CN103940792B - 一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法。通过将三种荧光光谱可辨的上转换材料分别与金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌核酸适配体连接形成多色上转换荧光纳米探针，再通过碱基配对与适配体互补寡核苷酸单链修饰的磁性纳米粒子形成纳米复合物。当检测体系中存在被测菌时，致病菌特异性与对应的适配体结合从而使双链解链，通过监控477nm、550nm和660nm三处上转换荧光信号强度，能够同时定量检测金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌，检测线性范围均为50-1×10⁶cfu/mL，检出限分别为25，10，15cfu/mL。本发明用于致病菌检测具有灵敏度高、快速简便的优点。该方法应用于牛奶和虾肉等食品中三种致病菌的检测，结果准确可靠。

Description

一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法

技术领域

一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌进行检测。

背景技术

食源性致病菌是重要的食品危害物质之一，其存活繁殖能力强、易传播，极大的危害人类的生命健康安全。如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等都会通过食物感染人体引发疾病。更为重要的是，在食品中往往会同时存在多种食源性致病菌，虽然各自含量不高，但同样会导致食源性疾病发生。因此需要研究出灵敏度高、特异性好的检测方法能够同时检测多种共存的致病菌。目前传统的平板计数法检测需要经历一个长时间的增菌富集过程，而不同种细菌各自的生长情况不同，因此同样的增菌条件和时间会导致很大的差异。另外，从分子检测方法来看，聚合酶链式反应(PCR)可以同时检测5到7种细菌，然而同样需要增菌和PCR扩增环节，并且需要提取细菌DNA用于检测，是一种间接检测方法不利于开展现场即时检测。近年来，基于荧光免疫分析法构建的致病菌检测方法较为多见，主要是将荧光标记物负载到致病菌的抗体上，通过免疫识别原理结合对应的致病菌，以荧光信号的强度类定量致病菌数量。荧光免疫分析法的性能主要依赖于信号标记物的荧光强度以及识别分子的特异性和稳定性。目前作为标记物的荧光基团种类很多，包括传统的荧光染料、量子点和其他多种荧光纳米材料。但大多数荧光染料性质不稳定易于被光漂白，影响检测灵敏度，而量子点和其他荧光纳米材料虽然改善了荧光淬灭现象，但基于其激发光仍然在紫外-可见光区，因此被测生物样品同样会被激发，荧光背景值高，检测灵敏度仍受到影响。并且由于发射峰宽大导致发射峰互相重叠制约了这些材料在多种致病菌同时标记检测中的应用前景。

上转换荧光纳米材料(UpconversionNanoparticles)就因具有特殊的光学性能而越来越受到关注。上转换发光机理是基于双光子或多光子机制将长波长的激发光转换成短波长的发射光的过程，是一种把红外光转变成为可见光的有效途径。因此相对于传统有机荧光染料和其他荧光纳米材料，上转换材料作为完全惰性的无机发光材料具有明显的优势和极大的应用潜能：首先，由于上转换材料是在基质中掺杂某些特定稀土元素制备而成的，因此在自然界中不存在天然的上转换发光现象，利用红外激光(如980nm)激发上转换荧光纳米材料，可以在可见光区得到唯一的上转换荧光发射，而不会引起其他荧光干扰，因此能够提高信噪比，建立更灵敏的激光诱导上转换荧光检测方法。第二，上转换荧光独特的发光过程主要集中于基质材料中，基本不受外界环境(如湿度、酸度等)和被测物样品的影响，因此上转换荧光材料特别合适作为复杂生物样本中的荧光标记物。第三，上转换材料光化学性质稳定，不易被光漂白，在受强光或激发光长时间照射下仍保持很高的光学稳定性。第四，可以通过改变掺杂元素的种类和比例来调节上转换发光光谱，在固定同一激发波长激发下得到发射光谱不同的上转换荧光，真正实现了单激发多谱带发射，从而有利于上转换材料在生物体系多组分同时检测中的应用。

另一方面，从识别分子的研究来看，核酸适配体(Aptamer)是从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的一簇DNA或RNA片段。这种寡核苷酸序列形成的高级结构具有能识别与之相对应的任何类型的蛋白和小分子的靶物质，并与靶物质有高亲和力而形成靶物质—适配子的复合物。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用和长期保存的优点，并且核酸适配体作为识别分子在蛋白质研究、药物检测、医学诊断和食品安全等方面得到了广泛应用。

因此本发明利用筛选得到的金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的适配体作为识别分子，同时制备得到三种荧光光谱可分辨的稀土元素掺杂上转换荧光纳米粒子，将其分别于三种适配体结合形成多色上转换荧光纳米探针，以980nm红外激光诱导上转换荧光为检测信号，结合磁分离富集效应，同时定量检测三种食源性致病菌，建立标准曲线。该发明可以用于果蔬、乳制品、肉制品等食品中金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的同时检测。

