CN101551394A - 以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，包括：(1)以磁性微粒为反应和分离的载体，将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面；(2)加入封闭液，在20～40℃条件下，中速振荡10min，磁性分离，弃上清；(3)包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原与待测血液中特异性的抗体结合；(4)通过外加磁场分离出表面带有特异性抗原－抗体复合物的磁性微粒；(5)将上述磁性微粒表面的抗体复合物与酶标记鼠抗人IgG二抗相结合；(6)采用化学发光检测仪，发光底物A液、B液，检测样本发光值。该方法具有检测速度快，特异性高，稳定、无放射性污染等特点，可明显提高检测的灵敏度和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域，尤其是涉及一种以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法。
背景技术
丙型肝炎(HCV)呈全球性流行，是欧美及日本等国家中末期肝病的主要原因。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％。丙型肝炎的传染源主要为急性临床型和无症状的亚临床病人、慢性病人和病毒携带者。HCV主要经血液传播，主要途径有输血、血制品传播以及经破损的皮肤和黏膜传播。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群抗-HCV阳性率为3.2％。抗-HCV阳性率随年龄增长而逐渐上升，由1岁组的2.0％至50～59岁组的3.9％。男女间无明显差异。
HCV感染的检测可分为特异性检测和非特异性检测，非特异性检测包括ALT，AST，肝功能等辅助性诊断手段；特异性检测可分为感染后抗-HCV特异性检测，病毒基因检测及抗原检测等。其中病毒基因检测系采用RT-PCR方法，可检测出血浆病毒颗粒的浓度，但由于本法容易受污染造成假阳性、成本高、操作烦琐且技术要求严格等因素而难以广泛推广和应用。HCV抗体(其中主要是IgG特异性抗体)的检测是目前国内外对HCV感染检测的最重要的方法。国内外对HCV-IgG抗体检测试剂的研制可分为三个阶段：第一代试剂主要是对NS3区抗体的检测；第二代试剂增加了对HCV-Core区抗体的检测；第三代试剂又增加了对NS5区抗体的检测。
传统的检测丙型肝炎病毒抗体的方法大多采用以聚苯乙烯等材料为载体的酶联免疫方法，此种方法较简便，但不足之处在于检测的灵敏度较差，容易出现漏检情况。
磁性微粒，又称磁性微球或磁珠，是由超顺磁性纳米粒子，包括磁性金属如Fe、Co、Ni或其金属氧化物等，与高分子或无机材料等形成的一种胶态液体复合物，可通过表面的功能基团进行各种表面的功能化修饰；在外加磁场的作用下通过吸附、清洗、解吸等操作快速移动和分离，可一步从复杂的生物体系中得到目标生物分子，具有磁性分离简便、亲和吸附高特异性以及巨大表面积等优点。因此，磁性微粒已广泛应用于生物学、医学等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，此种方法可明显提高检测的灵敏度和稳定性。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，主要步骤包括：
(1)固定：以磁性微粒为反应和分离的载体，将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面；
(2)封闭：加入10％v/v牛血清-PBS缓冲液0.02M封闭液，在20～40℃条件下，180r/min振荡10min，磁性分离，弃上清；重复封闭多次，封闭磁性微粒表面未与抗原偶联的空余位；
(3)与待测物结合：包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原与待测血液中特异性的抗体结合，形成特异性抗原--抗体复合物；
(4)磁性分离：通过外加磁场分离出表面带有特异性抗原--抗体复合物的磁性微粒；
(5)与酶标记鼠抗人IgG二抗结合：将上述磁性微粒表面的抗体复合物与酶标记鼠抗人IgG二抗相结合；
(6)检测：采用化学发光检测仪，发光底物A液、B液，检测样本发光值。
所述丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面的方法为：
(1)预处理：取磁性微粒，用0.02MPBS，PH7.6缓冲液(即磷酸盐缓冲液)清洗1～3次；
