JP6785239B2 - 抗アセトアミノフェン抗体及びアセトアミノフェンタンパク質付加物 - Google Patents
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Description
本発明は、NIHによって授与されたR42 DK079387−03に基づく政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は、2015年12月3日に出願された米国仮特許出願第62/086,923号の利益を主張するものであり、その開示内容全体を本明細書の一部として参照により援用する。
本開示は、アセトアミノフェン誘発毒性の検出及び診断に有用な、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に結合する単離された抗体を提供する。
アセトアミノフェン(APAP)誘発毒性は、肝臓において、反応性代謝産物であるN−アセチル−p−ベンゾキノンイミン(NAPQI)が必須タンパク質に共有結合することによって媒介される。治療的用量において、該代謝産物はグルタチオンとの結合により効果的に解毒され、3−(グルタチオン−S−イル)アセトアミノフェン結合体を形成する。過剰服用後には、該反応は肝臓のグルタチオンを枯渇させ、代謝産物が肝臓タンパク質に共有結合する。このシナリオで形成される主な付加物は、アセトアミノフェン−システイン付加物、即ち、3−(システイン−S−イル)アセトアミノフェンである。本開示の抗アセトアミノフェン−タンパク質付加物抗体には、アセトアミノフェンのタンパク質付加物に結合する抗体が含まれる。
一態様において、本開示は、対象から得た生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物を検出するための抗体を提供する。別の態様において、本開示は、対象から得た生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定するための抗体を提供する。対象から得た生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量は、対象を、高い量または低い量のアセトアミノフェン−タンパク質付加物を有するものとして分類するために使用でき、更に、対象においてアセトアミノフェンに関連した露出及び/または毒性を同定するために使用し得る。特定の実施形態において、アセトアミノフェン−タンパク質付加物は、3−(システイン−S−イル)アセトアミノフェン−タンパク質付加物である。
一態様において、本開示は、対象から得た生物学的試料中においてアセトアミノフェン−タンパク質付加物を同定する手段を提供する。別の態様において、本開示は、対象から得た試料中においてアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定するための手段を提供する。この方法は、一般に、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に特異的に結合する抗体を用いて、対象から得た生物学的試料中において1以上のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を検出及び/または測定することを含む。加えて、当該方法は、(i)対象から生物学的試料を得ることと、(ii)アセトアミノフェン−タンパク質付加物に特異的に結合する抗体を用いて、前記試料中において1以上のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を検出及び/または測定することを含み得る。適切な抗体は、上記セクションIに記載されている。
ある態様において、本開示は、対象から得られた生物学的試料中で測定されたアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量に基づいて対象を分類する手段を提供する。この方法は、一般に、(i)アセトアミノフェン−タンパク質付加物に特異的に結合する抗体を用いて、対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定することと、(ii)前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値に対して比較することと、(iii)前記対象を、前記試料中で測定されたアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量に基づいて、高い量または低い量のアセトアミノフェン−タンパク質付加物を有するものとして分類することを含む。任意に、当該方法は、(i)対象から生物学的試料を入手し、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に特異的に結合する抗体を用いて、前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定することと、(ii)前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値に対して比較することと、(iii)前記対象を、前記試料中で測定されたアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量に基づいて、高い量または低い量のアセトアミノフェン−タンパク質付加物を有するものとして分類することを含む。前述の方法では、1以上のアセトアミノフェンタンパク質付加物を測定することができる。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のアセトアミノフェンタンパク質付加物を測定することができる。前記対象から生物学的試料を入手し、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に特異的に結合する抗体を用いて、前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定する方法が上記で詳述されている。好ましい実施形態において、前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿及び唾液からなる群から選択される生物学的液体である。特定の実施形態では、前記アセトアミノフェン−タンパク質付加物は、3−(システイン−S−イル)アセトアミノフェン−タンパク質付加物である。
本開示の別の態様は、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に対する特異性を有する抗体を産生するための、アセトアミノフェン−タンパク質付加物免疫原を提供する。この新規な免疫原は、免疫原性担体タンパク質(CP)を2−イミノチオラン(2−IT)で修飾して、末端スルフヒドリル基を備えた多数の5−炭素リンカー分子を有する高度に置換されたCPを提供することにより調製された。次いで、この2−IT修飾CPは、生合成的に調製されたN−アセチル−p−ベンゾキノンイミン(NAPQI)との反応により、末端スルフヒドリル基において共有結合的に修飾された。特定の実施形態において、前記免疫原は、担体タンパク質−2−イミノチオラン結合−アセトアミノフェン免疫原である。従って、前記免疫原は、CP−2−IT−APAPと称することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体」は、アセトアミノフェン−タンパク質付加物を特異的に認識する免疫グロブリン由来の分子を言う。本発明の抗体は、全長抗体(IgM、IgG、IgA、IgE)であってもよく、または抗体断片(Fab、F(ab’)2、scFv)であってもよい。抗体は、キメラであってもよく、ヒト化されていてもよい。
