根据检测线上不同的荧光值，可以实现对目标物的定量测量。本发明方法对设备要求低，检测结果只需相机拍照即可获得，灵敏度高，特异性强，操作简便，通过适配子序列的改变可以测定各种目标物，也可采用三色荧光颗粒与三种适配体进行三种目标物的同时检测，在环境监测及食品分析等方面具有十分重要的意义。
附图说明
图1为上转换颗粒-适配体侧流试纸的结构示意图；
图2为本发明实施例1Hg2+的检测结果；其中，(a)为测定Hg2+离子的荧光侧流试纸条；(b)为Hg2+离子浓度对数值与对应的检测线的灰度值标准曲线；(c)为该检测探针的特异性；
图3为本发明实施例2赭曲霉毒素A的检测结果；其中，(a)为测定赭曲霉毒素A的荧光侧流试纸条；(b)为赭曲霉毒素A浓度对数值与对应的检测线的灰度值标准曲线；(c)为该检测探针的特异性；
图4为本发明实施例3沙门氏菌的检测结果；其中，(a)为测定沙门氏菌的荧光侧流试纸条；(b)为沙门氏菌浓度对数值与对应的检测线的灰度值标准曲线；(c)为该检测探针的特异性。
图5为本发明实施例4同时测定Hg2+离子、赭曲霉毒素A、沙门氏菌的荧光侧流试纸条结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开的基于上转换荧光适配体的侧流试纸检测方法，包括以下步骤：
1)分别将NaOH、NH4F、YCl3以及稀土激活剂的氯化物、稀土敏化剂的氯化物加入有机溶剂中，加热至280～290℃，保温反应0.5～3小时，制得稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒；(具体制备过程，可以参考中国专利：ZL20131 0439588.6)。
2)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土掺杂上转换荧光纳米粒进行水溶性修饰；
3)选择生化方法合成目标物适配子及与适配子碱基互补配对的cDNA单链；
4)采用缩合反应，完成cDNA单链在经步骤2)水溶性修饰后的稀土掺杂上转换荧光纳米粒表面的再次修饰，得到上转换荧光探针；
5)采用生物素-链霉素反应，将生物素修饰的cDNA单链以点状固定于在NC膜表面形成检测线。
6)将步骤4)按比例溶解在标准缓冲液中(Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)，SSC(8×),Tween 20(2％v/v),BSA(16％w/v))，并取20μL烘干在步骤5)所得侧流试纸的结合垫上。
7)制备已知浓度的检测体系，用步骤6)制备好的侧流试纸检测，经过30分钟反应，用相机测定980nm激发下检测线的照片，分析其灰度值并绘制标准曲线；
8)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值：制备样品检测体系：取目标物加入自来水中，按上述步骤加入探针进行检测，根据测得的待测样品灰度值，查目标浓度对数值与对应的荧光值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。
所述稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒为掺杂镧系金属的上转换荧光纳米粒，且该上转换荧光纳米粒中包含了NaYF4、Er、Yb或Tm。
所述稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒采用热分解法制得，具体操作为：分别将NaOH、NH4F、YCl3、稀土激活剂的氯化物以及稀土敏化剂的氯化物加入有机溶剂中，加热至280～290℃，保温反应0.5～3小时，制得稀土掺杂上转换荧光纳米粒。
步骤7)中，制备已知浓度的检测体系，得到不同浓度的目标液，具体操作是：对于细菌，将1-3mL目标细菌接种于200-500mL LB培养基中，35-37℃180-200rpm培养26-32h后，采用平板计数法计算每毫升目标细菌数目：按比例梯度稀释成1-106cfu/mL不同浓度菌液保存。对于毒素及重金属离子，配置不同浓度梯度的目标液。
步骤7)中，绘制标准曲线的具体操作是：分别将不同浓度的目标液与上转换荧光探针混合，并流过步骤5)中制备的侧流试纸。经过30分钟反应，将检测线的荧光转化成灰度值，并将灰度值与加入的目标物浓度一一对应绘制曲线。
步骤8)中，制备样品检测体系的具体操作是：取不同浓度的样品加入自来水中，加入检测探针进行检测，根据测得的待测样品荧光恢复值，查目标物浓度对数值与对应的灰度值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。
参见图1，是上转换颗粒-适配体侧流试纸的结构图。
实施例1
下面以Hg2+的检测为例，说明本发明方法的效果，具体实验过程，包括以下步骤：
1)将YCl3·6H2O(267.0mg,0.88mmol),TmCl3·6H2O(7.7mg,0.02mmol),ErCl3·6H2O(38.2mg,0.1mmol)溶入2mL去离子水中，并加入7.5mL油酸和15mL十八烯在室温下搅拌30分钟之后缓慢加热到120℃，恒温1小时再加热到156℃恒温1小时，后在氩气保护下脱水并冷却到室温。加入溶有NH4F(148.15mg,4mmol)和NaOH(100mg,2.5mmol)的甲醇10mL在室温下搅拌2小时。待甲醇挥发后加热溶液至280℃恒温1.5小时后冷却到室温。使用乙醇和环己烷清洗3～5次，在环己烷中保存，获得粒径35nm的β-NaYF4:Er/Tm；
2)混合14.5μL聚丙乙烯，1mL乙醇和1mL分散到氯仿中的稀土掺杂上转换荧光纳米粒(15mg/ml)，并经过过夜搅拌。以10000转/分钟的速度离心并洗涤2-3次，得到包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒；
