CN105228649A

CN105228649A - Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物

Info

Publication number: CN105228649A
Application number: CN201380076444.7A
Authority: CN
Inventors: G.J.道森; F.M.德赛; R.A.古铁雷斯; A.S.米尔霍夫; J.普罗斯特科
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG; Abbott Laboratories
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: US20140272933A1; CA2906421A1; US9841427B2; US9194873B2; CA2906421C; US20160123983A1; EP2968526A1; MX362075B; JP2016516989A; WO2014158272A1; US20170003290A9; JP6505076B2; BR112015023239A2; EP2968526A4; CN105228649B; BR112015023239A8; MX2015012823A

Abstract

本发明一般地涉及用于同时检测试验样品中的HCV抗原和抗-HCV抗体的组合免疫测定、试剂和试剂盒。

Description

HCV抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物

相关申请

本申请作为要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/785,124和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/788,136的优先权权益的PCT申请提交。前述申请的整个文本通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及用于检测和诊断HCV感染的免疫测定法。更具体地，本发明涉及用于同时检测试验样品中的HCV抗原和抗-HCV抗体的组合免疫测定法、试剂和试剂盒。

背景技术

根据WHO统计，全世界多达1.7亿人被丙型肝炎病毒(HCV)感染，即肝脏的一种病毒性感染。75-85%的被HCV感染的人会发展成慢性感染，这些病例中的大约20%会发展慢性丙型肝炎的并发症，包括感染20年以后的肝硬化或肝细胞癌。当前推荐的HCV感染的治疗是干扰素和利巴韦林药物的组合，但是，该治疗并不是在所有情况下都是有效的，并且在丙型肝炎相关的末期肝病中指示肝移植。目前，没有可用于预防HCV感染的疫苗，因此必须采取所有预防措施来避免感染。

因而，患者护理、以及通过血液和血液制品或通过亲近人接触发生的丙型肝炎病毒(HCV)的传播的预防需要使用灵敏检测测定的极度警觉。这会建立对用于筛查和鉴定HCV的载体和HCV-污染的血液或血液制品的特定方法的需求。HCV暴露的血清学测定依赖于存在于人血浆或血清中的HCV的检测。这可以通过检测由该病毒编码的独特结构蛋白和非结构蛋白来完成，或可替换地通过检测HCV的抗体来完成。

暴露于HCV病原体以后，最初没有病毒存在的证据，即没有可检测的病毒RNA或血清学标志物。这被称作“窗口阶段”(WP)。通常，在暴露于HCV以后10天后，可以检测到病毒RNA，而抗-HCV抗体在大约70天以后变成可检测的(Busch M P和Dodd R Y, Transfusion 40(10): 1157-1160, 2000)。HCV感染传播的预防，越来越重要的是具有设计成缩窄检测窗的可靠血液筛查试验。

存在众多基于血液的血清学筛查而检测HCV感染的方法，其用于检测HCV核心抗原或针对HCV多肽的抗体在患者血清或血浆中的存在。已经指出，针对HCV核心抗原测定的检测的测定会比基于抗体筛查测定的HCV筛查早40-50天检测HCV感染。HCV核心蛋白是包含多蛋白的前191个氨基酸的HCV的结构蛋白，且其形成将基因组RNA衣壳化的内部病毒包膜。已经开发了2种不同类型的血清学测定，其允许检测血清中的HCV核心抗原。一种测定形式检测血清转化之前受试者中的HCV核心抗原并用在筛查血液供体中，而另一种测定形式仅检测丙型肝炎患者中的核心抗原（不论它们的HCV抗体状态），且用在临床实验室中以诊断向HCV的暴露或监测抗病毒疗法。

但是，HCV核心抗原血液筛查测定通常仅检测在血清转化前阶段或血清转化后早期阶段的核心抗原。此外，当抗原在血清转化晚期与抗-核心抗体形成免疫-复合物时，HCV核心抗原测定不能检测核心抗原。这会建立对这样的血清学测定的需要：其可以检测血清转化前阶段的HCV核心抗原以及血清转化阶段的抗-HCV抗体，从而显著地缩窄WP。

这样的组合HCV筛查测定的实用性是显著的，因为就缩窄WP而言，这样的测定将是对当前血清学血液筛查方法的显著改善。但是，成功的抗原抗体组合测定的挑战之一是，选择适当的抗原和抗体用于执行这样的测定。本发明解决了该需要。

发明内容

本发明一般地涉及用于同时检测试验样品中的HCV抗原和抗-HCV抗体的组合免疫测定法、试剂和试剂盒，更具体地，本发明描述了用于组合检测试验样品中的HCV抗原和HCV抗体的免疫测定法，其包括：

a)同时提供下述试剂：

i. 能够结合生物素的固相

ii. 生物素化的抗-HCV抗体，其用于捕获存在于所述试验样品中的HCV抗原；

iii. 生物素化的HCV抗原，其用于捕获试验样品中的抗-HCV抗体；和

iv. 可检测地标记的HCV抗原，其用于结合被(iii)的生物素化的HCV抗原捕获的抗-HCV抗体；和

b)在产生反应混合物的条件下温育步骤(a)的试剂，其中

(i) (a)(ii)的生物素化的抗-HCV抗体通过生物素结合至固相并特异性地结合存在于所述试验样品中的HCV抗原以产生捕获在固相上的抗-HCV抗体-HCV抗原复合物；

(ii) (a)(iii)的生物素化的抗原通过生物素结合至固相并特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(iv)的可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体；

c)将包含附着的捕获的抗体和捕获的HCV抗原的固相与未反应的试验样品和试剂分离

d. 使分离的固相与可检测地标记的缀合物抗体接触，所述缀合物抗体结合在(b)(ii)的抗-HCV抗体-HCV抗原复合物中捕获的HCV抗原；和

e. 在触发信号后，检测从可检测标记物部分产生的信号，其中信号的存在指示HCV在试验样品中的存在。

在一个示例性实施方案中，所述免疫测定法可以进一步包括：

(a)提供

(v) 第二种生物素化的HCV抗原，其用于捕获试验样品中的抗-HCV抗体，其中所述第二种HCV抗原不同于步骤(aiii)中的HCV抗原；和

(vi). 可检测地标记的HCV抗原，其用于结合被(v)的生物素化的HCV抗原捕获的抗-HCV抗体；和

(b) (iii) (a)(v)的生物素化的抗原通过生物素结合至固相且特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(vi)的可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体。

这样的免疫测定法也可以如下检测第三种或多种另外的HCV抗原：

(a)提供

(vii) 第三种(或多种另外的)生物素化的HCV抗原，其用于捕获试验样品中的抗-HCV抗体，其中所述第三种HCV抗原不同于步骤1(a)(iii)或步骤2(a)(v)中的HCV抗原；和

(viii) 可检测地标记的HCV抗原，其用于结合被(vii)的生物素化的HCV抗原捕获的抗-HCV抗体；和

(b) (iv) (a)(vii)的生物素化的抗原通过生物素结合至固相且特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(viii)的可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体。

本发明的另一个方面描述了用于同时检测试验样品中的HCV抗原和HCV抗体的免疫测定法，其中所述组合测定包含：

a. 第一捕获抗原，其包含第一HCV蛋白的肽序列；

b. 第一检测抗原，其包含第一HCV蛋白的肽序列且进一步包含可检测标记物

c. 第二捕获抗原，其包含得自第二HCV蛋白的抗原序列

d. 第二检测抗原，其包含得自第二HCV蛋白的抗原序列且进一步包含可检测标记物

e. 第三捕获抗原，其包含得自第三HCV蛋白的抗原序列

f. 第三检测抗原，其包含得自第三HCV蛋白的抗原序列且进一步包含可检测标记物

g. 第一捕获抗体

h. 缀合物抗体，其包含可检测标记物

其中所述捕获抗体和所述缀合物抗体特异性地结合得自试验样品的第四HCV蛋白，且所述组合测定如下进行：

(i) 在一定条件下使所述试验样品与所述捕获抗原、所述检测抗原、所述捕获抗体和所述缀合物抗体接触以允许：

a)在所述第一捕获抗原和所述检测抗原和存在于所述试验样品中的第一抗-HCV抗体之间形成夹心复合物；

b)在所述第二捕获抗原和所述第二检测抗原和存在于所述试验样品中的针对第二HCV蛋白的抗-HCV抗体之间形成夹心复合物；

c)在所述第三捕获抗原和所述第三检测抗原与存在于所述试验样品中的针对第三HCV蛋白的抗-HCV抗体之间形成夹心复合物；和

d)在所述捕获抗体、所述缀合物抗体和存在于样品中的HCV抗原之间形成复合物；和

(ii)测量作为所述复合物形成的结果而从可检测标记物产生的信号，由此同时检测存在于样品中的HCV抗原和HCV抗体。

在任何上面总结的免疫测定法中，所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5或核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5中的任一种的独特且独立部分。

在某些实施方案中，所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白中的两种或更多种独立地选自相同蛋白的不同部分，所述蛋白选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。

在特定优选的实施方案中，在本发明的免疫测定法中，所述第一HCV蛋白是设计成用于检测存在于所述试验样品中的抗-核心抗体的核心抗原。更具体地，所述用于捕获抗-核心抗体的捕获抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。在某些实施方案中，所述用于检测抗-核心抗体的检测抗原也是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。在特定实施方案中，所述组合免疫测定法被设计成用于检测试验样品中的核心抗原和抗-核心抗体。通过使用上面总结的核心缺失抗原作为捕获抗原和检测抗原来促进这样的检测。因此，在上述的免疫测定法中，所述第一抗原和所述第四蛋白各自是核心相关蛋白，即，所述第一抗原在试验测定中供给，且作为HCV在样品中存在的结果，所述第四蛋白存在于所述试验样品中。

在采用从试验样品捕获抗原的特定实施方案中，所述免疫测定法可以采用多个抗体，其中所述多个抗体中的每一个针对相同HCV抗原的不同表位(例如，针对核心的脂质结合区的抗体和针对核心的DNA结合区的抗体作为两个分开的用于捕获核心抗原的捕获抗体)。

本发明的免疫测定法进一步包括，提供第二对捕获抗体和缀合物抗体，其中所述第二捕获/缀合物抗体对特异性地结合与上面总结的免疫测定法的第一捕获/缀合物抗体对相同的HCV蛋白，或特异性地结合不同的HCV蛋白。

在特定实施方案中，所述捕获抗原和所述捕获抗体附着至固体支持物。

在其它实施方案中，所述第一捕获抗原是生物素化的核心肽，且所述第一检测抗原是吖啶基化的核心肽，其中所述生物素化的和检测抗原中的每一种是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

另外的具体实施方案包括，所述第二捕获抗原是生物素化的NS3重组抗原，且所述第二检测抗原是吖啶基化的NS3重组抗原。在其它具体实施方案中，所述第三捕获抗原是生物素化的NS4肽，且所述第三检测抗原是吖啶基化的NS4肽。

在特定实施方案中，所述捕获抗体是生物素化的C11-7单克隆抗体。

在其它实施方案中，所述检测抗体缀合物包含选自C11-9和C11-14或它们的组合的抗体。

本文还描述了用于检测来自试验样品的多个HCV组分的免疫测定法，其包括：

a. 提供结合生物素的固相

b. 在一定条件和时间下，使所述固相与混合物接触，所述混合物包含：

i. 生物素化的第一捕获抗原、生物素化的第二捕获抗原、生物素化的第三捕获抗原和对第四HCV抗原特异性的生物素化的抗体；和

ii. 可检测地标记的第一、第二和第三检测抗原

所述条件和时间足以

(1) 在试验样品中的抗体和样品中的HCV蛋白之间形成免疫复合物，所述抗体可独立地分别与第一、第二和第三生物素化的抗原免疫反应且被其捕获，所述HCV蛋白可与生物素化的抗体免疫反应，和

(2) 在捕获抗体和各种第一、第二和第三可检测地标记的抗原之间形成免疫复合物；

c. 将固相与未反应的试验样品和试剂分离，所述固相包含附着的、可检测地标记的捕获的抗体和捕获的第四HCV抗原；

d. 使分离的固相与可检测地标记的缀合物抗体接触，所述缀合物抗体结合捕获的第四HCV抗原；和

e. 在触发信号后，检测从可检测地标记的部分产生的信号，其中信号的存在指示HCV在试验样品中的存在。

还在这样的测定中，第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。更具体地，在一个特定实施方案中，所述HCV核心抗原包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失；所述第二抗原是NS3抗原；所述第三抗原是NS4抗原；且所述生物素化的抗体针对HCV核心抗原。在具体实施方案中，所述抗-核心单克隆抗体是对HCV核心的脂质结合结构域特异性的抗体。可替换地或另外，所述NS3抗原是包含NS3解螺旋酶序列的重组HCV NS3抗原，所述NS3解螺旋酶序列包含解螺旋酶的结构域I、II和III中的每一个，其中所述抗原具有与C33抗原相比增加的对来自血清的HCV抗体的免疫反应性。

在本文中还预见到用于检测来自试验样品的多个HCV抗体的免疫测定法，其包括：

a. 提供结合生物素的固相

i. 生物素化的第一捕获抗原、生物素化的第二捕获抗原、生物素化的第三捕获抗原；和

ii. 可检测地标记的第一、第二和第三检测抗原

所述条件和时间足以

(1) 在试验样品中的抗体之间形成免疫复合物，所述抗体可独立地分别与第一、第二和第三生物素化的抗原免疫反应且被其捕获，和

c. 使固相与未反应的试验样品和试剂分离，所述固相包含附着的、可检测地标记的捕获的抗体；和

d. 在触发信号后，检测从可检测地标记的部分产生的信号，其中信号的存在指示HCV在试验样品中的存在。再次，在这样的免疫测定法中，第一、第二和第三HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。在一个特定的示例性测定中，所述第一抗原是HCV核心抗原；所述第二抗原是NS3抗原；且所述第三抗原是NS4抗原。更具体地，所述捕获核心抗原可以是、但不需要是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的抗原。所述NS3抗原也可以是从NS3衍生出的任何NS3抗原。在某些实施方案中，所述NS3抗原是包含NS3解螺旋酶序列的重组HCV NS3抗原，所述NS3解螺旋酶序列包含解螺旋酶的结构域I、II和III中的每一个，其中所述抗原具有与C33抗原相比增加的对来自血清的HCV抗体的免疫反应性。

本发明还包括用于同时检测样品中的HCV抗原和抗体的试剂盒，所述试剂盒包含：

第一对捕获抗原和检测抗原，其用于检测针对第一HCV蛋白的第一抗-HCV抗体，其中所述检测抗原被可检测地标记

第二对捕获抗原和检测抗原，其用于检测针对第二HCV蛋白的第二抗-HCV抗体；其中所述检测抗原被可检测地标记

第三对捕获抗原和检测抗原，其用于检测针对第三HCV蛋白的第三抗-HCV抗体，其中所述检测抗原被可检测地标记

第一对捕获抗体和缀合物抗体，其用于检测第四HCV蛋白，其中所述缀合物抗体被可检测地标记。

在试剂盒中，所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5或核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5中的任一种的独特且独立部分。具体地，所述试剂盒设计成检测所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白中的两种或更多种，它们独立地选自相同蛋白的不同部分，所述蛋白选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。在优选的试剂盒中，所述第一HCV蛋白是核心抗原，优选地，它是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。所述试剂盒包含抗-核心抗体检测抗原，其中所述检测抗原中的核心肽包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失。所述试剂盒也可以检测样品中的核心抗原，且因此可以有利地包含抗-核心捕获和检测抗体。这样的捕获抗体可以包含两种或更多种抗体。

所述试剂盒还可以包含第二对捕获抗体和缀合物抗体，其中所述第二捕获/缀合物抗体对特异性地结合与第一捕获/缀合物抗体对相同的HCV蛋白，或特异性地结合不同的HCV蛋白。在特定实施方案中，所述捕获抗原和所述捕获抗体附着至固体支持物。

可以容易地改造采用本发明的抗原的任何免疫测定法以用在自动化的系统或半自动化的系统中。

附图说明

图1显示了本发明的HCV NS3重组抗原的位置。

具体实施方式

本发明提供了HCV组合免疫测定法，其如下提供增强的向HCV的暴露的检测：检测针对HCV的两种抗体（如在常规免疫测定法中进行的那样），和在形成针对HCV的抗体之前在感染的早期阶段检测可能存在于个体的血液中的HCV核心抗原。本发明满足了本领域对组合免疫测定法的需要，所述组合免疫测定法用于在单个测定中同时检测样品中的HCV抗原和抗-HCV抗体。抗原/抗体组合测定方法依赖于抗原性的和免疫原性的HCV抗体以及在HCV血清转化的早期阶段存在的抗原的鉴别和应用，由此增加检测准确度和降低在窗口阶段中假结果的发生率。

使用本发明的组合测定可以试验HCV的生物样品包括疑似含有HCV病毒粒子、抗原或抗体的任何样品。本文中使用的术语“样品”以它的最宽的含义使用。本文中使用的“生物样品”包括、但不限于得自活物或曾经的活物的任何量的物质。这样的活物包括、但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其它动物。这样的物质包括、但不限于血液（例如，全血或其组分）、血浆、血清、尿、唾液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

在所述组合测定的抗-HCV抗体检测方面，采用至少一种(即，一种或多种)捕获抗原来结合和因此捕获存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体。所述捕获抗原通常是从HCV基因组所编码的HCV蛋白衍生出的抗原肽(含有一个或多个表位)。整个HCV基因组的序列和编码的HCV多蛋白序列记载在GenBank (分别是登录号M62321和登录号AAA45676)中，且是本领域技术人员可得到的。一些可以使用的示例性核心抗原包括从核心蛋白的DNA结合结构域(氨基酸1-125)衍生出的抗原。其它优选的核心抗原从核心的脂质结合结构域衍生出，所述脂质结合结构域位于核心蛋白的氨基酸残基134-171(MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG)。但是，在本发明中，特别优选的核心抗原包括从核心蛋白衍生出的抗原，所述抗原包含特异性单克隆抗体的已知表位结合区中的某些缺失或置换，使得用于HCV核心抗原检测的单克隆抗体不会检测这些经修饰的核心抗原，但是仍然检测来自试验样品的完整核心抗原。因而，可以将这些新颖的经修饰的核心抗原包被在固相支持物上和/或用在溶液相中以捕获存在于人血清或血浆中的针对HCV的核心区域的抗体，但是同时避免被在HCV Combo测定中用于检测核心Ag的缀合物抗体检测到，但是同时允许检测抗-核心抗体，所述抗-核心抗体也预期存在于所述试验样品中且在相同的HCV Combo测定形式中鉴别出。用在本发明的测定中的优选核心抗原包含含有氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的突变体核心蛋白。

