CN112964873A - 基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒 - Google Patents

基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种基于夹心法的SARS‑CoV‑2检测试剂盒。该试剂盒包括：a)固相偶联物；所述固相偶联物由固相载体及包被于所述固相载体上的抗原和抗体组成；所述抗体为抗新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体；所述抗原包括：SARS‑CoV‑2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、N蛋白及E蛋白；b)标记有化学发光标记物的抗原及抗体；所述抗体为与新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体，但与a)中的抗体结合的抗原表位不同；所述抗原包括：SARS‑CoV‑2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、N蛋白及E蛋白。

Description

基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属的冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60nm～140nm，且相比于SARS，具有更高的感染能力。新型冠状病毒具有很强的人际间传播能力，人群普遍易感，病人是最重要的传染源，因此做到无症状感染者、疑似和确诊病例早发现、早隔离、早治疗依旧是接下来疫情防控的主线。如何准确的检测病毒，快速识别出新冠感染患者，减少交叉感染；以及如何有效监控疾病进程和抗体产生情况，将是打好疫情攻坚战的重点。基于流行病学调查，新型冠状病毒所导致的疾病COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。
新型冠状病毒包含刺突蛋白(Spike protein)、包膜蛋白(Envelope protein)、膜蛋白(Membrane protein)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)等4种主要结构蛋白。其中刺突蛋白形成冠状病毒外层，通过形成三聚体在病毒表面上形成明显的刺突，在诱导中和抗体和T细胞反应保护性免疫中起关键作用，刺突蛋白包含两个亚基S1和S2的大型1型跨膜蛋白，S1主要包含一个受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)，负责识别细胞表面受体ACE2(血管紧张素转换酶2)的蛋白质上，介导病毒入侵细胞；S2包含膜融合所需的基本元素。包膜蛋白是一种结构蛋白。一旦病毒进入细胞内部，它可以锁定蛋白质，从而帮助打开和关闭被感染细胞的基因组；膜蛋白是形成病毒外壳的另一种结构蛋白。而位于病毒内部的N蛋白可以保护病毒RNA，使其在病毒内部保持稳定，许多N蛋白以长螺旋形连接在一起包裹RNA，在序列上比较保守。这几种结构蛋白在病毒的识别吸附、膜融合、复制组装、释放周期中发挥关键作用，能不同程度的诱导抗体和T细胞反应保护性免疫，也是血清抗原抗体检测的主要设计靶点。
据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中规定，目前确诊COVID-19的方法为使用实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性，或病毒基因测序，但疫情发展至今，核酸检测试剂的漏检问题一再暴露，阳性检出率只有30-50％，主要是由于采样方式局限性造成的。核酸检测，一般是通过收集疑似患者鼻咽拭子，提取其中的RNA片段进行荧光RT-PCR，采样过程中，会混入大量人体细胞、细菌，进而造成待测RNA丰度低，检测系统无法检测，最终导致假阴性的产生。同时，其采样方式会造成采样人员暴露于可能含有病原体的环境中，有潜在的感染风险。样品制备过程，需要步骤多、操作时间长，对检测人员的技术水平要求高。
化学发光技术主要依据检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下成定量线性关系的原理，利用配套的仪器对化学发光强度进行检测，从而确定待测物的含量，具有灵敏度高、报告速度快、自动化程度高等突出的特点，现已广泛应用于医学检验领域。
依据抗原抗体结合的免疫学原理，也可应用化学发光技术对病毒进行检测。目前与新型冠状病毒肺炎相关的检测集中于IgG和IgM上，针对抗原的检测较少。这是由于感染早期，病人血液中病毒滴度低，需要高灵敏度的检测方法，另外，血液中的病毒，可能已被相关抗体所识别，不对样品进行处理，很难释放出抗原表位，进而造成测试结果假阴性。
根据前期对SARS的研究结果，病人在感染病毒后，会于3～7天左右产生IgM抗体，1周后IgG抗体也会上升，当IgG出现后，滴度会持续增高，存在较长时间；IgM则持续降低，直至消失。因此，正确的观察两者的动态变化，有助于在核酸检测假阴性的情况下，进行新冠病毒感染的诊断。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中已指出：对临床怀疑新冠肺炎且核酸检测阴性的患者以及处于恢复期且核酸检测阴性的患者可以通过抗体检测进行诊断。
但是，目前现有中，抗体检测的灵敏度仍然不令人满意。
发明内容