3)采用Hg2+为目标物，选取由西安生工合成的特异性适配体，其序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGTCATGTTTGTTTGTTGGCCCCCCTTCTTTCTTA-3’；
4)将1mL步骤(2)制备的包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒以10000rpm离心并重悬在MES溶液中，加入120μL 2mg/mL的EDC以及60μL 2mg/mL的硫化NHS在37℃下孵育2小时，然后加入步骤3)的适配体后静置过夜，清洗3次后保存在PBS中；
5)选择由西安生工合成的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CCAACAAACAAA-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
6)将步骤5)中的cDNA序列与链霉亲和素结合并配成100μM浓度静置一小时获得检测线探针和对照线探针；
7)将步骤6)中的检测线探针和对照线探针以0.3μL的体积滴加在侧流试纸的NC膜上；
8)配置标准缓冲液：Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)，SSC(8×),Tween 20(2％v/v),BSA(16％w/v)；
9)取2μL步骤4)制备的探针溶解20μL在步骤8)制备的标准缓冲液中，并滴加在结合垫上以37℃烘干。
10)制备已知浓度的检测体系，配成1-100000ppb的梯度浓度，取80μL目标物溶液与步骤9)中制备好的侧流试纸反应，静置30分钟；参见图2中(a)，加入目标物会导致目标物结合适配体从而减少上转换颗粒在检测线的结合，因此随着目标物浓度的增加，检测线上亮度减小，根据目标物浓度和灰度值的关系绘制标准曲线，标准曲线见图2中(b)，检测范围在10-10000ppb。
11)对检测体系特异性的检验：在步骤9)制备的侧流试纸上加入Pb2+、Cu2+、Fe2+、卡那霉素、黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素、三聚氰胺、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、芽孢杆菌、沙门氏菌。检测结果参见图2中(c)，可以看出，该检测系统只对目标Hg2+具有强烈反应。
12)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值：制备样品检测体系：取80μL目标物滴加在步骤9)制备的侧流试纸结合垫上反应30分钟，在980nm激发光下拍照并分析检测线的灰度值，查Hg2+浓度的对数值与对应的荧光恢复值标准曲线，即求得样品中Hg2+的含量。
实施例2
下面以赭曲霉毒素A的检测为例，说明本发明方法的效果，具体实验过程，包括以下步骤：
1)将YCl3·6H2O(242.69mg,0.8mmol),ErCl3·6H2O(7.64mg,0.02mmol)andYbCl3·6H2O(69.75mg,0.18mmol)溶入2mL去离子水中，并加入7.5mL油酸和15mL十八烯在室温下搅拌30分钟之后缓慢加热到120℃恒温1小时再加热到156℃恒温1小时，后在氩气保护下脱水并冷却到室温。加入溶有NH4F(148.15mg,4mmol)和NaOH(100mg,2.5mmol)的甲醇10mL在室温下搅拌2小时。待甲醇挥发后加热溶液至280℃恒温1.5小时后冷却到室温。使用乙醇和环己烷清洗3-5次，在环己烷中保存，获得粒径45nm的β-NaYF4:Yb/Er；
2)混合14.5μL聚丙乙烯，1mL乙醇和1mL分散到氯仿中的稀土掺杂上转换荧光纳米粒(15mg/ml)，并经过过夜搅拌。以10000转/分钟的速度离心并洗涤2-3次，得到包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒；
3)采用赭曲霉毒素A为目标物，选取由西安生工合成的特异性适配体，其序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；
4)将1mL步骤2)制备的包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒以10000rpm离心并重悬在MES溶液中，加入120μL 2mg/mL的EDC以及60μL2mg/mL的硫化NHS在37℃下孵育2小时，然后加入步骤3)的适配体后静置过夜，清洗3次后保存在PBS中；
5)选择由西安生工合成的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CCCACACCCGAT-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
6)将步骤5)中的cDNA序列与链霉亲和素结合并配成100μM浓度静置1小时获得检测线探针和对照线探针；
7)将步骤6)中的检测线探针和对照线探针以0.3μL的体积滴加在侧流试纸的NC膜上；
8)配置标准缓冲液：Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)，SSC(8×),Tween 20(2％v/v),BSA(16％w/v)；
9)取0.2μL步骤4)制备的探针溶解20μL在步骤8)制备的标准缓冲液中，并滴加在结合垫上以37℃烘干。