通过使用本文描述的新颖的核心捕获抗原，本发明克服了用目前可得到的*Ac-DBA-c11-9/c11-14缀合物（其用于在HCV组合测定中检测核心抗原）观察到的显著问题，因为目前可得到的用于捕获抗-核心抗体的核心抗原也与被设计成进行核心抗原的血清学检测的检测抗体反应。在以前，通过删除5个氨基酸(C11-9结合区的氨基酸32、33和34，和核心的c11-14结合区的氨基酸和残基47和48)制备构建体来避免该问题，但是，这些构建体产生更差的抗-核心抗体检测，因为这些残基在抗-核心阳性的患者中是高免疫原性的。本文描述为捕获抗原的核心抗原的应用因为它们的设计而克服了该问题，所述设计包括更微小的删除，其可以成功地避免*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物的检测，但是保留或增强抗-核心反应性的样本的检测。在本发明的组合测定中，用于捕获和检测抗-HCV核心抗体的核心抗原有利地包含核心氨基酸的删除，其足以消除捕获抗体与检测核心抗原的结合，例如，删除了氨基酸115-121。

定义

本发明提供了用于检测试验样品中的HCV的试剂。优选地，该检测通过同时检测试验样品中的HCV抗原和抗-HCV抗体二者来实现。在本说明书中，经常使用某些术语，且因此以下部分提供了那些术语的另外定义。术语“抗体”(Ab)表示单克隆抗体(mAb (单数)或mAbs (复数))、多克隆抗体(pAbs (复数))、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全地或部分地人源化；包含人抗体的经修饰的可变区的多肽，其中可变区的一部分已经被来自非人序列的对应序列置换，且其中经修饰的可变区连接至人抗体的恒定区的至少一部分)、动物抗体(例如，但不限于，禽类(例如，鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、骆驼、骆马、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如，猴、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体(cAb；包含来自一个宿主物种的抗体的全部或部分重链和轻链可变区的多肽，所述可变区连接至来自另一个宿主物种的抗体恒定区的至少一部分)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv片段(“scFv”)、二硫键连接的Fv片段(“sdFv”)、dAb片段、双体、分离的互补性决定区(CDR)和抗-独特型(“抗-Id”)抗体、双功能抗体或双结构域抗体(例如，双重可变结构域抗体或DVD-IgG)和以上任一种的在功能上有活性的表位结合片段(或抗原反应性的片段)。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性的(或抗原反应性的)片段，即，含有如在本文的(n)中进一步描述的分析物结合部位的分子，和如在本文(ac)中进一步描述的变体。免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。具有以下特征的抗体被称作“亲和力成熟的抗体”：其亲和力(即，KD、kd或ka)已经通过筛选组合抗体文库而增加或提高，所述组合抗体文库已经使用生物展示制备。为简洁起见，针对分析物的抗体在本文中经常被称作“抗-分析物抗体”或仅仅称作“分析物抗体”(例如，抗-HCV抗体或HCV抗体)。

在本发明中，测定“组分”和“至少一种组分”通常表示捕获抗体、检测抗体或缀合抗体、对照、校准物、校准物系列、灵敏度实验对象组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、停止溶液等，其可以包含在根据本文所述的方法和本领域已知的其它方法用于测定试验样品（诸如患者尿、血清或血浆样品）的试剂盒中。因而，在本公开内容的背景下，“至少一种组分”和“组分”可以包括如本文中所述的多肽，其任选地固定化在固体支持物上。一些组分可以是在溶液中或者被低压冻干以重构用于测定。

在进行本发明的测定中，可能有用的是使用对照。“对照”表示已知不含有抗-HCV抗体(“阴性对照”)或含有抗-HCV抗体(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的抗-HCV抗体。“对照”、“阳性对照”和“校准物”可以在本文中互换使用以表示包含已知浓度的抗-HCV抗体的组合物。“阳性对照”可以用于建立测定性能特征，且是试剂(例如，分析物)的完整性的有用指示。

本发明的NS3抗原可用在血清学测定中用于检测试验样品中的抗-HCV抗体，因为这样的抗体会识别在本发明的NS3抗原内所含的表位。“表位”和“目标表位”表示任何分子(在该情况下，本文描述的NS3抗原)上被识别的且可以结合特异性结合配偶体（诸如抗体或其抗原反应性片段）上的互补位点的位点。表位由抗原(或其片段)的特定区域的精确氨基酸残基组成，所述特定区域已知结合特异性结合配偶体上的互补位点。抗原片段可以含有超过一个表位。

在本文描述的测定中，测定的一个或其它组分可以包含可检测标记物。术语“标记物”和“可检测标记物”是指这样的部分：其连接至特异性结合配偶体，诸如抗体或分析物，以使得特异性结合对的成员（诸如抗体和分析物）之间的反应是可检测的，且如此标记的特异性结合配偶体（例如，抗体或分析物）被称作“可检测地标记的”。标记物可以产生通过视觉装置或仪器装置可检测的信号。各种标记物包括产生信号的物质，诸如色原体、荧光化合物、化学发光的化合物、放射性化合物等。标记物的代表性例子包括产生光的部分（例如，吖啶鎓化合物）和产生荧光的部分（例如，荧光素）。本文描述了其它标记物。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。“可检测地标记的”的应用意图包括后一类可检测标记。

“连接序列”表示与一个或多个目标多肽序列(例如，全长、片段等)连接的天然或人工多肽序列。术语“连接”表示连接序列与目标多肽序列的连接。这样的多肽序列优选地通过一个或多个肽键连接。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度是约6至约30个氨基酸。天然的连接序列可以通过氨基酸置换、添加或缺失进行修饰以建立人工连接序列。示例性的连接序列包括、但不限于：(i)组氨酸残基(His标签)，诸如6xHis标签，其含有6个组氨酸残基，可用作连接序列以促进目标多肽和抗体的分离和纯化。(ii)肠激酶切割位点，如His标签，用于分离和纯化目标蛋白和抗体。肠激酶切割位点经常与His标签一起用在目标蛋白和抗体的分离和纯化中。各种肠激酶切割位点是本领域已知的。(iii)可以使用其它序列连接或联接单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其它连接序列的例子可以参见：Bird等人, Science 242: 423-426 (1988)；Huston等人, PNAS USA 85: 5879-5883 (1988)；和McCafferty等人, Nature 348: 552-554 (1990)。也可以为了另外的功能（诸如药物的附着或向固体支持物的附着）而修饰连接序列。在本公开内容的背景下，mAb例如可以含有连接序列，诸如His标签、肠激酶切割位点或二者。

“患者”和“受试者”可以在本文中互换使用以表示动物，诸如禽类(例如，鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、骆驼、骆马、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。优选地，所述患者或受试者是人，诸如处于HCV感染风险中的人或被HCV感染的人。

在分析本文描述的免疫测定法的结果时，可能有用的是包括特定水平的检测作为截止水平。“预定的截止值”和“预定水平”通常表示这样的测定截止值：其用于通过将测定结果与预定的截止值/水平进行对比来评估诊断/预后/治疗效果结果，其中预定截止值/水平已经与各种临床参数（例如，疾病的严重程度、进展/非进展/改进等）联系或相关。虽然本公开内容可以提供示例性的预定水平，但众所周知，截止值可能随免疫测定法的性质（例如，采用的抗体等）而变化。另外，完全在本领域技术人员的一般技能内的是，基于本公开内容改进本文公开内容用于其它免疫测定法以获得关于那些其它免疫测定法的免疫测定法特异性的截止值。尽管预定的截止值/水平的精确值在测定之间可能变化，但如本文中所述的相关性应当是普遍适用的。

如下所述，可能合乎需要的是，在本发明的某些实施方案中提供试验样品的预处理。如本文中所述的诊断测定中所用的“预处理试剂”(例如，裂解、沉淀和/或溶解试剂)是将存在于所述试验样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物溶解的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了别的以外，溶解分析物(即，抗-HCV抗体)会引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的（不要求分离步骤）或异质的（要求分离步骤）。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，从试验样品去除任何沉淀的分析物结合蛋白。预处理试剂任选地可以包含：(a)一种或多种溶剂和盐，(b)一种或多种溶剂、盐和去污剂，(c)去污剂，(d)去污剂和盐，或(e)适合用于细胞裂解和/或溶解分析物的任何试剂或试剂组合。

所述测定也可以进行严格的质量控制。在本文所述的免疫测定法和试剂盒的背景下的“质量控制试剂”包括、但不限于校准物、对照和灵敏度实验对象组。通常使用“校准物”或“标准物”(例如一种或多种，诸如多种)以便建立校准(标准)曲线用于内插分析物(诸如抗体或分析物)的浓度。可替换地，可以使用接近预定阳性/阴性截止值的单个校准物。可以联合使用多种校准物（即，多于一个校准物或不同量的校准物），从而构成“灵敏度实验对象组”。

术语“样品”、“试验样品”和“患者样品”可以在本文中互换使用。样品，诸如尿、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品，可以如从患者得到那样直接使用，或可以经过预处理，诸如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的灭活、试剂的添加等，以如本文中讨论的或如本领域已知的其它方式改变样品的特性。优选地，所述样品是尿、血清或血浆。

在某些测定中，可能合乎需要的是，提供测定的校准。“校准组合物的系列”表示多个包含已知浓度的抗-HCV抗体的组合物，其中每个组合物与该系列中的其它组合物的差别在于抗-HCV抗体的浓度。

贯穿本说明书，应当指出，NS3抗原和/或其它试剂可以结合至固体支持物或固相，两个术语互换使用。术语“固相”表示不溶性的或可以通过后续反应造成不溶的任何材料。可以针对它的吸引和固定捕获试剂的固有能力来选择固相。可替换地，固相可以具有附着于其上面的连接试剂，所述连接试剂具有吸引和固定捕获试剂的能力。所述连接试剂可以例如包括带电荷物质，所述带电荷物质的电荷就捕获试剂本身或与捕获试剂缀合的带电荷物质而言是相反的。一般而言，所述连接试剂可以是固定至(连接至)固相上且具有通过结合反应而固定捕获试剂的能力的任意结合配偶体(优选地特异性的)。在测定执行之前或在测定执行过程中，所述连接试剂能够实现捕获试剂与固相材料的间接结合。所述固相可以例如是塑料、衍生化的塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括，例如，试管、微量滴定孔、薄板、珠子、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它构型。

在本文描述的测定的某些描述中，可能有用的是，将NS3、NS4或核心抗原或HCV抗体称作特异性结合配偶体。“特异性结合配偶体”是特异性结合对的一个成员。特异性结合对包含2个不同的分子，所述分子通过化学或物理方式彼此特异性地结合。因此，除了普通免疫测定法的抗原和抗体特异性结合对以外，其它特异性结合对可以包括生物素和亲和素（或链霉亲和素）、碳水化合物和凝集素、互补的核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性的特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体（包括变体的片段），无论是分离的还是重组产生的。术语“特异性的”和“特异性”在特异性结合对(例如，抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应性片段))的成员之间的相互作用的背景下表示所述相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语表示抗体(或其抗原反应性片段)的特异性地结合给定抗原(或其片段)且不特异性地结合其它实体的能力。

用在本发明中的抗原

如本文中所述，本发明描述了在一个测定中检测HCV抗原的组合，以有利地提供正在测定的试验样品中的HCV的灵敏的且选择性的检测。在某些优选的实施方案中，所述组合测定进一步检测抗-HCV抗体的存在。更具体地，所述HCV抗原可以是在HCV测定中通常监测的任何抗原。这样的抗原包括、但不限于核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5或核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5中的任一种的独特且独立部分。用于个别地检测这样的抗原的免疫测定法是本领域技术人员商购可得的，且在这样的商购可得的测定中使用的任何抗原可以容易地用作本发明的免疫测定法中的捕获或检测抗原。例如，HCV NS3蛋白及其突变体原则上具有2个主要蛋白部分，第一个对应于氨基酸1192-1457，其按照P26664的HCV多蛋白编号(Genbank，在本文中再现为SEQ ID NO:2; Choo等人, PNAS 1991;)，也被称作C33 (如Chiron最初描述的)或“9NB49H”。NS3蛋白的第二部分对应于氨基酸1192-1657，也被称作NS3解螺旋酶或“NS3h”。包含这两种蛋白的全部或部分的抗原可以容易地用于检测试验样品中的抗-HCV抗体。例如，C33是一种众所周知的从HCV的NS3蛋白衍生出的抗原，且可以在本文中容易地用作捕获或检测抗原用于在本发明的组合免疫测定法中检测NS3抗体。

其它NS3衍生出的抗原包括在并行提交的美国临时申请号61/784,822（标题为“HCV NS3 Recombinant Antigens and Mutants Thereof for Improved Antibody Detection”，代理人案卷号03946-26530US01）中描述的那些。这样的抗原是C33和NS3解螺旋酶蛋白的变体，其中N-端或C-端序列经过修饰。在某些实施方案中，制备包括半胱氨酸至丝氨酸突变的抗原。这些突变允许增加抗原对氧化的抵抗力，由此保留表位呈现和因此保留免疫反应性。半胱氨酸至丝氨酸突变也允许通过仅突变选定的半胱氨酸残基（例如认为对于免疫反应性的维持而言不重要的那些）而对蛋白进行位点特异性的修饰(经由使用马来酰亚胺试剂的化学缀合)。此外，至少一些半胱氨酸至丝氨酸置换突变体会破坏全长解螺旋酶(HCV氨基酸1192-1657)的结合核苷酸三磷酸(例如ATP)的能力。这会将蛋白维持在打开或展开的构象(参见Gu & Rice, PNAS, 2010, 107:521-528和其中的参考文献)，且在本发明中证实会产生增强的免疫反应性。

可以用在本发明的测定中的示例性的NS3抗原显示在下文的表1中。一般而言，这些NS3抗原可以被描述为包含NS3解螺旋酶序列的重组HCV NS3抗原，所述NS3解螺旋酶序列包含所述解螺旋酶的每个结构域I、II和III，其中所述抗原具有与C33抗原相比增加的对来自血清的HCV抗体的免疫反应性，其中所述重组HCV NS3抗原包含一种或多种选自以下的特征：与野生型NS3解螺旋酶的ATP-结合活性相比，减少的ATP-结合活性；与野生型NS3相比，与野生型NS3解螺旋酶的ATP-结合活性相比，减少的ATP酶活性；和与野生型NS3解螺旋酶的氧化还原稳定性相比，增加的氧化还原稳定性。更具体地，在本发明的上下文中，野生型HCV NS3包含SEQ ID NO: 87的序列，且其中本发明的重组抗原与SEQ ID NO: 87的序列相比包含至少一个突变。这些抗原的生产和试验的详细描述提供在并行提交的美国临时申请号61/784,822（标题为“HCV NS3 Recombinant Antigens and Mutants Thereof for Improved Antibody Detection”，具有代理人案卷号03946-26530US01）中。

在其它实施方案中，组合免疫测定法的另一个方面检测针对核心抗原的抗体的存在。可以使用的一些示例性的核心抗原包括从核心蛋白的DNA结合结构域(氨基酸1-125)衍生出的抗原。其它优选的核心抗原从核心的脂质结合结构域衍生出，所述脂质结合结构域位于核心蛋白的氨基酸残基134-171(MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG)。但是，在本发明中，特别优选的核心抗原包括从核心蛋白衍生出的抗原，所述抗原包含特异性单克隆抗体的已知表位结合区中的某些缺失或置换，使得用于HCV核心抗原检测的单克隆抗体不会检测这些经修饰的核心抗原，但是仍然检测来自试验样品的完整核心抗原。因而，可以将这些新颖的经修饰的核心抗原包被在固相支持物上和/或用在溶液相中以捕获存在于人血清或血浆中的针对HCV的核心区域的抗体，但是同时避免被在HCV组合免疫测定法中用于检测存在于所述试验样品中的核心抗原的缀合物抗体检测到。因此，可以进行组合免疫测定法，其在检测抗-核心抗体的同时检测存在于所述试验样品中的两种核心抗原，所述抗-核心抗体也预期存在于所述试验样品中且在相同的HCV Combo测定形式中鉴别出。可以用于检测来自试验样品的抗-核心抗体的目的的核心抗原优选地包含核心抗原的氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失。

如贯穿本文指出的，本发明的方法通常是免疫测定方法。在示例性实施方案中，这样的方法包括用于分离目标分子(例如，存在于所述试验样品中的特定抗体，或可能存在于所述试验样品中的特定抗原)的方法。为了促进这样的分离，目标分子包含纯化标签或被吸引至纯化标签，所述纯化标签与标签结合配偶体接触。纯化标签和标签结合配偶体的结合因此可以用于从分子混合物分离目标分子。纯化标签可以包含具有相同或类似结构的部分。在某些实施方案中，亲和标签的标记部分可以通过单键直接地或经由稳定化学键的连接（以直链、支链或环状排列，任选地包括单键、双键、三键、芳族碳-碳键、以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键和它们的任意组合）而与功能标签结合。在某些实施方案中，标记部分和功能标签之间的结合包含醚、硫醚、羧酰胺、磺酰胺、脲或氨基甲酸酯部分。在优选的实施方案中，所述连接包含聚亚烷基链，即，碳-碳键的直链或支链排列。在其它实施方案中，所述连接包含聚环氧烷烃链，包括聚乙二醇部分。亲和标签的例子包括、但不限于生物素、地高辛配基(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、锌指、氟代的聚合物和多肽序列诸如聚组氨酸基序。

在某些实施方案中，有利地使用亲和标签来分离目标分子，这依赖于亲和标签以及被吸引至亲和标签或结合亲和标签的官能团的结合或吸引。在某些实施方案中，固体基质对标签具有亲和力，因为所述固体基质用标签结合配偶体衍生化。在某些实施方案中，可以将结合配偶体固定化在亲和基质上。术语“亲和基质”可以表示与结合配偶体结合的不动基质或支持物，所述结合配偶体能够与分子的纯化标签形成强烈的且优选地可逆的相互作用。亲和基质可以包括树脂、珠子、颗粒、膜、凝胶。结合配偶体特异性地识别或结合纯化标签。特异性结合配偶体将依赖于亲和标签，但是包括带电荷的部分以及结合对诸如受体-配体、抗体-抗原、碳水化合物-凝集素和生物素-链霉亲和素(或亲和素、中和亲和素或抗-生物素抗体)的一个成员。

在特定的且优选的实施方案中，在组合免疫测定法中使用的任何或所有抗原的C或N末端可以被生物素化，或可以包含生物素结合部分(例如，亲和素或链霉亲和素或中和亲和素或抗-生物素)作为亲和标签。这些肽是生物素化的或亲和素/链霉亲和素缀合的肽，且将充当捕获抗原。同样地，所述抗原可以可替换地用检测标记物标记，在该情况下，所述检测标记物将充当检测抗原。所述检测抗原和捕获抗原可能具有相同的根本氨基酸序列，或可替换地，可能具有不同的序列。在示例性实施方案中，所述捕获抗原在C或N末端被生物素化，以促进其与具有生物素结合配偶体(即，亲和素或链霉亲和素)的固体支持物的结合。为了示例性生产目的，经由IPTG诱导系统在25℃在大肠杆菌BL2L(DE3)细胞中重组地表达生物素化的肽。通过用表达期望肽的HCV表达质粒和含有来自大肠杆菌的BirA基因的第二质粒共转化BL21(DE3)细胞，完成在C-端或N-端处的原位生物素化(Weiss等人(1994) Protein Expression & Purif, 14:751-755; Schatz等人(1993) Biotechnology, 11:1138-1143)。使用二价阳离子螯合剂进行重组蛋白的纯化，所述螯合剂被证实会阻止金属催化的氧化和蛋白的聚集。当将EDTA或有关的二价阳离子螯合剂加入在纯化过程中使用的缓冲液中和加入在免疫测定法中使用的最终贮存缓冲液中时，蛋白稳定性显著改善。

