CN116964455A - 用一或多种生物标志物确定已受头部计算机断层扫描且对tbi呈阴性受试者的创伤性脑损伤tbi - Google Patents

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CN116964455A CN202180081238.XA CN202180081238A CN116964455A CN 116964455 A CN116964455 A CN 116964455A CN 202180081238 A CN202180081238 A CN 202180081238A CN 116964455 A CN116964455 A CN 116964455A
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B·麦奎斯顿
S·德特维勒
R·钱德拉
J·马力诺
H·张
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Abstract

本文公开了通过检测取自受试者(诸如人类受试者)的样品中至少一种生物标志物诸如泛素羧基末端水解酶L1(UCH‑L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合的水平来帮助确定受试者是否患有创伤性脑损伤(TBI)的方法，其中所述受试者已经接受了头部CT扫描，其对TBI呈阴性。

Description

用一或多种生物标志物确定已受头部计算机断层扫描且对 TBI呈阴性受试者的创伤性脑损伤TBI
相关申请信息
本申请要求于2020年12月1日提交的美国临时申请号63/120,062和于2021年4月5日提交的美国临时申请号63/170,873的优先权，这些申请中的每一个的内容均以引用的方式并入本文。
以引用的方式并入电子提交材料
与此同时提交并且识别为如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以引用的方式整体并入本文：一个6,664个字节的ASCII(文本)文档，名称为“39073-601-SQL_ST25.txt”，创建于2021年11月30日。
技术领域
本公开涉及帮助诊断和评估已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受头部损伤诸如创伤性脑损伤(TBI)的受试者的方法。所述方法涉及：检测在受试者已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受头部损伤之后的24小时内的一个或多个时间点取自受试者的一个或多个样品中至少一种生物标志物(诸如泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合)的水平，其中受试者还在同时、之前或之后(在临床相关的时间范围内)接受了头部计算机断层(CT)扫描；以及如果样品中一种或多种生物标志物的水平高于参考水平，则将受试者诊断为较有可能患有TBI。
背景技术
仅在美国，每年发生超过500万的轻度创伤性脑损伤(TBI)。当前，没有简单、客观、准确的测量可用于帮助患者评估。实际上，许多TBI评估和诊断都基于主观数据。不幸的是，诸如头颅CT和格拉斯哥昏迷评分(GCS)的客观测量在评估轻度TBI时并不十分全面或敏感。此外，对于轻度TBI，头部CT绝大部分时间都无法显示，价格昂贵，并且使患者暴露于不必要的辐射之下。另外，阴性头部CT也并不意味着该患者已免于脑震荡；相反，它仅意味着某些干预措施(例如手术)是没有必要的。临床医生和患者需要客观、可靠的信息来准确评估这种情况，以促进适当的分类和恢复。迄今为止，仅有有限的数据可用于使用UCH-L1和GFAP来在急症护理环境中帮助患者评估和管理。
轻度TBI或脑震荡更难客观地检测，并且这对全球急救中心来说是一项日常挑战。脑震荡通常不会导致大体病理，诸如出血，并且在对脑的常规计算机断层扫描中不会出现异常，但是会出现在几天到几周内以自发方式消退的快速发作的神经元功能障碍。大约15％的轻度TBI患者患有持续的认知功能障碍。在现场、急诊室和诊所、运动区和军事活动(例如，战斗)中，轻度TBI受害者的需求未得到满足。
目前用于评估脑损伤的严重程度的算法包括格拉斯哥昏迷量表评分和其他措施。这些措施有时可能足以关联急性严重程度，但对可能导致持续性缺陷的细微病理不够敏感。GCS和其他措施也无法区分伤害类型，并且可能不够充分。因此，进入临床试验被分组到单个GCS水平的患者可能具有严重程度和类型非常不同的损伤。因为结局也因此发生变化，所以不恰当的分类会破坏临床试验的完整性。损伤分类改进将能够在临床试验中更精确地描述TBI患者的疾病严重程度和类型。
此外，目前的脑损伤试验依赖于结局测量，诸如扩展的格拉斯哥结局量表，它捕捉了全局现象，但未能评估结局的细微差异。因此，连续30次脑损伤治疗试验都失败了。需要敏感的结局测量来确定患者从脑损伤恢复的情况，以便测试治疗和预防措施。
发明内容
在一个方面，本公开涉及用于帮助诊断和评估已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受头部损伤的受试者(诸如人类受试者)的方法的改进。这种改进的方法包括同时或依次进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描，其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述头部CT扫描对TBI呈阴性，则所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
在另一方面，参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
在另一方面，上述改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则监测受试者的TBI。在另一方面，改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI。在又一方面，改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI，然后监测所述受试者。
在上述改进的方法的又一方面，可在实际或怀疑对头部的损伤之后的约0至约12小时内取得样品。例如，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约5分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约10分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约12分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的15分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约20分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的30分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的60分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的1.5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的2小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的3小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的4小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的6小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的7小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的8小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的9小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的10小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的11小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的12小时内取得样品。
