DE69830906T2

DE69830906T2 - Nachweis von parasiten in wasser durch elektrochemilumineszenz

Info

Publication number: DE69830906T2
Application number: DE69830906T
Authority: DE
Inventors: O. Richard WILLIAMS; H. John KENTEN
Original assignee: Bioveris Corp
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1997-03-18
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: ATE300045T1; JP2001515598A; WO1998041867A1; DE69830906D1; AU6460398A; PT983508E; JP2006330002A; EP0983508B1; US6146838A; EP0983508A1; ES2244051T3; EP0983508A4; DK0983508T3

Description

HINTERGRUND
Cryptosporidium und Cryptosporidiose
Cryptosporidium ist eine Gattung eines Einzellerparasiten, der gewöhnlich in dem Gastrointestinaltrakt von Vertebraten gefunden wird. Es gibt acht benannte Arten von Cryptosporidium. C. parvum ist für 79 Säugerarten infektiös, einschließlich Menschen, wobei akute Gastroenteritis verursacht wird. Anders als den meisten Parasiten fehlt C. parvum innerhalb von Säugern die Wirtsspezifität und es ist in der Lage, vielfache Wirtsarten zu kreuzinfizieren.
Cryptosporidium wird als eine Oozyste über den Fäkal-Oral-Weg übertragen. Kontaminiertes Wasser, enger Mensch-zu-Mensch-Kontakt und Kontakt mit den Exkrementen infizierten Viehs, von Zootieren oder Haustieren kann zu einer Übertragung des Parasiten führen. Wenn er sich außerhalb eines Wirts befindet, die exogene Phase, existiert Cryptosporidium als eine sporulierte Oozyste. Die Oozyste besteht aus vier Sporozoiten innerhalb einer zähen zweischichtigen Wand. Die Oozystenwand hat definierte innere und äußere Schichten und eine Naht an einem Ende. Während des Zystenaustritts löst sich die Naht auf, wobei eine Öffnung bereitgestellt wird, durch welche die Sporozoiten die Oozyste verlassen. Wenn sie durch einen geeigneten Wirt aufgenommen werden, parasitieren aus der Zyste ausgetretene Sporozoiten, die lebende Substanz, die Zellen des Gastrointestinal- oder respiratorischen Trakts. Nach der Vermehrung geschieht die erneute Sporenbildung zu Oozysten. Oozysten in dem Gastrointestinaltrakt werden mit dem fäkalen Material ausgeschieden, während jene in dem respiratorischen Trakt den Körper in respiratorischen und nasalen Sekretionen verlassen.
Man trifft gewöhnlich sowohl in entwickelten als auch in unterentwickelten Ländern auf Infektionsfälle durch Cryptosporidium. Das leicht höhere Vorherrschen von Cryptosporidiose in den weniger entwickelten Ländern kann einer schlechten Hygiene, schlechter Ernährung, kontaminiertem Trinkwasser und engem Kontakt mit infizierten Personen und Tieren zugeschrieben werden.
Das am häufigsten mit Cryptosporidiose in Verbindung stehende klinische Anzeichen ist Diarrhö, die schwer sein kann und in Gewichtsverlust und Dehydrierung resultieren kann. Andere übliche klinische Symptome schließen Abdominalkrämpfe, Fieber, Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, Müdigkeit, Myalgie und Appetitlosigkeit ein. Infektionen mit Cryptosporidium sind allgemein im Dünndarm, geschahen jedoch ebenfalls in den Lungen, im Ösophagus, im Magen und in anderen Organen. Die mit der parasitischen Infektion verbundenen klinischen Symptome hängen von dem befallenen Organ ab.
Das Spektrum an Symptomen und die Schwere der Krankheit kann stark von einem Individuum zu einem anderen variieren und kann lebensbedrohend werden. Die Symptome akuter Enteritis dauern im Allgemeinen ein bis zwei Wochen an in Individuen, die ansonsten immunologisch gesund sind. Cryptosporidiose stellt eine erhöhte Bedrohung bei AIDS-Patienten, unterernährten Patienten, Individuen mit ererbten Immunschwächen und Personen, die immunsuppressive Arzneimittel erhalten.
Sämtliche Infektionen mit Cryptosporidium werden durch die Aufnahme oder das Inhalieren der Oozyste gestartet. Da der Parasit in der Form einer Oozyste übertragen wird, entwickelten sich Oozysten dahingehend, dass sie unter rauen Umgebungsbedingungen überleben und ungewöhnlich resistent gegen natürliche Stressarten und chemische Desinfektionsmittel sind. Zusätzlich macht die Anwesenheit einer exogenen Oozyste, wodurch der Einzellerparasit verkapselt wird, den Parasiten viel resistenter gegen gewöhnliche Wasserbehandlungsvorgänge. Maßnahmen, die Verbreitung der Infektion zu verhindern oder zu begrenzen konzentrieren sich auf das Eliminieren oder Reduzieren infektiöser Oozysten in der Umgebung. Für Menschen wird von Desinfektionsvorgängen erstrebt, dass sie die Übertragung von Person zu Person minimieren und dass sie effektiv die Kontaminierung von Wasserversorgungen behandeln.
Das erst kürzliche Auftreten großer Ausbrüche im Wasser fokussierte die Aufmerksamkeit auf die Wichtigkeit des Verstehens ihrer Übertragung durch die Umgebung. Oberflächenwasser können natürlich durch infizierte Tierexkremente verunreinigt sein. Viele Abfallbeseitigungspraktiken können zu kontaminierten Wasserläufen und -strömen -führen. Fäkalkontaminierung von Wasserwegen führte kürzlich zu einem massiven Ausbrechen einer C.-parvum-Infektion. Durch diese Praktiken verunreinigtes Wasser kann dann zu der Kontaminierung von Trinkwasserversorgungen oder von Feldfrüchten während der Bewässerung führen.
Chemische Zusammensetzung und Zerlegung von Cryptosporidium
Die Protein-, Kohlenhydrat- und Lipidzusammensetzung von C. parvum ist divers und komplex. Viele der Bestandteile sind antigenisch und wirken deshalb als Immunantwortziele. Glykoproteine im Bereich von < 14 bis 7200 kDA von zerstörten Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Oozyste"], gereinigten Oozystenschalen und gereinigten Sporozoiten wurden durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese identifiziert. Viele dieser aus Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Oozysten"] abgeleiteten Proteine sind glykosiliert. Spezifische Kohlenhydrateinheiten wurden identifiziert. Es wurde festgestellt, dass Sporozoiten-Glykoproteine mit endständigen N-Acetyl-D-Glykosaminresten bei dem Anheften des Parasiten wirken könnten oder irgendwie bei dem Eindringen unterstützen könnten. Diese Kohlenhydrate werden auf der Oozytenoberfläche [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Oozystenoberfläche"] exprimiert und sind nützlich bei immunologischen Detektionsverfahren. Sporozoiten von Cryptosporidium können die Zyste spontan durch eine Naht an einem Pol der Oozyste verlassen, wenn sie auf ungefähr 37° für annähernd 90 Minuten erwärmt werden. Dies macht es unnötig, mechanische Verfahren für die Oozystenwandzerstörung durchzuführen.
Die Vorbehandlung von C.-parvum-Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „C.-parvum-Oozysten"] mit Natriumhydrochlorid (eine „Bleiche") resultiert in einer Trennung der inneren und äußeren Oozystenwände. Das heißt, während es nicht notwendig ist, Oozysten in einem Reduktionsmittel vorzubehandeln, wenn C. parvum aus der Zyste entlassen wird, geschieht eine leichte Zunahme in der Schnelligkeit der Exzystierung, wenn mit Bleiche behandelte Oozysten in PBS, die 0,01 M Cystein-HCL enthält, während dem Vorgang des Zystenaustritts inkubiert werden. Oozysten, die nicht mit Bleiche vorbehandelt worden sind, treten etwas aus der Zyste aus, wenn sie auf annähernd 37°C erwärmt werden. Die Verwendung von Trypsin und Gallensalzen oder von Gallensalzen alleine kann den Zystenaustritt ungebleichter Oozysten steigern oder beschleunigen.