用于组合测定中的抗体

如贯穿本文讨论的，所述组合免疫测定法有利地也确定存在于所述试验样品中的一种或多种HCV抗原的存在。在这样的实施方案中，合乎需要的是，使用单克隆抗-HCV抗体捕获来自试验样品的抗原，并然后使用其它缀合物抗体检测已经捕获的抗原的存在。有众多商购可得的可以用于该努力的抗体。具体地，这样的抗体优选地确定核心抗原在试验样品中的存在。针对核心抗原的抗体是本领域技术人员已知的，包括、例如在美国专利公开号20120009196中描述的那些。另外，本发明进一步预见到在并行提交的美国专利申请号61/783,529（标题为“HCV Core Lipid Binding Domain Monoclonal Antibodies”，代理人案卷号03946-26531US01）中描述的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体可与HCV核心抗原的脂质结合结构域特异性地免疫反应。更具体地，HCV核心抗原是HCV的氨基酸残基134-171。在更具体的实施方案中，所述抗体特异性地结合至少一个由氨基酸序列MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG形成的表位。在更具体的实施方案中，所述抗体可与由HCV核心抗原的氨基酸141-161、134-154和151-171形成的表位免疫反应。

在特定示例性实施方案中，在组合免疫测定法中使用的抗体是被设计成检测试验样品中的HCV核心蛋白或其片段的抗体。这样的抗体可以检测DNA结合结构域、脂质结合结构域，或实际上检测整个核心蛋白。在某些实施方案中，在免疫测定法中使用的检测抗体针对核心肽的脂质结合结构域，且示例性的这样的抗体描述在并行提交的美国临时申请号61/783,529（标题为“HCV Core Lipid Binding Domain Monoclonal Antibodies”，代理人案卷号03946-26531US01）中。在其它实施方案中，在组合测定中使用的抗-HCV核心抗体可以是例如，C11-3、C11-7、C11-9和C11-14 (描述在美国专利6,727,092; Morota, 等人, J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14)。

在本发明的一个具体测定中，所述组合免疫测定法至少检测试验样品中的核心抗原，还检测试验样品中的核心抗体。在这样的实施方案中，变得合乎需要的（尽管不是必需的）是，确保捕获抗原被设计成捕获抗-核心抗体，所述抗-核心抗体优选地包含特异性单克隆抗体的已知表位结合区的某些缺失或置换，使得用于HCV核心抗原检测的单克隆抗体不会检测这些经修饰的核心抗原，但是仍然检测来自试验样品的完整核心抗原。要用作捕获抗体的示例性抗-核心抗体包括如在以下文献中描述的抗体AOT3、C11-3、C11-7、C11-9和C11-14：美国专利6,727,092以及Morota, 等人, J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14。

免疫诊断测定和试剂

在特定实施方案中，预见到上述的抗原和抗体用作组合免疫测定法中的免疫诊断试剂，所述组合免疫测定法被设计成用于检测疑似已经被HCV感染的试验样品中发现的多个HCV组分。免疫诊断试剂(它们是抗体或抗原)将包含上述的抗原多肽和抗体(通常相组合)，使得它们可以用在被设计成用于检测HCV抗原以及抗-HCV抗体的组合免疫测定法中，所述HCV抗原包括、但不限于HCV的NS3区域、HCV的核心抗原、HCV的NS4区域或它们的组合，所述抗-HCV抗体针对这些区域中的一种或多种。为了捕获的目的，所述免疫诊断试剂包含的抗原和/或抗体可以包被在固体支持物（例如，微粒(例如，磁性颗粒)、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片）上。在这点上，在免疫诊断试剂包含抗原(例如，针对不同的HCV蛋白或相同HCV蛋白的不同片段)的组合的情况下，所述抗原可以共同包被在相同固体支持物上或可以包被在单独固体支持物上。同样地，在免疫诊断试剂包含一种或多种抗体（其将用于捕获来自试验样品的一种或多种抗原）的情况下，这样的抗体可以共同包被在相同固体支持物上或可以包被在单独固体支持物上。

值得注意的是，所述免疫诊断试剂将包括抗原和抗体，其可以用可检测标记物标记或用允许捕获或检测的特异性配偶体标记。例如，所述标记可以是可检测标记物，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/亲和素标记物、生色团、化学发光标记等。这样的标记在下文中更详细地描述。

更进一步，本发明预见到HCV诊断试剂盒的制备，所述试剂盒包含本文描述的免疫诊断试剂和说明书，所述的说明书是关于通过检测两种或更多种HCV蛋白和/或抗-HCV抗体在这样的样品中的存在而在组合免疫测定法中使用所述免疫诊断试剂确定HCV在试验样品中的存在。例如，所述试剂盒可以包含关于通过免疫测定来测定试验样品中的抗-HCV抗体(例如，抗-核心试验样品中的抗体)的说明书。尽管优选的实施方案采用化学发光微粒免疫测定法来测定试验样品，应当理解，在本发明的组合免疫测定法中使用的抗原和抗体可以用在本领域技术人员已知的用于确定HCV在试验样品中的存在的任意其它免疫测定形式中。所述说明书可以呈纸形式或计算机可读的形式，诸如磁盘、CD、DVD等。可替换地或额外地，所述试剂盒可以包含校准物或对照物，例如，纯化的和任选地低压冻干的抗-HCV抗体或抗原和/或至少一个用于进行测定的容器(例如，试管、微孔滴定板或条带，其可以已经包被了组合免疫测定法的捕获组分(抗原和/或抗体)中的一种或多种)和/或缓冲液（诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一种可以提供为浓缩的溶液）、可检测标记物(例如，酶标记物)的底物溶液或停止溶液。优选地，所述试剂盒包含执行测定必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。在具体实施方案中，优选的是，所有组分个别地呈现在试剂盒中，使得所述免疫测定法可以执行为进行中捕获（capture-on-the-fly）型组合免疫测定法，其中给固体支持物包被允许捕获部分(例如，生物素化的抗原或生物素化的抗体)的结合的试剂，且所述试剂盒进一步包含在一个容器内的各个捕获和检测抗原对中的每一个和生物素化的捕获抗体，且第二个容器提供检测抗体缀合物。关于进行测定的说明书也可以包括关于制备用于定量抗-HCV抗体的目的的标准曲线或参比标准的说明书。

在试剂盒中提供的任何抗体（诸如抗-IgG抗体和抗-IgM抗体）还可以包含可检测标记物，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/亲和素标记、生色团、化学发光标记等，或所述试剂盒可以包括用于标记抗体的试剂、或用于检测抗体(例如，检测抗体)和/或用于标记分析物的试剂、或用于检测分析物的试剂。抗体、校准物和/或对照物可以提供在单独的容器中，或预分配进适当的测定形式（例如，微孔滴定板）中。在优选的组合免疫测定法中，提供两个容器。在第一个容器中至少提供第一对、第二对和第三对抗原以及一种或多种生物素化的抗体，其中每个对中的第一抗原是来自给定的HCV蛋白的被生物素化的捕获抗原，且每个对中的第二抗原是检测抗原，其来自与第一抗原相同的蛋白，但是用可检测标记物标记(例如，它被吖啶基化)，所述生物素化的抗体被设计成用于检测来自试验样品的一种或多种HCV抗原；且在第二个容器中提供用于检测抗原的形成缀合配偶体的抗体，所述抗原被来自第一个容器的生物素化的抗体捕获。预见到，在第一个容器内存在多个生物素化的抗体的情况下，所述多个形成缀合配偶体的抗体可以存在于检测缀合物抗体的每种不同抗原的单个容器或各个容器中。

任选地，所述试剂盒包括质量控制组分(例如，灵敏度实验对象组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的，且描述在多种免疫诊断产品的插页上。灵敏度实验对象组成员任选地用于确立测定性能特征，且进一步任选地是免疫测定试剂盒试剂的完整性和测定的标准化的有用指标。

所述试剂盒还可以任选地包括进行诊断测定或便利质量控制评价所需的其它试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于分离和/或处理试验样品的其它组分(诸如缓冲液和溶液)(例如，预处理试剂)也可以包括在试剂盒中。所述试剂盒可以另外包括一种或多种其它对照物。试剂盒的一种或多种组分可以被低压冻干，在该情况下，试剂盒可以进一步包含适合用于重构低压冻干的组分的试剂。

试剂盒的各种组分任选地根据需要提供在合适的容器（例如微孔滴定板）中。试剂盒可以进一步包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于样品的容器或筒)。在适当的情况下，试剂盒任选地也可以含有反应容器、混合容器和促进试剂或试验样品的制备的其它组分。试剂盒也可以包括一种或多种用于辅助获得试验样品的仪器，诸如注射器、移液器、镊子、测量匙等。

在优选的实施方案中，所述可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物。在这样的实施方案中，所述试剂盒可以包含至少一种吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一种吖啶鎓-9-甲酸芳基酯或它们的任意组合。如果可检测标记物是至少一种吖啶鎓化合物，那么所述试剂盒也可以包含过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。应当理解，在免疫诊断试剂中，用于抗体检测的抗原可以被可检测地标记，且在试剂盒中提供的用于与这样的试剂一起使用的任何抗体也可以被可检测地标记。

如果需要的话，所述试剂盒可以含有固体支持物相，诸如磁性颗粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘或芯片。

确定试验样品中的HCV的存在、量或浓度的方法

本公开内容提供了用于确定试验样品中的抗-HCV抗体和HCV抗原的存在、量或浓度的组合免疫测定方法。本领域已知的任意合适的测定可以用在这样的方法中，只要这样的测定使用用于检测HCV抗体的一种或多种抗原和/或用于检测试验样品中的一种或多种HCV抗原的一种或多种抗-HCV抗体。这样的测定的例子包括、但不限于：免疫测定法，诸如夹心免疫测定法(例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定法，包括放射性同位素检测(放射免疫测定法(RIA))和酶检测(酶免疫测定法(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA) (例如，Quantikine ELISA测定, R&D Systems, Minneapolis, Minn.))、竞争性抑制免疫测定法(例如，正向和反向)、荧光偏振免疫测定法(FPIA)、酶多种免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均匀化学发光测定等。

在组合免疫测定法的具体实施方案中，重组抗原(例如，核心、NS3和NS4抗原)可以用作捕获试剂(例如，通过使用这样的抗原，其中抗原的氨基或羧基端包含生物素标签)或用作检测(缀合物)试剂，其中抗原直接地或间接地用吖啶鎓标记。间接标记需要使用吖啶基化的BSA，其经由SMCC-型接头共价偶联至蛋白内的不成对半胱氨酸残基的游离巯基。为了促进这样的间接标记，在本发明的组合免疫测定法中使用的某些抗原可以容易地进一步修饰以包括在C-端的另外半胱氨酸残基。

通常，以1-步或2-步形式进行免疫测定。在1-步骤测定中用于捕获形成在溶液中的免疫复合物的固相试剂包括抗-生物素单克隆抗体、链霉亲和素或中和亲和素以捕获生物素化的部分(它是用于捕获HCV抗体的生物素化的抗原或用于捕获试验样品中的HCV蛋白/抗原的生物素化的抗体)。

在基于SELDI的免疫测定法中，特异性地结合抗-HCV-抗体或HCV抗原的捕获试剂附着至质谱探针（诸如预活化的蛋白芯片阵列）的表面。抗-HCV抗体或抗原然后被特异性地捕获在生物芯片上，且捕获的部分通过质谱法来检测。可替换地，抗-HCV抗体可以从捕获试剂洗脱，并通过传统的MALDI (基质辅助的激光解吸/电离)或通过SELDI来检测。化学发光微粒免疫测定法，尤其是采用ARCHITECT®自动化的分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)的免疫测定法，是优选免疫测定法的一个例子，其中可以容易地采用多个抗原(优选来自两种或更多种HCV蛋白的抗原)以及多个抗-HCV抗体的组合。也可以使用凝集测定，诸如被动血凝集测定。在凝集测定中，通过凝集或结块来检测抗原-抗体反应。在被动血凝集测定中，用抗原包被红细胞，且将包被的红细胞用在凝集测定中。

在本公开内容的实践中使用本领域众所周知的用于收集、操作和加工尿、血液、血清和血浆和其它体液的方法，例如，当免疫诊断试剂包含多个抗原和/或在抗-HCV抗体免疫测定法试剂盒中时。试验样品可以进一步包含除了目标多肽（诸如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白、肽、多肽、寡核苷酸或多核苷酸）以外的其它部分。例如，所述样品可以是得自受试者的全血样品。可以必须或期望在如本文中所述的免疫测定之前处理试验样品（尤其是全血），例如，用预处理试剂。即使在不需要预处理(例如，大多数尿样品)的情况下，可以任选地仅仅为了方便而进行预处理(例如，作为商业平台上的方案的一部分)。

所述预处理试剂可以是适合与本发明的组合免疫测定法和试剂盒一起使用的任何试剂。所述预处理任选地包括：(a)一种或多种溶剂(例如，甲醇和乙二醇)和盐，(b)一种或多种溶剂、盐和去污剂，(c)去污剂，或(d)去污剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，且这样的预处理可以用于例如在Abbott TDx、AxSYM®和ARCHITECT®分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)上的测定，如在文献中所述(参见，例如，Yatscoff等人, Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990), 和Wallemacq等人, Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999))，和/或如商购可得的。另外，可以如在Abbott的美国专利号5,135,875、欧洲专利公开号0 471 293、美国临时专利申请60/878,017（2006年12月29日提交）和美国专利申请公开号2008/0020401 (针对它关于预处理的教导，通过引用整体并入)中所述进行预处理。所述预处理试剂可以是异质试剂或均质试剂。

对于使用异质预处理试剂，预处理试剂会沉淀分析物结合蛋白(例如，可以结合抗-HCV抗体的蛋白或可以结合抗-HCV抗体的抗原在样品中形成存在)。这样的预处理步骤包括如下除去任何分析物结合蛋白：从沉淀的分析物结合蛋白分离通过向样品加入预处理试剂而形成的混合物的上清液。在这样的测定中，将不存在任何结合蛋白的混合物的上清液用在测定中，直接进行至抗体捕获步骤。

对于使用均质预处理试剂，不存在这样的分离步骤。使试验样品和预处理试剂的整个混合物与抗-HCV抗体的标记的特异性结合配偶体(即，抗原)或HCV抗原的标记的特异性结合配偶体(即，抗体)接触。在用第一特异性结合配偶体捕获之前或过程中，通常将用于这样的测定的预处理试剂在预处理过的试验样品混合物中稀释。尽管这样稀释，在捕获过程中在试验样品混合物中仍然存在(或保留)特定量的预处理试剂(例如，5 M甲醇和/或0.6甲二醇)。

在异质形式中，在从受试者得到试验样品以后，制备第一混合物。所述混合物含有要针对抗-HCV抗体和第一特异性捕获结合配偶体进行评估的试验样品，其中所述试验样品所含的第一特异性捕获结合配偶体和任何抗-HCV抗体形成第一特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体复合物。所述第一特异性捕获结合配偶体可以是核心抗原、NS3抗原或NS3中的任一种。在本发明中使用的示例性的NS3抗原可以是上文表1中所示的抗原中的任意一种或多种。同样地，在本发明的组合测定中，所述混合物也含有第二和第三特异性捕获结合配偶体，且这些第二和第三特异性捕获结合配偶体与存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体形成第二和第三特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体复合物。这样的第二、第三和第四抗原可以是选自核心抗原、NS3、NS4、NS5、及其部分的至少一种HCV抗原中的一种或多种。

另外，所述组合免疫测定法可以且优选地确实包括至少一种抗-HCV捕获抗体，其将与在试验样品中发现的第四特异性结合配偶体(即，在试验样品中发现的抗原或HCV蛋白)形成特定复合物，从而与存在于所述试验样品中的第四抗原形成抗-HCV抗体-第四特异性结合配偶体复合物。优选地，所述第四特异性结合对是检测试验样品中的核心抗原的结合对，且因此所述结合对是用于检测试验样品中的第四抗原(核心)的抗-核心抗体。

加入试验样品和各种特异性结合配偶体以形成混合物的次序不是至关重要的。在某些实施方案中，将所述第一、第二和第三特异性捕获结合配偶体(即，抗原)和所述抗-HCV捕获抗体固定化在固相上。在其它实施方案中，这4种组分都没有被固定化，而是相反都同时加入试验样品中以实现向固相上的捕获。在组合免疫测定法中使用的固相可以是本领域已知的任何固相，例如，但不限于，磁性颗粒、珠子、试管、微孔滴定板、比色皿、膜、支架分子、薄膜、滤纸、圆盘和芯片。

在第一、第二和第三特异性捕获结合配偶体与在试验样品中发现的它们各自的抗-HCV抗体之间、以及第一抗-HCV捕获抗体(例如，抗-核心)与在试验样品中发现的它们各自的HCV抗原或HCV蛋白之间形成免疫复合物以后，使用本领域已知的任何技术从复合物除去任何未结合的抗-HCV抗体或HCV抗原/蛋白。例如，通过洗涤，可以除去未结合的抗-HCV抗体或抗原。但是，理想地，所述第一、第二和第三特异性结合配偶体和所述抗-HCV抗体分别以超过存在于所述试验样品中的任何抗-HCV抗体和抗原的量存在，使得存在于所述试验样品中的所有抗-HCV抗体和抗原分别被第一、第二和第三特异性结合配偶体和抗-HCV捕获抗体结合。

除去任何未结合的抗-HCV抗体和抗原以后，通过将第一特异性检测结合配偶体加入混合物中以形成第一特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体-第一特异性检测结合配偶体复合物，实现检测。所述第一特异性检测结合配偶体优选地是抗-IgG抗体和抗-IgM抗体的组合。此外，也优选地，所述第一特异性检测结合配偶体用如上所述的可检测标记物标记或者含有如上所述的可检测标记物。在具体实施方案中，所述第一特异性检测配偶体可以替代性地或另外是结合捕获的抗体的抗原。同样地，在本发明的组合测定中，所述混合物也含有第二和第三特异性检测结合配偶体，且这些第二和第三特异性检测结合配偶体与捕获的存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体形成第二或第三特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体-第二或第三特异性检测结合配偶体复合物。此外，所述第二和第三特异性检测结合配偶体可以是抗-IgG抗体和抗-IgM抗体的组合。在具体实施方案中，所述第二和第三特异性检测配偶体可以替代性地或另外是结合捕获的抗体的抗原。此外，也优选地，所述第二和第三特异性检测结合配偶体（它们是抗-IgM或IgG抗体或抗原）用如上所述的可检测标记物标记或者含有如上所述的可检测标记物。另外，所述组合免疫测定法可以且优选地确实包括至少一种抗-HCV缀合物抗体，其将与捕获的在试验样品中发现的抗原或HCV蛋白形成特异性复合物，从而与从试验样品捕获的第四抗原形成抗-HCV抗体- 第四特异性结合配偶体-抗-HCV缀合物抗体复合物。

