CN107045061B - 基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒 - Google Patents
基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；利用本发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒。
背景技术
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一种嗜盐性弧菌，存在于近海的海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海产品或盐腌渍品中，它是我国沿海地区最为常见的一种食源性致病菌。其引起的食物中毒，主要引起急性胃肠炎甚至败血症。近年来由副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经超过沙门氏菌，跃居微生物食源性疾病病原菌第一位，成为我国首要的食源性致病菌。因而，加强对食品中副溶血性弧菌的快速准确的检测技术研究十分必要。
目前对副溶血性弧菌的检测方法，主要有传统分离培养及鉴定法、免疫学方法及基于PCR的分子生物学方法等。分离培养及鉴定法是检测副溶血弧菌的标准检验方法，它包括前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程。该方法检测结果相对可靠，但存在分离细菌操作步骤复杂、检测时间长等缺点，难以满足当今社会对食源性致病菌快速检测的需要。免疫学方法是基于抗原和抗体特异反应的原理而进行的一种检测方法，具有操作简便、快速等优点，但其检测灵敏性及特异性易受抗体吸附能力和抗体特异性以及基质背景干扰等因素的影响，同时存在交叉反应，检测结果准确性受限。以 PCR 为基础的定性、定量分析方法是目前应用较为广泛的分子生物学检测方法，该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，虽然可以满足快速检测的要求，但操作过程中易出现交叉污染和错误信号的放大等缺点，造成假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性。PCR应用要求有严格的实验室分区、实验室管理和质量控制措施，对设备和操作人员的要求较高，不利于在基层日常的检测工作中普及和应用。此外，由于食品中副溶血性弧菌的检测，通常需要较复杂的样本处理及长时间的预增菌过程，尤其在病原菌含量较低情况下难于检出。因此，采用一种有效的样品前富集技术，建立一种快速、简便、灵敏度高、特异性强的副溶血性弧菌检测方法，对加强食源性疾病的预防和控制具有重要意义。
近年来，一些新的病原体检测技术迅速发展起来，并逐渐应用于卫生检验工作中。免疫磁珠分离 (Immunomagnetic Separation，IMS) 技术是将免疫学反应与微球的磁性相结合的一种免疫学技术，它可将富集、分离融为一体，在免疫学检测、细胞分离、蛋白质纯化等方面有广泛应用，具有操作简便、快速、高效等优点。在食源性致病菌的检测方面，IMS法有效结合抗原-抗体反应的特异性和磁珠的磁场响应性，可实现从复杂基质中对目标菌的快速分离和富集，能够有效消除基质干扰，从而提高检测效率，是有效的样品前处理方法，具有较好的开发应用前景。鸡卵黄抗体（IgY）是通过免疫注射产蛋鸡，从鸡蛋中分离出的抗体，制备技术方法简单，制备的抗体产量高且性质稳定，可以弥补单克隆抗体制备繁琐、抗体产量低等缺点，在微生物检测和疾病治疗等方面已广泛应用。因此，在获得理想效价及高特异性的IgY抗体的基础上，将其应用于免疫学方法检测食品中的VP，可有效缩短检测时间、提高方法准确性。量子点( quantum dots，QDs) 是一种新型的半导体纳米材料，具有较好的光化学特性和光谱特性，作为一种新型的标记材料，与传统的荧光染料相比，具有荧光寿命长，激发光谱宽，发射光谱窄，对称性好，易于合成和生物修饰等特点，使量子点作为荧光探针在分析化学、卫生检测等领域得到了广泛的应用。本研究拟联合利用免疫磁珠分离技术、鸡卵黄抗体技术和量子点荧光标记技术，依据抗原抗体特异性反应的原理，通过免疫磁珠上的抗体与样品中目标菌的特异性结合，从样品中富集分离出目标菌，再利用制备的量子点纳米荧光生物探针进行标记，得到磁珠-细菌抗原-量子点“三明治”复合物，通过对复合物的量子点荧光强度进行检测，从而实现对目标菌的快速、定量的检测。
发明内容
本发明的目的在于为解决针对现有副溶血性弧菌检测方法存在的问题，而提供了一种基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒。
基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；
所述的兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG的蛋白浓度为1mg/mL；
所述的副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY是以副溶血性弧菌全菌为抗原，经灭活后，免疫SPF级健康高产蛋鸡，采用PEG6000法对所述的免疫后鸡蛋中的卵黄抗体IgY进行纯化；蛋白浓度为1mg/mL；
所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是由下述方法制备的：
①取羧基化磁珠100 μL至1.5 mL离心管中，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，加入MEST缓冲溶液400μL清洗3次；所述MEST缓冲液各成分含量如下：0.1mol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，0.5 mL/L吐温-20；所述的MEST缓冲液pH为 5.0；
②依次加入浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亚胺盐酸盐MEST缓冲液的溶液200μL， 浓度为10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺MEST缓冲液的溶液200μL，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；反应结束后用PBST清洗3遍；所述的PBST缓冲液各成分：8gNaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，0.5 mL/L Tween-20；所述的PBST缓冲液pH为7.4；
