JP2006330002A - 電気化学ルミネセンスを使用した水伝播性寄生虫の検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検出または定量は、水を濾過し寄生虫またはその断片を含むと思われるスラッジを得て、該スラッジの試料を抽出培地に抽出して該寄生虫の抗原性派生体を形成し、該抽出スラッジの試料および該抗原性派生体に特異的な抗体を含む測定混合物を形成し、該抗体と該抗原性派生体が結合するように該測定混合物をインキュベートし、そして抗体および抗原性派生体の結合複合体を電気化学ルミネセンス測定にかけ、これによって該水中のクリプトスポリジウムを検出または定量するステップからなる電気化学ルミネセンス測定によって遂行される。
【選択図】なし
Description
クリプトスポリジウムおよびクリプトスポリジウム症
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)は、脊椎動物の消化管内に一般的に見出される原生動物寄生虫の一属である。クリプトスポリジウムには命名された8つの種が存在する。C.parvumはヒトを含め、79種の哺乳類に感染性があり、急性胃腸炎の原因となる。ほとんどの寄生虫と違って、C.parvumは哺乳類の間で宿主特異性に欠け、多数の宿主種に交差感染することができる。
C.parvumのタンパク質、炭水化物、および脂質組成は多様で複雑である。成分の多くは抗原性であり、それゆえ免疫応答標的として機能する。粉砕した接合子嚢、精製接合子嚢および精製スポロゾイトから得た<14から7200kDaにわたる糖タンパク質が、SDS−PAGEゲル電気泳動により同定された。これら接合子嚢由来タンパク質の多くはグリコシル化されている。特異的な糖質部分が同定された。末端N−アセチル−D−グリコサミン残基を有するスポロゾイト糖タンパク質は寄生虫の接着において機能したり、侵入の際に多少の手助けとなっていることが決定された。これら糖質は接合子嚢表面に発現され、免疫検出法において有用なものである。クリプトスポリジウムのスポロゾイトは、約37℃、約90分間温めると、接合子嚢の一極にある縫合部を通して自然に脱嚢することができる。このことは接合子嚢壁破壊するための機械的方法を行うことを不要にしている。
免疫学的技術が環境の検体中のC.parvumを検出するために使用されてきた。クリプトスポリジウムの特異的抗原に対するモノクローナル抗体の利用はこれら方法の開発を促進した。
本発明の第一の目的は、環境試料中のクリプトスポリジウムの接合子嚢の検出または定量のための迅速、鋭敏かつ精密な測定を提供することである。
従来の測定法に固有の問題は、本発明の電気化学ルミネセンス(ECL)に基く測定により解決される。これらの測定によって水起源のクリプトスポリジウムを検出することができる。これらECL測定は、分散した施設におけるC.parvumの検出または定量のための迅速測定であり、即ち、水は処理プラントで測定される。簡便な定量測定法であることが、従来の方法を超えた主な改良である。それらは正確でそして感度があり、過大な労働なしで小時間で実行される。
(a)水を濾過してクリプトスポリジウムの接合子嚢を含有するスラッジを得て;
(b)スラッジの試料を抽出培地中に抽出して接合子嚢の少なくとも一つの抗原性派生体(antigenic derivative)を形成させ;
(c)抽出スラッジの試料、および抗原性派生体に特異的な抗体を含む測定混合物を形成させ;
(d)測定混合物を、抗体と抗原性派生体とが結合するようにインキュベートし;そして
(e)抗体と抗原性派生体との結合複合体を電気化学ルミネセンス測定にかけ、それによって濾過水中のクリプトスポリジウムの検出または定量を行う。