如本领域已知的任何合适的可检测标记物可以用作可检测标记物中的任意一种或多种。例如，所述可检测标记可以是放射性标记(诸如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P)、酶标记(诸如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(诸如吖啶酯、硫代酸酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记物(诸如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温标记或免疫聚合酶链式反应标记。对标记、标记方法和标记检测的介绍，参见：Polak和Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 第2版, Springer Verlag, N.Y. (1997), 和Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)，它是由Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg出版的组合手册和目录。荧光标记物可以用在FPIA中(参见，例如，美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，它们特此通过引用整体并入)。吖啶鎓化合物可以在均相化学发光测定中用作可检测标记(参见，例如，Adamczyk等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006)；Adamczyk等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004)；Adamczyk等人, Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004)；和Adamczyk等人, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003))。

一种优选的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。用于制备吖啶鎓9-甲酰胺的方法描述在Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk等人, J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk等人, Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk等人, Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk等人, Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly等人, In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. 编; CRC Press: Boca Raton, 第77-105页(2002); Adamczyk等人, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)；和美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699 (针对它关于相同内容的教导，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。

另一种优选的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酸芳基酯。式II的吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的一个例子是10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶鎓氟代磺酸盐(可得自Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich.)。制备吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的方法描述McCapra等人, Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965)；Razavi等人, Luminescence 15: 245-249 (2000)；Razavi等人, Luminescence 15: 239-244 (2000)；和美国专利号5,241,070 (针对它关于相同内容的教导，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。这样的吖啶鎓-9-甲酸芳基酯是至少一种氧化酶在分析物的氧化中产生的过氧化氢在信号的强度和/或信号的迅速方面的有效化学发光指示剂。吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的化学发光发射的进程快速地（即，在1秒以下）完成，而吖啶鎓-9-甲酰胺化学发光发射延长超过2秒。但是，吖啶鎓-9-甲酸芳基酯在有蛋白存在下丧失它的化学发光性能。因此，它的应用要求在信号产生和检测过程中不存在蛋白。用于分离或除去样品中的蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的，且包括、但不限于超滤、萃取、沉淀、透析、色谱法和/或消化(参见，例如，Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003))。从试验样品除去或分离的蛋白的量可以是约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%。关于吖啶鎓-9-甲酸芳基酯和它的用途的其它细节阐述在美国专利申请系列号11/697,835，其于2007年4月9日提交，且于2008年10月9日公开为美国专利申请公开号2008/0248493。可以将吖啶鎓-9-甲酸芳基酯溶解在任意合适的溶剂中，诸如脱气的无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或胆酸钠水溶液。

根据在Adamczyk等人, Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006)中描述的方法，可以进行化学发光测定。尽管可以使用任意合适的测定形式，微量培养板化学光度计(Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, Tenn.)能够快速地测定多个小体积的样品。使用96-孔黑色聚苯乙烯微量培养板(Costar #3792)，可以给化学光度计配备多个试剂注射器。可以将每个样品加入单独的孔中，随后同时/相继加入如通过采用的测定的类型确定的其它试剂。理想地，避免采用吖啶鎓芳基酯的中性或碱性溶液中的假碱的形成，诸如通过酸化。然后逐孔记录化学发光应答。在这点上，记录化学发光应答的时间部分地取决于采用的试剂和特定吖啶鎓的加入之间的延迟。

加入试验样品和一种或多种特异性结合配偶体以形成化学发光测定混合物的次序不是至关重要的。如果第一特异性捕获结合配偶体用吖啶鎓化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体复合物。可替换地，如果使用第一特异性检测结合配偶体且所述第一特异性检测结合配偶体用吖啶鎓化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性捕获结合配偶体-抗-HCV抗体-第一特异性检测结合配偶体复合物(类似地，对于上述组合测定中的第二和第三复合物)。使用本领域已知的任何技术，诸如洗涤，可以从混合物除去任何未结合的特异性结合配偶体，无论是标记的还是未标记的。

在加入上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后，可以在混合物中原位产生过氧化氢，或者可以向混合物提供或供应过氧化氢。可以以许多方式(诸如本领域技术人员将会明白的方式)原位产生过氧化氢。

可替换地，可以将过氧化氢来源简单地加入混合物中。例如，过氧化氢来源可以是已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其它溶液。在这点上，可以简单地加入过氧化氢的溶液。

在同时或随后向样品加入至少一种碱性溶液之后，产生指示抗-HCV抗体(在用抗原进行捕获的情况下)或抗原(在用抗体进行捕获的情况下)的存在的可检测信号，即化学发光信号。所述碱性溶液含有至少一种碱且具有大于或等于10、优选地大于或等于12的pH。碱性溶液的例子包括、但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。加入样品中的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于所用碱性溶液的浓度，本领域技术人员可以容易地确定加入样品中的碱性溶液的量。

使用本领域技术人员已知的常规技术，可以检测产生的化学发光信号。基于产生的信号的强度，可以定量样品中的抗-HCV抗体和/或抗原的量。具体地，样品中的抗-HCV抗体和/或抗原的量与产生的信号的强度成比例。通过将产生的光的量与抗-HCV抗体和/或抗原的标准曲线对比或通过与参比标准对比，可以定量存在的抗-HCV抗体和/或抗原的量。通过质谱法、重量分析方法和本领域已知的其它技术，使用抗-HCV抗体的已知浓度的系列稀释液或溶液，可以产生标准曲线。

使用本领域已知的任意适合形式，可以进行抗-HCV抗体和/或抗原免疫测定。一般而言，可以使要针对(例如，疑似含有)抗-HCV抗体试验的样品与捕获抗原和至少一种检测抗体(其可以是第二检测抗体或第三检测抗体)（诸如标记的抗-IgG和抗-IgM抗体）同时或依次且以任意次序接触。类似地，可以使要试验抗原存在的样品与捕获的抗体接触，所述捕获的抗体结合试验样品中的抗原，且结合的抗原然后可以被检测抗体检测到。

例如，可以首先使试验样品与至少一种捕获抗原接触，且然后(依次)与至少一种检测抗体接触。可替换地，可以首先使试验样品与至少一种检测抗体接触，且然后(依次)与至少一种捕获抗体接触。在另一个替代方案中，可以使试验样品同时与捕获抗原和检测抗体接触。

在夹心测定形式中，首先在允许形成第一捕获抗原/抗-HCV抗体复合物的条件下使疑似含有抗-HCV抗体(或其片段)的样品与至少第一捕获抗原接触。在组合测定中，将相同操作重复，或用第二、第三或更多捕获抗原同时进行。如果使用超过一种捕获抗原，那么形成多种第一捕获抗原/抗-HCV抗体复合物。在一种夹心测定中，以试验样品中预期的抗-HCV抗体的最大量的摩尔过量的量使用抗原，优选至少一种捕获抗原。例如，可以使用约5 μg至约1 mg抗原/mL缓冲液(例如，微粒包被缓冲液)。

经常用于测量小分析物的竞争性抑制免疫测定法包括依次和经典形式。在依次竞争性抑制免疫测定法中，将一种或多种针对目标抗体(即，抗-HCV抗体)的捕获抗原(即，多肽，且优选一对多肽，如本文中所述)包被在微孔滴定板的孔上。当将含有目标抗体的样品加入孔中时，目标抗体结合捕获抗原。在洗涤后，将已知量的标记的(例如，用生物素或辣根过氧化物酶(HRP))的抗体加入孔中。酶标记的底物是产生信号所必需的。HRP的合适底物的一个例子是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在洗涤后，测量由标记的抗体产生的信号，且其与样品中的抗体的量成反比。在一个经典的竞争性抑制免疫测定法中，将针对目标抗体的抗原包被在微孔滴定板的孔上。但是，不同于依次竞争性抑制免疫测定，同时将含有目标抗体(即，抗-HCV抗体)的样品和标记的抗体加入孔中。样品中的任何抗体与标记的抗体竞争对捕获抗原的结合。在洗涤后，测量由标记的分析物产生的信号，且其与样品中分析物的量成反比。

任选地，在使试验样品与至少一种捕获抗原(例如，第一捕获抗原)接触之前，所述至少一种捕获抗原可以结合至固体支持物，这会促进第一抗原/抗-HCV抗体复合物从试验样品的分离。捕获抗原所结合的基质可以是促进捕获抗原-抗-HCV抗体复合物从样品分离的任意合适的固体支持物或固相。例子包括板(诸如微孔滴定板)的孔、试管、多孔凝胶(例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶)、聚合物薄膜(例如，聚丙烯酰胺)、珠子(例如，聚苯乙烯珠子或磁珠)、滤纸/膜(例如，硝酸纤维素或尼龙)的条带、微粒(例如，胶乳颗粒、可磁化的微粒(例如，具有氧化铁或氧化铬核心和均聚或杂聚涂层以及约1-10微米半径的微粒))。基质可以包含合适的多孔材料，其具有结合抗原的合适表面亲和力和允许检测抗体到达的足够孔隙率。微孔材料一般是优选的，尽管可以使用水合状态的凝胶状材料。这样的多孔基质优选地呈具有约0.01至约0.5 mm、优选约0.1 mm的厚度的薄片形式。尽管孔径可能有相当大的变化，但是优选地孔径是约0.025至约15微米，更优选约0.15至约15微米。这样的基质的表面可以通过造成抗体与基质共价键合的化学过程来活化。抗原与基质发生不可逆结合，通常通过疏水力实现的吸附；可替换地，化学偶联剂或其它方式可以用于使抗原与基质共价结合，前提条件是，这样的结合不会干扰抗原的结合抗-HCV抗体的能力。

可替换地，来自试验样品的抗-HCV抗体可以与微粒结合，所述微粒已经预先用抗原包被。如果需要的话，一种或多种捕获试剂（诸如一对如本文中所述的多肽，其中的每一种可以被抗-HCV抗体结合）可以在不同的物理位置或可到达的位置连接至固相(例如，诸如以生物芯片构型(参见，例如，美国专利号6,225,047, 国际专利申请公开号WO 99/51773；美国专利号6,329,209；国际专利申请公开号WO 00/56934,和美国专利号5,242,828)。如果捕获试剂连接至作为固体支持物的质谱法探针，那么通过激光解吸电离质谱法可以检测与探针结合的抗-HCV抗体的量。可替换地，单个柱可以用不同珠子填充，所述珠子用一种或多种捕获试剂衍生化，由此将抗-HCV抗体捕获在单个位置中(参见抗体衍生化的基于珠子的技术，例如Luminex (Austin, Tex.)的xMAP技术)。

在使针对抗-HCV抗体测定的试验样品与至少一种捕获抗原(例如，第一捕获抗原)接触之后，将混合物温育以便允许形成第一抗原(或多个抗原)-抗-HCV抗体(或其片段)复合物。可以在约4.5至约10.0的pH在约2℃至约45℃的温度进行温育，且持续至少约一(1)分钟至约十八(18)小时、优选约1分钟至约24分钟、最优选约4分钟至约18分钟的时段。本文描述的免疫测定法可以在一个步骤中(意味着试验样品、至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体都依次或同时加入反应容器中)或在超过一个步骤(诸如两个步骤、三个步骤等)中进行。

在形成(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体复合物之后或同时，然后使所述复合物与至少一种检测抗体(在允许形成(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/第一抗体检测复合物的条件下)接触。所述至少一种检测抗体可以是在免疫测定法中使用的第二抗体、第三抗体、第四抗体等。如果使捕获抗原/抗-HCV抗体复合物与超过一种检测抗体接触，那么形成(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/(多个)检测抗体复合物。与捕获抗原(例如，第一捕获抗原)一样，当使至少第二(和以后的)检测抗体与捕获抗原/抗-HCV抗体复合物接触时，需要在与上述那些类似的条件下温育一段时间以形成(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/(第二或多个)检测抗体复合物。优选地，至少一种检测抗体含有可检测标记物。可以在形成(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/(第二或多个)检测抗体复合物之前、同时或之后，使所述可检测标记物结合至少一种检测抗体(例如，第二检测抗体)。可以使用本领域已知的任何可检测标记物(参见上面的讨论，包括Polak和Van Noorden (1997)和Haugland (1996))。

可检测标记物可以直接地或通过偶联剂结合抗体(或抗原，其可以包含可检测标记物)。可使用的偶联剂的一个例子是EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺, 盐酸盐)，其可商购得自Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo。可使用的其它偶联剂是本领域已知的。用于使可检测标记物结合抗体的方法是本领域已知的。另外，可以购买或合成许多可检测标记物，其已含有促进所述可检测标记物与抗体的偶联的端基，诸如CPSP-吖啶酯(即，9-[N-甲苯磺酰基-N-(3-羧基丙基)]-10-(3-磺丙基)吖啶鎓羧酰胺)或SPSP-吖啶酯(即，N10-(3-磺丙基)-N-(3-磺丙基)-吖啶鎓-9-甲酰胺)。

(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/(第二或多个)检测抗体复合物可以、但不一定在标记物的定量之前与试验样品的其余部分分离。例如，如果使至少一种捕获抗原(例如，第一捕获抗原)结合至固体支持物(诸如孔或珠子)，那么可以通过移除流体(试验样品的流体)免于与固体支持物接触来实现分离。可替换地，如果使至少第一捕获抗原结合至固体支持物，那么它可以同时与含有抗-HCV抗体的样品和至少一种第二检测抗体(或标记的检测抗原)接触以形成第一(多个)抗原/抗-HCV抗体/第二(多个)抗体(和/或标记的检测抗原)复合物，随后移除流体(试验样品)免于与固体支持物接触。如果至少第一捕获抗原没有结合固体支持物，那么为了定量标记物的量，不必从试验样品移除(第一或多个)捕获抗原/抗-HCV抗体/(第二或多个)检测抗体(和/或捕获的抗体的检测抗原)复合物。

在形成标记的捕获抗原/抗-HCV抗体/检测抗原(和/或检测抗体)复合物(例如，第一捕获抗原/抗-HCV抗体/第一检测抗原复合物，任选地也含有第二检测抗体)之后，使用本领域已知的技术定量所述复合物中标记物的量。例如，若使用酶标记物，则使经标记的复合物与所述标记物的底物反应，所述底物会产生可计量的反应诸如颜色的显影。如果标记物是放射性标记，那么使用闪烁计数器定量标记物。如果标记物是荧光标记物，那么如下定量标记物：用一种颜色的光(其称为“激发波长”)刺激标记物，并检测所述标记物响应于所述刺激而发射的另一种颜色(其称为“发射波长”)。如果标记物是化学发光标记物，那么通过目视或通过使用光度计、x-射线胶片、高速照相胶片、CCD照相机等检测发射的光来定量标记物。一旦已经定量复合物中标记物的量，就通过使用标准曲线（其已使用已知浓度的抗-HCV抗体或抗原的系列稀释物产生）来确定试验样品中的抗-HCV抗体或抗原的浓度。除了使用抗-HCV抗体或HCV抗原的系列稀释物以外，通过比重测定法、通过质谱法和通过本领域已知的其它技术可以产生标准曲线。

在采用ARCHITECT®分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应当是约6.0±0.2，微粒包被缓冲液应当维持在室温(即，在约17至约27℃)，微粒包被缓冲液pH应当是约6.5±0.2，且微粒稀释剂pH应当是约6.5±0.2。固体优选地小于约0.2%，诸如小于约0.15%，小于约0.14%，小于约0.13%，小于约0.12%，或小于约0.11%，诸如约0.10%。

FPIA是基于竞争性结合免疫测定原理。当被线性偏振光激发时，荧光地标记的化合物将发射具有与它的旋转速率成反比的偏振度的荧光。当荧光地标记的示踪剂-抗体复合物被线性偏振光激发时，因为荧光团在吸收光的时间与发射光的时间之间的旋转受限制，所以发射的光保持高度偏振。当“游离的”示踪剂化合物(即没有结合抗体的化合物)被线性偏振光激发时，它的旋转比在竞争性结合免疫测定法中产生的相应示踪剂-抗体缀合物快得多。因为不存在需要特殊处理和处置的放射性物质，所以FPIA比RIA有利。另外，FPIA是可以容易地和快速地执行的均质测定。

商购可得的抗-HCV抗体以及抗-IgG和抗-IgM抗体可以用在测定方法及其试剂盒中。商购可得抗体包括可从Abnova (Walnut, Calif., 和Taiwan)和GenWay Biotech, Inc. (San Diego, Calif.)得到的那些。关于抗-HCV抗体的制备，也参见欧洲专利申请EP2099825 A2。

任何合适的对照组合物可以用在抗-HCV抗体和HCV抗原组合免疫测定法中。所述对照组合物通常包含抗-HCV抗体和已知的抗原以及任何合乎需要的添加剂。

因而，考虑到以上内容，提供了确定试验样品中的抗-HCV抗体或抗原的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过以下测定来测定试验样品的抗-HCV抗体或抗原：

(i)采用包含至少一种分离的或纯化的含有HCV抗原的多肽和至少一种可检测标记物的免疫诊断试剂，并将由可检测标记物产生的作为试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号与作为对照物或校准物中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度的直接或间接指示而产生的信号进行对比，所述对照物或校准物任选地是一系列校准物的组成部分，其中每种校准物与该系列中的其它校准物的差别在于抗-HCV抗体的浓度。所述方法可以包括下述步骤：

(i)使所述试验样品与包含多种重组HCV抗原之一的免疫诊断试剂接触，从而与可能存在于所述试验样品中的HCV抗体形成第一、第二和第三特异性捕获结合配偶体/抗-HCV抗体复合物，

(ii)使所述第一、第二和第三特异性捕获结合配偶体/第一、第二和第三抗-HCV抗体复合物与抗-HCV抗体(例如，如本文中所述的抗-IgG抗体和抗-IgM抗体或多肽)的至少一种可检测地标记的第二特异性结合配偶体接触，从而形成第一特异性结合配偶体/各种第一、第二和第三抗-HCV抗体/第二特异性结合配偶体复合物，和

(iii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物所产生的信号，确定试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度。

任选地或优选地，除了使用抗-IgG和IgM抗体以外或作为替代，所述第二步包括加入第一、第二和第三检测抗原，其将特异性地结合已经分别被第一、第二和第三捕获抗原特异性地捕获的抗-HCV抗体，从而形成第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体/第二特异性结合配偶体复合物，且所述第三步包括：

(iii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一、第二和第三特异性捕获结合配偶体/第一、第二和第三抗-HCV抗体/第一、第二和第三特异性检测结合配偶体复合物内的可检测标记物所产生的信号，确定试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度。

可替换地，所述方法可以包括下述步骤：

(i)使所述试验样品与包含多种重组抗原之一的免疫诊断试剂接触，且同时或依次以任一次序，使所述试验样品与至少一种可检测地标记的第二特异性结合配偶体接触，所述配偶体可以与抗-HCV抗体竞争对至少一对第一特异性结合配偶体的结合且其包含可检测地标记的抗-HCV抗体，其中存在于所述试验样品中的任何抗-HCV抗体和所述至少一种可检测地标记的第二特异性结合配偶体彼此竞争以分别形成第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体复合物和第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物，和