在一个实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有轻度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有中度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有重度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有中度至重度TBI。在又一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为未患有TBI。
上述改进的方法还可以包括用针对TBI的治疗(例如，手术治疗、治疗性治疗或其组合)来治疗被评定或评估为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如人类受试者)。可以使用本领域已知的和本文进一步描述的任何此类治疗。此外，在另一实施方式中，还可以任选地在任何治疗过程期间和之后监测接受TBI治疗的任何受试者。可替换地，所述方法可以还包括监测评定为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如那些可能尚未接受任何治疗的受试者)。
在上述改进的方法中，样品可以选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。血液样品可包括全血样品、血清样品或血浆样品。在一些实施方式中，样品为全血样品。在一些实施方式中，样品为血浆样品。在又其他实施方式中，样品为血清样品。在又其他实施方式中，样品为唾液样品。在又其他实施方式中，样品为口咽标本。在又其他实施方式中，样品为鼻咽标本。这样的样品可以通过多种方式获得。例如，在受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。可替换地，可以在受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或化学品和毒素的组合之后获得样品。化学品或毒素的示例是霉菌、石棉、杀虫剂(pestiside)、杀昆虫剂(insecticide)、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。更进一步地，样品可以获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
上文改进的方法可以对任何受试者(诸如人类受试者)进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或中度至重度TBI的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP和或UCH-L1和GFAP；以及受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
在上述改进的方法中，测定是免疫测定。在一些实施方式中，测定是定点照护测定。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是口咽标本或鼻咽标本。
在另一方面，本公开涉及一种用于帮助诊断和评估已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受头部损伤的受试者(诸如人类受试者)的方法。所述方法包括：
a.同时或依次进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描；以及
b.如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述头部CT扫描对TBI呈阴性，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
在另一方面，参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
在另一方面，上述方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则监测受试者的TBI。在另一方面，所述方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI。在又一方面，所述方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI，然后监测所述受试者。
在上述方法的又一方面，可在实际或怀疑对头部的损伤之后的约0至约12小时内取得样品。例如，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约5分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约10分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约12分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的15分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约20分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的30分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的60分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的1.5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的2小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的3小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的4小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的6小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的7小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的8小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的9小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的10小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的11小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的12小时内取得样品。