Testverfahren für Cryptosporidium des Standes der Technik
Es wurden immunologische Techniken verwendet, um C. parvum in Umgebungsproben zu detektieren. Die Erhältlichkeit monoklonaler Antikörper für spezifische Antigene von Cryptosporidium erleichterte die Entwicklung dieser Verfahren.
Immunfluoreszenztests (IFA) sind die häufigsten Tests, die verwendet werden, um Cryptosporidium-Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Cryptosporidium-Oozysten"] in Proben nachzuweisen und um die Anwesenheit eines spezifischen Antikörpers nachzuweisen. Diese Verfahren nutzen fluoreszierende Farbstoffe, die mit Antikörpern markiert werden, um diese fluoreszierend zu machen, wenn sie an Ultraviolettlicht ausgesetzt werden. In einem typischen IFA-Test wird Wasser durch ein Polypropylenkartuschenfilter oder ein flaches Membranfilter filtriert. Beide Filter ergeben Filtrate, die dann vor der Analyse durch Mikroskopie der Reinigung unterzogen werden. Das Filtrat wird aus dem Filter entfernt und dann zentrifugiert. Fremde Trümmer werden durch Flotation über eine Sucroselösung entfernt. Der Überstand wird mit einem mit Fluorescein konjugierten Antikörper gegen Cryptosporidium markiert und wird durch Epifluoreszenzmikroskopie untersucht.
Gewisse im Handel erhältliche Immunfluoreszenztests und Reagenzien, die verwendet werden, um Cryptosporidium-Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Cryptosporidium-Oozysten"] zu detektieren schließen ein: (1) Hydro Fluor Combo, ein Immunfluoreszenztestsystem, basierend auf einem für Oozysten spezifischen monoklonalen Antikörper (IgM, OW3), (2) Detect IF Cryptosporidium, ein Immunfluoreszenztestsystem, basierend auf einem für Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Oozysten"] spezifischen monoklonalen Antikörper (IgM, C1) und (3) Crypto IF Kit, ein Immunfluoreszenztestsystem, basierend auf einem für Oozysten spezifischen monoklonalen Antikörper.
Die Nachteile von Immunfluoreszenztests schließen ihre niedrige Wiedergewinnungseffizienz, lange Bearbeitungszeiten, den Bedarf für hochtrainierte Analysten, hohe Kosten, die Unfähigkeit zwischen lebensfähigen oder virulenten Stämmen zu unterscheiden und Kreuzreaktivität der Sonden mit Algen ähnlicher Größe und Form. Zusätzlich schließt die IFA-Detektion oftmals den zeitaufwändigen und könnensintensiven Schritt des Suchens unter einem Mikroskop nach Oozysten in Wasserschlamm, die mit einem fluoreszierenden Antikörper markiert worden sind. Es ist ebenfalls oftmals schwierig, Oozysten von Trümmern, die durch die Antikörper unspezifisch gebunden worden sind, zu unterscheiden. Das Vorgehen ist teuer und braucht oftmals Tage bis zum Abschluss.
Enzymgekoppelte Immunabsorptionsbestimmungen (ELISA) unter Verwendung von oozytenreaktiven [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „oozystenreaktiven"] monoklonalen Antikörpern werden ebenfalls verwendet, um Cryptosporidium in kontaminierten Wasserproben zu detektieren. Zwei ELISA-Grundtests wurden in der Vergangenheit zum Nachweisen von Cryptosporidium-Antigen in Proben verwendet: (1) die Doppelantikörpersandwichtechnik für die Detektion von Antigenen und (2) den indirekten enzymgekoppelten Immunabsorptionstest für die Detektion von Antikörpern.
Bei dem Doppelantikörpersandwichverfahren wird Antiserum auf eine Vertiefung adsorbiert. Testantigen wird hinzugefügt und bindet, falls es komplementär ist, an den Antikörper. Ein für das Testantigen spezifischer, enzymgekoppelter Antikörper bindet dann das Antigen, wodurch ein Sandwich gebildet wird. Das Substrat des Enzyms wird dann hinzugefügt und die Reaktion erzeugt eine sichtbare Farbänderung. Bei dem indirekten Immunabsorptionstest wird ein Antigen auf eine Vertiefung adsorbiert. Testantiserum wird dann hinzugefügt, wobei komplementäre Antikörper an das Antigen binden. Enzymgekoppeltes Antimensch-Gammaglobulin wird dann hinzugefügt. Es bindet an den gebundenen Antikörper. Das Substrat des Enzyms wird dann hinzugefügt, wodurch eine sichtbare Farbänderung erzeugt wird. Eine Schwierigkeit, die bei enzymbasierten Tests auftritt, ist die Deaktivierung des Enzyms durch Bestandteile der Testmischung. Eine weitere Schwierigkeit liegt in dem Waschschritt, wo starke Kräfte die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung überwinden. Dies führt zu einem Verlust an Testpräzision.
Auf Polymerasekettenreaktionen (PCR) basierende Detektionstests wurden ebenfalls verwendet, um Oozysten in klinischen oder Umgebungsproben nachzuweisen. Etliche DNS- und RNS-Regionen von C. parvum wurden sequenziert und es wurde von ihnen berichtet, dass sie Testziele für die Parasitendetektion sind.
Durchflusszytometrie ist ein anderes Verfahren, das verwendet wird, um parasitische Kontaminierung von Wasserproben nachzuweisen. Durchflusszytometrietechniken können ganze Oozysten quantifizieren, erfordern jedoch viel mehr Präparation und Zeit und erfordern eine äußerst teure Ausrüstung.
Zahlreiche Probleme sind mit Verfahren des Standes der Technik zum Nachweisen von Cryptosporidium in Wasser und Umgebungsproben verbunden. Zusätzlich zu jenen erwähnten und dem allgemeinen Fehlen an präzisen, wiederholbaren Tests, erfordern Techniken des Standes der Technik allgemein, dass Proben zu einem Labor oder zu einer anderen entfernten Örtlichkeit für das Durchführen des Tests verbracht werden. Techniken des Standes der Technik fehlen die notwendige Zuverlässigkeit, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit, um Cryptosporidium in kontaminierten Wasserproben genau nachzuweisen.
Die Detektion von infektiösen C.-parvum-Oozysten in Wasser und anderen Umgebungsproben ist wesentlich, um kontaminierte Wasserversorgungen nachzuweisen und zu behandeln. Es ist deshalb entscheidend, dass spezifische, schnelle und hochsensitive Tests entwickelt werden, um die Anwesenheit des Parasiten genau und zuverlässig nachzuweisen. Die bekannten Verfahren an Enzymimmuntests und Immunfluoreszenz erfüllen diese Erfordernisse nicht. Die Quelle, Lebensfähigkeit und Pathogenität von in Wasser oder anderen Umgebungsproben gefundenen Oozysten können nicht zuverlässig bestimmt werden unter Verwendung von Verfahren des Standes der Technik. Es gibt einen Bedarf für eine epidemiologische Routineüberwachung und Umgebungsprüfung, die an Ort und Stelle durchgeführt werden kann, um eine frühe Detektion des Parasiten bereitzustellen.
Robertson et al., Parasitology Jan. 1993, Band 106, 1, Seiten 13–19, beschreiben Protokolle für den In-vitro-Zystenaustritt von Oozysten von Cryptosporidium parvum unter Verwendung von unterschiedlichen chemischen Vorinkubationsschritten.
Johnson et al. FASEB Journal Abstracts, 9.–13. März 1995, Band 9, Nr. 3, Teil 1, Seite A229, Zusammenfassung Nr. 1328, XP 002911135, beschreiben einen quantitativen Test für Cryptosporidium-Oozysten in Trinkwasser.