(ii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物所产生的信号，确定试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度，其中所述第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物产生的信号与试验样品中的抗-HCV抗体的量或浓度成反比。免疫诊断试剂所包含的重组抗原可以包被在微粒上。在这点上，免疫诊断试剂所包含的抗原可以共包被在与另外的HCV抗原相同的微粒上。当免疫诊断试剂所包含的多肽共包被在相同微粒(例如，含有4%固体的微粒混悬液(4%重量/体积的微粒或4克微粒/100 mL微粒混悬液))上时，优选地所述多肽以约1:2至约1:6的比例共包被在相同微粒上，其中，当所述多肽以约1:2的比例共包被在相同微粒上时，分离的或纯化的本发明的抗原(例如，在表1中描述的那些)的浓度是至少约40 μg/mL，且其它分离的或纯化的多肽的浓度是至少约80 μg/mL。如果试验样品得自患者，所述方法可以进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果所述方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，那么所述方法任选地可以进一步包括根据需要改变患者的治疗性/预防性处理以提高效力。所述方法可以适合用于自动化的系统或半自动化的系统中。

并且，考虑到以上内容，提供了确定试验样品中的抗-HCV抗体或HCV抗原或蛋白的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过以下测定来测定试验样品：

(i)采用包含至少一种HCV抗原(且优选2、3或更多种抗原)和至少一种可检测标记物(优选地每种抗原被可检测地标记)的免疫诊断试剂，和

(ii)将由所述可检测标记物产生的作为试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号与作为对照物或校准物中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度的直接或间接指示而产生的信号进行对比，所述对照物或校准物任选地是一系列校准物的组成部分，其中每种校准物与该系列中的其它校准物的差别在于抗-HCV抗体的浓度。所述方法可以包括下述步骤：

(i)使所述试验样品与包含至少一种、两种、三种或更多种本发明的重组HCV抗原的免疫诊断试剂接触从而形成第一特异性捕获结合配偶体/抗-HCV抗体复合物，

(ii)使所述第一特异性捕获结合配偶体/抗-HCV抗体复合物与抗-HCV抗体(例如，抗-IgG抗体和抗-IgM抗体，或结合抗-HCV抗体的标记的抗原)的至少一种可检测地标记的第二特异性结合配偶体接触从而形成第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体/第二特异性结合配偶体复合物，和

(iii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物所产生的信号，确定试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度。可替换地，所述方法可以包括下述步骤：

(i)使所述试验样品与包含至少一种、两种、三种或更多种不同HCV抗原的免疫诊断试剂接触，且同时或依次以任一次序，使所述试验样品与至少一种可检测地标记的第二特异性结合配偶体接触，所述配偶体可以与抗-HCV抗体竞争对至少一对第一特异性结合配偶体的结合且其包含可检测地标记的抗-HCV抗体，其中存在于所述试验样品中的任何抗-HCV抗体和所述至少一种第二特异性结合配偶体彼此竞争以分别形成第一特异性结合配偶体/抗-HCV抗体复合物和第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物，和

(ii)通过检测或测量在(ii)中形成的第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物所产生的信号，确定试验样品中的抗-HCV抗体的存在、量或浓度，其中所述第一特异性结合配偶体/第二特异性结合配偶体复合物内的可检测标记物产生的信号与试验样品中的抗-HCV抗体的量或浓度成反比。免疫诊断试剂所包含的多肽可以包被在微粒上。在这点上，免疫诊断试剂所包含的多肽可以共包被在相同微粒上。当免疫诊断试剂所包含的多肽共包被在相同微粒(例如，含有4%固体的微粒混悬液(4%重量/体积的微粒或4克微粒/100 mL微粒混悬液))上时，优选地所述多肽以约1:2至约1:6的比例共包被在相同微粒上，其中，当所述多肽以约1:2的比例共包被在相同微粒上时，分离的或纯化的包含重组HCV抗原的多肽的浓度是至少约40 μg/mL，且其它分离的或纯化的多肽的浓度是至少约80 μg/mL。如果试验样品得自患者，所述方法可以进一步包括诊断、预测或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果所述方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，那么所述方法任选地可以进一步包括根据需要改变患者的治疗性/预防性处理以提高效力。所述方法可以适合用于自动化的系统或半自动化的系统中。

通常，可以将预定水平用作基准，相对于它来评估在测定试验样品的抗-HCV抗体后获得的结果。通常，在进行这样的对比时，如下获得预定水平：以足够次数且在适当条件下运行特定测定，使得分析物存在、量或浓度与疾病、障碍或病症(例如，先兆子痫或心血管疾病)的特定阶段或终点或与特定标志可以进行联系或关联。通常，用参照受试者(或受试者群体)的测定来获得预定水平。

具体地，关于如用于监测疾病进展和/或治疗的预定水平，抗-HCV抗体的量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或“有利变化的”)或“不利的”(或“不利变化的”)。“升高”或“增加”表示试验样品中的量或浓度高于典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)，或高于另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)。术语“降低”或“减少”表示试验样品中的量或浓度低于典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)或低于另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)。术语“改变”表示样品中的量或浓度与典型的或正常的水平或范围(例如，预定水平)相比或与另一个参比水平或范围(例如，先前或基线样品)相比有所改变(增加或减小)。

根据标准实践来确定抗-HCV抗体或HCV抗原的典型的或正常的水平或范围。因为抗-HCV抗体和/或HCV抗原的水平在某些情况下是非常低的，所以当与典型的或正常的水平或范围或参比水平或范围相比存在不可通过实验误差或样品偏差解释的任何净变化时，可以视为已经发生所谓的改变的水平或变化。因此，在特定样品中测量的水平将与在得自所谓正常受试者的类似样品中确定的水平或水平范围进行对比。在该背景下，“正常受试者”是例如不具有可检测的肝炎的个体，且“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是例如没有表现出可检测肝炎的患者或群体。此外，鉴于抗-HCV抗体和HCV抗原通常不以高水平见于大多数人群体中，所以“正常受试者”可以视为不具有抗-HCV抗体或HCV抗原的量或浓度的大幅可检测的增加或升高的个体，且“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是没有表现出抗-HCV抗体的量或浓度的大幅可检测的增加或升高的患者或群体。“表观正常受试者”是其中尚未评估或当前正在评估抗-HCV抗体或HCV抗原的受试者。当分析物通常不可检测(例如正常水平是零，或在正常群体的约25至约75%的范围内)但在试验样品中被检测到时，以及当分析物以高于正常水平存在于所述试验样品中时，称作分析物的水平“升高”。因而，除了别的以外，本公开内容提供了一种筛选具有例如如本文中定义的肝炎或处于具有例如如本文中定义的肝炎的风险中的受试者的方法。

因此，本文所述的方法也可以用于确定受试者是否具有发展中的肝炎或处于发展中的肝炎的风险中。具体地，这样的方法可以包括以下步骤：

(a)确定得自受试者的试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量(例如，使用本文所述的方法或本领域已知的方法)；和

(b)将在步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量与预定水平进行对比，其中，如果在步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量相对于预定水平而言是有利的，那么确定所述受试者不具有肝炎或未处于肝炎的风险中。但是，如果在步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量相对于预定水平而言是不利的，那么确定受试者具有肝炎或处于肝炎的风险中。

另外，本文提供了一种监测受试者的疾病进展的方法。最优地，所述方法包括以下步骤：

(a)确定得自受试者的试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量；

(b)确定得自受试者的稍后试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量；和

(c)将如步骤(b)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量与在步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量进行对比，其中如果在步骤(b)中确定的浓度或量当与在步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或抗原的浓度或量相比时未变化或是不利的，那么确定受试者的疾病已经持续、进展或恶化。通过对比，如果如在步骤(b)中确定的抗-HCV抗体和/或抗原的浓度或量当与如步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或抗原的浓度或量相比时是有利的，那么确定受试者的疾病已经停止、消退或改善。

任选地，所述方法进一步包括将如步骤(b)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量与例如预定水平进行对比。进一步，任选地，如果所述对比表明如步骤(b)中确定的抗-HCV抗体和/或抗-HCV抗原的浓度或量例如相对于预定水平而言不利地改变，那么所述方法包括用一种或多种药物组合物治疗受试者一段时间。

另外，所述方法可以用于监测接受一种或多种药物组合物治疗的受试者的治疗。具体地，这样的方法涉及在已经给受试者施用一种或多种药物组合物之前提供得自受试者的第一试验样品。接着，确定得自受试者的第一试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量(例如，使用本文所述的或本领域已知的方法)。在确定抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量之后，任选地随后将抗-HCV抗体的浓度或量与预定水平进行对比。如果在第一试验样品中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量低于预定水平，那么不用一种或多种药物组合物治疗受试者。但是，如果在第一试验样品中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量高于预定水平，那么用一种或多种药物组合物治疗受试者一段时间。用一种或多种药物组合物治疗受试者的时间段可以由本领域技术人员确定(例如时间段可以为约七(7)天至约两年，优选约十四(14)天至约一(1)年)。

在用一种或多种药物组合物治疗的过程期间，随后从受试者获得第二试验样品和后续试验样品。试验样品的数目和从受试者获得所述试验样品的时间不是至关重要的。例如，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后七(7)天获得第二试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后两(2)周获得第三试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后三(3)周获得第四试验样品，可以在首次给受试者施用一种或多种药物组合物之后四(4)周获得第五试验样品，等。

在从受试者获得每个第二试验样品或后续试验样品之后，确定第二试验样品或后续试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量(例如，使用本文所述的或本领域已知的方法)。随后将在第二试验样品和后续试验样品的每一个中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量与在第一试验样品(例如，最初任选地与预定水平对比的试验样品)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量进行对比。如果如步骤(c)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量当与如步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量相比时是有利的，那么确定受试者的疾病已经停止、消退或改善，且应当继续给受试者施用步骤(b)的一种或多种药物组合物。但是，如果在步骤(c)中确定的浓度或量当与如步骤(a)中确定的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量相比时未变化或是不利的，那么确定受试者的疾病已经持续、进展或恶化，且应当用较高浓度的在步骤(b)中施用给受试者的一种或多种药物组合物治疗受试者，或应当用不同于步骤(b)中施用给受试者的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者。具体地，可以用不同于受试者先前已经接受的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者以减少或降低受试者的抗-HCV抗体和/或HCV抗原水平。

通常，对于其中可能进行重复试验的测定(例如，监测疾病进展和/或对治疗的反应)，在已经从受试者获得第一试验样品之后的时段获得第二试验样品或后续试验样品。具体地，得自受试者的第二试验样品可以在已经从受试者获得第一试验样品之后数分钟、数小时、数天、数周或数年获得。例如，可以在从受试者获得第一试验样品之后约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年的时段从受试者获得第二试验样品。当用于监测疾病进展时，以上测定可以用于监测遭受急性病症的受试者的疾病进展。急性病症（也被称作危急护理病症）表示急性的、危及生命的疾病或其它涉及例如心血管系统或排泄系统的危急医学病症。通常，危急护理病症表示需要在基于医院的场合(包括、但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心或其它紧急护理场合)中的急性医学干预或由护理人员或其它基于场所的医护人员进行施用的那些病症。对于危急护理病症，通常在较短的时间范围内进行重复监测，即，数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、4约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，且初始测定同样通常在疾病或病症发作的较短时间范围(例如，约数分钟、数小时或数天)内进行。

测定也可以用于监测遭受慢性或非急性病症的受试者的疾病进展。非危急护理或非急性病症表示除了急性的、危及生命的疾病或涉及例如心血管系统和/或排泄系统的其它危急医学病症以外的病症。通常，非急性病症包括较长期或长持续时间的那些病症。对于非急性病症，通常在较长的时间范围内进行重复监测，例如，数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，且初始测定同样通常在疾病或病症发作的较长时间范围(例如，约数小时、数天、数月或数年)内进行。

此外，可以使用从受试者获得的第一试验样品执行上述测定，其中所述第一试验样品得自自一种来源，诸如尿、血清或血浆。任选地，可以随后使用从受试者获得的第二试验样品重复上述测定，其中所述第二试验样品得自自另一来源。例如，如果第一试验样品得自尿，那么第二试验样品可以得自血清或血浆。可以将得自使用第一试验样品和第二试验样品的测定的结果进行对比。所述对比可以用于评估受试者的疾病或病症的状态。

此外，本公开内容也涉及确定易感或遭受肝炎的受试者是否将受益于治疗的方法。具体地，本公开内容涉及HCV伴侣诊断方法和产品。因此，如本文中所述的“监测受试者的疾病的治疗”的方法进一步最佳地也可以包括为疗法选择或鉴定候选者。

因而，在特定实施方案中，公开内容也提供了一种确定具有肝炎或处于肝炎的风险中的受试者是否是疗法的候选者的方法。通常，受试者是这样的受试者：其已经经历肝炎的某种症状，或其实际上已经被诊断为具有肝炎或处于肝炎的风险中，和/或其表现出如本文中所述的不利浓度或量的抗-HCV抗体或其片段和/或HCV抗原。

所述方法任选地包括如本文中所述的测定，其中在用一种或多种药物组合物(例如，特别是用与涉及HCV的作用机理有关的药物)、用免疫抑制疗法或通过免疫吸附疗法、用抗血管生成疗法治疗受试者之前和之后评估分析物，或其中在这样的治疗之后评估分析物并将分析物的浓度或量与预定水平进行对比。在治疗后观察到的分析物的不利浓度或量证实所述受试者将不会受益于接受进一步或持续治疗，而在治疗后观察到的分析物的有利浓度或量证实所述受试者将受益于接受进一步或持续治疗。该证实有助于临床研究的管理和改进的患者护理的提供。

试剂盒和方法的改进

所述试剂盒(或其组分)、以及通过如本文中所述的免疫测定法确定试验样品中的抗-HCV抗体和/或HCV抗原的浓度的方法可以改进以用于多种自动化的和半自动化的系统（包括其中固相包含微粒的那些）中，如在例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述，和如例如作为ARCHITECT®由Abbott Laboratories (Abbott Park, Ill.)商业销售的。

自动化的或半自动化的系统与非自动化的系统(例如，ELISA)相比的一些差异包括第一特异性结合配偶体(例如，抗原)所附着的基质(其可影响夹心形成和分析物反应性)、以及捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的时长和时机。尽管非自动化的形式（诸如ELISA）可能需要相对较长的与样品和捕获试剂一起的温育时间(例如，约2小时)，自动化的或半自动化的形式(例如，ARCHITECT®, Abbott Laboratories)可能具有相对较短的温育时间(例如，对于ARCHITECT®，大约18分钟)。类似地，尽管非自动化的形式（诸如ELISA）可能温育检测抗体（诸如缀合物试剂）相对较长的温育时间(例如，约2小时)，自动化的或半自动化的形式(例如，ARCHITECT®)可能具有相对较短的温育时间(例如，对于ARCHITECT®，大约4分钟)。

可以从Abbott Laboratories获得的其它平台包括、但不限于AxSYM®、IMx®(参见，例如，美国专利号5,294,404，其特此通过引用整体并入)、PRISM®、EIA (珠子)和Quantum™II、以及其它平台。另外，可以以其它形式采用所述测定、试剂盒和试剂盒组分，例如，在电化学或其它手提式或照护现场测定系统上。本公开内容例如适用于执行夹心免疫测定法的商业Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。在例如下述文献中描述了在一次性使用的试验装置中的免疫传感器及其制备和操作方法：美国专利号5,063,081, 美国专利申请公开号2003/0170881, 美国专利申请公开号2004/0018577, 美国专利申请公开号2005/0054078,和美国专利申请公开号2006/0160164，针对它们关于相同内容的教导，它们都通过引用整体并入。

具体地，关于测定对I-STAT®系统的适应，下述构型是示例性的。用一对金电流计工作电极和银-氯化银参比电极制造微制造的硅片。在工作电极之一上，将具有固定化的捕获抗体的聚苯乙烯珠子(0.2 mm直径)附着于电极上的图案化聚乙烯醇的聚合物涂层。将该芯片装配进具有适合于免疫测定法的流控技术形式的I-STAT®筒。在筒的样品保留腔室的壁的一部分上，存在包含用碱性磷酸酶(或其它标记物)标记的检测抗体的层。在筒的流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸酯的水性试剂。

在运行中，将疑似含有抗-HCV抗体和/或HCV抗原的样品加入试验筒的保留腔室中，且将该筒插入I-STAT®读数器中。在检测抗体或可检测地标记的检测抗原已经溶解在样品中以后，在该筒内的泵元件迫使样品进入含有芯片的导管中。在这里，它被振荡以促进捕获抗原(或捕获抗体)、抗-HCV抗体(或HCV抗原)和标记的检测抗体(和/或检测抗原)之间的夹心的形成。在测定的倒数第二个步骤中，将流体驱出袋并进入导管中以将样品洗出芯片和进入废物腔室中。在测定的最终步骤中，碱性磷酸酶标记物与对氨基苯酚磷酸酯反应以切割磷酸酯基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极处电化学地氧化。基于测量的电流，读数器能够借助于嵌入的算法和工厂确定的校正曲线计算样品中的抗-HCV抗体或HCV抗原的量。

如本文中所述的方法和试剂盒包括用于进行免疫测定的其它试剂和方法。例如，包括各种缓冲液，诸如本领域中已知和/或可以容易地制备或优化以例如用于洗涤、用作缀合物稀释剂、和/或用作校准物稀释剂的缓冲液。一种示例性的缀合物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)中所用且含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、盐、蛋白阻滞剂、抗微生物剂和去污剂的ARCHITECT®缀合物稀释剂。一种示例性的校准物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.)中所用的ARCHITECT®人校准物稀释剂，其包含含有MES、其它盐、蛋白阻滞剂和抗微生物剂的缓冲液。另外，如在2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142,048和美国专利申请系列号12/650,241所述，使用与信号抗体连接的核酸序列作为信号放大剂，可以例如以I-STAT®筒形式得到改进的信号产生。

实施例

实施例1：HCV NS3 9NB49H的克隆和表达.

将编码HCV -1的氨基酸1192-1457 (Seq ID #) 2)的核苷酸序列(Seq ID # 1)为大肠杆菌表达进行密码子优化，并克隆进修饰的pET32a载体中，其中编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列被消除，并用甲硫氨酸(M)替换。另外，包括羧基端六组氨酸标签以促进经由固定化的金属亲和色谱法(IMAC)的纯化。用纯化的质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并筛选转化体。得到的质粒被命名为p9NB49H，且从其表达的蛋白被命名为9NB49H。

通过在极端肉汤(TB)培养基中培养p9NB49H转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，实现蛋白表达。在摇瓶中培养细胞至0.50的OD600nm，然后用1mM IPTG诱导，并在25-37℃生长大约3小时直到得到大约3.5的OD600nm。将细胞通过离心进行收获，并悬浮于补充了蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(50 mM KPO4, 300 mM KCl, 5 mM咪唑, pH 8.0)中。将细胞混悬液冷冻和融化，加入benzonase，并通过在冰上超声处理来裂解细胞。通过离心将裂解物分成可溶性的和不溶性的级分。SDS-PAGE揭示，NS3 9NB49H蛋白存在于可溶性级分中。使用天然 IMAC缓冲液试剂盒和Profinity IMAC筒(BioRad)根据制造商的方案，在裂解物可溶性级分上进行IMAC纯化。通过脱盐柱或通过透析，完成纯化的蛋白向PBS中的缓冲液更换。在纯化操作中使用的所有缓冲液含有20 mMβ-巯基乙醇(βME)。

实施例2：HCV NS3 Nbt-9NB49H的克隆和表达.

