CN109917124A - 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括磁微粒、样本稀释液、阴性对照、抗原阳性对照、抗体阳性对照、酶结合物；在所述磁微粒上包被有重组HCV病毒抗原以及鼠抗人HCV核心抗原单克隆抗体；所述抗体阳性对照含有HCV抗体阳性人血浆；所述抗原阳性对照含有HCV重组核心抗原。本发明试剂盒采用化学发光与磁微粒分离技术相结合,同时检测血清中HCV病毒重组核心抗原及抗‑HCV抗体，配合郑州安图生物工程股份有限公司的全自动化学发光仪，可以作为临床检测的初筛试验，进一步缩短窗口期，有效控制了丙型肝炎的传播。

Description

一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体检测技术，尤其是涉及一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒（以下简称HCV）为黄病毒科肝炎病毒属病毒，是一种单股正链RNA病毒，复制场所为肝脏细胞。丙型肝炎病毒在全球不同地域均有不同程度的传播。根据世界卫生组织（WHO）统计的数据显示，全球大约共有1.7-2亿的人群被感染HCV，感染率高达3%，同时每年递增3.5万新感染病例。HCV感染已成为严重影响全世界人类健康的公共卫生难题之一。目前丙型肝炎的血清学检测标志物主要有：丙型肝炎病毒抗体，丙型肝炎病毒核心抗原以及丙型肝炎病毒核酸。目前主流的检测方法为抗体检测，作为丙型肝炎诊断的初筛试剂，但是抗体检测窗口期较长，一般为2-6周。核酸检测技术以及核心抗原检测作为抗体检测的补充，主要对于抗体检测异常的样本进行复测确证，但是不能作为初筛试验，对于抗体检测为阴性实际为窗口期的样本可能会错过，且操作繁琐，对实验环境要求较高，不便于在临床开展实验。HCV抗原抗体联合检测是一种比较新的检测手段，灵敏度较抗体检测高，作为临床初筛试剂，基本上可以弥补上述几种检测手段的不足，但目前市面上该类试剂盒比较少，且主要为酶联免疫法，全自动化程度不高，操作繁琐，不便于作为初筛试验在临床推广运用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可作为临床初筛试验用且灵敏度更高、结果更准确的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括磁微粒、样本稀释液、阴性对照、抗原阳性对照、抗体阳性对照、酶结合物；在所述磁微粒上包被有重组HCV病毒抗原以及鼠抗人HCV核心抗原单克隆抗体；所述抗体阳性对照含有HCV抗体阳性人血浆；所述抗原阳性对照含有HCV重组核心抗原。

所述样本稀释液中含有生物素标记的HCV重组抗原。

所述酶结合物含有辣根过氧化物酶标记的鼠抗人HCV核心抗原单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的亲和素。

本发明试剂盒采用化学发光与磁微粒分离技术相结合,同时检测血清中HCV病毒重组核心抗原及抗-HCV抗体，配合郑州安图生物工程股份有限公司的全自动化学发光仪，可以作为临床检测的初筛试验，进一步缩短窗口期，有效控制了丙型肝炎的传播。

本发明制备的试剂盒采用磁微粒作为固相载体，由于磁微粒具有较大的比表面积，能够增大免疫反应发生面积，提高了反应的灵敏度；磁微粒球形和均一的表面，可减少化学性粘附和非特异性结合，提高了试剂盒的特异性；酶促化学发光系统能够实现对反应信号的有效放大；同时通过对缓冲液配方的优化，使本发明的试剂盒实现了免疫反应的低本底和高信号，因此，本发明试剂盒不仅特异性好，而且使抗原和抗体都达到了很高的检出灵敏度。本发明的试剂盒配合全自动化学发光仪A2000 Plus使用，实现了全自动测定，降低了人为操作对测试结果的影响，使检测结果更可靠，更准确，更快速，更具有可重复性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，使方便本领域技术人员对本申请的进一步理解和实施。

实施例1 制备丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒

一、磁微粒包被物的制备

将特异性抗原以及抗体通过共价偶联的方式连接到磁珠上的过程称为磁微粒包被；制备得到的磁微粒抗原、磁微粒抗体的结合物称为磁微粒包被物。

包被的基本原理为：抗原或抗体表面的氨基与磁珠表面的化学基团在化学交联剂的作用下发生化学反应，形成抗原/抗体--磁微粒的共价结合物，该共价结合物经过洗涤和封闭，去除未反应的抗原或抗体，以及封闭非特异性结合的位点，最终制备成试剂盒磁珠包被物。其常规操作过程如下：

1、取含有某种官能团（-COOH、-NH2、-HS等）的顺磁纳米颗粒溶液，用缓冲液A(MES缓冲液，pH6.0)进行洗涤，将纳米磁微粒的缓冲液成分置换成缓冲液A；

2、称取交联剂EDC，以缓冲液A配制成浓度为10mg/ml的EDC溶液；

3、将步骤1洗涤后的纳米磁微粒溶液与步骤2制备的EDC溶液充分混合，室温振荡反应180分钟；

4、将步骤3中的纳米磁微粒溶液加入HCV重组抗原，室温振荡180分钟，使抗原与磁珠通过共价偶联的方式结合在一起，用含有蛋白以及表面活性剂的缓冲液对制备好的纳米磁微粒混悬液进行洗涤，定容，保存至2-8℃环境中。