在一个实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为患有TBI。在另一实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为患有轻度TBI。在另一实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为患有中度TBI。在另一实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为患有重度TBI。在另一实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为患有中度至重度TBI。在又一实施方式中，使用上述方法，受试者被评定或评估为未患有TBI。
上述方法还可以包括用针对TBI的治疗(例如，手术治疗、治疗性治疗或其组合)来治疗被评定或评估为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如人类受试者)。可以使用本领域已知的和本文进一步描述的任何此类治疗。此外，在另一实施方式中，还可以任选地在任何治疗过程期间和之后监测针对TBI接受治疗的任何受试者。可替换地，所述方法可以还包括监测评定为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如那些可能尚未接受任何治疗的受试者)。
在上述方法中，样品可以选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。在一些实施方式中，样品为全血样品。血液样品可以是全血样品、血清样品或血浆样品。在一些实施方式中，样品为血浆样品。在又其他实施方式中，样品为血清样品。在又其他实施方式中，样品为唾液样品。在又其他实施方式中，样品为口咽标本。在又其他实施方式中，样品为鼻咽标本。这样的样品可以通过多种方式获得。例如，在受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。可替换地，可以在受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或化学品和毒素的组合之后获得样品。化学品或毒素的示例是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。更进一步地，样品可以获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
上文方法可以对任何受试者(诸如人类受试者)进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或中度至重度TBI的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP和或UCH-L1和GFAP；以及受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
在上述方法中，测定是免疫测定。在一些实施方式中，测定是定点照护测定。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是口咽标本或鼻咽标本。
在又另一方面，本公开涉及用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受对头部的损伤的受试者(诸如人类受试者)的方法的改进。所述改进包括对在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内获自所述受试者的样品进行测定，以测量或检测所述样品中生物标志物的水平，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；并且其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平，并且在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描对TBI呈阴性或者没有对所述受试者进行头部CT扫描，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
在另一方面，参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
在另一方面，上述改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且任选地，如果进行的话，头部CT扫描对TBI呈阴性，则监测受试者的TBI。在另一方面，改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且任选地，如果进行的话，如果头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI。在又一方面，改进的方法还包括如果生物标志物的水平高于参考水平并且任选地，如果进行的话，如果头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗受试者的TBI，然后监测所述受试者。
在上述改进的方法的又一方面，可在实际或怀疑对头部的损伤之后约0至约12小时内取得样品。例如，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约5分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约10分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约12分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的15分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的约20分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的30分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的60分钟内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的1.5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的2小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的3小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的4小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的5小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的6小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的7小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的8小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的9小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的10小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的11小时内取得样品。可替换地，可以在实际或怀疑对头部的损伤之后的12小时内取得样品。