本发明的第一方面涉及SARS-CoV-2检测试剂盒，包括：
a)固相偶联物；
所述固相偶联物由固相载体及包被于所述固相载体上的抗原和抗体组成；
所述抗体为抗新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白；
b)标记有化学发光标记物的抗原及抗体；
所述抗体为与新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体，但与a)中的抗体结合的抗原表位不同；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白。
可选的，如上所述的试剂盒，所述化学发光标记物为吖啶类化学发光物质。
可选的，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括抗原释放组分；
所述抗原释放组分包括：10mM～50mM柠檬酸盐、0.5mM～2mM有机酸、0.1v/v％～2v/v％表面活性剂，pH＝3～4.5。
可选的，如上所述的试剂盒，所述表面活性剂包含Tween，优选为Tween-20、Tween-80、Tween-100中的至少一种。
可选的，如上所述的试剂盒，所述抗原释放组分还包含防腐剂，优选浓度为0.1w/v％～0.5w/v％。
可选的，如上所述的试剂盒，所述固相载体为试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔、微珠或圆片。
可选的，如上所述的试剂盒，所述固相载体的材质为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶和琼脂糖凝胶中的一种或多种。
可选的，如上所述的试剂盒，在a)中，所述抗体为多种，分别针对N蛋白的不同表位。
可选的，如上所述的试剂盒，在b)中，所述抗体的种属来源与步骤a)中的所述抗体相同。
本发明的第二方面涉及基于如上所述试剂盒的检测SARS-CoV-2的非诊断目的方法，包括：
i)将待检测样品进行处理以释放其中的SARS-CoV-2抗原及抗体，并将其与所述固相偶联物共孵育；
ii)洗去未结合的SARS-CoV-2抗原及抗体；
iii)加入所述标记有化学发光标记物的抗原及抗体，并对所述化学发光标记物的信号强度进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明整合SARS-CoV-2抗原检测和抗体检测为一个单一的检测试剂盒，只需一份样本，就能够快速检测患者体内病毒抗原和总抗体含量，节省操作时间和成本，方便快捷，减少交叉污染；该试剂盒预期用于临床患者和密切接触者的筛查和管理，重点高危地区人群的筛查、流行病学的调查等应用场景。由于检测灵敏度高，因此本发明也可以很好地用于血清样本的检测。
总抗体检测既包含了IgM抗体检测早期诊断新型冠状病毒的优势，又有检测IgG抗体既往感染(包含处于恢复期IgM下降的患者)的特点，可以更好的防止漏检、缩短诊断窗口期，具有更高的特异性和灵敏度。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如在本发明的说明书和实施例中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括单数和复数所指物，除非上下文另外明确说明。举例来说，“抗体”是指一种(个)或超过一种(个)的抗体。
本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本试剂盒针对现有技术难点和可能会存在的缺陷，根据直接化学发光技术的免疫夹心法和间接法的原理，开发了此款同时检测冠状病毒抗原和总抗体试剂盒。与相应的化学发光测定仪配套，能够实现对新型冠状病毒抗原和总抗体的自动化(自动取样、自动检测、自动报告)、高通量(300人份/小时)、快速检测(30min出报告)。
本发明涉及一种SARS-CoV-2检测试剂盒，包括：
a)固相偶联物；
所述固相偶联物由固相载体及包被于所述固相载体上的抗原和抗体组成；
所述抗体为抗新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白；
b)标记有化学发光标记物的抗原及抗体；
所述抗体为与新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体，但与a)中的抗体结合的抗原表位不同；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白。
本发明整合SARS-CoV-2抗原检测和抗体检测为一个单一的检测试剂盒，只需一份样本，就能够快速检测患者体内病毒抗原和总抗体含量，节省操作时间和成本，方便快捷，减少交叉污染；该试剂盒预期用于临床患者和密切接触者的筛查和管理，重点高危地区人群的筛查、流行病学的调查等应用场景。由于检测灵敏度高，因此本发明也可以很好地用于血清样本的检测。
总抗体检测既包含了IgM抗体检测早期诊断新型冠状病毒的优势，又有检测IgG抗体既往感染(包含处于恢复期IgM下降的患者)的特点，可以更好的防止漏检、缩短诊断窗口期，具有更高的特异性和灵敏度。
在一些实施方式中，所述化学发光标记物为吖啶类化学发光物质。
进一步的，吖啶类化学发光物质包括吖啶酯和吖啶磺酰胺。
进一步的，吖啶类化学发光物质包括吖啶酯AE-NHS、吖啶酯DMAE-NHS、吖啶酯Me-DMAE-NHS、吖啶酯NSP-DMAE-NHS、吖啶盐NSP-SA、吖啶盐NSP-SA-NHS、吖啶酰肼NSP-SA-ADH等。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括抗原释放组分；