5、将步骤3中的纳米磁微粒溶液加入HCV核心抗原单克隆抗体，室温振荡180分钟，使抗体与磁珠通过共价偶联的方式结合在一起，用含有蛋白以及表面活性剂的缓冲液对制备好的纳米磁微粒混悬液进行洗涤，定容，保存至2-8℃环境中。

6、将步骤4和步骤5制备的磁微粒混悬液按照1:1的比例混合，保存至2-8℃环境中。

二、生物素重组抗原的制备

其常规的操作规程如下：

1、溶解5mg/ml的HCV重组抗原于0.02mol/L的PBS缓冲液中，通过透析除去抗原中的其它干扰物质；

2、溶解2.5mg Sulfo-NHS-Biotin于100μL纯化水中，与步骤1制备的HCV重组抗原混合，室温反应0.5h；

3、将上述反应的抗原通过纯化柱纯化，保存于含有20%甘油的磷酸盐缓冲液中；

4、配制含适当浓度的离子表面活性剂以及牛血清白蛋白，pH 7.4的Tris-NaCl缓冲液，配制成一定浓度的生物素抗原工作液，使其达到预期的检测灵敏度。

三、酶结合物的制备

配制含适当浓度的离子表面活性剂以及牛血清白蛋白，pH 7.4的Tris-NaCl缓冲液，制备成一定浓度的酶标亲和素以及酶标HCV核心抗原单抗的工作溶液，用过调整浓度，使其达到预期的检测灵敏度。

四、阴性对照的制备

配制含适当浓度的离子表面活性剂以及小牛血清，pH 7.4的PBS缓冲液。

五、抗原阳性对照的制备

配制含适当浓度的离子表面活性剂以及小牛血清，pH 7.4的PBS缓冲液，制备成含有一定浓度的HCV重组核心抗原的工作溶液，通过调整浓度使其达到预期的发光值。

六、抗体阳性对照的制备

配制含适当浓度的离子表面活性剂以及小牛血清，pH 7.4的PBS缓冲液，制备成含有一定浓度的HCV抗体阳性血浆的工作溶液，通过调整浓度使其达到预期的信号值。

实施例2 本发明试剂盒的检测方法

将实施例1制备的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒与全自动化学发光仪A2000、A2000 Plus配套使用，其流程如下：

第一步，将样本、样本稀释液和磁微粒包被物工作液加入反应杯中，37℃孵育15min分钟，样本中HCV抗体与磁微粒包被的HCV重组抗原以及样本稀释液中的生物素抗原结合，样本中的HCV核心抗原与磁微粒包被的HCV核心抗原单克隆抗体结合，孵育完成后，固相置于一个磁场内被吸住，结合在固相上的物质被保留，而其他未结合的物质被冲洗除去。样本稀释液和磁微粒包被物工作液可以同时与样本混合,也可以先后加入。

第二步，将酶结合物添加到反应管在37℃孵育15分钟，辣根过氧化物酶标记的亲和素与第一步反应生产的磁微粒HCV重组抗原-抗体-生物素标记的HCV重组抗原复合物结合，辣根酶标记的HCV核心抗原单抗与第一步生产的HCV核心抗原单克隆抗体-HCV核心抗原形成夹心复合物；孵育完成后，该复合物被一个磁场吸住，而其他未结合的物质被冲洗除去。

第三步，将化学发光底物添加到反应管内生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲醋阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲醋阴离子从激发态至基态时，产生化学发光图。再通过光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量。所产生的光子数与样本内HCV抗原抗体的含量成正比。

样本中是否含有HCV病毒抗原或者抗体，首先需要测定阳性对照的相对发光值，通过计算得到CUT OFF值，然后测定样本相对发光值，该发光值与CUT OFF的比值即为S/CO。样本测试的最终结果以S/CO值形式给出。样本中是否含有HCV病毒抗原或者抗体，需要将样本的测试结果S/CO 值与参考值进行比较，如果小于1，表示样本中不含有HCV病毒抗原以及抗体，如果大于或等于1，表示样本中含有HCV病毒抗原或者抗体。

实施例3 本发明试剂盒性能测试

分别采用HCV抗体国家参考品以及WHO HCV核心抗原标准物质对抗体和抗原检测系统进行性能测试。

1、抗体检测系统性能测试

用HCV抗体检测试剂第6套国家参考品进行考核，阳性符合率29/30，阴性符合率30/30，最低检出限参考品L1-L3为阳性，L4为阴性，精密性1.6%。满足国家标准要求：阳性符合率≥29/30；阴性符合率≥29/30；最低检出限参考品L1-L2为阳性，L4为阴性，L3为阳性或者阴性；精密性参考品CV≤15%。检测结果见表1：

表1：HCV抗体国家盘检测结果

2、抗原检测系统性能测试

采用HCV核心抗原WHO标准物质（PEI code 129096/12）进行分析灵敏度检测，4倍稀释检测S/CO为2.5。

Claims (3)

1.一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于：包括磁微粒、样本稀释液、阴性对照、抗原阳性对照、抗体阳性对照、酶结合物；所述磁微粒上包被有重组HCV病毒抗原以及鼠抗人HCV核心抗原单克隆抗体；所述抗体阳性对照含有HCV抗体阳性人血浆；所述抗原阳性对照含有HCV重组核心抗原。

2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液中含有生物素标记的HCV重组抗原。

3.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物含有辣根过氧化物酶标记的鼠抗人HCV核心抗原单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的亲和素。