WO-A-90/05302 beschreibt eine Zusammensetzung, die für die Verwendung in einem ECL-Test geeignet ist, worin durch diese Zusammensetzung emittierte elektromagnetische Strahlung detektiert wird.
WO-A-92/14138 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für einen auf magnetischem mikropartikulärem Material basierenden Lumineszenztest, einschließend eine Vielzahl von Magneten.
Ein Hauptziel dieser Erfindung ist, einen schnellen, empfindlichen und präzisen Test für die Detektion oder Quantifizierung von Oozysten von Cryptosporidium in Umgebungsproben bereitzustellen.
Es ist ein anderes Ziel dieser Erfindung, ein schnelles, empfindliches und präzises Testvorgehen für die Detektion oder die Quantifizierung von Sporozoiten von Cryptosporidium in einer Umgebungsprobe bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein schnelles, empfindliches und präzises Testvorgehen für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium in einer Umgebungsprobe bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist, schnelle quantitative Tests für C. parva in dezentralisierten Lagen, d. h. bei Wasserbehandlungsanlagen, die nicht arbeitsintensiv sind und die zuverlässige Testinstrumente nutzen, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Detektion oder die Quantifizierung von Cryptosporidia in einer Probe bereit, umfassend:

a) das Extrahieren der Probe in einem Extraktionsmedium;
b) das Solubilisieren eines Antigens von Cryptosporidia-Oozysten und/oder -Sporozoiten in diesem Extraktionsmedium;
c) das Ausbilden einer Testmischung, umfassend
i) dieses solubilisierte Antigen
ii) einen für dieses Antigen spezifischen Antikörper
d) das Inkubieren dieser Testmischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Bindung dieses Antikörpers und dieses Antigens zu erlauben, wodurch ein Antikörper-Antigen-Komplex gebildet wird; und
e) das Bestimmen der Anwesenheit dieses Antikörper-Antigen-Komplexes, wodurch Cryptosporidia in der Probe detektiert oder quantifiziert werden.

Die in den Stand-der-Technik-Tests innewohnenden Probleme werden in den auf Elektrochemilumineszenz (ECL) basierenden Tests der Erfindung gelöst. Diese Tests können Cryptosporidium in Wasserquellen detektieren. Diese ECL-Tests sind schnelle Tests für die Detektion oder Quantifizierung von C. parva in dezentralisierten Lagen, d. h. das Wasser wird bei der Behandlungsanlage untersucht. Die einfachen quantitativen Tests sind eine Hauptverbesserung gegenüber den Verfahren des Standes der Technik. Sie sind präzise und empfindlich und werden in wenigen Stunden ohne ausgedehnte Arbeit durchgeführt.
Die Tests können ganze Oozysten oder Fragmente von Oozysten detektieren oder quantifizieren unter Verwendung eines Verfahrens, das zuverlässig, genau und nicht teuer ist und das schnell unter Verwendung von einfacher Ausrüstung durchgeführt werden kann.
Diese Erfindung liegt im weiteren Sinne in einem Verfahren für die Detektion oder Quantifizierung von Cryptosporidium in Wasser durch einen Elektrochemilumineszenztest, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Filtern von Wasser, um einen Schlamm zu gewinnen, der Oozysten von Cryptosporidia enthält;
b) das Extrahieren einer Probe aus dem Schlamm in einem Extraktionsmedium, um wenigstens ein Antigenderivat der Oozysten zu bilden;
c) das Bilden einer Testmischung, umfassend eine Probe des extrahierten Schlamms und einen Antikörper, der für das Antigenderivat spezifisch ist;
d) das Inkubieren der Testmischung, um das Binden des Antikörpers und des Antigenderivats zu erlauben;
e) das Durchführen eines Elektrochemilumineszenztests für den gebundenen Komplex aus Antikörper und Antigenderivat und dadurch Detektieren oder Quantifizieren von Cryptosporidia in dem filtrierten Wasser.

Die Testmischung enthält eine Probe des extrahierten Schlamms, Magnetpartikel, die mit einem ersten Antikörper, der spezifisch ist für ein erstes Epitop des Antigenfragments, markiert sind, eine markierte Probe, umfassend einen zweiten Antikörper, der spezifisch ist für ein zweites Epitop des Antigenderivats, und ein ECL-Testreagenz. Das zweite Epitop kann dasselbe sein oder kann unterschiedlich sein von dem ersten Epitop.
Das Verfahren der Erfindung kann ebenfalls verwendet werden für die Detektion oder Quantifizierung von Sporozoitenantigenen von Cryptosporidia und in Tests, in welchen die äußere Wand von Cryptosporidia-Oozysten und -Sporozoiten, die in den Oozysten enthalten sind, gleichzeitig untersucht werden. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Kit für das Durchführen des Elektrochemilumineszenztests für Cryptosporidia in Wasser, welcher ein Extraktionsmedium für die Extraktion von Antigenderivaten in Oozystenwänden und/oder Sporozoiten aus organischem Schlamm, der aus Wasserfiltration gewonnen worden ist, und einen Antikörper, der spezifisch ist für ein Antigenderivat in dem extrahierten Schlamm, einschließt. Kits für das Durchführen eines Elektrochemilumineszenztests für Cryptosporidium in Wasser können ebenfalls Bestandteile eines Elektrochemilumineszenztests einschließen, einschließlich Magnetpartikeln, die mit einem Antikörper markiert worden sind, der spezifisch für ein Epitop auf einem Antigenderivat von extrahierten Cryptosporidia-Oozysten ist, ECL-Markierungssonden, umfassend einen Antikörper, spezifisch für ein Epitop des Antigenderivats, und Testreagenzien.
Die Verfahren und Tests zum Nachweisen von Cryptosporidium in Umgebungsproben bieten verschiedene Vorteile gegenüber den Detektionsverfahren des Standes der Technik. Der Test kann an dem rohen Schlamm an der Stelle der Filtration, d. h. in einer dezentralisierten Lage, durchgeführt werden, so dass es keinen Bedarf dafür gibt, Proben an eine andere Örtlichkeit für die Analyse zu transportieren. Die unter Verwendung dieser Erfindung gewonnenen Ergebnisse sind präzise, genau, schnell und überwinden die in Vorgängen des Standes der Technik innewohnenden Probleme.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist ein Elektrochemilumineszenztest für die Detektion von Cryptosporidia in Schlamm, der aus einem Rohwasserfilter gewonnen wird. Die Anwesenheit und Menge sowohl von Oozysten und/oder Sporozoiten kann in diesen Tests bestimmt werden. Folglich kann der Test detektieren, ob das Wasser gegenwärtig mit lebenden Parasiten kontaminiert ist oder ob nur leere Oozysten in der Wasserprobe verbleiben. Aus einem Rohwasserfiltrat gesammelter Schlamm wird direkt behandelt, um Antigene in löslicher Form aus dem Parasiten für die Detektion freizusetzen.
Lebende und tote Parasiten können aus der Filtratprobe detektiert werden. Der Test stellt deshalb qualitative oder quantitative Information bereit im Hinblick auf eine vorangegangene Kontamination des Wassers (keine lebensfähigen Parasiten) ebenso wie im Hinblick auf eine gegenwärtige Kontamination (infektiöse, Sporozoiten enthaltende Parasiten).
Das Verfahren umfasst allgemein die folgenden Schritte:

a) Filtern des Wassers, um einen Schlamm zu gewinnen, der Oozysten von Cryptosporidia enthält;
b) Extrahieren einer Probe des Schlamms in einem Extraktionsmedium, um Derivate von Oozysten zu bilden, einschließlich wenigstens ein Antigenderivat;
c) Bilden einer Testmischung, umfassend eine Probe des extrahierten Schlamms und einen Antikörper, der spezifisch für das Antigenderivat ist;
d) Inkubieren der Testmischung, um die Bindung des Antikörpers und des Antigenderivats zu erlauben; und
e) Durchführen eines Elektrochemilumineszenztests für den gebundenen Komplex aus Antikörper und Antigenderivat und dadurch Detektieren oder Quantifizieren der Cryptosporidia.