アセトアミノフェン(APAP)(パラセタモールとも呼ばれる)の肝毒性は、3−(システイン−S−イル)アセトアミノフェンとしてタンパク質に共有結合する反応性代謝物のN−アセチル−p−ベンゾキノンイミンによって媒介される。これらアセトアミノフェン−タンパク質付加物は、アセトアミノフェンへの曝露の特異的バイオマーカーであり、これら付加物のレベル上昇は、アセトアミノフェン毒性の特異的バイオマーカーである。本開示は、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に対する特異性を有するモノクローナル抗体の調製のための、新規で固有の免疫原を記載するものである。得られた抗体は、アセトアミノフェン媒介毒性の発病の際に生理学的に形成されるアセトアミノフェン−タンパク質付加物と特異的に反応する。
1:250の希釈率でのウサギモノクローナル抗体クローン14−12由来の組織培養上清を、RmAbの最終希釈が1:500となるように、阻害剤(BSA−APAPまたはAPAPの何れか)の連続4倍希釈液と混合した。APAPの最終濃度は、ELISAウェル当たり80、20、5、1.25及び0.31nmolであった。APAP−BSAの最終濃度(加水分解されたタンパク質からのAPAP−CysとしてのHPLC−ECによって定量化)は、ELISAウェル当たり10、2.5、0.625、0.156及び0.04pmolであった。
ラテラルフローアッセイの試験バンドにおいて固定化されたアセトアミノフェンタンパク質付加物へのRMAbの結合は、希釈緩衝液(0.02%NaN3及び0.125%(W/V)非脂肪乾燥ミルクを含有するリン酸緩衝化生理食塩水)中において、RMAbの連続希釈液を調製することにより決定された。結合したRMAbは、ヤギ抗ウサギIgGに吸着させた40nmの金ナノ粒子を用いて検出された。RMAb(μg/mL IgG)の対数プロット対試験バンドの読み取り値(任意の反射率単位)は、0.01μgのRMAbが、約20,000の試験バンド反射率を与えることを示す(図4)。0.1μg/mlの溶液100μlを用いたことに基づいて、0.01μgの値を算出した。その後のラテラルフロー形式の競合阻害アッセイでは、この量のRMAbが使用された。試験バンド抗原は、APAP−タンパク質付加物を産生するように、NAPQIで修飾された卵白アルブミンであった。
次に、RMAbを用いたラテラルフロー形式の競合阻害アッセイを行った。RMAbを0.2μg/mlに希釈し、このAb濃度を等体積の阻害剤、即ちBSA−APAPまたはAPAPの何れかと組み合わせて、各100μlラテラルフローアッセイに適用される最終濃度が0.01μg RMAbに、また指定された阻害剤の最終濃度になるようにした。データは、RMAbを用いたラテラルフローアッセイが、1.19〜0.0186μMの7連続2倍希釈範囲のAPAP−タンパク質付加物を検出し、また2500〜78μM(最終濃度)の6連続2倍希釈範囲のAPAPを検出したことを示している(図5)。まとめると、このデータは、アッセイがAPAPタンパク質付加物(APAP−Cys)の検出について鋭敏であり、APAPの検出に対しては遥かに低感度(>8000倍)であることを示す。言い換えれば、APAP−Cysの1分子は、試験バンドに固定化されたAPAP−タンパク質付加物へのRMAb結合の阻害について、1molのAPAPよりも約8000倍強力である。
NAPQI付加タンパク質の同定は、アセトアミノフェン毒性に対する特異的免疫アッセイの開発を可能にし得る。一実施形態では、タンパク質特異的抗体を競合免疫アッセイにおいて使用することができ、ここではアセトアミノフェン−タンパク質付加物に対して特異的な抗体の限定量を、アセトアミノフェン−タンパク質付加物を含むと推定される試料と混合してよく、該付加物は、もし試料中に存在すれば、合成により調製された固定化されたアセトアミノフェン−タンパク質付加物への抗体の結合を阻害するであろう。この方法は、試料中の如何なる(システイン含有)タンパク質が付加されたかには関係なく、全付加物(全てのアセトアミノフェン−タンパク質付加物を含む)を測定する。典型的な例には、図2のELISA、ならびに図5及び図6のラテラルフローアッセイが含まれる。
Claims (27)
- 単離された抗体であって、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に対して特異的に結合するが、遊離のアセトアミノフェンには特異的に結合せず、また免疫原である担体タンパク質−2−イミノチオラン−APAPを認識し、(a)配列番号1の軽鎖CDR1アミノ酸配列;(b)配列番号2の軽鎖CDR2アミノ酸配列;(c)配列番号3の軽鎖CDR3アミノ酸配列;(d)配列番号4の重鎖CDR1アミノ酸配列;(e)配列番号5の重鎖CDR2アミノ酸配列;および(f)配列番号6の重鎖CDR3アミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
- 請求項1に記載の単離された抗体であって、配列番号14のアミノ酸配列を備えた、前記抗体。
- 請求項1に記載の単離された抗体であって、配列番号13のアミノ酸配列を備えた、前記抗体。
- 請求項1に記載の単離された抗体であって、配列番号17及び配列番号18からなる群から選択される核酸配列を含んだ核酸配列によりコードされる、前記抗体。
- 単離された抗体であって、アセトアミノフェン−タンパク質付加物に対して特異的に結合するが、遊離のアセトアミノフェンには特異的に結合せず、(a)配列番号7の軽鎖CDR1アミノ酸配列;(b)配列番号8の軽鎖CDR2アミノ酸配列;(c)配列番号9の軽鎖CDR3アミノ酸配列;(d)配列番号10の重鎖CDR1アミノ酸配列;(e)配列番号11の重鎖CDR2アミノ酸配列;および(f)配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を具備した、前記単離された抗体。
- 請求項5に記載の単離された抗体であって、配列番号15または配列番号16のアミノ酸配列を備えた、前記抗体。
- 請求項1または5に記載の単離された抗体であって、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体からなる群から選択される、前記単離された抗体。
- 請求項1または5に記載の単離された抗体であって、遊離のアセトアミノフェンよりも2000倍以上更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記単離された抗体。
- 請求項1に記載の単離された抗体であって、遊離のアセトアミノフェンよりも8000倍更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記単離された抗体。
- 請求項1または5に記載の少なくとも1つの単離された抗体を含む免疫アッセイ。