所述抗原释放组分包括：10mM～50mM柠檬酸盐、0.5mM～2mM有机酸、0.1v/v％～2v/v％表面活性剂，pH＝3～4.5。
pH还可以选择3.5、4等。
本试剂抗原释放组分，是通过研究证实的，在保证抗原抗体活性的情况下，将已结合的抗原抗体解离下来最优条件，其中的缓冲体系和乙酸可保证向血清样本中添加抗原释放组分后，整体pH在3～4.5，为最有利于抗原抗体解离的条件，同时也可保证抗原的活性；提高检出率和准确性。
在一些实施方式中，有机酸为乙酸、乙二酸、苹果酸、水杨酸中的至少一种。
在一些实施方式中，所述表面活性剂包含Tween。在一些实施方式中，Tween包括Tween-20、Tween-80、Tween-100中的至少一种。
在一些实施方式中，所述抗原释放组分还包含防腐剂，优选浓度为0.1w/v％～0.5w/v％。
在一些实施方式中，所述固相载体为试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔、微珠或圆片。
在一些实施方式中，所述多孔板为酶标板，其含有的孔位可以为16、32、48、64、96或更多。
在本发明中，术语“微球”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。
微球的表面上具有对于待测定的感兴趣物质(靶标或分析物)的特异性结合特性。
微球优选为磁珠，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。
所述微球的表面修饰有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团包括-OH、-COOH、-NH2、-CHO、以及-SO3H中的一种或多种。在一些实施方式中，包被的抗原和抗体通过物理吸附或直接化学缀合(例如通过桥接物进行桥接)与所述微球缀合或结合。
在一些实施方式中，所述固相载体的材质为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶和琼脂糖凝胶中的一种或多种。
在优选的实施方式中，在a)中，所述抗体为多种，分别针对N蛋白的不同表位。期望的抗体中能应当能覆盖N蛋白的绝大部分活性表位，以期增加检测SARS-CoV-2的N蛋白抗原的灵敏度。
显然，相应的，b)中所述的抗体也可以为多种，分别与不同的a)中抗体配对。
在本发明中，a)中所述抗体和b)中的所述抗体，其来源可独立地选自包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。
“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。此外，抗体还包括能够结合期望抗原的功能性片段，例如Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。
在一些实施方式中，在b)中，所述抗体的种属来源与步骤a)中的所述抗体相同。
同种属来源的抗体能够有效降低交叉反应。
根据本发明的再一方面，还涉及基于如上所述试剂盒的检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：
i)将待检测样品进行处理以释放其中的SARS-CoV-2抗原及抗体，并将其与所述固相偶联物共孵育；
ii)洗去未结合的SARS-CoV-2抗原及抗体；
iii)加入所述标记有化学发光标记物的抗原及抗体，并对所述化学发光标记物的信号强度进行检测。
在本申请中使用术语“检测”和类似术语来概括地指过程或发现或确定某事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平，或发生的概率。例如，术语“检测”当关于靶核酸序列使用时，可以表示发现或确定所述序列的存在、不存在、水平或数量，以及存在或不存的概率或似然性。要理解的是，表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量检测。例如，定量检测包括确定样品中SARS-CoV-2有关的抗原或抗体的水平、数量或量。
术语“样品”是指含有或推测含有来自个体的SARS-CoV-2有关的抗原或抗体的任何组合物。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分离的组分。在具体的实施方案中，对全血样品进行分析。如本文所用的，“全血样品”包括从身体中抽取的血液，尚未从所述血液去除诸如血浆或血小板的成分。通常，除抗凝剂的存在外，样品未经修饰。样品还可以指其他类型的生物样品，例如血浆、血清、血液组分(血沉棕黄层)和干血斑(dried blood spots)。血液样品优选为外周血、样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物的成分和组分，包括细胞系。
该方法可用于诊断目的或非诊断目的。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本试剂盒主要分为校准品和检测试剂，其中，检测试剂由3部分组成：
1.1 R1磁珠组分：
由6种顺磁性磁珠以及磁珠稀释液组成，磁珠包被蛋白组合如下：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗；
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白；