Glykosilierte Proteine in den Wänden der Oozysten und Sporozoiten dienen als Antigenderivate für diese Tests. Die Protein-, Kohlenwasserstoff- und Lipidzusammensetzung von C. parvum ist divers und komplex. Viele von diesen sind antigenisch und wirken folglich als Ziele der Immunantwort. Identifikation und Charakterisierung von C.-parvum-Antigenen wurde durch Protokolle für das Reinigen von Oozysten und Sporozoiten erleichtert. Viele Protein/Glykoproteinmoleküle aus zertrümmerten Oozysten, gereinigten Oozystenhüllen und gereinigten Sporozoiten im Bereich von < 14 bis 7200 KDA, wurden in proteingefärbten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese-Gelen (SDS-PAGE-Gelen) identifiziert. Für diese glykosilierten Proteine spezifische monoklonale Antikörper in der Wand der Oozyste und des Sporozoiten können in diesen Immuntests verwendet werden.
Der mAb OW3 identifiziert Sporozoiten-cDNS von C. parvum, die eine mutmaßliche 670 Aminosäuren lange Sequenz kodiert, mit einer signifikanten Homologie sowohl zu hsp70 als auch einem 78 kDa großen Glukoseregulierungsprotein. Dieser mAb erkennt ein > 200 kD Oozystenwandantigen von C. parvum auf Westernblots. Obwohl dieses Molekül ein Bestandteil der Oozystenwand sein könnte, sollte die Gly-Gly-Met-Pro-Wiederholung von C.-parvum-hsp70 hochimmunogen sein und einfach eine Antigeneigenschaft gemeinsam haben mit COWP-190. Der mAb OW-IGO, entwickelt, um Antigeneinheiten in der äußeren Hülle von C.-parvum-Oozysten zu detektieren, markiert ebenfalls das fibrilläre Material in der parasitophoren Vakuole entwickelter Makrogameten, Mikrogametozyten und sporulierender Oozysten. Auf Westernblots erkennt der Antikörper Hauptbanden bei 250 und 40 kDa und zusätzlich kleinere Banden. Die meiste Westernblotaktivität wird durch Periodatbehandlung aufgehoben, was wiederum Kohlenhydrate auf der äußeren Wand nahe legt.
Der aus einem Filtrat von Rohwasser gesammelte Schlamm wird behandelt, um die Antigene aus den Parasiten freizusetzen, so dass sie durch Immuntests detektiert werden können. Die Extraktion und Solubilisierung der Antigene erfordert eine Säurebehandlung der Parasiten in der Anwesenheit von Gallensalzen bei annähernd 40°C. Diese Behandlung aktiviert Proteaseenzyme, die dabei helfen, die Oozystenwände abzubauen. Die Probe wird dann mit einer Base wie z. B. Tris behandelt, um einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8 bereitzustellen. Die Probe wird dann mit zerstörenden Mitteln wie ionischen oder nichtionischen Detergenzien und/oder Harnstoff oder Formamid behandelt, inkubiert bei erhöhten Temperaturen in gepufferten Lösungen. Die Probe kann dann mit reduzierenden Mitteln wie Mercaptoethanol oder Dithiothreitol behandelt werden. Überschüssige Gallensalze oder Detergensreagenzien können entfernt oder abgeschieden werden, indem unterschiedliche nichtionische Detergenzien oder BSA oder anderes tierisches Serum-Albumin oder Immunglobulin zu dem Extrakt hinzugefügt wird, wodurch die Zielantigene in Lösung und in einem Zustand belassen werden, bereit, um mit spezifischen komplementären Antikörpern zu binden. Überschüssige chaotrope Mittel können durch Dialyse oder enzymatische Mittel oder durch Chromatographie entfernt werden oder ihre Wirkungen können durch Verdünnung entfernt werden. Überschüssige Reduktionsmittel können entfernt werden durch Behandlung mit: mit Sauerstoff (oder Luft) gesättigter Puffer, Diamid, Iodlösung (0,05 N in Wasser), Tertbutylhydroperoxid, Ferricyanid, Wasserstoffperoxid, Iodacetamid, N-Methylmaleimid, 2-(2-Pyridyl-dithio)-Ethanol.
Die Tests der Erfindung nutzen Vorgänge, um die Parasitenoozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Parasitenoozysten"] mit Gallensalzen bei erhöhten Temperaturen in vitro zu behandeln, um Zystenaustritt zu induzieren und um Antigene sowohl aus den Oozysten als auch aus den Sporozoiten freizusetzen. Diese Antigene können dann in einem Immuntest detektiert und quantifiziert werden.
Die Antigene in Lösung in der behandelten Schlammsuspension, bestehend aus Antigenen, die aus den Oozystenmembranen und den Sporozoiten freigesetzt worden sind, falls vorhanden, werden mit Antikörpern inkubiert, die spezifisch sind für die Antigenderivate, z. B. der Antikörper OW3, der spezifisch ist für ein Oozystenwandantigen von > 200 kD. Der Antikörper OW3 erkennt lineare, sich wiederholende Epitope, charakterisiert aus Westernblot-Experimenten. Lineare Epitope werden nicht zerstört nach der Detergensbehandlung und bleiben deshalb aktiv mit Antikörpern, folgend auf Solubilisierung des Schlamms. Wenn die Antigene erst in Lösung sind, kann der ECL-Immuntest durchgeführt werden.
ECL-Testtechniken stellen eine empfindliche und präzise Messung der Anwesenheit und Konzentration eines Analyten von Interesse bereit. In solchen Techniken wird Elektrochemilumineszenz durch eine Spannung ausgelöst, die auf die Arbeitselektrode einer ECL-Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer bestimmten Weise gelegt wird. Die durch die ECL-Markierung erzeugte Lumineszenz wird gemessen und zeigt die Anwesenheit oder Menge des Analyten an.
Elektrochemilumineszenztests können durchgeführt werden mit oder ohne den Bedarf für einen Auftrennschritt während des Testvorgehens und bei maximalen Signalmodulierungen für verschiedene Analytkonzentrationen, so dass präzise und empfindliche Messungen über einen breiten Konzentrationsbereich des Analyten gemacht werden können. Nichttrenntests schließen jene ein, die mikropartikuläres Material nutzen, das in der Testprobe suspendiert ist, um einen oder mehrere der Bindungsbestandteile des Tests zu binden.
Für eine vollständigere Beschreibung der ECL-Techniken wird Bezug genommen auf die veröffentlichte PCT-Anmeldung US85/01253 (WO86/02734), die veröffentlichte PCT-Anmeldung Nummer US87/00987 und die veröffentlichte PCT-Anmeldung US88/03947. Diese Publikationen und jene, auf die unten Bezug genommen wird, werden durch Bezugnahme eingeschlossen. Während es in der Technik erwartet werden würde, dass Lumineszenz aus elektrochemilumineszierenden Einheiten absorbiert, gestreut oder anderweitig unter Beeinflussung aus dem mikropartikulären Material leiden würde, lehrt die US-Anmeldung mit der Seriennummer 539,389 (veröffentlichte PCT-Anmeldung US89/04919) empfindliche, spezifische Bindungstestverfahren, basierend auf einem Lumineszenzphänomen, worin inertes mikropartikuläres Material spezifisch an einen der Bindungsreaktanden des Testsystems gebunden wird. Die Tests jener Anmeldung können in einem heterogenen Testformat (mit einem oder mehreren Trennschritten) durchgeführt werden und können am vorteilhaftesten in einem homogenen (nicht getrennten) Testformat verwendet werden.