(2)表面活化：将25％v/v戊二醛按1∶10溶解到含有上述磁性微粒的0.02M，PH7.6PBS缓冲溶液中，混匀，置于振荡器中，在20～40℃条件下，180r/min转速下振荡2h，充分反应磁性分离，弃上清液，用缓冲液将所述磁性微粒清洗干净；
(3)偶联：将丙型肝炎病毒抗原以1∶2K比例溶解到含有上述处理好的磁性微粒缓冲液中，混匀，置于振荡器中，在20～40℃条件下180r/min振荡，充分反应2h，磁性分离，弃上清液，即将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒上。
所述丙型肝炎病毒抗原为丙型肝炎病毒结构区Core和非结构区NS3，NS4，NS5的融合基因重组抗原；酶标记鼠抗人IgG二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG。
所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG的工作浓度为1∶2000v/v。
所述发光底物A液由luminol(鲁米诺)0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、Tris-Hcl缓冲液0.2M，pH 9.4组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)0.5mM、维生素C 0.12mM、乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M，pH 6.5组成。
本发明具有如下优点：
1、检测速度快，特异性高，稳定、无放射性污染等特点。
2、磁生微粒做为免疫学载体，可明显提高检测的灵敏度、稳定性。在没有磁场存在的情况下，磁性微粒悬浮在液体中，使得抗原抗体反应类似于均相反应；磁性微粒在外加磁场的作用下可方便地分离，洗涤快速；
3、磁性微粒具有较大的比表面积，可包被较大量的抗原或抗体，检测灵敏度高、范围宽。
4、磁性微粒对生物分子的固定条件温和，固定容量较大，可最大限度的保持偶联后的生物分子活性。
将磁性复合微粒应用于传统的免疫学检测方法中，以磁性微粒作为载体，以磁性微粒的磁性金属氧化物作为核心，表面包覆一层有机聚合物，有机聚合物表面的功能基团与丙型肝炎病毒抗原分子通过半胱氨酸的-SH，表面疏水相互作用或电荷作用等牢固的将其固定在磁性微粒表面，而结合于磁性微粒表面的蛋白质能提供特异性的亲和特性，因此，磁性微粒用于酶联免疫检测，也可提高该方法的敏感性，并实现自动化控制。
下表为三种方法测定丙型肝炎病毒抗体性能指标的对比结果：
| 性能指标 | 酶联免疫法 | 化学发光法 | 磁性微粒 |
| 灵敏度 | 98.9％ | 99.5％ | 99.8％ |
| 特异性 | 99.2％ | 99.3％ | 99.6％ |
| 精密度 | 分析内精密度(CV＝8.5％，N＝10) | 分析内精密度为4.5％(n＝10)；分析间精密度平均为6.8％(n＝10) | 分析内精密度(CV＝8.7％，N＝10) |
具体实施方式
本发明所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，主要步骤包括：
(1)固定：以磁性微粒为反应和分离的载体，用下述方法将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面：
取磁性微粒30ul，用0.02MPBS，PH7.6缓冲液(即磷酸缓冲液)清洗1～3次；
将25％v/v戊二醛按1∶10溶解到含有磁性微粒的上述缓冲液中，混匀置于振荡器中，在20～40℃，180r/min条件下振荡，充分反应2h，磁性分离，弃上清液，用缓冲液将所述磁性微粒清洗2次；
将丙型肝炎病毒抗原按1∶2K比例溶解到含有上述处理好的磁性微粒的缓冲液中混匀，置于振荡器中，在20～40℃条件下，中速振荡，充分反应2h，磁性分离，弃上清液即可；
(2)封闭：加入10％v/v牛血清-PBS 0.02M封闭液，在20～40℃条件下，中速振荡10min，磁性分离，弃上清液；上述封闭过程重复4次，封闭磁性微粒表面未与抗原偶联的空余位；然后加入含1％(m/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS(0.02M，PH7.4)缓冲液3ml做为磁性微粒长期保存的保护液；
(3)与待测物结合：取出包被板，做好标记，留出空白对照孔一孔，加入阳性对照二孔和阴性对照三孔100ul/孔，其它各孔加入已连接好丙型肝炎病毒重组抗原的磁性微粒20ul/孔，再加入样品稀释液100ul/孔，最后加入待测样品10ul/孔，轻轻振荡混匀，贴上板贴，置37℃温箱中孵育30min；