将在实施例1中描述的编码NS3 9NB49H蛋白的核苷酸序列亚克隆进修饰的pET32a质粒中，其中所述开放读码框编码：氨基端生物素化标签(MSGLNDIFEAQKIEWHE)，在NS3-en编码序列上游的GSGSNSM- 接头序列，然后是羧基端六组氨酸标签，然后是终止密码子。得到的质粒被命名为pNbt-9NB49H。Beckett等人(Protein Science, 8(4):921-929, 1999)描述的生物素化标签允许经由大肠杆菌BirA基因编码的生物素连接酶实现位点特异性的生物素掺入。用pNbt-9NB49H表达质粒和在IPTG诱导型启动子控制下的表达生物素连接酶的第二质粒(pBirAcm)共转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在Terrific肉汤（含有加至0.050 mM终浓度的生物素）中在37℃在摇瓶中培养细胞至0.50的OD600nm，然后用1mM IPTG诱导，并在25℃培养过夜。然后将细胞通过离心进行收集，并再悬浮于裂解缓冲液中和超声处理以破坏细胞。在某些情况下，为了进一步确保高水平的位点特异性的生物素化，将ATP和生物素加入裂解的细胞中(分别是3mM和0.25 mM终浓度)，并在室温温育2小时。然后如在实施例1中所述，通过IMAC纯化重组蛋白。

实施例3：HCV NS3 9NB49H-Cbt的克隆和表达.

将在实施例1中描述的编码NS3 9NB49H蛋白的核苷酸序列亚克隆进修饰的pET32a载体中，其中所述开放读码框编码：N-端甲硫氨酸，然后是NS3，然后是GSGSG-接头和六组氨酸标签，然后是GG- 接头和生物素化标签(GLNDIFEAQKIEWHE)，最后是终止密码子。得到的质粒被命名为p9NB49H-Cbt。如在实施例1和2中所述进行蛋白表达和生物素化。

实施例4：HCV NS3h及其变体的克隆和表达.

如在下面的表2中所述和如在图1中所示，使用与HCV NS3解螺旋酶的不同区域融合的、由p9NB49H表达的相同氨基端(即HCV多蛋白的氨基酸1192-1215)，构造重组HCV NS3解螺旋酶变体。将编码解螺旋酶构建体的核苷酸序列克隆进修饰的pET32a载体(没有硫氧还蛋白融合)，其具有如在实施例1中描述的羧基端GSGSG-六组氨酸标签或如在实施例2中描述的羧基端GSGSG-六组氨酸-GG-生物素化标签。如在实施例1和2中所述，执行具有或没有生物素化的蛋白表达和纯化。

表2

HCV多蛋白的区域	HCV NS3的区域	质粒命名	表达的蛋白命名	Seq ID# (核苷酸, 氨基酸)
					1216-1658	190-632	pNS3h(+Cbt)	NS3h (解螺旋酶) (+Cbt)	19,20

实施例5：发酵、蛋白表达和纯化.

在10L发酵罐内培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达NS3重组蛋白(例如9NB49H或NS3h或其变体)。将在含有Superbroth (SB) Media (富集培养基，用甘油作为碳源)的摇瓶中生长的120mL种子培养物用于接种含有SB培养基的10L发酵罐。在37℃培养细胞，直到达到8-12的在600nm的光密度。通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至1 mM的终浓度，诱导蛋白表达。然后将培养物在25-37℃培养另外4小时。然后将细胞从发酵罐收获，然后穿过中空纤维膜滤器以将收获物从10L的开始体积浓缩至1-2升。然后将浓缩的细胞通过离心进行沉淀，除去上清液，并将得到的沉淀物在-80℃保存直到用于蛋白纯化。

通过如上所述进行发酵，但是在诱导时加入生物素至0.05mM的终浓度，实现含有氨基端或羧基端生物素化标签序列的重组HCV NS3蛋白的体内生物素化(参见实施例2和3)。然后将培养物在25-37℃培养另外4小时，并如在以上段落中所述进行加工。

将含有表达的可溶性的HCV NS3重组抗原的冷冻大肠杆菌细胞沉淀物融化，然后再悬浮于冷的裂解缓冲液(40 mM NaPO₄, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 5%甘油, 5 mMβ-巯基乙醇, pH 7.2)中，随后通过在0℃的连续流超声处理裂解45分钟。离心以除去不溶物以后，将GE镍琼脂糖Fast Flow树脂加入上清液并在2-8℃温育过夜(在125 rpm摇动)。然后将含有结合的抗原的树脂在轻度真空下用洗涤缓冲液(40mM NaPO₄，pH 7.2, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM咪唑, 5 mMβ-巯基乙醇)洗涤，并使用含有40mM NaPO₄、150 mM NaCl、1 mM EDTA、500 mM咪唑、10 mM DTT的缓冲液（pH 7.2）洗脱结合的抗原。如下通过阴离子交换色谱法进一步纯化抗原：使抗原在20 mM Tris pH 8.4中结合至GE Q HP阴离子交换树脂，随后用20 mM Tris（pH 8.4）、1 M NaCl、5 mM EDTA进行梯度洗脱。然后使用GE Sephadex G25柱将洗脱的蛋白脱盐进含有10 mM磷酸盐、150 mM NaCl、5 mM EDTA的最终缓冲液（pH 7.2）中。将纯化的NS3蛋白在-70℃保存。

实施例6：吖啶鎓-牛血清白蛋白(Acr-BSA)的制备.

从商业来源(Proliant Biologicals, Ankeny, IA)购买30%(300 mg/mL)的牛血清白蛋白(BSA)溶液，其含有0.1%叠氮化钠作为防腐剂。将1毫升(300 mg)的30%BSA溶液用2.0 mL的0.1M PBS（pH 8.0）稀释，转移至0.5-3.0 mL Slide-A-Lyzer透析盒(ThermoFisher, Waltham, MA)，并在0.1M PBS（pH 8.0）(2次交换, 600 mL/交换)中在2-8℃透析过夜。基于在280 nm的紫外吸光度，透析的BSA溶液的浓度是97.1 mg/mL。将200毫克(2.060 mL, 3.0 umol, 1.0 mol当量)的97.1 mg/mL的BSA溶液加入含有10.181 mL的0.1M PBS（pH 8.0）的琥珀色玻璃瓶中。向该混合物中加入在DMF [N,N-二甲基甲酰胺]中的39 mg (1.092 mL, 45 umol, 15.0 mol当量)的SPSP-吖啶鎓活性酯。给反应瓶盖帽；通过在350 rpm搅拌30 min，将溶液混合，然后在室温放置过夜(20-26h)。温育以后，使用0.01M PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）运行缓冲液通过色谱法(Sephacryl HR S-200柱, GE Healthsciences, PA)除去游离的吖啶鎓和聚集体。将与单体Acr-BSA缀合物对应的级分合并，并通过紫外分光光度法(240-600 nm扫描)表征。使用在280 nm和370 nm的吸光度值确定蛋白浓度并计算每个BSA分子的吖啶鎓掺入。计算的蛋白浓度是6.779 mg/mL，具有每个BSA分子6.2个吖啶鎓的平均数目。

实施例7：马来酰亚胺活化的Acr-BSA的制备.

马来酰亚胺活化的Acr-BSA的制备. 将1.99 mL Acr-BSA (实施例8; 13.5毫克, 202 nmol, 1.0 mol当量)在PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）中的溶液加入琥珀色玻璃瓶中，并用0.254 mL 0.4M磷酸盐/8 mM EDTA/1.6%CHAPS（pH 7.4）处理以将反应物pH调至7.4。向均匀溶液中加入0.040 mL (0.35 mg, 4.0摩尔当量)的新鲜0.02M的4-(N马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill)的水溶液。给反应瓶盖帽；将溶液在不起泡的情况下搅拌20 min，然后在暗处在室温静止温育60-90分钟。通过应用至用0.1M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.7）预平衡的Zeba旋转柱(Pierce, Rockford, Ill)，将反应混合物脱盐以除去未掺入的磺基-SMCC。在280和370 nm测量洗脱的Acr-BSA-Mal试剂的吸光度以估计蛋白浓度。计算的蛋白浓度是6.28 mg/mL。立即将Acr-BSA-Mal用在HCV NS3抗原的缀合中。

重组9NB49H与Acr-BSA-Mal的缀合. 将在0.789 mL的0.1M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.7）中的Acr-BSA-Mal (5.6毫克, 84 nmol, 2.0摩尔当量)加入聚丙烯试管中。向其加入在0.01M PBS/5 mM EDTA（pH 7.2）中的1.2 mg (1.3 mL, 42 nmol, 1.0 mol当量)重组9NB49H抗原。将溶液在不起泡的情况下搅拌30 min，然后在暗处在室温静止温育过夜。在该阶段或在9NB49H游离半胱氨酸的羧甲基化以后，纯化缀合物。在羧甲基化的情况下，用0.270 mL 0.5M磷酸盐缓冲液（pH 11.0）处理粗制的缀合物溶液以将pH调至8.0。将混合物搅拌5 min，然后在混合下加入0.94 mg (0.020 mL, 120摩尔当量)的新鲜0.25M碘乙酸(IAA)在1N NaOH或0.25M碘乙酰胺水溶液(IAM)中的溶液以实现9NB49H游离Cys-羧甲基化。将混合物在室温和暗处静止反应60 min，然后穿过在0.01M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.3）中平衡的PD10柱(3.0 mL洗脱体积)。

在减去Acr-BSA贡献的280nm吸光度以后，从缀合物的280nm吸光度确定Acr-BSA-9NB49H缀合物蛋白浓度。使用1%(w/v) 9NB49H溶液的0.52的吸光度计算蛋白浓度。如所述计算的9NB49H浓度为0.406 mg/mL。

实施例8：吖啶鎓-BSA-NS3h缀合物的制备.

(LC)马来酰亚胺活化的Acr-BSA的制备. 将在PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）中的Acr-BSA (实施例8; 3.0 mg, 0.443 mL, 45 nmol,或1.0 mol当量)加入琥珀色玻璃瓶中并用0.058 ml 0.4M磷酸盐/8 mM EDTA/1.6%CHAPS（pH 7.4）缓冲液处理以将反应物pH调至7.4。向均匀溶液中加入0.018 mL (0.080 mg, 180 nmol, 4.0 mol当量)新鲜的0.01M 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基己酸琥珀酰亚胺酯(Lon Chain或LC-SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill)在二甲基亚砜(DMSO, Sigma Aldrich, St Louis, MO)中的溶液。给反应瓶盖帽；将溶液在不起泡的情况下搅拌20 min，然后在暗处在室温静止温育60分钟。通过应用至用0.1M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.7）预平衡的Zeba旋转柱(Pierce, Rockford, Ill)，将反应混合物脱盐以除去未掺入的LC-SMCC。在280和370 nm测量洗脱的Acr-BSA-Mal试剂的吸光度以估计蛋白浓度。计算的蛋白浓度是5.25 mg/mL。将Acr-BSA-(LC)Mal立即用在下一个缀合步骤中。

重组NS3h与Acr-BSA-(LC)Mal的缀合. 将1.20 mL (3.12 mg)的2.6 mg/mL的NS3h在0.025M磷酸盐/0.25M NaCl/5 mMβ-巯基乙醇/5 mM EDTA（pH 8.0）中的溶液穿过PD10脱盐柱以除去β-巯基乙醇。用2.5 mL 0.01M PBS/5 mM EDTA（pH 7.2）洗脱NS3h蛋白，并通过在280 nm的吸光度计算洗脱液的浓度为2.9 mg/mL。向聚丙烯试管中加入在0.1M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.7）中的1.56 mg (0.297 mL, 23.4 nmol, 2.0 mol当量)的Acr-BSA-(LC)Mal，随后加入在0.01M PBS/5 mM EDTA（pH 7.2）中的0.60 mg (0.518 mL, 11.7 nmol, 1.0 mol当量)的重组NS3h抗原。将溶液在不起泡的情况下搅拌30 min，然后在暗处在室温静止温育过夜。向缀合物溶液中加入0.093 mL 0.5M磷酸盐缓冲液（pH 11.0）以将混合物pH调至8.0。将混合物搅拌5 min，然后在混合下加入0.56 mg (0.012 mL, 120摩尔当量)的新鲜0.25M碘乙酸(IAA, Thermofisher Scientific, Waltham, MA)在1N NaOH中的溶液，以实现NS3游离Cys-羧甲基化。将混合物在室温和暗处静止反应60 min，用0.080 mL 0.01M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.3）将终体积调至1.0 ml，并穿过在0.01M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.3）(2.5 mL洗脱体积)中平衡的PD10柱。接着通过SEC色谱法(TosoHaas G3000SWxl柱, Toso Bioscience LLC, King of Prussia, PA)纯化脱盐的缀合物以除去不希望的聚集体。减去Acr-BSA贡献的280nm吸光度以后，从缀合物的280nm吸光度确定Acr-BSA-NS3h缀合物蛋白浓度。使用1%(w/v) NS3h溶液的0.95的吸光度计算蛋白浓度。

实施例9：自动化的基于磁性微粒的免疫测定法.

使用利用顺磁微粒和化学发光缀合物的自动化免疫分析仪(ARCHITECT®系统; Abbott Laboratories；参见“Bulk Reagent Random-Access Analyzer: ARCHITECT i2000”Frank A. Quinn, 第363-367页. 见The Immunoassay Handbook, 第三版, David Ward编, Nature Publishing Group, London, UK；美国专利号5,795,784和美国专利号5,856,194)，针对它们的检测抗-HCV NS3抗体的能力试验了HCV NS3-衍生的蛋白。检测的测定形式包括2-步形式或1-步形式。测定通常可以描述为包括两种形式：2-步和1-步(也描述为‘假’1-步)。在2-步形式中，将人样品、测定特异性的稀释剂缓冲液和重组抗原包被的顺磁微粒混合进反应容器中，涡旋，并温育18 min，其中针对重组抗原的抗体被微粒捕获。该温育以后，使用磁体将微粒/免疫复合物分离在反应容器的侧壁处，并除去反应上清液。然后用水/去污剂溶液洗涤微粒。在第二步中，通过在含有吖啶鎓-标记的缀合物的缓冲液中悬浮和温育(4 min)颗粒，检测与微粒结合的来自样品的抗体。所述缀合物可以是针对人免疫球蛋白的吖啶鎓-标记的抗体或吖啶鎓-标记的重组抗原。缀合物温育之后进行第二个洗涤步骤，最后活化吖啶鎓并同时测量光输出，所述光输出与结合在微粒上的缀合物的量成比例。

在1-步形式中，加工人样品、重组抗原包被的顺磁微粒和测定特异性的稀释剂缓冲液（其含有包含吖啶鎓-标记的重组抗原的缀合物）混合进反应容器中。18-分钟温育以后，其中针对重组抗原的抗体同时被磁性微粒捕获并结合至吖啶鎓-标记的重组抗原。随后，使用磁体将微粒/免疫复合物分离在反应容器的侧壁处，并用水/去污剂混合物洗涤。然后将颗粒从容器壁释放，并悬浮于稀释剂中和温育4分钟。温育之后进行第二个洗涤步骤，最后活化吖啶鎓并同时测量光输出，所述光输出与结合在微粒上的缀合物的量成比例。

生物素-捕获免疫测定法. 在Architect分析仪上的生物素捕获介导的免疫测定法使用生物素化的NS3蛋白(例如，如在实施例2-6中描述的Nbt或Cbt，或已经通过化学方式以非位点特异性的方式向其偶联生物素的NS3蛋白)和生物素捕获蛋白(例如亲和素、链霉亲和素、中和亲和素或抗-生物素抗体)包被的顺磁颗粒。在该形式中，在存在于样品中的NS3抗体和生物素基-NS3之间形成的免疫复合物经由固定化在微粒表面上的生物素捕获蛋白而捕获至微粒表面上。由吖啶基化的NS3重组抗原组成的缀合物可以加入第一步或第二步(即在捕获步骤之后)中以检测捕获的抗-NS3。可替换地，抗-人抗体吖啶鎓缀合物可以加入第二步中以检测捕获的抗-NS3。

实施例10：免疫测定形式.

使用下述人样本：

阴性对照样品是重新钙化的不反应的人血浆(对于HBsAg而言不反应的，且对于抗-HCV、HIV-1 RNA或HIV-1 Ag、抗-HIV-1/HIV-2和抗-HTLV-I/HTLV-II而言阴性的)。

被称作‘组B’的阳性对照样品是人重新钙化的人血浆样品，其对于单个抗-HCV标志物而言是反应性的，如通过Chiron RIBA HCV 3.0 SIA (2+或更大c33带强度，且对于其它带而言是不反应的)确定的。将该组在含有EDTA二钠和叠氮化钠的重新钙化的不反应的人血浆(对于HBsAg而言不反应的，且对于抗-HCV、HIV-1 RNA或HIV-1 Ag、抗-HIV-1/HIV-2和抗-HTLV-I/HTLV-II而言阴性的)中稀释。

血液样品：从SeraCare (Gaithersburg, MD)和Zeptometrix (Franklin, MA)得到商购可得的人血液样品组（被称作血清转化组）。所述血清转化组由得自个体的系列血液样品组成，所述个体在早抽血日期就HCV抗体而言是阴性的，但是在晚抽血日期就抗体而言是反应性的。利用血清转化组来确定不同抗体试验和抗原/抗体试验的灵敏度。更灵敏的试验在比不太灵敏的试验更早的时间检测HCV暴露。

核心抗原样本ST5 1:10是HCV RNA阳性的且HCV抗体阴性的且已经在含有EDTA二钠和叠氮化钠的重新钙化的不反应的人血浆(对于HBsAg而言不反应的，且对于抗HCV、HIV-1 RNA或HIV-1 Ag、抗HIV 1/HIV-2和抗-HTLV-I/HTLV-II而言是阴性的)中1:10稀释的人血浆。

CAL是对HCV核心、NS3和NS4的抗体而言反应性的且在含有EDTA二钠和叠氮化钠的重新钙化的不反应的人血浆(对于HBsAg而言不反应的，且对于抗HCV、HIV-1 RNA或HIV-1 Ag、抗HIV 1/HIV-2和抗-HTLV-I/HTLV-II而言阴性的)中稀释的重新钙化的人血浆。

实施例11: HCV抗原/抗体(Combo)测定形式

本文描述了在Abbott Laboratories开发的ARCHITECT免疫测定平台上在单个反应中检测丙型肝炎(HCV)核心抗原和抗体的方法。开发了原型化学发光免疫测定法，用于同时检测血清和血浆中的HCV核心抗原和针对HCV (抗-HCV)的抗体。原型组合测定是在ARCHITECT仪器平台上的2-步(18’/4’)、3瓶子测定。HCV combo试验除了提供可能存在于HCV感染的个体的血液中的HCV核心抗原的检测以外，还提供针对HCV的核心、NS3和NS4蛋白的人抗体的检测。