Das Signal aus markierten Arten kann verstärkt werden, indem sie aufkonzentriert werden, bevor sie einem Messschritt ausgesetzt werden. Die US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/255,824, die veröffentlichte PCT-Anmeldung US92/00982, bezieht sich auf ein Verfahren einer partikelbasierten Elektrochemilumineszenzmessung, worin Partikel in engen Kontakt mit der Elektrode gebracht werden unter Verwendung eines Magneten, um ein magnetisches Feld aufzulegen, welches die Partikel an der Elektrode sammelt.
Bei Elektrochemilumineszenztests nützliche Partikel haben vorzugsweise einen Durchmesser von 0,01 bis 200 μm und einen Oberflächenbestandteil, der in der Lage ist, direkt oder direkt an den Analyten zu binden. Die Partikel werden in dem ECL-System suspendiert und sind vorteilhafterweise magnetisch ansprechend.
Der Test erfordert einen Elektrolyten. Allgemein befindet sich der Elektrolyt in der flüssigen Phase, zum Beispiel als eine Lösung eines Salzes in Wasser. Der Elektrolyt ist in gewissen Ausführungen der Erfindung ein gepuffertes System wie eine wässrige Lösung aus Natriumphosphat/Natriumchlorid oder eine wässrige Lösung aus Natriumphosphat/Natriumfluorid.
Wie beschrieben in der veröffentlichten PCT-Anmeldung US89/04859, ist es wünschenswert, ein Reduktionsmittel, typischerweise ein Amin oder eine Amineinheit (von einem größeren Molekül) einzuschließen, das oxidiert werden kann und spontan abgebaut werden kann, um es in eine hochreduzierende Art umzuwandeln, was wiederum das Elektrochemilumineszenzphänomen erleichtert. Ein großer Bereich von Aminen und entsprechenden Amineinheiten kann genutzt werden beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung. Amine (und entsprechende davon abgeleitete Einheiten), die vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung genutzt werden, einschließlich aliphatischen Aminen, wie primären, sekundären und tertiären Alkylaminen, deren Alkylgruppen von eins bis drei Kohlenstoffatomen haben, ebenso wie substituierte aliphatische Amine. Tripropylamin wird besonders bevorzugt.
Wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung US89/04915 beschrieben, werden die Tests der Erfindung wünschenswerterweise in der Anwesenheit eines Enhancers durchgeführt, der in einer Menge genutzt wird, die ausreichend ist, so dass in seiner Anwesenheit die gewünschte Zunahme in der Emission elektromagnetischer Strahlung erfolgt, typischerweise eine Verbindung der Formel
worin R Wasserstoff oder C_nH_2n+1, R' C_nH_2n, X 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist.
Die Vorrichtung zur Durchführung der Tests der Erfindung schließt eine Arbeitselektrode oder eine andere auslösende Oberfläche ein, um ein elektrisches Potenzial anzulegen, um die Reaktionen auszulösen, die die partikelgekoppelte ECL-Einheit dazu bringt, Elektrochemilumineszenz zu zeigen, und Magnete, die in der Lage sind, die partikelgekoppelte ECL-Einheit an der Elektrode zu sammeln. Weitere Gerätedetails zur Durchführung des ECL-Tests der Erfindung werden offenbart in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen US89/04854 und US90/01370.
Die Tests der Erfindung können in jedem der üblichen Formate, d. h. direkte, indirekte, vorwärts-, rückwärts- oder kompetitive Formate, durchgeführt werden. Sandwichimmuntests, wie sie in dem Gebiet der Diagnostik im Allgemeinen wohl bekannt und in der ECL-Detektion besonders bekannt sind, werden bevorzugt. Solche Tests schließen einen Analyten (Antigen) ein, der durch zwei Antikörper gebunden wird: einen „primären" oder Fangantikörper, der an eine feste Oberfläche gebunden ist, indem er zum Beispiel mit Biotin markiert ist, und einen „sekundären" oder Markierungsantikörper, der markiert ist mit einer chemilumineszierenden Art wie Ru(bpy)₃ ²⁺. Folglich wird in solch einem Test ein mit Streptavidin überzogener fester Untergrund an einen biotinylierten primären Antikörper gebunden. Der primäre Antikörper wird an den Analyten gebunden (das Antigen, falls vorhanden), welches Antigen an den mit Ru(bpy)₃ ²⁺ markierten sekundären Antikörper gebunden ist.
In der Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper der spezifisch ist für ein erstes Epitop eines Antigens von Interesse – OW3 in dem Falle eines Tests für Oozystenantigene, E3E in dem Falle eines Tests für Sporozoitenantigene – an Biotin konjugiert. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch ist für ein zweites Epitop des Antigens von Interesse (welches dasselbe sein kann, wie das erste Epitop) wird an eine ECL-Markierung („TAG") konjugiert. Der extrahierte Schlamm und eine Lösung aus dem biotinylierten Antikörper werden vereinigt und inkubiert. Der TAG-markierte Antikörper wird dann hinzugefügt und wird inkubiert, um das Binden von TAG-markierten Antikörpern und Analyten zu erlauben. Nach dieser Inkubation wird eine Suspension aus mit Streptavadin überzogenen Perlen hinzugefügt, um mit dem Biotin auf dem primären Antikörper zu kombinieren.
Der Oozytenantigenimmunkomplex wird nachgewiesen unter Verwendung eines Analysegerätes mit dem ORIGEN^®-Analyzer. ORIGEN^®-Analyzer und Reagenzien sind erhältlich von Igen, Inc., Gaithersburg, MD. Der Immunkomplex, der bei diesem Vorgehen quantifiziert wird, besteht aus den mit Streptavidin überzogenen Perlen, gebunden durch Biotin an den Komplex des Antikörpers, OW3, der gebunden ist an das für OW3 spezifische Antigen, welches wiederum gebunden ist an einen anderen OW3 Antikörper, konjugiert mit der elektrochemilumineszierenden Einheit, die das Licht in dem Analysegerät produziert. Die magnetischen Perlen und der gebundene Sandwich werden an die Oberfläche der Elektrode durch einen Magneten gebracht, der verbunden ist mit der Flusszelle. Eine Spannung wird an die Elektrode angelegt. Durch die ECL-Einheit erzeugtes Licht wird detektiert und quantifiziert durch einen Photomultiplier.
Das bei der Behandlung des aus dem Wasserfilter gesammelten Schlamms erzeugte solubilisierte Material schließt sämtliche der Antigenderivate von C. parvum in dem filtrierten Wasser ein. Folglich kann eine einzelne Zubereitung des solubilisierten Materials verwendet werden, um es sowohl für die Cryptosporidium-Oozysten als auch die -Sporozoiten, die es enthält, zu untersuchen. Es ist wichtig, sowohl die Anzahl lebensfähiger Sporozoiten in dem Wasser zu quantifizieren, da sie die für den Menschen infektiöse Form des Parasiten darstellen, als auch die Oozysten, aus welchen sie befreit worden sein könnten. Die letztere Messung kann eine gegenwärtige Konzentration lebensfähiger Oozysten oder eine Konzentration unlebensfähiger Oozysten darstellen, was eine Geschichte der Kontamination erkennen lässt.
Der monoklonale Antikörper 3E3 ist spezifisch für das hochimmunogene, 27 kD große Sporozoitenoberflächenantigen (p27). Der monoklonale Antikörper 3E3 wird mit Biotin konjugiert und wird aus der Reaktionsmischung aufgereinigt. Ein polyklonales Antiserum, das gegen dasselbe hochimmunogene 27 kD große Sporozoitenoberflächenantigen (p27) zubereitet worden ist, wird mit einem TAG konjugiert und wird dann aus der Reaktionsmischung aufgereinigt. Eine Lösung des biotinylierten Antikörpers (in einer Testverdünnung) wird zu dem behandelten Schlamm hinzugefügt und wird für ungefähr eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung des TAG-markierten Antiserums (in Testverdünnung) wird dann zu der Mischung hinzugefügt und unter denselben Bedingungen inkubiert. Nach dieser Inkubation wird eine Suspension aus mit Streptavadin überzogenen Perlen hinzugefügt und für ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Sporozoit-Antigen-Immunkomplex wird unter Verwendung eines Analysegeräts (wie der ORIGEN^®-Analyzer) detektiert, wie oben beschrieben.