本発明は、生水の濾過から得たスラッジ中のクリプトスポリジウム検出のための電気化学ルミネセンス測定に関する。接合子嚢および/またはスポロゾイトの存在および量が両方とも、これら測定法により決定される。従って、この測定法によって、水が現に生存寄生虫で汚染されているか、または水試料中に空の接合子嚢が残存しているかが検出される。生水の濾過から採取されたスラッジは、検出のために寄生虫から可溶性の形で抗原を遊離するように直ちに処理される。
(a)水を濾過してクリプトスポリジウムの接合子嚢を含有するスラッジを得て;
(b)スラッジの試料を抽出培地中に抽出して少なくとも一つの抗原性派生体を含む接合子嚢の派生体を形成させ;
(c)抽出スラッジの試料および抗原性派生体に特異的な抗体を含む測定混合物を形成させ;
(d)測定混合物を、抗体と抗原性派生体とが結合するようにインキュベートし;そして
(e)抗体と抗原性派生体との結合複合体に対する電気化学ルミネセンス測定を実行し、その結果クリプトスポリジウムの検出または定量を行う。
(式中、Rは水素またはCnH2n+1,R’はCnH2n,Xは0〜70,およびnは1〜20)の充分な量で利用される促進剤の存在下で実行される。
水試料採取
携帯用/清浄水100〜1000リットルをcuno−typeフィルターで濾過した。スラッジ濾過物と一緒に濾過膜をカットし、ホルダーからはずした。膜シートをプラスチック容器中に置き、0.1%Tween80界面活性剤溶液を容器に加えた。フィルターを20分間攪拌し、スラッジ懸濁液を遠心ボトルに傾斜する。第2の界面活性剤溶液1リットルを容器に加え、そしてフィルターを再び20分間攪拌する。第2のリットルを遠心ボトルに傾斜し、そしてスラッジ濾過懸濁液2リットルを7,280g、12分間遠心分離した。ボトルを遠心機から取り出し上清液を注意して吸引し、ボトル中に約20〜30ml溶液にペレットを残す。残った液体を激しく振とうしてペレットを再懸濁し、そして50ml遠心分離管に移す。ボトルを0.1%Tween80溶液ですすぎ、50ml遠心分離管に加え、必要ならば、〜5ml蒸留水を用いて遠心分離管を釣り合わせる。50ml管を2,190g,10分間遠心分離し、上清液を傾斜する。2つのペレットを合わせ再懸濁する。濃縮物の最終容積はピペットマンを使ってマイクロリットルまで測る。
クリプトスポリジウム抗原の可溶化
実施例1で得た再懸濁濃縮物の容積の50%を清潔な50ml遠心分離管にピペットで移す。10倍濃度ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)の原液をHClでpH2.5に調節する。低pHのHBSS10倍濃度の予め決められた量およびウシ胆汁酸塩の5%原液の予め決められた量をスラッジ懸濁液に加え、0.5%胆汁酸塩および1xHBSSの最終濃度にする。スラッジ懸濁液を次いで40℃、2時間インキュベートする。インキュベーションの後、溶液をトリス塩基でpH7に調節し、そしてドデシル硫酸ナトリウムの3%原液を加え、最終濃度0.3%にする。200mMメルカプト−エタノールまたは100mMジチオスレイトールの予め決められた量を加え、20mMメルカプト−エタノールまたは10mMジチオトレイトールの最終濃度にする。懸濁液を混合し、40℃にて1時間インキュベートする。N−メチルマレイミドを最終濃度20mMになるよう加える。Triton X−100の5%原液を0.5%の最終濃度になるよう加え、そしてウシ血清アルブミンをインキュベーション混合物に2%の最終濃度になるように加えて過剰の界面活性剤を隔離し、それによって界面活性剤の存在下での免疫反応性を改善する。溶液を混合し、抽出混合物の最終容積をピペットマンでマイクロリットルまで測る。
OW3/ORIGEN TAG−NHSエステル複合体の調製