在第一步中，仪器分配110 ul样本+ 50 ul来自瓶子1的反应混合物+ 50 ul来自瓶子2的链霉亲和素/中和亲和素或抗-生物素顺磁微粒，所述顺磁微粒在含有去污剂的微粒稀释剂(20 mM MES, pH 6.6, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 13.6%蔗糖, 0.1%Nipasept, 0.0005%喹诺酮,和5 mM DTT & 5 mM谷胱甘肽，且含有24.3 mM SB3-14 (N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐))中稀释。瓶子1含有生物素和吖啶鎓标记的HCV特异性的试剂(肽、蛋白和抗体以及各种去污剂和缓冲剂)的混合物，所述试剂能够与存在于血清或血浆中的HCV抗体或抗原形成免疫复合物。具体地，瓶子1含有：在80 mM Bis-Tris（pH 6.3）、0.92 M NaCl、8%蔗糖、1.7%葡聚糖2000、3%BSA、0.3%Triton X100、0.04%甲基纤维素、7 mM EDTA、0.04%叠氮化钠)中的吖啶基化的-核心肽5 (氨基酸15-68^34^48)、生物素化的- 核心肽5 (氨基酸15-68^34^48)、吖啶基化的- NS3重组抗原(9NB49H或NS3h)、生物素化的- NS3重组抗原(9NB49H-Cbt或NS3h-Cbt)、吖啶基化的- NS4肽氨基酸1694-1735、生物素化的- NS4肽氨基酸1694-1735和生物素化的- c11-7单克隆抗体。因此，反应的第一步包括110 ul样本+ 50 ul来自瓶子1的反应混合物+ 50 ul来自瓶子2的链霉亲和素/中和亲和素/抗-生物素微粒，并延长18分钟–从而允许形成各种免疫复合物。

抗体检测测定的第一步如下所述。具体地，对于抗-核心检测，需要一种生物素标记的核心肽和一种吖啶鎓标记的核心肽存在于反应混合物中，其可以被存在于样本中的抗-核心抗体结合。该免疫复合物然后结合至被生物素结合蛋白（在该情况下，是中和亲和素，但是可以可替换地是链霉亲和素或抗-生物素）包被的固相。抗-NS3反应的过程要求，一种生物素标记的NS3蛋白+ 一种吖啶鎓标记的NS3蛋白需要存在于反应混合物中，其可以被存在于样本中的抗-NS3抗体结合。同样，对于抗-NS4，一种生物素标记的NS4肽和一种吖啶鎓NS4标记的肽需要存在于反应混合物中，其可以被存在于样本中的抗-NS4抗体结合。

抗原检测测定的第一步如下所述。对于核心抗原检测反应，能够结合血清或血浆中的HCV核心抗原的生物素标记的单克隆抗体(Mab c11-7)存在于第一反应(瓶子1)中。该免疫复合物然后也经由生物素部分结合至固相。

抗体和抗原反应的第二步如下. 18分钟温育步骤以后，洗涤微粒以从混合物除去未结合的反应物。然后将微粒与来自瓶子3的缀合物*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物一起温育，所述缀合物在含有不同去污剂和蛋白的缓冲溶液(80 mM Bis Tris, pH 6.3, 0.924 M NaCl, 3.0%蔗糖, 5.0%山梨醇, 7mM EDTA, 1.7%葡聚糖2000, 0.8%PVSA (25%溶液), 3.0%BSA, 0.02%苄索氯铵, 55,000单位/L肝素钠, 0.2%氟化钠, 0.3%Triton X-100, 0.3%甘氨酸, 0.2%SB3-12, 0.4%SB3-16, 0.2%SB3-18, 0.15%CHAPS, 0.2%皂苷, 0.35%CTAB, 0.02%TTAB, 0.1%叠氮化钠, 0.1%Nipasept, 1%A56620, 0.04%甲基纤维素（Methylcellulos）)中稀释。在该步中，将缀合在固相上的任何免疫-复合的核心抗原。在第2步的4分钟温育以后，将含有完整的标记的免疫复合物的完整微粒再次洗涤，并用磁体与未反应的组分分离。然后触发反应，并读出经由免疫复合物结合至固相的吖啶鎓-标记的缀合物所产生的化学发光信号，其与存在于正在试验的样品中的分析物的量成比例。

实施例12：核心肽设计

HCV感染的检测要求使用多种HCV蛋白进行抗体检测(包括HCV核心、NS3和在某些情况下的NS4和NS5肽或蛋白)。HCV核心抗原的检测要求使用与HCV核心抗原结合的抗体，且这样的抗体可能结合至在HCV combo试验的抗体侧中使用的HCV核心蛋白。研究科学家已经鉴别出由在核心抗原试验中使用的抗体靶向的HCV核心抗原上的氨基酸序列——对于用于捕获HCV核心抗原的那些(在该测定中，C-11-7)，和用于产生信号的那些(C11-9/C11-14)。对于抗体识别的每个位点，必须通过氨基酸置换或氨基酸缺失来修饰构成该识别位点的氨基酸。

通过从核心蛋白除去5个氨基酸(氨基酸残基32-34和47-48)而产生修饰的核心肽，从而避免被在ARCHITECT HCV核心抗原试验中使用的2个单克隆(C11-14和C11-9)识别。除去这5个氨基酸的一种不希望的结果是，这些氨基酸的丢失会损害人抗体对核心蛋白的应答。

因而，制备了一系列核心肽以确定是否可以对核心蛋白做出最小修饰使得最小修饰的肽不会被在核心抗原试验中利用的抗体识别，但是允许充分检测针对核心蛋白的抗体。这些修饰的肽被设计成恢复用已经删除了5个氨基酸的核心肽观察到的一些丢失的反应性。假定可以设计会逃避该缀合物的检测的单克隆抗体c11-9 (氨基酸29-37)和c11-14 (氨基酸45-49)的已知表位结合区中的某些缺失/置换。

核心肽的设计包括HCV的核心序列的不同区域中的靶向氨基酸缺失和/或置换，由此这些缺失/置换成功地避免在HCV Combo测定中用于检测核心Ag的*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物的检测。

将每种新合成的核心肽包被在中和亲和素顺磁微粒上，并用*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物探测。如下面(表4)所示，当与*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物反应时，肽1 (氨基酸15–68之间的完整序列)提供高信号/噪音(S/N)值。注：阴性对照包括在固相上或在液相中不含有任何HCV核心表位识别分子的微粒。这些阴性对照产生低S/N (信号/噪音)值。阳性对照(6C37包被的微粒)含有HCV重组蛋白(包含HCV核心蛋白的氨基酸1-150)，其由于被*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物识别而产生高S/N值。

上面的肽1代表氨基酸15–68之间的完整氨基酸序列，其以前已经用于检测针对HCV核心蛋白的抗体。上面的肽2具有共计5个氨基酸缺失，这些氨基酸中的3个(32、33和34)代表C11-9单克隆抗体的表位识别位点的组成部分，且这些氨基酸中的2个(47和48)代表C11-14单克隆抗体的表位识别位点。肽1的信号较高，因为它被HCV核心缀合物*Ac-DBA c11-9/c11-14识别。肽4和6-10的S/N值具有>3.0的S/N值，且不是用在HCV组合测定中的候选物，因为它们也被核心缀合物识别。肽2、3和5的S/N值是非常低的，类似于关于阴性对照所观察到的S/N值，且因而不被HCV核心抗原缀合物识别，由此使它们的设计可用于HCV combo试验。

表5.核心肽 2 、 3 和 5 与人样本的免疫反应性

如上面表5中所示，在间接测定形式中肽2、3和5都表现出与人样本的免疫反应性，可与抗-HCV反应。用肽3和5观察到的含有针对HCV的抗体的人样品的S/N值稍微高于用肽2观察到的值，但是因为肽5含有这2种肽的最小缺失(仅缺失氨基酸34和48)，所以选择肽5作为HCV Combo开发的候选肽。因而，将肽5（其成功地避免被*Ac-DBA c11-9/c11-14缀合物检测且对于被HCV感染的人样本而言是免疫反应性的）视作HCV Combo的候选肽。

实施例13：单克隆抗体

HCV combo试验利用3种单克隆抗体(C11-7、C11-14和C11-9)。两种单克隆抗体(C11-7、C11-14)以前已经描述在Abbott美国专利“Methods for the simultaneous detection of HCV Antigens and HCV antibodies”，Shah等人的美国专利6,727,092，2004年4月27日授权。但是，这两种单克隆抗体的原始公开内容引入在Aoyagi等人的美国专利6,623,921（2003年9月23日授权）中。第三种单克隆抗体公开在出版物(Morota等人, J. Virol. Meth 157:8 (2009))中，并且在Muerhoff, 等人的专利申请号20120009196(公开日期2012-01-12)中进行了讨论。

实施例14：微粒的制备.

HCV Combo测定使用一类能够捕获生物素-标记的蛋白(链霉亲和素、中和亲和素和抗-生物素)的顺磁微粒。简而言之，将Dynal M270羧酸粗颗粒用2次交换洗涤进MES-Chaps缓冲液pH 5.5 (25 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES), 0.1%3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐(Chaps))中。将颗粒以1%固体用0.25 mg/mL的EDAC (N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)预活化30分钟。将颗粒用1次交换洗涤进MES-Chaps缓冲液pH 5.5中。将中和亲和素/链霉亲和素/抗-生物素Ab储备溶液以0.40 mg/mL加入颗粒（以1%固体）保持60分钟。将颗粒用3次交换洗涤进PBS-Chaps缓冲液pH 7.2 (磷酸盐缓冲盐水(PBS), 0.1%Chaps)。最终的颗粒浓度是在PBS-Chaps缓冲液pH 7.2中的1%固体。随后将这些微粒在微粒稀释剂(20 mM MES, pH 6.6, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 13.6%蔗糖, 0.1%Nipasept, 0.0005%喹诺酮,和5 mM DTT & 1.54 g/L谷胱甘肽，且含有24 mM SB3-14 (N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐)中稀释至0.075%固体。

实施例15：HCV核心肽.

由AnaSpec (Fremont, CA)制备合成肽。纯度水平>95%。

生物素-TNRRPQDVKFPGGGQIVGGYLLPRRGPRLGVRTRKTSERSQPRGRRQPIPKA。

2. 使用吖啶基化的标记的HCV核心肽5作为用于测定的缀合物，且如下表示：

TNRRPQDVKFPGGGQIVGGYLLPRRGPRLGVRTRKTSERSQPRGRRQPIPKA。

核心肽5的吖啶基化方法描述在实施例18中。

实施例16：NS4肽(氨基酸1694-1735)

由Ana Spec (Fremont CA)制备这些合成肽。纯度水平>95%。

HCV combo试验利用两种形式的HCV NS4肽：

1. 如下将生物素化的NS4肽捕获在链霉亲和素包被的微粒上：

生物素- IIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGL。

2. 将吖啶基化的标记的NS4肽用作用于测定的缀合物，且如下表示：

吖啶鎓- IIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLC。

NS4的吖啶基化方法描述在实施例17中。

实施例17：Acr-BSA-NS4肽缀合物的制备

将在0.1M PBS/0.1%CHAPS/5 mM EDTA（pH 6.7）中的13毫克(2.0 mL, 0.196 umol, 1.0 mol当量) Acr-BSA-Mal (得自实施例2)加入聚丙烯试管中。向该溶液中加入0.100 mL (4.02 mg, 0.784 umol, 4.0 mol当量)新鲜的41 mg/mL的C-端半胱氨酸NS4肽(AnaSpec, Fremont, CA)在二甲基亚砜(DMSO, Sigma Aldrich, St Louis, MO)中的溶液。给反应瓶盖帽，将溶液在不起泡的情况下简短涡旋，并在黑暗中在室温温育过夜。接着将粗制的缀合物用0.25M巯基乙胺HCl (MEA)水溶液处理约30 min至最终的1.14 mM MEA反应浓度，以淬灭未反应的马来酰亚胺基团。立即使用0.01M PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）通过SEC色谱法在TosoHaas G3000SW柱(Tosoh Bioscience LLC., King of Prussia, PA)上纯化缀合物。合并与主要缀合物峰对应的级分。在280和370 nm测量缀合物合并物的吸光度，并用于确定经校正的280 nm吸光度值。在使用之间在-20℃保存缀合物。

实施例18：Acr-BSA-核心肽缀合物的制备.

将在0.1M PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）中的6毫克(1.01 mL, 90 nmol, 1.0 mol当量) Acr-BSA (得自实施例1)加入聚丙烯试管。向该溶液中加入0.431 mL (4.31 mg, 22.5 umol, 250 mol当量)新鲜的10 mg/mL 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)水溶液和0.259 mL (2.58 mg, 22.5 umol, 250 mol当量)新鲜的10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液。将混合物轻轻涡旋，然后在室温和暗处静止反应10 min。向活化的Acr-BSA缀合物溶液中加入4.4 mg (0.881 mL, 0.72 umol, 8 mol当量)新鲜的5.0 mg/mL的核心肽(AnaSpec, Fremont, CA)在0.01M PBS（pH 7.2）中的溶液。将溶液轻轻涡旋，并在室温在暗处反应过夜。使用0.01M PBS/0.1%CHAPS（pH 6.3）通过SEC色谱法在TosoHaas G3000SWxl柱(Tosoh Bioscience LLC., King of Prussia, PA)上纯化缀合物以除去聚集体。合并与主要缀合物峰对应的级分。在280和370 nm测量Acr-BSa-NS4肽缀合物合并物的吸光度，并用于确定经校正的280 nm吸光度值。在使用之间在-20℃保存缀合物。

实施例19：生物素化的C11-7单克隆抗体的制备.

将13毫克(1.0 mL, 86.6 nmol, 1.0 mol当量)的13.1 mg/mL的C11-7单克隆抗体(mAb)在0.01M PBS（pH 7.2）中的溶液加入含有0.916 mL 0.01M PBS（pH 7.2）缓冲液的琥珀色玻璃瓶中。向该溶液中加入0.144 mL 0.133M磷酸盐/0.376M NaCl/7.5%CHAPS（pH 8.0）以将反应物pH调至7.4-7.5，并将混合物在不起泡的情况下搅拌5 min。向搅拌的C11-7 mAb溶液中加入0.350 mg (0.100 mL, 433 nmol, 5.0 mol当量)的5.71 mg/mL的Chromalink Biotin (CLB, SoluLink, San Diego, CA)在无水二甲基甲酰胺(DMF, Sigma Aldrich, St Louis, MO)中的溶液。将混合物搅拌30 min，然后在室温在暗处静止反应过夜。将粗制的缀合物混合物穿过。通过穿过用0.01M PBS/0.1%CHAPS（pH 7.2）平衡的Zeba旋转柱(Pierce, Rockford, Ill)，将反应混合物脱盐以除去未掺入的CLB生物素。在280和354 nm测量洗脱的C11-7 mAb-CLB缀合物的吸光度以估计蛋白浓度，并计算每个抗体分子的生物素掺入。计算的蛋白浓度是4.03 mg/mL，具有每个C11-7 mAb分子4.12个生物素的平均数目。

实施例20：葡聚糖-BSA的制备.

将1.068 mL在蒸馏水中制备的100 mg/mL的高碘酸钠(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)溶液加入如下制备的葡聚糖溶液中：将117.48 mg葡聚糖(150,000 MW GPC Grade, Pharmacosmos, Holbaek, 丹麦)溶解在2.1 mL蒸馏水中，并在23℃水浴中在暗处在搅拌下温育120分钟。在120分钟结束时，将6.408 mL在150mM HEPBS (Sigma Chemical, St. Louis, MO)缓冲液（pH 8.9）中平衡的55mg/mL的BSA溶液(Proliant Biologicals, Boone, IA)加入氧化的葡聚糖溶液中，并在23℃在暗处继续反应另外120分钟。在温育结束时，将1.06 g硼烷-二甲基胺复合物(97%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)加入葡聚糖-BSA溶液中在23℃在暗处保持60分钟，随后加入1.34 mL的0.65 M Tris-HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))（pH 7.5）缓冲液在23℃保持16-20小时。使用以2.6 mL/min在PBS中平衡的HiPrep Sephacryl S300 26/60柱(GE Healthcare, Uppsala, 瑞典)，纯化得到的溶液。将粗制的葡聚糖-BSA加载到柱上，并在2.6 mL/min运行，同时监测在280nm的吸光度。收集2.6 mL级分，并合并空隙（voided）级分。然后使用Amicon Ultra-15离心浓缩器(50,000 MWCO, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)将合并的级分浓缩至小于10 mL。给浓缩的葡聚糖-BSA掺入叠氮化钠和CHAPS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)的溶液至0.1%叠氮化钠和0.5%CHAPS的终浓度。将该溶液在45℃烘箱中热应激7天，并在另外的HiPrep Sephacryl S400柱纯化之前在2-8℃保存。以2.6 mL/min的流速用PBS平衡HiPrep Sephacryl S400 26/60柱(GE Healthcare, Uppsala, 瑞典)，并将热应激的葡聚糖-BSA加载到柱上。将级分合并，以便消除高分子量聚集体和低分子量降解产物。

使用Amicon Ultra-15离心浓缩器(如上)将合并的级分浓缩至大于5 mg/mL，并在用于制备缀合物之前在2-8℃保存溶液。

实施例21：C11-9/C11-14葡聚糖-BSA缀合物的制备

在含有磷酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、0.2%CHAPS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)的缀合缓冲液（pH 7.4）中使6 mg纯化的、热应激的葡聚糖-BSA溶液(得自上面)与1.62 mg吖啶鎓SPSP (9-[[[[4-[4-氧代-4-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)丁基]苯基]磺酰基](3-磺丙基)氨基]羰基]-10-(3-磺丙基)反应。使反应在室温在暗处进行过夜。在过夜反应结束时，将2.7 mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC, Thermo-Fisher Scientific, Rockford, IL)加入SPSP-葡聚糖-BSA溶液中，并继续在室温在暗处温育60分钟。使用用含有磷酸钠、NaCl、1mM EDTA、0.5%CHAPS的缓冲液（pH 6.0）平衡过的柱，通过凝胶过滤除去未反应的SPSP和sSMCC。使用Amicon Ultra-4离心浓缩器(30,000 MWCO)将最终的溶液浓缩至大于10 mg/mL，并确定在280nm和370nm的吸光度。

在水浴中在37℃平衡在含有磷酸钠、NaCl、1mM EDTA的缀合缓冲液（pH 6.0）中的8.76 mg C11-9:C11-14 F(ab’)2片段的2.5:1 (mg:mg)混合物。将0.39 mL的在含有EDTA的磷酸钠缓冲液（pH 6.0）中制备的120mM的盐酸半胱胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)溶液加入温度平衡的抗体片段中，并在37℃温育90分钟。还原片段以后，使用用含有磷酸钠、NaCl、1mM EDTA、0.5%CHAPS的缓冲液（pH 6.0）平衡的柱通过凝胶过滤除去多余的盐酸半胱胺，并使用Amicon Ultra-4离心浓缩器(10,000 MWCO)将溶液浓缩至大于8 mg/mL。将含有5 mg/mL的SPSP和sSMCC标记的葡聚糖-BSA和4 mg/mL的还原片段的最终缀合反应物在磷酸钠、NaCl、1mM EDTA、0.5%CHAPS缓冲液（pH 6.0）中在2-8℃在暗处温育16-24小时。

用过量的盐酸半胱胺封闭任何未反应的马来酰亚胺基团以后，使用在含有0.1%CHAPS的PBS（pH 6.3）中平衡过的HiPrep Sephacryl S400柱(GE Healthcare, Uppsala, 瑞典)纯化粗制的缀合反应物。合并主要缀合物峰的级分，以便消除高分子量材料和任何未结合的抗体片段。将缀合物的浓度表达为抗体片段的量，并使用缀合物在280nm和370nm的吸光度与SPSP和sSMCC标记的葡聚糖-BSA的吸光度的对比来确定。

实施例22：测定稀释剂制剂.