Die Detektions- oder Quantifikationstests für eines oder beide der Oozysten- oder Sporozoitenantigene können im Wesentlichen gleichzeitig, d. h. nacheinander durchgeführt werden. Ein signifikanter Vorteil gegenüber den Verfahren des Standes der Technik liegt darin, dass man bestimmen kann, ob die Wasserprobe tatsächlich mit lebenden Sporozoiten infiziert ist oder ob dort nur nichtinfektiöse leere Oozyten [Anmerkung des Übersetzers: muss wohl heißen „Oozysten"] vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem Wasserfilter gesammelte Schlamm direkt ohne ausgedehnte Vorbehandlung analysiert werden.
Das Verfahren und der Test der Erfindung werden weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
SAMMELN DER WASSERPROBE
100 bis 1000 Liter trinkbares/sauberes Wasser wird durch ein Filter vom Cuno-Typ filtriert. Die Filtermembran, zusammen mit dem Schlammfiltrat, wird freigeschnitten und aus dem Halter entfernt. Die Membranscheibe wird in einen Plastikbehälter gegeben und 1 Liter einer 0,1% Tween-80-Detergenslösung wird zu dem Container hinzugefügt. Das Filter wird für 20 Minuten geschüttelt und die Schlammlösung wird in eine Zentrifugenflasche dekantiert. Ein zweiter Liter Detergenslösung wird zu dem Container hinzugefügt und das Filter wird wiederum für 20 Minuten geschüttelt. Der zweite Liter wird dann in eine Zentrifugenflasche dekantiert und die 2-Liter-Schlammfiltratsuspension wird bei 7280 g für 12 Minuten zentrifugiert. Die Flaschen werden aus der Zentrifuge entfernt und die überständige Flüssigkeit wird vorsichtig abgesaugt, um ein Pellet in annähernd 20 bis 30 ml Flüssigkeit in den Flaschen zu belassen. Die verbleibende Flüssigkeit wird kräftig geschüttelt, um das Pellet zu resuspendieren und wird in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen übertragen. Die Flasche wird mit einer 0,1% Tween-80-Lösung gespült und wird zu einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von ≈ 5 ml destilliertem Wasser, falls nötig, hinzugefügt, um die Zentrifugenröhrchen auszubalancieren. Die 50 ml-Röhrchen werden bei 2190 g für 10 Minuten zentrifugiert und die überständige Flüssigkeit wird dekantiert. Die zwei Pellets werden vereinigt und resuspendiert. Das Endvolumen des Konzentrats wird in Mikrolitern mit einem Pipetman gemessen.
BEISPIEL 2
SOLUBILISIERUNG DER CRYPTOSPORIDIUMANTIGENE
50% des Volumens des in Beispiel 1 gewonnenen resuspendierten Konzentrates wird in ein sauberes 50 ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert. Eine 10fach konzentrierte Stammlösung aus basischer Hanks Salzlösung (HBSS) wird auf einen pH-Wert von 2,5 mit HCl angepasst. Eine vorbestimmte Menge der 10 × konzentrierten HBSS mit niedrigem pH-Wert und eine vorbestimmte Menge einer 5%-Stammlösung aus Rindergallensalzen werden zu der Schlammsuspension hinzugefügt, um Endkonzentrationen von 0,5% Gallensalzen und 1 × HBSS zu ergeben. Die Schlammsuspension wird dann bei 40°C für 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wird die Lösung auf einen pH-Wert von 7 mit Tris-Base angepasst und eine 3%ige Stammlösung aus Natriumdodecylsulfat wird hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3% zu ergeben. Eine vorbestimmte Menge 200 mM Mercaptoethanol oder 100 mM Dithiothreitol wird hinzugefügt, um eine Endkonzentration aus 20 mM Mercaptoethanol oder 10 mM Dithiothreitol zu ergeben. Die Suspension wird vermischt und bei 40°C für 1 Stunde inkubiert. N-Methylmaleimid wird hinzugefügt auf eine Endkonzentration von 20 mM. 5% Stammlösung aus Triton X-100 wird hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,5% zu ergeben und Rinderserum-Albumin wird dann zu der Inkubationsmischung hinzugefügt auf eine Endkonzentration von 2%, um überschüssiges Detergens abzusondern und dadurch die Immunreaktivität in der Anwesenheit der Detergenzien zu verbessern. Die Lösung wird vermischt und das Endvolumen der Extraktionsmischung wird gemessen in Mikrolitern mit einem Pipetman.
Dieses Extrakt ist äquivalent zu 50% des durch den Filter geführten Volumens. Das Volumen des zu analysierenden Extraktes kann wie folgt berechnet werden: Teile das Extraktvolumen in Mikrolitern durch die Anzahl an Litern des beprobten Wassers. Dies wird ein Volumenverhältnis von Mikrolitern Extrakt pro Liter Wasserprobe ergeben. Das zu analysierende Wasserprobenäquivalent sollte wenigstens 10% des über das Filter passierten Wasservolumens sein. Folglich sollten 20% des Extraktes analysiert werden. Das zu analysierende Immuntestvolumen sollte zwischen 20 und 50 Mikrolitern betragen.
BEISPIEL 3
ZUBEREITUNG DES OW3/OBIGEN-TAG-NHS-ESTER KONJUGATES
0,5 mg OW3-Protein werden in 500 μl PBS, pH 7,8, in einem Polypropylengefäß gelöst. Konzentrierende Ultrafiltrationsvorrichtungen werden verwendet, um einen Pufferaustausch und eine Konzentration des Proteins zu erreichen. OBIGEN-TAG-NHS-Ester Stammlösung wird zubereitet durch hinzufügen von 50 μl DMSO zu den 75 μg Fläschchen TAG-NH3-Ester (Igen). Das Fläschchen wird sanft verwirbelt, um den Boden und die Unterseiten des Fläschchens mit dem DMSO zu benetzen. Dieses DMSO-Volumen löst 75 pg OBIGEN-TAG-NHS-Ester, was in einer 1,5 μg/μl Stammlösung resultiert.
Ein molares Verhältnis von 25:1 OBIGEN-TAG-NHS-Ester wird hinzugefügt zu der obigen OW3-Lösung in einer Konzentration von 1 mg/ml. Basierend auf Molekulargewichten von 1057 bzw. 750000 werden 35 μg/μl des OBIGEN-TAG-NHS-Esters zu der Proteinlösung hinzugefügt. Der verbleibende OBIGEN-TAG-NHS-Ester wird verworfen. Die Inhalte des Fläschchens werden verwirbelt und bei Dunkelheit bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von 20 μl 2 M Glycin und durch Inkubieren bei Dunkelheit bei Raumtemperatur für zusätzliche 10 Minuten gestoppt.
Ungekoppelte OBIGEN-TAG-Markierung wird entfernt durch Laden der Mischen auf eine PD-10-Säule (eine von Pharmacia hergestellte, vorgepackte Sephadex G-25 Säule), die zuvor mit PBS äquilibriert worden ist, welches Natriumacid oder Thimerosol enthält. Wegen der langen Auftrennungszeit der Säule wird sie mit Aluminiumfolie bedeckt, um das Konjugat vor Licht abzuschirmen. Zwei gelbe Banden bildeten sich, indem die Auftrennung des gebunden von freiem OBIGEN-TAG fortschritt. Das markierte Protein eluierte als erstes, gefolgt von einer zweiten Bande, entsprechend unkonjugiertem OBIGEN-TAG. Acht 0,5 ml Fraktionen werden gesammelt, nachdem das Probenvolumen in das Harzbett eindrang.