OW3タンパク質0.5mgをポリプロピレンバイアル中の500μl PBS,pH7.8に溶解する。限外濾過濃縮装置をバッファー交換およびタンパク質濃縮をするために使用する。ORIGEN TAG−NHSエステル原液をDMSO 50μlをTAG−NH3エステル(Igen)の75μgに加えることにより調製する。バイアルを穏やかに回しバイアルの底および低い側をDMSOで濡らす。このDMSOの容積で75pgのORIGEN TAG−NHSエステルを溶解し、1.5μg/μl原液を得る。
スポロゾイト(p27)抗原を、クリプトスポリジウムは感染した仔ウシからの高度に濃縮された形で得たものであることを除いて、実施例2に記載した方法で調製した抽出物から得た3E3抗体を用いて固相で免疫精製により調製した。ウサギを通常の方法に従って免疫した。抗体は標準技術を使って調製した。これらの抗体は実施例3に記載したプロトコールに従って標識した。
OW3抗原のビオチニル化
OW3抗原1.5mgを150mM塩化ナトリウム含有150mMリン酸カリウムバッファー、pH7.8,1.5mlに溶解し、0.5ml分画に分けた。
この方法はOW3抗体について上に記載したとおりである。
接合子嚢抗原の測定
処理したスラッジ(実施例2)の30μl試料を、12×70mm試験管にピペットで入れる。ORIGEN Assay Diluent(IGENから入手可)中ビオチニル化OW3抗体(実施例4)2mg/ml溶液25μlを試験管に加える、次いで、ORIGEN Assay Diluent(実施例3)中TAG−標識OW3抗体2mg/ml溶液25μlを加える。混合物を37℃、2時間インキュベートし、定期的に混合する。インキュベーションに続いて、ORIGEN Assay Diluent中Dynal 2.8ミクロン・ストレプトアビジン被覆ビーズの1mg/ml懸濁液25μl(25μgに等しい)を加える。混合物を再び30分間、室温でインキュベートする。イムノアッセイインキュベーション混合物をORIGEN Assay Bufferで300μlに稀釈する。
スポロゾイト抗原のための測定方法は、3E3抗体を使用する以外は接合子嚢抗原について上記に記載した通りである。
接合子嚢およびスポロゾイト抗原に対する同時的測定
実施例7および8のECLイムノアッセイは同時に(同時にまたは急速に連続してのいずれか)実施することができる。実施例1で得られた濃縮物は実施例2に記載したようにして可溶化される。可溶化した産物は二つの同じ部分に分けられる。それらの部分は、実施例3から5に記載された方法を使用して測定される。
Claims (16)
- (a)水を濾過してクリプトスポリジウム(Cryptosporidium)の接合子嚢を含有するスラッジを得て、
(b)該スラッジの試料を抽出培地中に抽出して該接合子嚢の少なくとも1つの抗原性派生体(antigenic derivative)を形成させ、
(c)(i)該抽出したスラッジの試料、および
(ii)該抗原性派生体に特異的な抗体、
を含む測定混合物を形成させ、
(d)該測定混合物を、該抗体と該抗原性派生体とが結合するようにインキュベートし、そして
(e)抗体と抗原性派生体との結合複合体について電気化学ルミネセンス測定を行い、これによって該水中のクリプトスポリジウムの検出または定量を行う、
ステップからなる、電気化学ルミネセンス測定による水中のクリプトスポリジウムの検出または定量方法。 - (a)生水を濾過して濾液およびクリプトスポリジウムの接合子嚢を含有する有機スラッジを生成し、
(b)該有機スラッジの試料を
(i)培地を低pHに緩衝化することができる物質、および
(ii)少なくとも1つの界面活性剤(surfactant)、
を含む抽出培地中に抽出して、少なくとも1つの抗原性派生体を含む該接合子嚢の派生体を形成させ、
(c)(i)抽出したスラッジの試料、
(ii)該抗原性派生体の第1エピトープに特異的な捕捉抗体で標識した磁気粒子、