在一个实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有轻度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有中度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有重度TBI。在另一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为患有中度至重度TBI。在又一实施方式中，使用上述改进的方法，受试者被评定或评估为未患有TBI。
上述改进的方法还可以包括用针对TBI的治疗(例如，手术治疗、治疗性治疗或其组合)来治疗被评定或评估为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如人类受试者)。可以使用本领域已知的和本文进一步描述的任何此类治疗。此外，在另一实施方式中，还可以任选地在任何治疗过程期间和之后监测针对TBI接受治疗的任何受试者。可替换地，所述方法可以还包括监测评定为患有轻度、中度、重度或中度至重度TBI的受试者(诸如那些可能尚未接受任何治疗的受试者)。
在上述改进的方法中，样品可以选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。血液样品可以是全血样品、血清样品或血浆样品。在一些实施方式中，样品为全血样品。在一些实施方式中，样品为血浆样品。在又其他实施方式中，样品为血清样品。在又其他实施方式中，样品为唾液样品。在又其他实施方式中，样品为口咽标本。在又其他实施方式中，样品为鼻咽标本。这样的样品可以通过多种方式获得。例如，在受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。可替换地，可以在受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或化学品和毒素的组合之后获得样品。化学品或毒素的示例是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。更进一步地，样品可以获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
上文改进的方法可以对任何受试者(诸如人类受试者)进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或中度至重度TBI的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP和或UCH-L1和GFAP；以及受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
在上述改进的方法中，测定是免疫测定。在一些实施方式中，测定是定点照护测定。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定，并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是全血。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定，并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是血清。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定，并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是血浆。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定，并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是唾液。在又其他实施方式中，测定是免疫测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是定点照护测定，受试者是人并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是临床化学测定，并且样品是口咽标本或鼻咽标本。在又其他实施方式中，测定是单分子检测测定，并且样品是口咽标本或鼻咽标本。
附图说明
图1A-图1D显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与格拉斯哥昏迷评分(GCS)严重程度(即，GCS轻度对中度/重度)相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起12小时内(图1A、1C)或自损伤起24.1小时内(图1B、1D)评定样品。GFAP水平示出于图1A和图1B中。UCH-L1水平示出于图1C和图1D中。
图2A-图2F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与损伤之后的意识丧失(即，存在相对于不存在)相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图2A、2D)、12小时内(图2B、2E)或24.1小时内(图2C、2F)评定样品。GFAP水平示出于图2A-图2C中。UCH-L1水平示出于图2D-图2F中。
图3A-图3F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与MRI结果(即，阳性相对于阴性)相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图3A、3D)、12小时内(图3B、3E)或24.1小时内(图3C、3F)评定样品。GFAP水平示出于图3A-图3C中。UCH-L1水平示出于图3D-图3F中。
图4A-图4F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与创伤后健忘症(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图4A、4D)、12小时内(图4B、4E)或24.1小时内(图4C、4F)评定样品。GFAP水平示出于图4A-图4C中。UCH-L1水平示出于图4D-图4F中。
具体实施方式
本公开涉及用于帮助诊断和评估已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受对头部的损伤诸如创伤性脑损伤(例如像轻度、中度、重度或中度至重度TBI)的受试者(诸如人类受试者)的改进的方法，其使用生物标志物诸如泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合来进行，此时受试者已经任选地在临床相关时间范围内接受至少一次头部计算机断层术(CT)扫描，其对TBI呈阴性。