⑥SARS-CoV-2E蛋白；
其中抗病毒N蛋白鼠单抗可以是小鼠腹水提取也可以是杂交瘤细胞体外培养获得，并且可以为多种针对不同N蛋白不同免疫位点的单抗；包被磁珠的S1、S2、RBD、M、E蛋白可以是天然提取也可以是重组表达的。
磁珠浓度均为0.1mg/mL，磁珠稀释液为常用的含有50mM MES、3％BSA、防腐剂等成分的稀释液，pH在6.0。
1.2 R2吖啶组分：由分别标记了吖啶酯的N蛋白鼠单抗和抗原组分以及吖啶稀释液组成。
吖啶酯组合包括：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗，其与R1磁珠组分中的单抗可以组成配对抗体以检测N蛋白抗原。
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白；
⑥SARS-CoV-2E蛋白；
吖啶组分浓度均为20ug/mL，吖啶稀释液为含有30mM PBS、3％BSA、Mouse IgG、防腐剂等成分的稀释液，pH在7.5。
1.3 R3抗原释放组分：由30mM柠檬酸盐、1mM乙酸、1％Tween-80、0.3％NaN3组成，pH 3.5。
实施例2
本试剂盒主要分为校准品和检测试剂，其中，检测试剂由3部分组成：
1.1 R1磁珠组分：
由6种顺磁性磁珠以及磁珠稀释液组成，磁珠包被蛋白组合如下：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗；
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白
⑥SARS-CoV-2E蛋白
其中抗病毒N蛋白鼠单抗可以是小鼠腹水提取也可以是杂交瘤细胞体外培养获得，并且可以为多种针对不同N蛋白不同免疫位点的单抗；包被磁珠的S1、S2、RBD、M、E蛋白可以是天然提取也可以是重组表达的。
磁珠浓度均为0.05mg/ml，磁珠稀释液为常用的含有20mM MES、5％BSA、防腐剂等成分的稀释液，pH在5.5。
1.2 R2吖啶组分：由分别标记了吖啶磺酰胺的N蛋白鼠单抗和抗原组分以及吖啶稀释液组成。
组合包括：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗，其与R1磁珠组分中的单抗可以组成配对抗体以检测N蛋白抗原。
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白；
⑥SARS-CoV-2E蛋白。
吖啶组分浓度均为100ug/mL，吖啶稀释液为含有10mM PBS、5％BSA、Mouse IgG、防腐剂等成分的稀释液，pH在8.5。
1.3 R3抗原释放组分：由10mM柠檬酸盐、0.5mM乙酸、0.1％Tween-20、0.5％ProClin-300组成，pH 3。
实施例3
本试剂盒主要分为校准品和检测试剂，其中，检测试剂由3部分组成：
1.1 R1磁珠组分：
由6种顺磁性磁珠以及磁珠稀释液组成，磁珠包被蛋白组合如下：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗；
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白；
⑥SARS-CoV-2E蛋白；
其中抗病毒N蛋白鼠单抗可以是小鼠腹水提取也可以是杂交瘤细胞体外培养获得，并且可以为多种针对不同N蛋白不同免疫位点的单抗；包被磁珠的S1、S2、RBD、M、E蛋白可以是天然提取也可以是重组表达的。
磁珠浓度均为0.5mg/ml，磁珠稀释液为常用的含有100mM MES、0.5％BSA、防腐剂等成分的稀释液，pH在6.5。
1.2 R2吖啶组分：由分别标记了吖啶酯的N蛋白鼠单抗和抗原以及吖啶稀释液组成。
组合包括：
①抗新冠病毒N蛋白鼠单抗，其与R1磁珠组分中的单抗可以组成配对抗体以检测N蛋白抗原。
②SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基；
③SARS-CoV-2Spike蛋白S2亚基；
④SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
⑤SARS-CoV-2M蛋白；
⑥SARS-CoV-2E蛋白；
吖啶组分浓度均为200ug/mL，吖啶稀释液为含有50mM PBS、0.1％BSA、Mouse IgG、防腐剂等成分的稀释液，pH在5.5。
1.3 R3抗原释放组分：由10～50mM柠檬酸盐、2mM苹果酸、2％表面活性Tween-100、0.1％NaN3组成，pH 4.5。
实施例4
本实施例为试剂盒的使用方法，包括：
本试剂可与本公司生产的iFlash-3000系列化学发光测定仪配套使用，其中清洗液、预激发液、激发液以及相应的清洗和发光读数步骤为测定仪的默认设定，其余步骤由人工设定程序，由测定仪处理完成。
第一步 样本处理：设定程序，吸取20ul样本于反应杯中，并加入试剂100uL R3组分，于37℃孵育5min，使可能结合的抗原抗体解离，充分释放。
第二步 添加磁珠：向反应杯中添加50uL上述R1试剂组分，于37℃孵育10min，样本中的病毒N蛋白抗原与包被于磁珠上的抗N蛋白鼠单抗结合；样本中的新冠病毒总抗体分别与可能包被于磁珠上S1、和/或S2、和/或RBD、和/或M、和/或E蛋白抗原结合，随后执行清洗程序，洗去未结合和吸附的样品；
第三步 添加吖啶：向反应杯中添加100uL上述R2组分，并于37℃孵育10min，使抗原抗体充分反应，形成免疫复合物。随后执行清洗程序，洗去未结合的组分。可能形成的免疫复合物(包括但不限于)如下：