③活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBST缓冲液稀释的副溶血性弧菌兔多克隆抗体IgG孵育2h漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下反应2 h；偶联反应结束后，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，400 μL PBST溶液清洗3遍，加入1 mL 1%的BSA封闭；封闭结束后，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用400μL uLPBS缓冲液洗涤3遍后， 重悬于400 μL的PBS溶液中，4 ℃保存；所述的PBS缓冲液各成分含量如下：8g NaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4；所述的PBS缓冲液pH为7.4；
所述的量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针由下述方法制备的：取10 uL羧基化的荧光量子点于1.5 mL棕色进样瓶中，加入用MEST缓冲液配制的5mg/mL EDC和5mg/mL NHS各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；活化结束后将溶液转移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min；弃去上清并用PBST清洗1遍，活化后的量子点重悬于400μL的PBST中；加入副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY 120μg，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下避光反应2 h；将量子点溶液移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；加入1mL 1%的BSA，涡旋混匀后利用垂直混合仪在25℃下继续避光孵育1h进行封闭；封闭结束后，将量子点溶液转移至1.5 mL的EP管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存；
所述的基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，还包括阴性质控品、阴性质控品，所述的阳性质控品为含有灭活的副溶血性弧菌的PBS溶液；所述阴性质控品为无菌PBS溶液。
本发明提供了基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针； 所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；利用本发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。
附图说明
图1 免疫磁珠最佳加入量结果；
图2为免疫磁珠富集时间的确定结果；
图3量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记时间的确定结果；
图4量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记量的确定结果；
图5检测方法的检出限确定结果；
图6检测方法的特异性结果；
图7 模拟样检测结果。
具体实施方式
本发明是根据免疫学中的抗体抗原特异性反应原理，利用免疫磁珠对样品的可富集性、分离的速度快、效率高等优点，结合量子点荧光标记技术，建立的一种具备多重信号放大、灵敏度高、特异性好、简便快速检测副溶血性弧菌的方法，具有较好的市场应用前景。
下面将结合附图，对本发明的实施例进行具体的描述。实施中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1 副溶血性弧菌兔克隆抗体IgG的制备
取浓度为1×109 CFU·mL-1灭活菌液与等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂乳化完全，制备灭活疫苗。首次免疫取浓度为1×109 CFU·mL-1弗氏完全佐剂疫苗免疫健康新西兰大白兔（由吉林大学基础医学院实验动物中心提供），采用背部皮下多点注射法，每只免疫2 mL，在第二周、第三周采用同等剂量的弗氏不完全佐剂疫苗对兔进行第二次免疫、第三次免疫。10天后，用灭活菌液加强免疫两次。每次免疫前兔耳缘静脉取血，测定血清效价。达到分离标准，兔心脏采血，分离血清，得到抗副溶血性弧菌的抗血清。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法对所述的抗血清中的多克隆抗体IgG进行纯化；采用间接ELISA法对纯化后抗体的效价和特异性进行测定，表1为免疫前后兔血清及抗体效价测定结果，结果显示，随着免疫次数的增加，血清抗体效价逐渐升高，最终获得的副溶血性弧菌兔多克隆抗体效价可以达到1:1024000；表2为兔多克隆抗体IgG特异性结果，结果显示，制备的抗体特异性较好；采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgG抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。
表1 免疫前后兔血清及抗体IgG效价测定结果
实施例2 副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY的制备。
按实施例1的方法制备副溶血性弧菌弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂疫苗即可用来免疫蛋鸡。采用肌肉多点注射的方式将疫苗接种于鸡胸。首次免疫采用弗氏完全佐剂疫苗，每只鸡1mL，间隔两周后采用弗氏不完全佐剂疫苗进行第二次免疫，随后每隔两周进行一次强化免疫。收集免疫前后的鸡蛋，储存于4℃冰箱中备用。采用PEG 6000盐析法对鸡蛋中的卵黄抗体进行提取。采用间接ELISA法对纯化前后卵黄抗体的效价和特异性进行测定，表3为免疫前后鸡血清及抗体IgY效价测定结果，结果显示，随着免疫次数的增加，鸡血清中的抗体效价逐渐升高，最后一次免疫后，抗体效价高达1：64000，经提取纯化后，最终获得的副溶血性弧菌IgY抗体效价可以达到1:128000。表4为鸡卵黄抗体IgY特异性结果，结果显示制备的IgY抗体特异性较好；采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的IgY抗体的浓度进行测定，并用PBS缓冲液将其蛋白浓度调整为1mg/mL，-20℃保存备用。