本文所述的方法涉及检测在实际或怀疑对头部的损伤的约24小时内的时间点取自受试者(诸如人类受试者)的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物水平。任选地，如果进行的话，可以在检测取自受试者的一个或多个样品中的一种或多种生物标志物水平的同时、之前或之后以任何次序同时或依序进行头部CT扫描。当受试者已经任选地接受了头部CT扫描，且其对TBI呈阴性时，检测一种或多种生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)的水平(其高于参考水平)有助于准确将所述受试者(诸如人类受试者)评估或诊断为较有可能患有TBI。换句话说，在一些方面，本文所述的改进的方法允许鉴定已经患有TBI但可能以其他方式被错误诊断为未患有TBI的受试者，如果这种诊断仅基于一次或多次头部CT扫描的结果。
如本部分和本文的整个公开中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不意图是限制性的。
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的并且不旨在是限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”以及其变化形式旨在不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或字词。除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方式或要素”、“由本文所呈现的实施方式或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方式或要素组成”的其它实施方式，无论是否明确地阐述。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于范围6-9，除6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
“亲和力成熟抗体”在本文中用于指在一个或多个CDR中具有一个或多个变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有所述变化的亲本抗体相比对于靶抗原的亲和力(即KD、kd或ka)提高。示例性亲和力成熟抗体将对于靶抗原具有纳摩尔浓度或甚至皮摩尔浓度的亲和力。用于产生亲和力成熟抗体的多种程序在本领域中是已知的，包括对使用生物展示制备的组合抗体库的筛选。例如，Marks等人，BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置由活性增强氨基酸残基进行的选择性突变描述于美国专利号6,914,128B1。
如本文所用，“模拟测定”是指其中测试样品中分析物的存在和/或浓度是通过测量整个反应混合物(例如，单个反应容器)中的分析物所产生的总信号(例如，荧光、颜色等)来确定的测定。在模拟测定中，噪声与信号无法区分。模拟测定的示例为这样一种测定，其中分析物的存在和/或浓度是通过测量从包含在单个反应容器中的多个珠粒或微粒产生的总信号来确定的。
如本文所用的“一种抗体”和“多种抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的)、动物抗体诸如但不限于鸟(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物(包括非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如猴子、黑猩猩等))、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(“sdFv”)和抗独特型(“抗Id”)抗体、双结构域抗体、双可变结构域(DVD)或三可变结构域(TVD)抗体(双可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu,C等人，NatureBiotechnology,25(11):1290-1297(2007)和PCT国际申请WO 2001/058956，每个文献的内容以引用的方式并入本文)以及以上任一个的功能活性表位结合片段。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、分类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类。为简单起见，针对分析物的抗体在本文中经常被称为“抗分析物抗体”或仅仅是“分析物抗体”(例如，抗UCH-L1抗体或UCH-L1抗体)。
如本文所用的“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽、以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“曲线下面积”或“AUC”是指ROC曲线下面积。ROC曲线下AUC是准确性的量度。AUC为1代表完美测试，而AUC为0.5代表无意义测试。优选的AUC可以是至少大约0.700、至少大约0.750、至少大约0.800、至少大约0.850、至少大约0.900、至少大约0.910、至少大约0.920，至少大约0.930、至少大约0.940、至少大约0.950、至少大约0.960、至少大约0.970、至少大约0.980、至少大约0.990或至少大约0.995。
“珠粒”和“颗粒”在本文中可互换使用，并且是指基本上球形的固体支持物。珠粒或颗粒的一个实例是微粒。可用于本文的微粒可以是本领域中已知的任何类型。例如，珠粒或颗粒可以是磁珠或磁性颗粒。磁性珠粒/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性铁磁材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO以及NiO/Fe。亚铁磁性材料的示例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(或FeO.Fe2O3)。珠粒可以具有磁性的实心核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。可替换地，磁性部分可以是围绕非磁性核心的层。微粒可具有在本文所述方法中起作用的任何尺寸，例如约0.75至约5nm、或约1至约5nm、或约1至约3nm。
“结合蛋白”在本文中用于指与结合配偶体结合并与其形成复合物的单体或多聚体蛋白质，例如像多肽、抗原、化学化合物或其他分子、或任何种类的底物。结合蛋白特异性结合结合配偶体。结合蛋白包括抗体，以及其抗原结合片段和其本领域中已知的和下文所述的其它各种形式和衍生物，以及包含一个或多个结合抗原分子或抗原分子上的特定位点(表位)的抗原结合结构域的其它分子。因此，结合蛋白包括但不限于抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体、和任何此类抗体的保留结合抗原的能力的片段。
“双特异性抗体”在本文中用于指通过以下技术产生的全长抗体：四源杂交瘤技术(参见Milstein等人，Nature,305(5934):537-540(1983))；通过两个不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz等人，Nature,314(6012):628-631(1985))；或通过在Fc区中引入突变的钮-入-孔法或类似方法(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(14):6444-6448(1993))，所述方法产生多种不同免疫球蛋白物质，其中仅一者是功能性双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂的一者(一对HC/LC)上结合一种抗原(或表位)，且其第二臂(另一对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。根据这个定义，双特异性抗体具有两个不同抗原结合臂(在特异性和CDR序列两方面)，并且对于其结合的各抗原而言是单价的。