(iii)該抗原性派生体の第2エピトープに特異的な標識抗体を含む標識プローブであって、該第1および第2エピトープは同じかまたは異なるエピトープであり、そして該標識は電気化学ルミネセンス部分を含む、および
(iv)ECL測定試薬、
を含む測定混合物を形成させ、
(d)該測定混合物をインキュベートして磁気粒子−捕捉抗体−抗原性派生体−標識抗体−ECL標識を形成させ、そして
(e)ステップ(d)において形成された複合体について電気化学ルミネセンス測定を行い、これによって該水中のクリプトスポリジウムを検出または定量する、
ステップからなる、電気化学ルミネセンス測定による水中のクリプトスポリジウムの検出または定量方法。 - 混合物の該測定のpHを、該電気化学ルミネセンス測定を行う前に約4〜8のpH範囲に緩衝化する、請求項2記載の方法。
- 該測定混合物のpHを、該測定混合物を稀釈することにより上昇させる、請求項2記載の方法。
- 該測定混合物のpHを塩基溶液で緩衝化する、請求項4記載の方法。
- インキュベーションを室温より高い温度で行う、請求項2記載の方法。
- (a)水を濾過してクリプトスポリジウムの接合子嚢を含有するスラッジを得て、
(b)該スラッジの試料を抽出培地中に抽出して、該接合子嚢の外壁からの少なくとも1つの抗原性派生体および該接合子嚢内に含有されるスポロゾイトの少なくとも1つの抗原性派生体を含む、該接合子嚢の抗原性派生体を形成させ、
(c)(i)該抽出したスラッジの第1の試料、および
(ii)該接合子嚢の外壁上の抗原性派生体に特異的な第1抗体、
を含む第1の測定混合物を形成させ、
(d)(i)該抽出したスラッジの第2の試料、および
(ii)該スポロゾイトの該抗原性派生体に特異的な第2抗体、
を含む第2の測定混合物を形成させ、
(e)該第1抗体と該接合子嚢の外壁からの該抗原性派生体とが結合するように該第1の測定混合物をインキュベートし、
(f)該第2抗体と該スポロゾイトの該抗原性派生体とが結合するように該第2の測定混合物をインキュベートし、
(g)該第1抗体と抗原性派生体との結合複合体について第1の電気化学ルミネセンス測定を行い、そして
(h)該第2抗体と該スポロゾイトの抗原性派生体との結合複合体について第2の電気化学ルミネセンス測定を行い、
そして、それによって、接合子嚢外壁および該接合子嚢に含有されるスポロゾイトの両者を検出または定量する、
ステップからなる、クリプトスポリジウムの接合子嚢外壁、および該接合子嚢に含有されるスポロゾイトを同時に測定する電気化学ルミネセンス測定による水中のクリプトスポリジウムの検出または定量方法。 - (a)(i)抽出培地および接合子嚢の派生体を含有する、抽出した水濾過スラッジを含む試料であって、少なくとも1つの抗原性派生体を含み、
(ii)該抗原性派生体に特異的な抗体、
を含む、測定混合物を形成させ、
(b)該抗体と該抗原性派生体とが結合するように該混合物をインキュベートし、そして、
(c)抗体と抗原性派生体との結合複合体について電気化学ルミネセンス測定を行う、
ステップからなる、未処理水濾液から得られたスラッジ中のクリプトスポリジウムを検出または定量する電気化学ルミネセンス測定法。 - (a)(i)抽出したスラッジの試料、
(ii)該抗原性派生体の第1エピトープに特異的な捕捉抗体で標識した磁気粒子、
(iii)該抗原性派生体の第2エピトープに特異的な第2抗体からなる標識プローブであって、該標識は電気化学ルミネセンス部分からなり、該第1および第2エピトープは同じかまたは異なっていてもよい、
(iv)ECL測定試薬、
を含む測定混合物を形成させ、
(b)該測定混合物をインキュベートして磁気粒子−捕捉抗体−抗原性派生体−標識抗体−ECL標識を形成させ、そして
(c)ステップ(b)において形成された該複合体について磁気電極上で電気化学ルミネセンス測定を行い、