10)制备已知浓度的检测体系，配成0.01-100ng/mL的梯度浓度，取80μL目标物溶液与步骤9)中制备好的侧流试纸反应，静置30分钟；结果参见图3中(a)，加入目标物会导致目标物结合适配体从而减少上转换颗粒在检测线的结合，因此随着目标物浓度的增加，检测线上亮度减小，根据目标物浓度和灰度值的关系绘制标准曲线，标准曲线见图3中(b)，检测范围在0.01-50ng/mL。
11)对检测体系特异性的检验：在步骤9)制备的侧流试纸上加入Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+、卡那霉素、黄曲霉毒素b1、三聚氰胺、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、芽孢杆菌、沙门氏菌。检测结果参见图3中(c)，显示该检测系统只对目标赭曲霉毒素A具有强烈反应。
12)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值：制备样品检测体系：取80μL目标物滴加在步骤9)制备的侧流试纸结合垫上反应30分钟，在980nm激发光下拍照并分析检测线的灰度值，查赭曲霉毒素A浓度的对数值与对应的荧光恢复值标准曲线，即求得样品中赭曲霉毒素A的含量。
实施例3
下面以沙门氏菌的检测为例，说明本发明方法的效果，具体实验过程，包括以下步骤：
1)将YCl3·6H2O(210.8mg,0.695mmol),YbCl3·6H2O(116.2mg,0.30mmol),andTmCl3·6H2O(1.9mg,0.005mmol).溶入2mL去离子水中，并加入7.5mL油酸和15mL十八烯在室温下搅拌30分钟之后缓慢加热到120℃恒温1小时再加热到156℃恒温1小时，后在氩气保护下脱水并冷却到室温。加入溶有NH4F(148.15mg,4mmol)和NaOH(100mg,2.5mmol)的甲醇10mL在室温下搅拌2小时。待甲醇挥发后加热溶液至280℃恒温1.5小时后冷却到室温。使用乙醇和环己烷清洗3-5次，在环己烷中保存，获得粒径45nm的β-NaYF4:Yb/Tm；
2)混合14.5μL聚丙乙烯，1mL乙醇和1mL分散到氯仿中的稀土掺杂上转换荧光纳米粒(15mg/ml)，并经过过夜搅拌。以10000转/分钟的速度离心并洗涤2-3次，得到包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒；
3)采用沙门氏菌为目标物，选取由西安生工合成的特异性适配体，其序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’；
4)将1mL步骤2)制备的包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米粒以10000rpm离心并重悬在MES溶液中，加入120μL 2mg/mL的EDC以及60μL2mg/mL的硫化NHS在37℃下孵育2小时，然后加入步骤3)的适配体后静置过夜，清洗3次后保存在PBS中；
5)选择由西安生工合成的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CTGTCATAATGTCAAG-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
6)将步骤5)中的cDNA序列与链霉亲和素结合并配成100μM浓度静置一小时获得检测线探针和对照线探针；
7)将步骤6)中的检测线探针和对照线探针以0.3μL的体积滴加在侧流试纸的NC膜上；
8)配置标准缓冲液：Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)，SSC(8×),Tween 20(2％v/v),BSA(16％w/v)；
9)取1.2μL步骤4)制备的探针溶解20μL在步骤8)制备的标准缓冲液中，并滴加在结合垫上以37℃烘干。
10)制备已知浓度的检测体系，配成10-10000cfu/mL的梯度浓度，取80μL目标物溶液与步骤9)中制备好的侧流试纸反应，静置30分钟；结果参见图4中(a)，加入目标物会导致目标物结合适配体从而减少上转换颗粒在检测线的结合，因此随着目标物浓度的增加检测线上亮度减小，根据目标物浓度和灰度值的关系绘制标准曲线，标准曲线见图4中(b)，检测范围在150-2000ng/mL。
11)对检测体系特异性的检验：在步骤9)制备的侧流试纸上加入Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+、卡那霉素、黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素、三聚氰胺、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、芽孢杆菌。检测结果参见图4中(c)，显示该检测系统只对目标沙门氏菌具有强烈反应。
12)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值：制备样品检测体系：取80μL目标物滴加在步骤9)制备的侧流试纸结合垫上反应30分钟，在980nm激发光下拍照并分析检测线的灰度值，查沙门氏菌浓度的对数值与对应的荧光恢复值标准曲线，即求得样品中沙门氏菌的含量。
实施例4
下面以同时检测Hg2+、赭曲霉毒素A、沙门氏菌的检测为例，说明本发明方法的多目标物检测效果，具体实验过程，包括以下步骤：
1)将以上三个实施例的检测线探针0.3μL的体积滴加在同一侧流试纸的NC膜上；
2)将以上三个实施例中的上转换荧光探针按红：绿：蓝：标准缓冲液＝2:0.2:1.2:20μL的比例混合并烘干在侧流试纸上。