抗原：鼠单抗-病毒N蛋白-鼠单抗
总抗体(双抗原夹心)：
吖啶酯标记鼠抗人二抗：
S1蛋白-抗S1抗体-S1蛋白；S2蛋白-抗S2抗体-S2蛋白；RBD蛋白-抗RBD抗体-RBD蛋白；M蛋白-抗M抗体-M蛋白；E蛋白-抗E抗体-E蛋白；
第四步 测定待测物浓度：根据仪器预先设定好的发光程序，激发通过一系列反应结合在磁珠上的化学发光标记物，并由化学发光测定仪读取发光值；
第五步 产生报告：根据校准曲线和参考区间，报告病人血样中新型冠状病毒抗原和总抗体的含量，以辅助临床判断病情。
对比例1
同实施例1，区别在于R1磁珠组分仅含有抗新冠病毒N蛋白鼠单抗；
R2吖啶组分仅含有抗新冠病毒N蛋白鼠单抗。
对比例2
同实施例1，区别在于R1磁珠组分仅含有SARS-CoV-2Spike蛋白S1亚基受体结合域(Receptor Binding Domian，RBD)蛋白；
R2吖啶组分仅含有吖啶标记的RBD蛋白。
将实施例1、对比例1、对比例2通过实施例4的方法进行检测，检测样本为血清，检测结果如表1和表2所示：
表1
Figure BDA0002947312350000131
Figure BDA0002947312350000141
Figure BDA0002947312350000151
Figure BDA0002947312350000161
Figure BDA0002947312350000171
表2
Figure BDA0002947312350000181
从表1和表2可以看出，本发明所提供的检测方法，其检测灵敏度显著优于对比例1和2，能够有效用于新冠血清样本的检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，包括：
a)固相偶联物；
所述固相偶联物由固相载体及包被于所述固相载体上的抗原和抗体组成；
所述抗体为抗新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白；
b)标记有化学发光标记物的抗原及抗体；
所述抗体为与新冠病毒核衣壳N蛋白的单克隆抗体，但与a)中的抗体结合的抗原表位不同；
所述抗原包括：SARS-CoV-2Spike蛋白的S1亚基、S2亚基、RBD、M蛋白及E蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶类化学发光物质。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗原释放组分；
所述抗原释放组分包括：10mM～50mM柠檬酸盐、0.5mM～2mM有机酸、0.1v/v％～2v/v％表面活性剂，pH＝3～4.5。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂包含Tween，优选为Tween-20、Tween-80、Tween-100中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原释放组分还包含防腐剂，优选浓度为0.1w/v％～0.5w/v％。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔、微珠或圆片。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体的材质为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶和琼脂糖凝胶中的一种或多种。
8.根据权利要求1～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，在a)中，所述抗体为多种，分别针对N蛋白的不同表位。
9.根据权利要求1～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，在b)中，所述抗体的种属来源与步骤a)中的所述抗体相同。
10.基于权利要求1～9任一项所述试剂盒的检测SARS-CoV-2的非诊断目的方法，其特征在于，包括：
i)将待检测样品进行处理以释放其中的SARS-CoV-2抗原及抗体，并将其与所述固相偶联物共孵育；
ii)洗去未结合的SARS-CoV-2抗原及抗体；
iii)加入所述标记有化学发光标记物的抗原及抗体，并对所述化学发光标记物的信号强度进行检测。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113624965A (zh) * 2021-08-05 2021-11-09 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用
WO2022008973A3 (en) * 2020-07-10 2022-05-12 Covid Diagnostics Ltd. Compositions, methods, and systems for detecting immune response
CN114736274A (zh) * 2022-01-25 2022-07-12 伊莱瑞特(武汉)生物技术有限公司 新冠病毒s蛋白总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
CN114814216A (zh) * 2022-06-30 2022-07-29 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1806175A (zh) * 2003-06-10 2006-07-19 新加坡科技研究局 诊断sars冠状病毒感染的方法