“CDR”在本文中用于指抗体可变结构序列内的“互补决定区”。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR。对于每个可变区，从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。如本文所用的术语“CDR组”是指存在于单一可变区中的结合抗原的一组三个CDR。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，其包含来自重链和轻链可变区中的每一个的CDR组。包含单个CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽可以称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。总体上，CDR残基直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
这些CDR的精确边界已根据不同系统加以不同界定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991))所述的系统不仅提供可适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且也提供界定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可称为“KabatCDR”。Chothia和同事(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列的层面上具有巨大多样性，但Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为“L1”、“L2”和“L3”或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可称为“Chothia CDR”，其具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan,FASEB J.,9:133-139(1995)和MacCallum,J.Mol.Biol,262(5):732-745(1996)描述。其它CDR边界定义可能不严格遵循本文中系统之一，但将仍然与Kabat CDR重叠，但鉴于特定残基或残基群组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现而可将它们缩短或延长。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任一个定义的CDR，但某些实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR。
“临床相关的时间范围”是指这样一个时间范围(例如，秒、分钟或小时)，在此期间，细心和审慎的执业医生(例如，医生、护士、护理人员或其他人)会合理地考虑与成像程序(诸如头部CT扫描)有关或者依据监督实体(例如，标准制定主体，诸如世界卫生组织(WHO)、医师审查委员会、监管批准机构诸如FDA、EMEA或其他机构等)所确立的指南的一个或多个生物标志物测试的结果。
“组分”，“多个组分”或“至少一种组分”通常指可以包括在用于根据本文所述的方法和本领域中已知的其他方法测定测试样品(诸如患者尿液、全血、血清或血浆样品)的试剂盒中的捕获抗体、检测物或缀合物、校准物、对照、敏感性组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、终止液等。一些组分可以在溶液中或被冻干以进行重构用于在测定中使用。
如本文所用，“与...相关”是指与...相比。
如本文所用的“CT扫描”是指计算机断层(CT)扫描。CT扫描组合了从不同角度拍摄的一系列X射线图像，并且使用计算机处理来创建您体内骨骼、血管和软组织的横截面图像或切片。CT扫描可以使用X射线CT、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、计算机轴向断层扫描(CAT扫描)或计算机辅助断层扫描。CT扫描可以是常规CT扫描或螺旋式/螺旋型CT扫描。在常规的CT扫描中，逐个切片地进行扫描，并且在每个切片之后扫描停止并向下移动到下一个切片，例如，从腹部的顶部向下移动到骨盆。常规的CT扫描要求患者屏住呼吸以避免运动伪影。螺旋式/螺旋型CT扫描是连续扫描，其以螺旋方式拍摄，并且是其中扫描图像是连续的更快过程。
当从已经遭受、可能已经或怀疑遭受对头部的损伤的受试者拍摄的图像中没有观察到颅内病变时，头部CT扫描对TBI呈“阴性”。为了进一步澄清，当未发现或鉴定出病变时，受试者的头部CT扫描对TBI呈“阴性”；然而，在一些方面，即使头部CT为阴性，受试者仍可能出现症状(例如，TBI的症状)。鉴于并非所有损伤或病变都可以通过头部CT可视化，大多数受试者在头部CT上将对TBI呈阴性。因此，本文所述的方法和测定法可用于提供对可能仍患有TBI的头部CT阴性的受试者的评定或确定。
“通过测定确定”在本文中用于指通过任何合适的测定确定参考水平。在一些实施方式中，参考水平的确定可以通过与待应用于受试者样品的测定相同类型的测定来实现(例如，通过免疫测定、临床化学测定、单分子检测测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、化学分析、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析、或蛋白质免疫染色、电泳分析、蛋白质测定、竞争性结合测定、功能性蛋白质测定或色谱法或光谱法，诸如高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱-质谱法(LC/MS))。在一些实施方式中，参考水平的确定可以通过与待应用于受试者样品的测定相同类型和相同测定条件下的测定来实现。如本文所指出的，本公开提供示例性参考水平(例如通过比较不同时间点的参考水平来计算)。基于本公开提供的描述，将本文的公开适合于其他测定法来获得那些其他测定法的测定特异性参考水平完全在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，一组训练样品，其包括从已知已经遭受对头部的损伤的人类受试者获得的样品(并且更具体地，从已知已经遭受(i)轻度TBI和/或(ii)中度、重度或中度至重度TBI的人类受试者获得的样品)和从已知尚未遭受对头部的损伤的人类受试者获得的样品，可以用于获得测定特异性参考水平。应当理解，“通过测定确定”并且具有所列举的“敏感性”和/或“特异性”水平的参考水平在本文用于指这样的参考水平，当在本发明的方法中采用所述参考水平时，其被确定为提供所述的敏感性和/或特异性的方法。确定与本发明方法中的给定参考水平相关联的敏感性和特异性完全在本领域技术人员的普通技术范围内，例如通过使用多个不同的可能参考水平对测定数据进行重复统计分析。