表3 免疫前后鸡血清及抗体IgY效价测定结果
表4 鸡卵黄抗体IgY特异性结果
实施例3 抗副溶血性弧菌免疫磁珠的制备
取羧基化磁珠（10mg/mL）100 μL至1.5 mL离心管中，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，加入MEST缓冲溶液400μL清洗3次；依次加入10MEST缓冲溶液配置的浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）各200μL，涡混匀后利用垂直混合仪在25 ℃下活化30 min，活化结束后置于磁力架上磁性分离后弃去上清，将活化后的磁珠重悬于280μL的PBST中，得到活化后的磁珠；然后所制备的副溶血性弧菌兔多克隆抗体IgG加入100μg孵育2h孵育2h，用400μL PBST溶液清洗3遍，加入1 mL1%的BSA封闭磁珠表面未共价偶联抗体的羧基官能团；封闭结束后，将离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用400μL uLPBS缓冲液洗涤3遍后, 重悬于400 μL的PBS溶液中，4 ℃保存备用。
实施例4 量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针的制备
取10 uL羧基化的荧光量子点于1.5 mL棕色进样瓶中，加入用MEST缓冲液配制的5mg/mL EDC和NHS各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下活化30min。活化结束后将溶液转移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min。弃去上清并用PBST清洗1遍，活化后的量子点重悬于400μL的PBST中。加入所制备的副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY 120μg，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下避光反应2 h。偶联反应结束后，将量子点溶液移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍。加入1mL 1%的BSA，涡旋混匀后利用垂直混合仪在25℃下继续避光孵育1h进行封闭。封闭结束后，将量子点溶液转移至1.5mL的EP管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍。最后重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存备用。
实施例5 缓冲液的配置
PBS缓冲液: 取NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 g，溶于800m L蒸馏水中，用NaOH调节pH至7.4，在定溶至1000mL。
实施例6 菌液标准品的制备
取﹣80 ℃保存菌种，进行菌株活化。将活化后的菌株在3%氯化钠胰蛋白胨琼脂平板上划线分纯，37 ℃培养18~24 h后，挑取单个菌落，接种3%氯化钠胰蛋白胨液体培养基，37 ℃振荡培养12~18 h。取1mL菌液10倍倍比稀释平板倾注法进行活菌计数。剩余的菌液用1 %甲醛在室温下灭活10 min ，将灭活的菌液 3000 rpm 离心 3 min，收集菌体，然后用PBS溶液充分混匀，制成菌悬液并，用PBS溶液调节菌悬液浓度为109 CFU·mL-1，存于4 ℃冰箱中备用。
实施例7 质控品的制备
①阳性质控品：阳性质控品由含103~105灭活的副溶血性弧菌的PBS溶液构成；
②阴性质控品：阴性质控品由灭菌后的PBS溶液构成。
实施例8 基于磁性分离和量子点标记技术的副溶血性弧菌检测方法的建立
1.免疫磁珠最佳加入量的选择
取25、50、75、100、150μL由实施例3所制备好的免疫纳米磁珠分别加入到1 mL含105CFU/mL的副溶血性弧菌的PBS 缓冲液中，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集反应1h，进行免疫捕获，反应结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。将沉淀重悬于300μL的PBS中，加入100μL由实施例4所制备的荧光量子点生物探针，漩涡混匀后利用垂直混合仪在室温25℃下避光孵育1h，进行荧光标记。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，得到磁珠—菌体抗原—量子点“三明治”夹心复合物。将得到的复合物重悬于1mL的PBS溶液中，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图1为免疫磁珠加入量优化结果，结果显示当随着磁珠加入量的增加，样品荧光强度也逐渐增强，当免疫纳米磁珠加入量达到50μL时，荧光值达到最大。再继续增加免疫磁珠的量,荧光值反而降低。故选择50μL作为免疫磁珠的最佳加入量。
2.免疫磁珠富集时间的选择
取6份实施例3所制备的免疫磁珠50μL，分别加入1 mL含105CFU/mL的副溶血性弧菌的PBS 缓冲液中，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下分别富集15，30，45，60，90，120min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，加入100μL由实施例4所制备的荧光量子点生物探针在25℃下避光孵育1h进行标记。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图2为免疫磁珠富集时间的确定结果，结果显示，随着富集时间的增加，样品的荧光强度呈上升趋势。在富集时间为60 min之后，随着时间的延长，荧光强度有所上升，但差异并不明显。故选择60 min作为免疫磁珠最佳富集时间。