3)制备已知浓度的检测体系，配成Hg2+、赭曲霉毒素A、沙门氏菌混合溶液，取80μL掺杂不同目标物溶液与步骤9)中制备好的侧流试纸反应，静置30分钟；参见图5，加入对应目标物会导致相对应的上转换颗粒在检测线的结合减少，因此随着目标物浓度的增加，对应检测线上亮度减小。
综上所述，通过上述实施例，可以看出，本发明方法灵敏度高，特异性强，操作简便，可通过适配子序列的更换测定各种试样并能实现三种目标物的同时检测，在环境监测及食品安全分析等方面具有十分重要的意义。
Figure IDA0001619192080000011
Figure IDA0001619192080000021
Figure IDA0001619192080000031

Claims (3)

1.一种基于上转换荧光适配体同时检测三种目标物的侧流试纸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用热分解法分别制备用于检测Hg2+的粒径为35nm的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒β-NaYF4:Er/Tm，用于检测赭曲霉毒素A的粒径为45nm的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒β-NaYF4:Yb/Er，以及用于检测沙门氏菌的粒径为45nm的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒β-NaYF4:Yb/Tm；
2)采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸分别对步骤1)制得的三种稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒进行水溶性修饰，获得水溶性修饰后的包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒；
3)合成待检测目标的适配子及与该适配子碱基互补配对的cDNA单链；
所述待检测目标包括Hg2+、赭曲霉毒素A和沙门氏菌；
其中，合成的Hg2+的特异性适配体的序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGTCATGTTTGTTTGTTGGCCCCCCTTCTTTCTTA-3’；
合成的Hg2+的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CCAACAAACAAA-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
合成的赭曲霉毒素A的特异性适配体的序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；
合成的赭曲霉毒素A的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CCCACACCCGAT-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
合成的沙门氏菌的特异性适配体的序列为：
5’-GCTGAGTCTGAGTCGTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGA CATTATGACAG-3’；
合成的沙门氏菌的cDNA，其序列分别为：
检测线5’-CTGTCATAATGTCAAG-3’；
对照线5’-CGACTCAGACTCAGC-3’；
4)采用缩合反应，分别将上述Hg2+、赭曲霉毒素A和沙门氏菌的适配子在步骤2)制得的水溶性修饰后的包裹聚丙烯酸的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒的表面进行再次修饰，制得三种目标物的上转换荧光探针；
5)采用生物素-链霉素反应，将生物素修饰的cDNA单链以点状固定于侧流试纸的NC膜表面形成检测线；
6)将步骤4)制得的三种目标物的上转换荧光探针按红：绿：蓝：标准缓冲液＝2:0.2:1.2:20的比例溶解在标准缓冲液中后，滴加在步骤5)制得的同一侧流试纸的结合垫上，烘干备用；
7)制备已知浓度的检测体系，用步骤6)制备好的侧流试纸检测，反应30min，用相机测定980nm激发下检测线的照片，分析其灰度值并绘制标准曲线；
8)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值，检查目标浓度对数值与对应的荧光值标准曲线，求得样品中目标物的数量；
当不存在目标物时，上转换荧光探针将直接通过碱基互补配对与检测线上的cDNA单链序列结合；
当存在目标物时，目标物将竞争性的结合上转换荧光探针上的适配体序列，导致与检测线上cDNA单链序列结合的上转换荧光探针变少，从而检测线上的信号减弱。
2.根据权利要求1所述的基于上转换荧光适配体同时检测三种目标物的侧流试纸检测方法，其特征在于，步骤7)中，绘制标准曲线的具体操作是：分别将不同浓度的目标液与上转换荧光探针混合，并流过步骤5)制得的侧流试纸上，反应30min，检测线的荧光转化成灰度值，并将该灰度值与加入的目标物浓度一一对应绘制得到标准曲线。
3.根据权利要求1所述的基于上转换荧光适配体同时检测三种目标物的侧流试纸检测方法，其特征在于，步骤8)中，制备样品检测体系的具体操作是：取不同浓度的样品加入自来水中，加入上转换荧光探针进行检测，根据测得的待测样品荧光灰度值，检查目标物浓度对数值与对应的灰度值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。
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