实际上，当区分受试者患有创伤性脑损伤或未患有创伤性脑损伤或受试者患有轻度相对于中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤时，技术人员将权衡提高截止值对敏感性和特异性的影响。提高或降低截止值将对敏感性和特异性以及其他标准统计量度产生明确且可预测的影响。众所周知，提高截止值将提高特异性，但可能降低敏感性(测试呈阳性的疾病患者的比例)。相比之下，降低截止值将提高敏感性，但将降低特异性(测试呈阴性的未患病者的比例)。检测创伤性脑损伤或确定轻度对中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤的结果对于本领域技术人员而言将是显而易见的。在区分受试者是否患有创伤性脑损伤或轻度对中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤时，截止值越高，特异性随着更多的真阴性而提高(即，将未患有创伤性脑损伤、未患有轻度创伤性脑损伤、未患有中度创伤性脑损伤、未患有重度创伤性脑损伤或未患有中度至重度创伤性脑损伤的受试者与患有创伤性脑损伤、轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤的受试者区分开)。但与此同时，提高截止值会减少总体上被鉴定为阳性的案例的数量，以及真阳性的数量，因此敏感性必须降低。相反，截止值越低，敏感性随着更多的真阳性而提高(即，将患有创伤性脑损伤、患有轻度创伤性脑损伤、患有中度创伤性脑损伤、患有重度创伤性脑损伤或患有中度至重度创伤性脑损伤的受试者与未患有创伤性脑损伤、轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤的受试者区分开)。但与此同时，降低截止值会增加总体上被鉴定为阳性的案例的数量，以及假阳性的数量，因此特异性必须降低。
通常，高敏感性值有助于技术人员排除疾病或病状(诸如创伤性脑损伤、轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤或中度至重度创伤性脑损伤)，并且高特异性值有助于技术人员纳入疾病或病状。技术人员希望排除还是纳入疾病取决于每种错误类型的患者的后果。因此，在不完全公开有关如何选择值的基础信息的情况下，无法知道或预测用于推导测试截止值的精确平衡。敏感性与特异性和其他因素的平衡将视具体情况而定。这就是为什么有时提供替代截止值(例如，参考值)以便医师或从业者可以选择的原因。
如本文所用的抗体的“衍生物”可以是指与真正或亲本抗体相比具有对其氨基酸序列的一个或多个修饰的抗体并且表现出修饰的结构域结构。衍生物仍然可以能够采用天然抗体中发现的典型结构域配置，以及能够特异性结合靶标(抗原)的氨基酸序列。抗体衍生物的典型实例是与其它多肽偶联的抗体、重排的抗体结构域、或抗体片段。衍生物还可以包含至少一种其他化合物，例如，蛋白质结构域，所述蛋白质结构域通过共价或非共价键连接。根据本领域中已知的方法，连接可以基于遗传融合。存在于包含抗体的融合蛋白中的另外的结构域可优选地通过柔性接头、有利地是肽接头连接，其中所述肽接头包含多个亲水的肽键合的氨基酸，其长度足以跨越另外的蛋白质结构域的C末端与抗体的N末端之间的距离，反之亦然。抗体可以与效应分子连接，所述效应分子具有适于生物活性或选择性结合例如固体支持物、生物活性物质(例如细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物的构象。
如本文所用，“数字测定”是指其中捕获分析物并且分离和询问分析物分子(例如，以检测样品中分析物的存在和/或浓度)的测定。在数字测定中，噪声与信号分开。在数字测定中，结果被赋值为1或0。数字测定的示例包括以下中的一种或多种(其可能重叠但不相互排斥)：单分子检测测定、纳米孔测定、单分子酶联免疫吸附测定、直接捕获计数测定等。
“滥用药物”在本文中用于指代出于非医疗原因(例如娱乐和/或致幻的效果)服用的一种或多种添加剂物质(例如药物)。过度沉溺、使用或依赖此类滥用药物通常被称为“药物滥用”。滥用药物的示例包括酒精、巴比妥酸盐、苯二氮卓类、大麻、可卡因、致幻剂(诸如氯胺酮、墨斯卡灵(拍约他)、PCP、裸盖菇素、DMT和/或LSD)、甲喹酮、阿片类药物、安非他命(包括甲基苯丙胺)、合成代谢类固醇、吸入剂(即含有具有精神活性的挥发性物质的物质，例如亚硝酸盐、喷雾漆、清洁液、记号笔、胶水等)及其组合。
“双重特异性抗体”在本文中用于指可在其两个结合臂(一对HC/LC)的每一个中结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有两个具备相同特异性和相同CDR序列的相同抗原结合臂，且对于其结合的每种抗原而言是二价的。
“双可变结构域”在本文中用于指结合蛋白上的两个或更多个结合位点，所述结合蛋白可以为二价的(两个抗原结合位点)、四价的(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。DVD可以为单特异性的，即能够结合一种抗原(或一个特异性表位)、或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原(即相同抗原分子的两个或更多个表位或不同靶抗原的两个或更多个表位)。优选的DVD结合蛋白包含两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽并且被称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。这样的DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体的并且类似于IgG分子，但提供比IgG分子更多的抗原结合位点。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半都类似于IgG分子的一半，并且包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但与IgG分子的提供单抗原结合结构域的一对重链和轻链不同，DVD-Ig的一对重链和轻链提供两个或更多个抗原结合位点。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可以源自供体(“亲本”)单克隆抗体，因此包含具有每个抗原结合位点均参与抗原结合的总共六个CDR的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。因此，结合两个不同表位的DVD-Ig结合蛋白(即，两个不同抗原分子的两个不同表位或相同抗原分子的两个不同表位)包含源自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点和第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
在PCT公开号WO 2007/024715、美国专利号7,612,181和Wu等人，NatureBiotech.,25:1290-1297(2007)中提供了对DVD-Ig结合分子的设计、表达和表征的描述。此类DVD-Ig分子的优选实例包含含有结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头(前提条件是它不是CH1，X2是Fc区)，且n是0或1，但优选1；和含有VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头(前提条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区)；且n是0或1，但优选1。这种DVD-Ig可以包含两条这样的重链和两条这样的轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，而在可变区之间没有干预的恒定区，其中重链和轻链缔合形成串联功能性抗原结合位点，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链缔合形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，DVD-Ig分子可以包含这样的重链和轻链，每个所述重链和轻链包含串联连接的三个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，而在可变结构域之间没有干预的恒定区，其中一对重链和轻链可以缔合形成三个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链缔合形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。