CN104792987A (zh) * 2015-04-29 2015-07-22 中国食品药品检定研究院 用于诊断戊型肝炎病毒感染的方法和试剂盒
CN105228649A (zh) * 2013-03-14 2016-01-06 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
CN108700584A (zh) * 2017-01-20 2018-10-23 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测系统
CN109917124A (zh) * 2018-10-30 2019-06-21 郑州安图生物工程股份有限公司 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111999496A (zh) * 2020-08-20 2020-11-27 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法
CN112229994A (zh) * 2020-12-10 2021-01-15 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种基于磁微粒化学发光的新型冠状病毒抗体检测试剂盒
CN112285348A (zh) * 2020-12-29 2021-01-29 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒
CN112305218A (zh) * 2020-08-18 2021-02-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1806175A (zh) * 2003-06-10 2006-07-19 新加坡科技研究局 诊断sars冠状病毒感染的方法
CN105228649A (zh) * 2013-03-14 2016-01-06 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
CN104792987A (zh) * 2015-04-29 2015-07-22 中国食品药品检定研究院 用于诊断戊型肝炎病毒感染的方法和试剂盒
CN108700584A (zh) * 2017-01-20 2018-10-23 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测系统
CN109917124A (zh) * 2018-10-30 2019-06-21 郑州安图生物工程股份有限公司 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒
CN111024954A (zh) * 2020-03-09 2020-04-17 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN112305218A (zh) * 2020-08-18 2021-02-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用
CN111999496A (zh) * 2020-08-20 2020-11-27 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法
CN112229994A (zh) * 2020-12-10 2021-01-15 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种基于磁微粒化学发光的新型冠状病毒抗体检测试剂盒
CN112285348A (zh) * 2020-12-29 2021-01-29 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022008973A3 (en) * 2020-07-10 2022-05-12 Covid Diagnostics Ltd. Compositions, methods, and systems for detecting immune response
CN113624965A (zh) * 2021-08-05 2021-11-09 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用
CN113624965B (zh) * 2021-08-05 2024-02-09 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 N蛋白特异性IgG4在甄别新型冠状病毒感染者和疫苗接种者中的应用
CN114736274A (zh) * 2022-01-25 2022-07-12 伊莱瑞特(武汉)生物技术有限公司 新冠病毒s蛋白总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
CN114814216A (zh) * 2022-06-30 2022-07-29 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 用于鉴别新冠核衣壳蛋白的核酸适体-抗体混合夹心法

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