3. 量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记时间的确定
取6份实施例3所制备的免疫磁珠50μL，分别加入1 mL含105 CFU/mL的副溶血性弧菌的PBS 缓冲液中，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集60min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，分别加100μL量子点探针，在25℃下避光孵育15，30，45，60，90，120 min进行标记。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图3为量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记时间的确定结果，结果显示，随着量子点探针标记时间的增加，样品的荧光强度呈上升趋势。而当量子点探针的标记时间在90min继续增大时，样品的荧光强度增加不明显，故选择90 min作为量子点探针的最佳标记时间。
4. 量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记量的确定
取6份实施例3所制备的免疫磁珠50μL，分别加入1 mL含105CFU/mL的副溶血性弧菌的PBS 缓冲液中，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集60min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，分别加入50、100、200、300、400、500μL量子点探针，在25℃下避光孵育90min进行标记。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图4为量子点标记的纳米荧光生物探针最佳标记量的确定结果，结果显示，随着量子点探针用量的增加，样品的荧光强度呈上升趋势。而当量子点探针的量在300μL继续增大时，样品的荧光强度增加不明显，故选择300μL作为量子点探针的最佳标记量。
检测方法的评价
（1）检出限实验
取7份实施例3所制备的免疫磁珠50μL，分别加入1 mL含 0，101，102，103，104，105，106 CFU/mL副溶血性弧菌的PBS 缓冲液中，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集60min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，分别加300μL量子点探针，在25℃下避光孵育90min。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图5为检测方法的检出限确定结果，以样品荧光强度值与空白对照荧光值之比≥2.1为判定该方法的最低检测限。结果显示当菌液浓度为102到106 CFU/mL时，复合物的荧光强度与菌液浓度呈线性关系，其标准曲线为y=57.06x+13.80(R2=0.989)，该方法的最低检测限（LOD）为102 cfu/mL。
（2）特异性实验
取8份实施例3所制备的免疫磁珠50μL，分别加入1 mLPBS和1 mL含 105 CFU/mL的副溶血性弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌的菌液以及副溶血性弧菌和沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O157：H7、副溶血性弧菌和单增李斯特菌的混合菌液，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集60min。富集结束后通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次，分别加300μL量子点探针，在25℃下避光孵育90min。孵育结束后，通过磁吸分离法用PBS溶液清洗3次。重悬于1mL的PBS溶液，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。图6为检测方法的特异性结果，结果显示用本方法检测沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌时，复合物的荧光强度值与空白对照PBS溶液的荧光强度值相近，故该方法不能识别沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌；而使用本方法检测副溶血性弧菌与沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特菌的混合菌液时，复合物的荧光强度与阳性对照副溶血性弧菌相近，故本方法特异性较好，能特异性识别副溶血性弧菌。
（3）重复性实验
取102，104，106 CFU/mL三种浓度的待测菌液，每个浓度的菌液设3个平行样，按照所建立的方法，对待测样品在同一天进行测定，评价检测方法的日内重复性。按照所建立的方法，对待测样品连续三天进行测定，评价检测方法的日间重复性。表5为检测方法重复性实验结果。结果显示，日内变异系数在4.03%~7.41%、，日间变异系数在2.03%~7.83%，均小于10%，表明建立的检测方法重复性良好。
表5 检测方法重复性结果
实施例9 试剂盒的制备
由实施例3所描述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠、实施4例所描述的量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针、实施例5所描述的缓冲液、实施例6所描述的菌液标准品、实施例7所描述的质控品共同组成基于磁性分离和量子点标记的检测副溶血性弧菌抗原的试剂盒。
实施例10 试剂盒的使用方法