そして、それによって、該スラッジ中のクリプトスポリジウムを検出または定量する、
ステップからなる、未処理水濾液から得られたスラッジ中のクリプトスポリジウムを検出または定量する電気化学ルミネセンス測定法。 - (a)(i)抽出培地、および接合子嚢の外壁からの少なくとも1つの抗原性派生体を含有する、抽出した水濾過スラッジを含む、第1の試料、
(ii)該接合子嚢の外壁上の抗原性派生体に特異的な第1抗体、
を含む、第1の測定混合物を形成させ、
(b)(i)抽出培地、およびスポロゾイトの少なくとも1つの抗原性派生体を含有する、抽出した水濾過スラッジを含む、第2の試料、
(ii)該スポロゾイトの抗原性派生体に特異的な第2抗体、
を含む、第2の測定混合物を形成させ、
(c)該第1抗体と該接合子嚢の外壁からの該抗原性派生体とが結合するように該第1の測定混合物をインキュベートし、
(d)該第2抗体と該接合子嚢の外壁からの該抗原性派生体とが結合するように該第2の測定混合物をインキュベートし、
(e)該第1抗体と抗原性派生体の結合複合体について第1の電気化学ルミネセンス測定を行い、
(f)該第2抗体と該スポロゾイトの抗原性派生体の結合複合体について第2の電気化学ルミネセンス測定を行い、
そして、それによって、接合子嚢外壁および該接合子嚢に含有されるスポロゾイトの両者を検出または定量する、
ステップからなる、接合子嚢外壁および該接合子嚢中に含有されるスポロゾイトを測定する、クリプトスポリジウムを検出または定量する電気化学ルミネセンス測定法。 - (a)抽出培地を低pHに緩衝化することができる物質および界面活性剤を含む、抽出培地、および
(b)少なくとも1つの抗原性派生体を含む接合子嚢の派生体、
を含む、クリプトスポリジウムの接合子嚢の抽出物。 - (a)抽出培地を低pHに緩衝化することができる物質および界面活性剤を含む、抽出培地、および
(b)接合子嚢外壁からの少なくとも1つの抗原性派生体、および該接合子嚢中に含有されるスポロゾイトの抗原性派生体の1つを含む、該接合子嚢の派生体、
を含む、クリプトスポリジウムの接合子嚢の抽出物。 - (a)水濾過スラッジ、
(b)少なくとも1つの酸および少なくとも1つの界面活性剤を含む、スラッジ抽出培地、および
(c)抗体および抽出したスラッジの抗原性派生体を含む、複合体、
を含む、物質組成物。 - (a)水濾過スラッジ、
(b)少なくとも1つの酸および少なくとも1つの界面活性剤を含むスラッジ抽出培地、および
(c)クリプトスポリジウム接合子嚢の抗原性派生体の第1エピトープに対する第1抗体で標識した磁気粒子、および該抗原性派生体の第2エピトープに対する電気化学ルミネセンス標識した第2抗体を含む、複合体であって、該第1および第2エピトープは同じかまたは異なっていてもよい、
を含む、物質組成物。 - (a)少なくとも1つの酸および少なくとも1つの界面活性剤を含む、水濾過から得られた有機スラッジ抽出のための抽出培地、および
(b)抽出したスラッジの抗原性派生体に特異的な抗体、
を含む、水中のクリプトスポリジウムについて電気化学ルミネセンス測定を行うためのキット。 - (a)少なくとも1つの酸および少なくとも1つの界面活性剤を含む、水濾過から得られた有機スラッジの抽出のための抽出培地、および
(b)(i)抽出したクリプトスポリジウム接合子嚢の抗原性派生体の第1エピトープに特異的な第1抗体で標識した磁気粒子、および
(ii)該抗原性派生体の第2エピトープに特異的な第2抗体を含む標識プローブであって、該標識は電気化学ルミネセンス部分を含み、該第1および第2エピトープは同じかまたは異なっていてもよい、を含む電気化学ルミネセンス測定の構成分、
を含む、水中のクリプトスポリジウムについて電気化学ルミネセンス測定を行うためのキット。
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