(4)洗涤：磁性分离5min，弃上清液后充分混匀，用自动洗板机注液250ul/孔，磁性分离5min；重复此步骤3-5遍；
(5)加酶：除空白孔外，加入测抗-HCV酶结合物100ul/孔，贴上板贴，置37℃温箱中孵育30分钟后撕下板贴，按步骤4洗涤；
(6)检测：每孔(含空白孔)分别加入预先混合好的发光底物A液和发光底物B液各50ul/孔，震荡混匀，室温(18℃-25℃)避光反应10分钟；采用化学发光检测仪检测发光值。
所述丙型肝炎病毒抗原为丙型肝炎病毒结构区Core和非结构区NS3，NS4，NS5的融合基因重组抗原；酶标记鼠抗人IgG二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG。
所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG的工作浓度为1∶2000v/v。
所述发光底物A液由luminol(鲁米诺)0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、Tris-Hcl缓冲液0.2M，pH 9.4组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)0.5mM、维生素C 0.12mM、乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M，pH 6.5组成。
Claims (5)
1、一种以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，主要步骤包括：
(1)固定：以磁性微粒为反应和分离的载体，将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面；
(2)封闭：加入10％v/v牛血清-PBS0.02M，PH7.6缓冲液作为封闭液，在20～40℃，180r/min条件下振荡10min，磁性分离，弃上清；重复封闭多次，封闭磁性微粒表面未与抗原偶联的空余位；
(3)与待测物结合：包被在磁性微粒表面的丙肝病毒抗原与待测血液中特异性的抗体结合，形成特异性抗原--抗体复合物；
(4)磁性分离：通过外加磁场分离出表面带有特异性抗原--抗体复合物的磁性微粒；
(5)与酶标记鼠抗人IgG二抗结合：将上述磁性微粒表面的抗体复合物与酶标记鼠抗人IgG二抗相结合；
(6)检测：采用化学发光检测仪，发光底物A液、B液，检测样本发光值。
2、根据权利要求1所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于：所述丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒表面的方法为：
(1)预处理：取磁性微粒，用0.02M PBS PH7.6缓冲溶液，清洗1～3次；
(2)表面活化：将25％v/v戊二醛按1∶10溶解到含有上述磁性微粒的0.02M，PH7.6PBS缓冲溶液中，置于振荡器中，在20～40℃条件下，以180r/min的振速振荡混匀，充分反应2h，磁性分离，弃上清液，用缓冲液将所述磁性微粒清洗干净；
(3)偶联：将丙型肝炎病毒抗原按1∶2K比例溶解到含有上述处理好的磁性微粒缓冲液中，混匀，置于振荡器中，在20～40℃条件下，180r/min振荡，充分反应2h，磁性分离，弃上清液，即将丙型肝炎病毒抗原偶联在磁性微粒上。
3、根据权利要求1或2所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于：所述丙型肝炎病毒抗原为丙型肝炎病毒结构区Core和非结构区NS3，NS4，NS5的融合基因重组抗原；酶标记鼠抗人IgG二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG。
4、根据权利要求3所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人I gG的工作浓度为1∶2000v/v。
5、根据权利要求3所述的以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于：所述发光底物A液由A液由luminol0.15mM、羟基香豆素0.59mM、没食子酸0.35mM、Tris-Hcl缓冲液0.2M，pH 9.4组成；发光底物B液由氨基酸氧化酶0.85mM、吐温-200.8％v/v、DTPA 0.5mM、维生素C 0.12mM、乙酸-乙酸盐缓冲液0.2M，pH 6.5组成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20091007 |