发明内容

一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法：首先，将经过表面改性的三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子分别于金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的核酸适配体偶联，同时三种致病菌适配体的互补寡核苷酸单链与Fe₃0₄磁性纳米粒子连接。随后，通过碱基配对双链杂交将适配体修饰的上转换纳米粒子与互补短链修饰的磁性纳米粒子连接，形成上转换—磁珠纳米复合物。利用980nm激光激发纳米复合物，由于三种上转换荧光粒子的光谱可以完全区分因此可以得到三组上转换荧光发射峰，记录此时的荧光强度。第三，在检测体系中加入三种被测致病菌，由于致病菌会优先与对应的适配体结合并改变适配体的空间构象导致互补短链与适配体解离，从而使部分上转换—磁珠纳米复合物分解，此时再通过外界磁场分离，洗去脱落的上转换荧光纳米粒子后利用980nm激发收集得到的剩余纳米复合物，同样分别记录三组上转换荧光强度。在一定范围内，被测致病菌的数量与上转换荧光信号减小的趋势呈正相关，对照相应的荧光发射峰建立标准曲线，以此现象实现同时定量检测金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的目的。

具体操作步骤如下：

1.利用溶剂热技术，在乙醇(10mL)—水(9mL)—油酸(20mL)的反应体系下，加入1.2gNaOH搅拌混匀。制备不同稀土元素(Tm、Ho、Er)掺杂的上转换荧光纳米粒子，向体系中分别逐滴加入不同比例的镧系元素硝酸盐溶液混合均匀，随后再逐滴加入4mmoL的NaF溶液，反应液逐渐成粘稠状继续搅拌15分钟后转移入四氟乙烯高温反应釜，在190℃下反应12小时。反应结束后冷却至室温利用乙醇多次清洗，离心得到油酸包覆的上转换荧光纳米粒子。由于掺杂稀土元素不同因此得到三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子。

2.将0.5g聚丙烯酸加入到10mL二乙二醇中加热完全溶解，随后向其中加入2mL甲苯溶解的油酸包覆的上转换荧光纳米粒子，在240℃下反应2小时，反应结束后离心清洗得到表面羧基修饰的亲水性上转换荧光纳米粒子。

3.分别取三种羧基化的上转换荧光纳米粒子各10mg与1μmoL氨基化的致病菌适配体在EDC/NHS作用下，利用缩合反应，偶联形成三种适配体修饰的上转换荧光纳米探针；同样地，制备适配体互补短链修饰的Fe₃0₄磁性纳米粒子探针。

4.在杂交缓冲液中，通过碱基互补配对，三条适配体与各自互补短链杂交，形成上转换—磁珠复合纳米材料。通过外加磁性分离后在980nm激光激发下Tm、Ho、Er掺杂的三种上转换材料分别在477nm、550nm和660nm处得到荧光发射峰，记录此时三组荧光发射峰的荧光强度。

5.在上转换—磁珠复合纳米材料的反应体系中，同时加入被测物金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌，经过30分钟孵育，由于致病菌特异性与对应的适配体结合，改变其空间构象，使得原本适配体—互补链的双链结构解链，从而导致部分上转换粒子和磁性纳米粒子脱离，随后利用外界磁珠再次分离，洗去溶液中游离态的上转换粒子，再通过980nm激光激发此时剩余的上转换—磁珠复合纳米材料，随着加入三种被测致病菌的数量增多，三种上转换粒子对应的三处荧光发射峰强度逐步减小。因此根据荧光差值与对应的三种菌浓度建立标准曲线。

6.对实际食品样品—牛奶和虾肉中含有的金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌进行同时检测。对样品做简单处理，随后直接加入到上述反应体系中孵育，通过磁分离后根据在980nm激光激发下477nm、550nm和660nm三处的上转换荧光信号，从标准曲线中求得对应的三种致病菌的浓度。

利用多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法有益效果：

1.本发明采用适配体对三种食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌)进行特异性识别结合，提高了检测方法的准确性和稳定性。

2.本发明利用激光诱导上转换荧光发射，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。

3.本发明利用三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子作为标记物，在980nm激发下得到三组荧光发射峰，通过监测三处发射峰荧光强度的变化可以准确定量金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌浓度，实现多组分致病菌同时检测。

附图说明

图1，基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌方法的原理图。

图2，980nm激发下上转换荧光纳米粒子荧光发射光谱图：NaYF₄:Yb，Tm上转换纳米粒子，发射峰位于477nm(a)；NaYF₄:Yb，Ho上转换纳米粒子，发射峰位于550nm(b)；NaYF₄:Yb，Er/Mn上转换纳米粒子，发射峰位于660nm(c)；上述三种上转换荧光纳米粒子混合后激发，得到三组可分辨的发射峰(d)。

图3，上转换纳米粒子电镜图：油酸分子包覆的上转换粒子在环己烷中(a)分散；羧基化修饰的上转换粒子在水溶液中分散(b)。

图4，三组上转换荧光发射峰强度随三种致病菌浓度变化叠加图(a)；金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌检测标准曲线图(b)。