- 生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定する方法であって、少なくとも1種の請求項1または5に記載の単離された抗体を含む免疫アッセイにより、対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定することを含む、前記方法。
- 生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定する方法であって、少なくとも1種の請求項1または5に記載の単離された抗体を含む免疫アッセイにより、対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を測定することを含む、前記方法。
- 請求項11または12に記載の方法であって、前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液及び毛髪からなる群から選択される生物学的液体である、前記方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも2000倍以上更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
- 請求項11または12に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも8000倍更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
- 対象においてアセトアミノフェン誘発毒性を検出するための方法であって、(i)対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を、少なくとも1つの請求項1または5に記載の単離された抗体を用いた免疫アッセイにより測定することと、(ii)前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値と比較し、ここで前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量が前記基準値と比較してより大きいことにより、前記対象におけるアセトアミノフェン誘発毒性が示されることを含む、前記方法。
- 対象においてアセトアミノフェン誘発毒性を検出するための方法であって、(i)対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を、少なくとも1つの請求項1または5に記載の単離された抗体を用いた免疫アッセイにより測定することと、(ii)前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値と比較し、ここで前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量が前記基準値と比較してより大きいことにより、前記対象におけるアセトアミノフェン誘発毒性が示されることを含む、前記方法。
- 請求項16または17に記載の方法であって、前記アセトアミノフェン誘発毒性がアセトアミノフェン過剰服用に直接的にまたは間接的に関連している、前記方法。
- 請求項16または17に記載の方法であって、前記アセトアミノフェン誘発毒性が肝毒性である、前記方法。
- 請求項16または17に記載の方法であって、前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液及び毛髪からなる群から選択される生物学的液体である、前記方法。
- 請求項16または17に記載の方法であって、前記生物学的試料は病因が未知の肝毒性を伴った対象由来である、前記方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも2000倍以上更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
- 請求項16または17に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも8000倍更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
- 対象における肝毒性がアセトアミノフェン誘発毒性によるものであるかどうかを決定する方法であって、(i)少なくとも1種の請求項1または5に記載の単離された抗体を使用する免疫アッセイによって、対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の存在及び/または量を測定することと、(ii)アセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在するかどうかを決定し、アセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在しなければ、前記対象における肝毒性はアセトアミノフェン誘発毒性によるものではなく、またアセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在するならば、前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値と比較し、ここでの前記基準値と比較した前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量の方が多いことにより、前記対象における肝毒性がアセトアミノフェン誘発毒性によるものであることが示されることを含む、前記方法。
- 対象における肝毒性がアセトアミノフェン誘発毒性によるものであるかどうかを決定する方法であって、(i)少なくとも1種の請求項1または5に記載の単離された抗体を使用する免疫アッセイによって、対象から得られた生物学的試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の存在及び/または量を測定することと、(ii)アセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在するかどうかを決定し、アセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在しなければ、前記対象における肝毒性はアセトアミノフェン誘発毒性によるものではなく、またアセトアミノフェン−タンパク質付加物が存在するならば、前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量を基準値と比較し、ここでの前記基準値と比較した前記試料中のアセトアミノフェン−タンパク質付加物の量の方が多いことにより、前記対象における肝毒性がアセトアミノフェン誘発毒性によるものであることが示されることを含む、前記方法。
- 請求項24に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも2000倍以上更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
- 請求項24または25に記載の方法であって、前記抗体は遊離のアセトアミノフェンに対してよりも8000倍更に効果的に、アセトアミノフェンタンパク質付加物に対して特異的に結合する、前記方法。
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