Die Proteinkonzentration in Mol pro Liter wurde bestimmt durch Verwendung eines Standardproteintests (z. B. Bradford, Lowry oder ein Pierce BCA Protein-Test-Kit). Eine Extinktion, abgelesen bei einem OD von 280 nm, wird vermieden, da der TAG die Extinktion bei diesen Wellenlängen nicht ändert. Die Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt, um die endgültige vereinigte Proteinkonzentration und die Molarität zu bestimmen. Der Prozentsatz an wiedergewonnenem Protein bewegte sich im Bereich von 70–90%, in Abhängigkeit von der genutzten Auftrennungstechnik.
Die Extinktion des TAG-OW3 bei 455 nm wird gemessen unter Verwendung einer Küvette mit 1 cm Weglänge. Der Extinktionswert wird geteilt durch 13700, um die OBIGEN-TAG-Konzentration in Mol pro Liter zu erhalten. Das OBIGEN-TAG:OW3-Verhältnis wird berechnet durch Teilen des zuvor gewonnenen Wertes für die OBIGEN-TAG-Konzentration durch den zuvor gewonnenen Wert für die Proteinkonzentration.
MARKIEREN DES DAS P27-ANTIGEN ERKENNENDEN ANTIKÖRPERS
Sporozoiten-(p27-)Antigen wurde zubereitet durch Immunaufreinigung auf einer festen Phase unter Verwendung von 3E3-Antikörper aus Extrakten, zubereitet wie beschrieben in Beispiel 2, mit der Ausnahme, das Cryptosporidium in einer hochkonzentrierten Form aus infizierten Kälbern gewonnen worden war. Kaninchen wurden nach gewöhnlichen Verfahren immunisiert. Antikörper wurden zubereitet unter Verwendung von Standardtechniken. Diese Antikörper wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Protokoll markiert.
Das Protokoll, dem gefolgt wird, ist wie oben. beschrieben für OW3, mit der Ausnahme, dass 17,6 μg (11,7 μl einer 1,5 μg/μl Lösung, zubereitet aus dem 75 pg TAG-Produkt) des ORIGEN-TAG-NHS-Esters zu der Proteinlösung hinzugefügt werden.
BEISPIEL 4
BIOTINYLIERUNG DES OW3-ANTIGENS
1,5 mg OW3-Antikörper werden gelöst in 1,5 ml 150 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, enthaltend 150 mM Natriumchlorid, und werden in 0,5 ml Fraktionen aliquotiert.
1 mg ORIGEN-Biotin-LC-Sulfo-NHS-Ester in 0,5 ml sterilem destilliertem Wasser wird unmittelbar vor der Verwendung gelöst, was in einer 2 mg/ml Lösung resultiert. Um ein Molverhältnis von 10:1, 20:1 oder 40:1 ORIGEN-Biotin-LC-NHS-Ester auf 0,5 mg Antikörper in 0,5 ml Puffer zu erreichen, werden 9,3, 18,5 bzw. 37 μl des Biotinylierungsreagens zu den Antikörperaliquoten hinzugefügt. Die Lösung wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und wird durch die Zugabe von 20 μl 2 M Glycin gequencht.
Nicht umgesetzter ORIGEN-Biotin-LC-Sulfo-NHS-Ester wird entfernt, indem die Antikörperlösung gegen den gewünschten Endpuffer an PBS, enthaltend 0,02% NaN₃, dialysiert wird. Gelfiltration auf einer entsalzenden Säule geeigneter Größe (wie eine PD-10-Wegwerfsäule von Pharmacia) oder einer Spinsäule oder die Verwendung eines Mikrokonzentrators wie Centricon-20 (Amicon) können ebenfalls genutzt werden, um nicht umgesetzten ORIGEN-Biotin-LC-Sulfo-NHS-Ester zu entfernen. Der biotinylierte Antikörper wird bei 4°C gelagert, bis er für die Verwendung fertig ist.
BIOTINYLIERUNG EINES 3E3-ANTIKÖRPERS
Dieses Vorgehen ist wie oben für den OW3-Antikörper beschrieben.
BEISPIEL 4
TEST FÜR OOZYSTENANTIGENE
Eine 30-Mikroliter-Probe des behandelten Schlamms (Beispiel 2) wird in ein 12 × 70 mm Teströhrchen pipettiert. 25 Mikroliter einer 2 mg/ml Lösung des biotinylierten OW3-Antikörpers (Beispiel 4) in ORIGEN-Testverdünnungsmittel (ORIGEN Assay Diluent; erhältlich von IGEN) wird zu dem Röhrchen hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern der 2 mg/ml Lösung des TAG-markierten OW3-Antikörpers in ORIGEN-Testverdünnungsmittel (Beispiel 3). Die Mischung wird bei 37°C für 2 Stunden inkubiert, wobei periodisch gemischt wird. Nach der Inkubation werden 25 Mikroliter einer 1 mg/ml Suspension aus mit Streptavadin überzogenen 2,8 Micron Dynalperlen (äquivalent zu 25 Mikrogramm) in ORIGEN-Testverdünnungsmittel hinzugefügt. Die Mischung wird wiederum für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Immuntestinkubationsmischung wird dann auf 300 Mikroliter mit ORIGEN-Testpuffer verdünnt.
Das Röhrchen wird in das Karussell des ORIGEN-Analyzer gestellt und der Testzyklus wird gestartet. Unter Verwendung einer Rollkolbenpumpe zieht das Gerät eine Aliquote der Probe aus dem Karussellröhrchen und transportiert es zu der elektrochemischen Durchflusszelle. Die paramagnetischen Perlen werden an der Elektrode durch einen Magneten gesammelt, der mit der Durchflusszelle verbunden ist. Danach wird eine Spannung an die Elektrode angelegt. Durch TAG erzeugtes Licht wird detektiert oder quantifiziert durch einen Photomultiplier.
Der Immuntest wird kalibriert, indem für bekannte Mengen an Cryptosporidium-Oozysten untersucht wird, gezählt durch allgemein anerkannte Vorgänge unter Verwendung eines Durchflusszytometers. Die Kalibratorlösung wird aus frisch isolierten Oozysten aus dem Stuhl infizierter Patienten zubereitet.
TEST FÜR SPOROZOITENANTIGEN
Das Testvorgehen für das Sporozoitenantigen ist wie für den Oozystenantigentest, oben beschrieben, mit der Ausnahme der Verwendung von 3E3-Antikörpern.
Der Immuntest wird kalibriert, indem für bekannte Mengen an Cryptosporidium-Oozysten, die lebende Sporozoiten enthalten, untersucht wird. Die Kalibratorlösung wird aus frisch isolierten Oozysten aus dem Stuhl infizierter Patienten zubereitet und wird durch allgemein anerkannte Vorgänge unter Verwendung eines Durchflusszytometers gezählt.
BEISPIEL 6
GLEICHZEITIGER TEST FÜR OOZYSTEN- UND SPOROZOITENANTIGEN
Die ECL-Immuntests der Beispiele 7 und 8 können gleichzeitig (entweder zeitgleich oder in schneller Folge) durchgeführt werden. Das in Beispiel 1 gewonnene Konzentrat wird solubilisiert wie beschrieben in Beispiel 2. Das solubilisierte Produkt wird in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Die Teile werden dann unter Verwendung der in den Beispielen 3 bis 5 beschriebenen Verfahren untersucht.