为了能够以HCV Combo形式检测核心抗原，需要暴露核心衣壳蛋白。该暴露需要使用存在于外环瓶子(瓶子1)或中环瓶子(瓶子2)中的去污剂，且该去污剂可以属于非离子类别和/或含有具有胺的烷基链基团(Aoyagi等人: G01N 33/576, WO 00/07023, 2000年2月10日)。

检测HCV核心抗原所需的去污剂对抗体的结合在HCV combo测定中利用的NS3蛋白的能力具有负面影响。抗-NS3信号的这种损失是可再现的，且已经在使用抗-NS3“唯一”样品的测定开发过程中监测到，所述样品含有针对NS3、但是不针对其它HCV蛋白的抗体。在我们的研究中利用的样品被称作组B，并通过将高反应性的样品在NS3抗体阴性的正常人血浆中稀释来制备。将组B稀释至含有中等反应性，并用作免疫测定法的检测患者样品中的NS3抗体的能力的替代标志物。在监测抗-NS3反应性时，利用信号/噪音(S/N)比来表示相对反应性，其中高S/N比是合乎需要的。以前的使用抗-HCV测定的经验已经证实，可行的抗体测定应当提供>20的S/N值。

实施例23：去污剂对HCV combo测定的影响

使用在实施例11中描述的Combo形式(和本文描述的combo测定的所有捕获试剂)，表6中的数据显示了两性离子去污剂磺基甜菜碱(SB3)的不同烃链长度在以HCV combo测定形式检测抗-NS3 (组B)和核心抗原中的作用。当在反应物中不存在去污剂时，组B检测是高的(S/N = 39.6)，但是核心抗原的检测是低的(S/N = 3.8)。当在反应物中使用8的烃链长度(SB3-8)时，组B和核心抗原检测二者都是低的。随着烃链长度增加，特别是增加至12或14，核心抗原反应性提高。但是，当链长度是16时，核心抗原检测和组B反应性二者都下降，从而提示达到组B检测和核心抗原检测之间的合适平衡的最佳烃链长度似乎是12-14。

表6：不同两性离子去污剂在以HCV combo测定形式检测抗-NS3和核心抗原中的作用(S/N：样品rlu/阴性血浆rlu的比率)。

表6:

	对照稀释剂- 无去污剂	对照稀释剂+ SB3-8	对照稀释剂+ SB3-10	对照稀释剂+ SB3-12	对照稀释剂+ SB3-14	对照稀释剂+ SB3-16
							样品	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N
组B	39.6	9.8	36.9	26.9	26.4	15.2
							核心抗原ST5 1:10	3.8	1.5	4.2	72.1	94.9	62.0

表7显示了不同去污剂的应用和它们对组B检测和核心抗原检测的影响。没有去污剂的对照稀释剂显示了组B的良好检测(S/N = 63.9)，但是核心抗原基本上没有检测(S/N = 2.2)。其它去污剂显示了组B和核心抗原(C7BzO)的中等检测。用去污剂SB3-14观察到最佳检测，其中组B和核心抗原二者的检测分别在71.7和81.9的S/N是最高的。

表7:

	对照稀释剂- 无去污剂	对照稀释剂+ SB3-14	对照稀释剂+ CHAPS	对照稀释剂+ C7BzO	对照稀释剂+ Empigen BB	对照稀释剂+ TSP16	对照稀释剂+ASB-16	对照稀释剂+ NDSB256磺基甜菜碱	对照稀释剂+NDSB201磺基甜菜碱
										样品	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N
组B: 抗-NS3	63.9	71.7	46.8	56.4	32.5	58.3	35.2	46.2	26.8
										核心抗原ST5 1:10	2.2	81.9	5.1	56.2	40.4	10.3	43.6	1.9	1.8

在研究中使用的去污剂的总结：将去污剂SB3-14、CHAPS、C7BzO (3-(4-庚基)苯基-3-羟丙基)二甲基铵基丙烷磺酸盐)、Empigen BB (EMPIGEN®BB, Sigma-Aldrich)和ASB-16 (酰氨基磺基甜菜碱-16)归类为两性离子表面活性剂；由于相等数目的带正电荷的和带负电荷的化学基团在分子内的存在，它们具有中性电荷。该组去污剂具有溶解膜蛋白的能力(Sigmaalrich.com)。将TSP-16归类为非离子型表面活性剂，其含有不带电荷的亲水首基。将磺基甜菜碱、NDSB256 (二甲基苄基铵丙烷磺酸盐; N-苯基-甲基-N,N-二甲基铵-丙烷磺酸盐)和NDSB201 (3-(1-吡啶并)-1-丙烷磺酸盐)归类为非去污剂磺基甜菜碱，其是可以减少聚集和辅助蛋白的重折叠的两性离子化合物。它们没有被视作去污剂，因为它们不可以聚集以形成胶束。

表8中显示了0-100 mM的去污剂SB3-14在微粒稀释剂中的滴定(瓶子2, 中环)。对于组B和核心抗原的最佳检测而言的SB3-14去污剂的浓度似乎是在25 - 75 mM之间，具有可接受的组B (S/N>20)和核心Ag (S/N>20)灵敏度。

表8:

	对照稀释剂- 无去污剂	对照稀释剂+ 0.1mM SB3-14	对照稀释剂+ 1mM SB3-14	对照稀释剂+ 10mM SB3-14	对照稀释剂+ 25mM SB3-14	对照稀释剂+ 50mM SB3-14	对照稀释剂+ 75mM SB3-14	对照稀释剂+ 100mM SB3-14
									样品	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N	S/N
组B: 抗-NS3	28.5	32.4	33.9	33.2	27.2	25.1	22.2	8.8
									核心抗原ST5 1:10	4.1	4.5	4.4	8.1	35.8	38.3	43.7	56.8

实施例24：测定性能——去污剂的布置

表9显示了在选择血清转化组上的HCV Combo测定性能，其中用于核心抗原检测的去污剂放置在外环(瓶子1)中，或者可替换地，放置在中环(瓶子2)中。性能保持大致相同，检测到的抽血的总数是19/23。

表9：当SB3-14放在外环瓶子(瓶子1)或中环瓶子(瓶子2)中时HCV Combo测定稳定性

S/CO: 10个NC用于截止值计算

S/CO >/= 1.0视作反应性的。

实施例25：SB3-14在不同试剂瓶子中的测定稳定性

如上所述，可以以等同性能将核心抗原检测必需的去污剂定位在外环瓶子(瓶子1)或中环瓶子(瓶子2)中。但是，与当将去污剂移入中环瓶子(表10)中时rlu保留没有明显损失相比，当将去污剂保持在外环瓶子中时在62天时段内的稳定性试验表明NS3样本(组B)的rlu的保留的约67%下降。

表10：SB3-14在不同试剂瓶子中的测定稳定性。当在2-8℃保存试剂时随时间变化的NS3组的RLU。

实施例26：在血清转化组上的HCV组合测定的性能.

通过抗-HCV唯一测定(Abbott ARCHITECT LN6C37)和HCV Combo测定(上述)，试验了共9个血清转化组PHV-907、PHV-909、PHV-912、PHV-913、PHV-914、PHV-919 (可商购得自SeraCare)和BCP 6214、BCP 6229和BCP 9044 (可商购得自ZeptoMetrix)。以S/CO (样品/截止值)的方式表达结果，其中1.0或更大的S/CO视作反应性的。如在表11中所示，与抗体唯一测定(6C37)检测到的感染证据相比，HCV Combo测定更早地检测这些组中的感染证据。下面(表12)显示了在该系列的第1次抽血时RNA阳性的血清转化组的平均窗口阶段减小（按天计）。HCV Combo测定显示的检测平均而言比抗体唯一测定早大约18.4天，且大致等同于通过RNA检测的结果。上面显示的在收集过程中变成RNA阳性的单一血清转化组(PHV-919)显示了与RNA同时和比抗体唯一测定的检测早3天通过HCV Combo测定实现的检测。

这些数据证实了比抗体唯一试验更早的、HCV抗原/抗体Combo试验在HCV暴露检测中的值。

表11:

BLD: 低于检测限度

S/CO: 10 NC用于截止值计算

S/CO >/= 1.0视作反应性的。

实施例27：

表12 通过HCV Combo测定实现的窗口阶段减小. 在HCV血清转化组中检测到HCV Ag或Ab的时间(天)，在第1次抽血中检测HCV RNA。

通过HCV Combo实现的平均窗口阶段减小：18.4天。

实施例28：

表13表明，通过任何形式检测到的血清转化抽血的最高数目是通过进行中捕获HCV Combo测定形式，检测到17次抽血的总数(在潜在的21次抽血中)。6C37抗体唯一测定检测到11次抽血，而Murex HCV Combo (MiDAS Report, Health Protection Agency-Centre for Infections, Report PER06007, 2007年2月)检测到9次抽血。表14显示了在表13中所示的两个血清转化组的S/CO信息。进一步，在表14中，显示了组B (抗-NS3唯一样品)的S/CO值。进行中捕获形式是更稳健的，具有6.19的S/CO，与此相比，6C37具有3-4的S/CO，从而指示HCV Combo的进行中捕获形式对于HCV血清转化组的检测而言是最合适的测定形式。

表13:2个关键血清转化组的不同测定形式的灵敏度对比

表13：

	6C37抗-HCV唯一测定	Murex HCV Combo测定	进行中捕获形式的HCV Combo
				BCP6212	8	2	9
BCP6213	3	7	8
				检测到的总抽血	11	9	17

来自每个血清转化组的反应性抽血的数目(10 NC用作截止值)。

表14: S/CO信息

S/CO*: 10 NC用于截止值计算。

实施例29: 9NB49H和NS3h的血清转化灵敏度.

针对它们的检测得自HCV感染的个体的血清转化组的各个血清样品中的抗体的能力，以HCV Ag/Ab Combo形式检查了NS3重组抗原9NB49H (Acr-BSA-9NB49H和9NB49H-Cbt)和NS3h (NS3h-Cbt和Acr-BSA-NS3h)。以S/CO (样品/截止值)的方式表达结果，其中具有≥1.0的S/CO的样品视作反应性的，且具有<1.0的S/CO的样品视作非反应性的。与使用9NB49H和Murex HCV Ag/Ab Combo的测定相比，使用NS3h的测定产生了更大的血清转化灵敏度，即以最高的S/CO值检测到最高反应性的抽血。

表15:

nd: 未测定。

Claims

1.一种用于组合检测试验样品中的HCV抗原和HCV抗体的免疫测定法，其包括：

a)同时提供下述试剂：

i. 能够结合生物素的固相

iii. 生物素化的HCV抗原，其用于捕获所述试验样品中的抗-HCV抗体；和

b)在产生反应混合物的条件下温育步骤(a)的试剂，其中

(i) (a)(ii)的生物素化的抗-HCV抗体通过所述生物素结合至所述固相并特异性地结合存在于所述试验样品中的HCV抗原以产生捕获在所述固相上的抗-HCV抗体-HCV抗原复合物；

(ii) (a)(iii)的生物素化的抗原通过所述生物素结合至所述固相并特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在所述固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(iv)的所述可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在所述固相上的所述HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体；

d. 使分离的固相与可检测地标记的缀合物抗体接触，所述缀合物抗体结合在(b)(ii)的抗-HCV抗体-HCV抗原复合物中捕获的所述HCV抗原；和

e. 在触发所述信号后，检测从可检测标记物部分产生的信号，其中所述信号的存在指示HCV在所述试验样品中的存在。

2.根据权利要求1所述的免疫测定法，其进一步包括：

(a)提供

(v) 第二种生物素化的HCV抗原，其用于捕获所述试验样品中的抗-HCV抗体，其中所述第二种HCV抗原不同于步骤(aiii)中的HCV抗原；和

(b) (iii) (a)(v)的生物素化的抗原通过所述生物素结合至所述固相且特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在所述固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(vi)的所述可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在所述固相上的所述HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体。

3.根据权利要求2所述的免疫测定法，其进一步包括：

(a) 提供

(vii) 第三种生物素化的HCV抗原，其用于捕获所述试验样品中的抗-HCV抗体，其中所述第三种HCV抗原不同于步骤1(a)(iii)或步骤2(a)(v)中的HCV抗原；和

(b) (iv) (a)(vii)的生物素化的抗原通过所述生物素结合至所述固相且特异性地结合存在于所述试验样品中的抗-HCV抗体以产生捕获在所述固相上的HCV抗原-抗-HCV抗体复合物，且(a)(viii)的所述可检测地标记的HCV抗原特异性地结合捕获在所述固相上的所述HCV抗原-抗-HCV抗体复合物中的抗-HCV抗体。

4.一种用于同时检测试验样品中的HCV抗原和HCV抗体的免疫测定法，其中所述组合测定包含：

a. 第一捕获抗原，其包含第一HCV蛋白的肽序列；

c. 第二捕获抗原，其包含得自第二HCV蛋白的抗原序列

e. 第三捕获抗原，其包含得自第三HCV蛋白的抗原序列

g. 第一捕获抗体

h. 缀合物抗体，其包含可检测标记物

其中所述捕获抗体和所述缀合物抗体特异性地结合得自所述试验样品的第四HCV蛋白，且所述组合测定如下进行：

a)在所述第一捕获抗原和所述检测抗原与存在于所述试验样品中的第一抗-HCV抗体之间形成夹心复合物；

b)在所述第二捕获抗原和所述第二检测抗原与存在于所述试验样品中的针对第二HCV蛋白的抗-HCV抗体之间形成夹心复合物；

d)在所述捕获抗体、所述缀合物抗体和存在于所述样品中的HCV抗原之间形成复合物；和

(ii)测量作为所述复合物形成的结果而从所述可检测标记物产生的信号，由此同时检测存在于所述样品中的HCV抗原和HCV抗体。

5.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自：核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5或核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5中的任一种的独特且独立部分。

6.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白中的两种或更多种独立地选自相同蛋白的不同部分，所述蛋白选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。

7.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第一HCV蛋白是核心抗原。

8.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中所述捕获抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

9.根据权利要求8所述的免疫测定法，其中所述检测抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

10.根据权利要求7所述的免疫测定法，其中所述第四蛋白是核心抗原。

11.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第一对中的捕获抗体包括两种或更多种不同的抗体。

12.根据权利要求4所述的免疫测定法，其进一步包括提供第二对捕获抗体和缀合物抗体，其中所述第二捕获/缀合物抗体对特异性地结合与权利要求1的第一捕获/缀合物抗体对相同的HCV蛋白或特异性地结合不同的HCV蛋白。

13.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述捕获抗原和所述捕获抗体附着至固体支持物。

14.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第一捕获抗原是生物素化的核心肽，且所述第一检测抗原是吖啶基化的核心肽，其中每种所述生物素化的和检测抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

15.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第二捕获抗原是生物素化的NS3重组抗原，且所述第二检测抗原是吖啶基化的NS3重组抗原。

16.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述第三捕获抗原是生物素化的NS4肽，且所述第三检测抗原是吖啶基化的NS4肽。

17.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述捕获抗体是生物素化的C11-7单克隆抗体。

18.根据权利要求4所述的免疫测定法，其中所述缀合物包含选自C11-9和C11-14或它们的组合的抗体。

19.一种用于检测来自试验样品的多个HCV组分的免疫测定法，其包括：

a. 提供结合生物素的固相

ii. 可检测地标记的第一、第二和第三检测抗原，所述条件和时间足以

(1) 在所述试验样品中的抗体和所述样品中的HCV蛋白之间形成免疫复合物，所述抗体可独立地分别与所述第一、第二和第三生物素化的抗原免疫反应且被其捕获，所述HCV蛋白可与所述生物素化的抗体免疫反应，和

(2) 在所述捕获抗体和各种第一、第二和第三可检测地标记的抗原之间形成免疫复合物；

d. 使分离的固相与可检测地标记的缀合物抗体接触，所述缀合物抗体结合所述捕获的第四HCV抗原；和

e. 在触发所述信号后，检测从可检测地标记的部分产生的信号，其中所述信号的存在指示HCV在所述试验样品中的存在。

20.根据权利要求19所述的免疫测定法，其中所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。

21.根据权利要求19所述的免疫测定法，其中：

所述第一抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的HCV核心抗原；

所述第二抗原是NS3抗原；

所述第三抗原是NS4抗原；

所述生物素化的抗体针对HCV核心抗原。

22.根据权利要求19所述的免疫测定法，其中所述抗-核心单克隆抗体是对HCV核心的脂质结合结构域特异性的抗体。

23.根据权利要求19所述的免疫测定法，其中所述NS3抗原是包含NS3解螺旋酶序列的重组HCV NS3抗原，所述NS3解螺旋酶序列包含所述解螺旋酶的结构域I、II和III中的每一个，其中所述抗原具有与C33抗原相比增加的对来自血清的HCV抗体的免疫反应性。

24.一种用于检测来自试验样品的多个HCV抗体的免疫测定法，其包括：

a. 提供结合生物素的固相

(1) 在所述试验样品中的抗体之间形成免疫复合物，所述抗体可独立地分别与所述第一、第二和第三生物素化的抗原免疫反应且被其捕获，和

d. 在触发所述信号后，检测从可检测地标记的部分产生的信号，其中所述信号的存在指示HCV在所述试验样品中的存在。

25.根据权利要求24所述的免疫测定法，其中所述第一、第二和第三HCV蛋白独立地选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。

26.根据权利要求24所述的免疫测定法，其中：

所述第一抗原是HCV核心抗原；

所述第二抗原是NS3抗原；且

所述第三抗原是NS4抗原。

27.根据权利要求24所述的免疫测定法，其中所述捕获核心抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的抗原。

28.根据权利要求24所述的免疫测定法，其中所述NS3抗原是包含NS3解螺旋酶序列的重组HCV NS3抗原，所述NS3解螺旋酶序列包含所述解螺旋酶的结构域I、II和III中的每一个，其中所述抗原具有与C33抗原相比增加的对来自血清的HCV抗体的免疫反应性。

29.一种用于同时检测样品中的HCV抗原和抗体的试剂盒，其包含：

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白独立地选自：核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5或核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5中的任一种的独特且独立部分。

31.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述第一、第二、第三和第四HCV蛋白中的两种或更多种独立地选自相同蛋白的不同部分，所述蛋白选自核心抗原、E1、E2、NS2、NS3、NS4和NS5。

32.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述第一HCV蛋白是核心抗原。

33.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述捕获抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

34.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述检测抗原是包含氨基酸34和48和氨基酸115-121的缺失的核心肽。

35.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述第四蛋白是核心抗原。

36.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述第一对中的捕获抗体包含两种或更多种抗体。

37.根据权利要求29所述的试剂盒，其进一步包括提供第二对捕获抗体和缀合物抗体，其中所述第二捕获/缀合物抗体对特异性地结合与权利要求30的第一捕获/缀合物抗体对相同的HCV蛋白或特异性地结合不同的HCV蛋白。

38.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述捕获抗原和所述捕获抗体附着至固体支持物。