待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入试剂盒中的PBS缓冲液10 mL，充分混匀后，将1mL浸提液转入离心管中，向该离心管中加入试剂盒中的抗副溶血性弧菌免疫磁珠50μL,漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下富集60min, 富集结束后将离心管插入磁力架分离，用移液器吸出上清。添加试剂盒中的PBS缓冲液洗涤3遍，磁分离后吸出洗涤液，再加入300μL试剂盒中的量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针，室温下置于旋转混合仪上反应, 在25℃下避光孵育90min，通过量子点上的抗体与免疫纳米磁珠上的副溶血性弧菌抗原的免疫结合，量子点被标记到副溶血性弧菌表面，形成磁珠—副溶血性弧菌抗原—量子点“三明治”复合物。反应完成后，磁吸分离，除去多余的量子点标记探针，并用PBS缓冲液清洗3遍，复合物重新分散在1mL PBS缓冲液中，利用荧光光谱仪，在激发波长为350nm时，检测样品的荧光强度值。按上述同样的方法检测试剂盒中提供的阴性质控品及阳性质控品样品，并利用标准菌液制作标准曲线，若阳性质控品样品的荧光值小于阴性质控品，则表明试剂盒失效。
实施例11 模拟样品的检测
将蛤蜊去壳碾磨后，称取5 g溶解于10 mL的PBS溶液中4℃浸泡24 h，过滤收集浸出液。用该浸出液稀释副溶血性弧菌，分别配制成浓度为0，101，102，103，104，105，106 cfu/mL的菌悬液然后按照所建立的方法，检测模拟样品。图7为模拟样检测结果，结果显示，随着菌液浓度的增加，反应产物的荧光强度逐渐增大，当菌液浓度为102到106 CFU/mL时，复合物的荧光强度与菌液浓度呈线性关系，其标准曲线为y=24.41x+33.50(R2=0.968)。根据样品荧光强度值与空白对照荧光值之比≥2.1为判定该方法的最低检测限，则此方法在该样品中的检测限为102 CFU/mL
综上，利用本发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。
Claims (2)
1.基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针； 所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；
所述的副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY是以副溶血性弧菌全菌为抗原，经灭活后，免疫SPF级健康高产蛋鸡，采用PEG6000法对所述的免疫后鸡蛋中的卵黄抗体IgY进行纯化；蛋白浓度为1mg/mL；
所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是由下述方法制备的：
①取羧基化磁珠100 μL至1.5 mL离心管中，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，加入MEST缓冲溶液400μL清洗3次；所述MEST缓冲液各成分含量如下：0.1mol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，0.5 mL/L吐温-20；所述的MEST缓冲液pH为 5.0；
②依次加入浓度为10 mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基二亚胺盐酸盐MEST缓冲液的溶液200μL， 浓度为10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺MEST缓冲液的溶液200μL，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；反应结束后用PBST清洗3遍；所述的PBST缓冲液各成分：8g NaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，0.5 mL/L Tween-20；所述的PBST缓冲液pH为7.4；
③活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBST缓冲液稀释的副溶血性弧菌兔多克隆抗体IgG孵育2h漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下反应2 h；偶联反应结束后，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，400 μL PBST溶液清洗3遍，加入1 mL 1%的BSA封闭；封闭结束后，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用400μL uLPBS缓冲液洗涤3遍后， 重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存；所述的PBS缓冲液各成分含量如下：8g NaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4；所述的PBS缓冲液pH为7.4；
所述的量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针由下述方法制备的：取10uL羧基化的荧光量子点于1.5 mL棕色进样瓶中，加入用MEST缓冲液配制的5mg/mL EDC和5mg/mL NHS各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；活化结束后将溶液转移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min；弃去上清并用PBST清洗1遍，活化后的量子点重悬于400μL的PBST中；加入副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY 120μg，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下避光反应2 h；将量子点溶液移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；加入1mL 1%的BSA，涡旋混匀后利用垂直混合仪在25℃下继续避光孵育1h进行封闭；封闭结束后，将量子点溶液转移至1.5 mL的EP管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性质控品、阴性质控品，所述的阳性质控品为含有灭活的副溶血性弧菌的PBS溶液；所述阴性质控品为无菌PBS溶液。
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