Claims

Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Cryptosporidia in einer Probe, umfassend: (a) das Extrahieren der Probe in einem Extraktionsmedium; (b) das Solubilisieren eines Antigens von Cryptosporidia-Oocysten und/oder -Sporozoiten in dem Extraktionsmedium; (c) das Ausbilden einer Testmischung, umfassend: (i) das solubilisierte Antigen und (ii) einen für das Antigen spezifischen Antikörper; (d) das Inkubieren der Testmischung unter ausreichenden Bedingungen, um die Bindung des Antikörpers und des Antigens zu gestatten, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex gebildet wird; und (e) das Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Antigen-Komplexes und dadurch Detektieren oder Quantifizieren von Cryptosporidia in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe eine Wasserprobe ist und worin der Verfahrensschritt a) aus Anspruch 1 das Filtrieren der Wasserprobe zum Erhalt eines Schlammes, der Oocysten und/oder Sporozoiten von Cryptosporidia umfasst, die in der Wasserprobe vorhanden sind, und das Extrahieren einer Probe des Schlamms in einem Extraktionsmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Antikörper an einen Marker gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Marker Biotin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Marker eine elektrochemilumineszente Einheit ist und worin der Antikörper/Antigen-Komplex über eine Elektrochemilumineszenzmessung bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Extraktionsmedium ein Gallen(säure)salz oder ein ionisches Detergens umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Extraktionsmedium sauer ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Solubilisierung bei erhöhter Temperatur ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Extraktionsmedium zusätzlich ein Protein in ausreichender Menge umfasst, um das Detergens zu sequestrieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe ein durch das Filtrieren eines Volumens an Wasser gebildeter Schlamm ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Antigen ein äußeres Zellwandantigen eines Oocysten ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Antikörper an einen Marker gebunden ist, die Testmischung zusätzlich einen zweiten Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist, und einen festen Träger enthält, der an den zweiten Antikörper gebunden ist oder diesen einfangen kann, und worin der Antikörper/Antigen-Komplex zusätzlich den zweiten Antikörper und den festen Träger umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend: (a) das Solubilisieren von Antigenen von Oocysten von Cryptosporidia in dem Extraktionsmedium, eingeschlossen mindestens ein erstes Antigen von der (a) äußeren Wand der Oocysten und mindestens ein zweites Antigen eines Sporozoiten, enthaltend in den Oocysten; (b) Bilden einer ersten Testmischung, umfassend: (i) einen ersten Teil der solubilisierten Antigene und (ii) einen ersten Antikörper, der für das erste Antigen spezifisch ist; (c) Ausbilden einer zweiten Testmischung, umfassend: (i) einen zweiten Teil der solubilisierten Antigene und (ii) einen zweiten Antikörper, spezifisch für das zweite Antigen, (d) das Inkubieren der ersten Testmischung unter ausreichenden Bedingungen, um eine Bindung des ersten Antikörpers und des ersten Antigens zur Bildung eines ersten Antikörper/Antigen-Komplexes zu gestatten; (e) das Inkubieren der zweiten Testmischung unter ausreichenden Bedingungen, um die Bindung des zweiten Antikörpers und des zweiten Antigens und dadurch Bildung eines zweiten Antikörper/Antigen-Komplexes zu gestatten; (f) das Bestimmen der Anwesenheit des ersten Antikörper/Antigen-Komplexes, und (g) das Bestimmen der Anwesenheit des zweiten Antikörper/Antigen-Komplexes, dadurch Detektieren oder Quantifizieren sowohl der Oocysten als auch der Sporozoiten in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die erste Testmischung umfasst: (i) einen ersten Teil der solubilisierten Antigene, (ii) einen ersten Einfangantikörper, spezifisch für das erste Antigen, (iii) eine erste Markersonde, umfassend einen ersten Markerantikörper, spezifisch für das erste Antigen, und eine erste elektrochemolumineszente Einheit, und (iv) ein erstes Magnetteilchen, gebunden an oder befähigt zum Einfangen des ersten Einfangantikörpers; und worin die zweite Testmischung umfasst: (i) einen zweiten Teil der solubilisierten Antigene, (ii) einen zweiten Einfangantikörper, spezifisch für das zweite Antigen, (iii) eine zweite Markersonde, umfassend einen zweiten Markerantikörper, spezifisch für das zweite Antigen, und eine zweite elektrochemolumineszente Einheit, und (iv) ein zweites Magnetteilchen, gebunden an oder befähigt zum Einfangen des zweiten Einfangantikörpers; und worin der Verfahrensschritt (d) das Inkubieren der ersten Testmischung unter ausreichenden Bedingungen zur Bildung eines ersten Komplexes umfasst, umfassend das erste Magnetteilchen, den ersten Einfangantikörper, das erste Antigen und die erste Markersonde; und worin Verfahrensschritt (e) das Inkubieren der zweiten Testmischung unter ausreichenden Bedingungen zur Bildung eines zweiten Komplexes umfasst, umfassend das zweite Magnetteilchen, den zweiten Einfangantikörper, das zweite Antigen und die zweite Markersonde.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend: (a) Bilden einer ersten Testmischung, umfassend: (i) das solubilisierte Antigen, (ii) einen Einfangantikörper, spezifisch für das Antigen, (iii) eine Markersonde, umfassend einen Markerantikörper, spezifisch für das Antigen, und eine elektrochemolumineszente Einheit, und (iv) ein Magnetteilchen, gebunden an oder befähigt zum Einfangen des Einfangantikörpers; (b) Inkubieren der ersten Testmischung unter zur Bildung eines ersten Komplexes ausreichenden Bedingungen, der umfasst das Magnetteilchen, den Einfangantikörper, das Antigen und die Markersonde; und (c) das Durchführen eines Elektrochemolumineszenztests auf den ersten Komplex, dadurch Detektieren oder Quantifizieren von Cryptosporidia in der Probe.
Materiezusammensetzung, umfassend: (a) einen Schlamm, gebildet durch Filtrieren einer Wasserprobe, (b) ein Extraktionsmedium, umfassend mindestens ein Detergens in einer zum Solubilisieren mindestens eines Antigens von Cryptosporidia-Oocysten ausreichenden Menge; und (c) einen Komplex, umfassend das Antigen und einen für das Antigen spezifischen Antikörper.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Detergens ein Gallen(säure)salz oder ein ionisches Detergens ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Antigen ein äußeres Zellwandantigen von Oocysten ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin der pH-Wert der Zusammensetzung im Bereich von etwa 4–8 liegt.
Kit zum Quantifizieren von Cryptosporidia in einer Probe, umfassend in einem oder mehreren Behältern: (a) ein Extraktionsmedium, umfassend mindestens ein Gallen(säure)salz oder ionisches Detergens in einer zum Solubilisieren mindestens eines Zellwandantigens von Cryptosporidia-Oocysten ausreichenden Menge, und (b) einen für das Antigen spezifischen Antikörper.
Kit nach Anspruch 20, worin der Antikörper mit Biotin markiert ist.
Kit nach Anspruch 20, worin der Antikörper mit einer elektrochemilumineszenten Einheit markiert ist.
Kit nach Anspruch 20, umfassend: (a) einen für das Antigen spezifischen Einfangantikörper; (b) einen für das Antigen spezifischen Markerantikörper; und (c) einen festen Träger, gebunden an oder befähigt zum Einfangen des Einfangantikörpers.
Kit nach Anspruch 23, worin der Einfangantikörper mit Biotin markiert ist, worin der Markerantikörper mit einem elektrochemilumineszenten Marker markiert ist und worin der feste Träger ein mit Streptavidin beschichtetes Magnetkügelchen ist.
Kit nach Anspruch 20 oder 23, zusätzlich umfassend einen gepufferten, Proteinenthaltenden Testverdünner.
Extrakt von Oocysten von Cryptosporidia, umfassend: (a) ein Extraktionsmedium, umfassend eine zum Puffern des Mediums auf einen niedrigen pH-Wert befähigte Substanz und ein oberflächenaktives Mittel und (b) Derivate der Oocysten, umfassend mindestens ein antigenisches Derivat, das zum Komplexieren mit einem Antikörper zur Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes befähigt ist, der über einen Immunoassay detektierbar ist.
Extrakt von Oocysten nach Anspruch 26, umfassend mindestens ein antigenes Derivat der äußeren Oocystenwand und mindestens ein antigenes Derivat des Sporozoiten in dem Oocysten, worin mindestens eines der Derivate zur Komplexbildung mit einem Antikörper zur Bildung eines Antikörper/Antigen-Komplexes befähigt ist, der durch einen Immunoassay detektierbar ist.