图5，本发明方法用于其他多种致病菌检测对照实验结果图。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实施例1：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌标准检测曲线的建立

分别取200μL三种致病菌适配体功能化的上转换荧光纳米粒子，与对应互补链修饰的磁性纳米粒子在37℃下孵育半小时，通过碱基互补构成三对上转换—磁珠纳米复合物。通过磁场分离洗去未结合的上转换纳米粒子，利用980nm光源激发记录此时477nm、550nm和660nm三处的上转换荧光强度。随后加入不同浓度的三种致病菌，浓度范围从1cfu/mL到1×10⁸cfumL。在37℃下再孵育半小时，磁场分离后洗去脱落的上转换纳米粒子，再次测定剩余纳米复合物的荧光强度，建立荧光减小值与致病菌浓度之间的线性关系和最低检出限，见下表：

表一：多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌方法的性能分析

说明本发明方法灵敏度高，稳定性好，最大的优势在于能够同时检测体系中三种食源性致病菌，结果相互不干扰。

实施例2：牛奶实际样品中三种致病菌同时检测

从当地超市购买4种无菌牛奶，向其中分别加入浓度范围在1×10²cfu/mL到1×10⁵cfu/mL的三种致病菌。分别取5mL牛奶在10℃下7000转/分离心10分钟，后将上层乳脂去除，再经过20倍稀释，静止后用超细玻璃纤维过滤纸过滤，直收集滤液备用。利用本发现方法检测牛奶中三种致病菌浓度方法与实施例1类似，记录980nm激发得到的477nm、550nm和660nm三处的上转换荧光强度，利用致病菌与荧光强度的线性方程，得到三种致病菌的浓度，结果见下表：

表二：牛奶实际样品中三种致病菌的检测结果

说明本发明能够适用于液态食品基质中三种致病菌的同时检测，且结果准确可靠。

实施例3：虾肉实际样品中三种致病菌同时检测

从当地超市购买4种冷冻虾肉，解冻后分别称取25g虾肉浸泡在225mL含有3％NaCl的碱性蛋白胨中，其中分别加入浓度范围在1×10²cfu/mL到1×10⁵cfu/mL的三种致病菌混合均匀。样品静止30分钟后离心，上清液用超细玻璃纤维过滤纸过滤，直收集滤液备用。利用本发现方法检测虾肉中三种致病菌浓度方法与实施例1类似，记录980nm激发得到的477nm、550nm和660nm三处的上转换荧光强度，利用致病菌与荧光强度的线性方程，得到三种致病菌的浓度，结果见下表：

表三：虾肉实际样品中三种致病菌的检测结果

说明本发明能够适用于固态食品基质中三种致病菌的同时检测，且结果准确可靠。

Claims (3)

1.一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法，其特征在于：将金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌三种致病菌适配体分别与NaYF₄：Yb，Tm、NaYF₄：Yb，Ho、NaYF₄：Yb，Er/Mn三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子偶联形成三种荧光纳米探针，同时金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌三种致病菌适配体的互补寡核苷酸单链与Fe₃O₄磁性纳米粒子连接，通过双链杂交形成三组上转换-磁珠纳米复合物，利用980nm激光激发纳米复合物，记录此时的三组荧光发射峰强度，在检测体系中加入金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌三种被测致病菌，由于致病菌会优先与对应的适配体结合并改变适配体的空间构象导致互补短链与适配体解离，从而使部分上转换-磁珠纳米复合物分解，利用980nm激发收集得到的剩余纳米复合物，同样分别记录NaYF₄：Yb，Tm、NaYF₄：Yb，Ho、NaYF₄：Yb，Er/Mn三组上转换荧光纳米粒子的荧光强度，在一定范围内，被测致病菌的数量与上转换荧光信号减小的趋势呈正相关，对照相应的荧光发射峰建立标准曲线，以达到对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌三种致病菌同时定量检测的目的。

2.如权利要求1所述的一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法，其特征在于：三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子分别为NaYF₄：Yb，Tm上转换荧光纳米粒子，NaYF₄：Yb，Ho上转换荧光纳米粒子和NaYF₄：Yb，Er/Mn上转换荧光纳米粒子，三种上转换荧光纳米粒子在980nm激发下的荧光发射峰分别在477nm、550nm和660nm处。

3.如权利要求1所述的一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法，其特征在于：三种致病菌适配体分别与三种荧光光谱可辨的上转换荧光纳米粒子偶联，其结合配对关系为：金黄色葡萄球菌适配体与NaYF₄：Yb，Tm上转换荧光纳米粒子偶联，副溶血性弧菌适配体与NaYF₄：Yb，Ho上转换荧光纳米粒子偶联，以及沙门氏菌适配体与NaYF₄：Yb，Er/Mn上转换荧光纳米粒子偶联。