在一个优选的实施方式中，DVD-Ig结合蛋白不仅结合与其亲本单克隆抗体结合的相同靶分子，而且具有一种或多种其亲本单克隆抗体中的一种或多种的所需特性。优选地，这样的附加特性是一种或多种亲本单克隆抗体的抗体参数。可能对来自一种或多种亲本单克隆抗体的DVD-Ig结合蛋白有贡献的抗体参数包括但不限于抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白质稳定性、蛋白质溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直系同源抗原结合。
DVD-Ig结合蛋白结合UCH-L1的至少一个表位。DVD-Ig结合蛋白的非限制性示例包括结合UCH-L1的一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白、结合人UCH-L1的表位和另一物种(例如，小鼠)的UCH-L1表位的DVD-Ig结合蛋白以及结合人UCH-L1的表位和另一靶分子的表位的DVD-Ig结合蛋白。
如本文所用的“动态范围”是指测定读数与被分析样品中的靶分子或分析物的量成比例的范围。
“表位”或“多个表位”或“目标表位”是指任何分子上被识别并且可以结合其特异性结合配偶体上的互补位点的位点。分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是在多肽、蛋白质、半抗原、糖类抗原(诸如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖。其特异性结合配偶体可以是但不限于抗体。
如本文所用，“片段抗原结合片段”或“Fab片段”是指结合抗原并且包含一个抗原结合位点、一条完整的轻链和一条重链的一部分的抗体片段。Fab是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。Fab由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。可变结构域在单体的氨基末端包含互补位(抗原结合位点)，其包含一组互补决定区。Y的每个臂因此结合抗原上的表位。可以生成Fab片段，诸如本领域中描述的那样，例如使用木瓜蛋白酶，其可以用于将免疫球蛋白单体切割成两个Fab片段和Fc片段，或者可以通过重组方式产生。
如本文所用的“F(ab')2片段”是指通过胃蛋白酶消化整个IgG抗体以去除大部分Fc区，同时保留铰链区的一些完整所生成的抗体。F(ab')2片段具有两个抗原结合F(ab)部分，它们通过二硫键连接在一起，并且因此是二价的，分子量为约110kDa。二价抗体片段(F(ab')2片段)比完整的IgG分子小，并且能够更好地渗透到组织中，因此在免疫组织化学中促进更好的抗原识别。F(ab')2片段的使用还避免了与活细胞上的Fc受体或蛋白A/G的非特异性结合。F(ab')2片段可以结合和沉淀抗原。
如本文所用的“框架”(FR)或“框架序列”可以意指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的精确界定可通过不同系统(例如参见上文)来确定，所以框架序列的含义易受相应不同解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区分成各链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，并且CDR3位于FR3与FR4之间。在不将特定子区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其它所提及的框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR表示四个子区域中的一个，并且FR表示构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。
人重链和轻链FR序列在本领域是已知的，其可被用作重链和轻链“接受者”框架序列(或者简单的说是“接受者”序列)以通过使用本领域中已知的技术来人源化非人抗体。在一个实施方式中，人重链和轻链接受者序列选自在公众可获得的数据库诸如V-base(hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或国际信息系统(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中列出的框架序列。
如本文所用的“功能性抗原结合位点”可以意指结合蛋白(例如抗体)上能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可以不如与抗原结合位点所源自的亲本结合蛋白，例如亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评价蛋白质，例如抗体与抗原结合的多种方法中的任一者测量。此外，本文中的多价蛋白质，例如多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力无需在数量上相同。
“GFAP”在本文中用于描述神经胶质原纤维酸性蛋白。GFAP是由人中的GFAP基因编码的蛋白质，并且它可被生产(例如通过重组方式，在其他物种中)。
“GFAP状态”可以表示在某个时间点的GFAP水平或量(例如使用单一的GFAP度量)，与监测相关的GFAP水平或量(例如通过对受试者的重复测试确定GFAP量的增加或减少)，与创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)的治疗相关的GFAP的水平或量，或其组合。
如本文所用，“格拉斯哥昏迷量表”或“GCS”是指一种15分制量表(例如，1974年Graham Teasdale和Bryan Jennett,Lancet 1974；2:81-4中描述)，其提供用于评定患有脑损伤的患者的意识水平损伤的实用方法。该测试使用以下值测量最佳运动反应、言语反应和睁眼反应：I.最佳运动反应(6-完全服从命令-服从两部分要求；5-针对头颈部的刺激将手放到锁骨上方；4-迅速弯曲手臂于肘部，但特征不主要异常；3-弯曲手臂于肘部，特征明显主要异常；2-伸展手臂于肘部；1-手臂/腿部没有运动，没有干扰因素；NT-瘫痪或其他限制性因素)；II.言语反应(5-正确说出姓名、地点和日期；4-没有取向，但交流连贯；3-可理解的单字；2-只有呻吟/叹息；1-无可听见的反应，无干扰因素；NT-有干扰交流的因素)；以及III.睁眼(4-刺激前睁眼；3-说话或喊话要求后；2-指尖刺激后；1-任何时候都不睁眼，无干扰因素；NT-因局部因素而闭眼)。通过添加I+II+III的值来确定最终评分。如果GCS评分为13-15，则认为受试者患有轻度TBI。如果GCS评分为9-12，则认为受试者患有中度TBI。如果GCS评分为8或更低，通常为3-8，则认为受试者患有重度TBI。如本文所用，“格拉斯哥结局量表”是指用于功能性结局的全球量表，其将患者状态评定为以下五个类别之一：死亡、植物人状态、重度失能、中度失能或恢复良好。本文中可互换使用的“扩展的格拉斯哥结局量表”或“GOSE”通过将重度失能、中度失能和良好恢复的类别细分为低级类别和高级类别来提供更详细的八种分类，如表1中所示。
表1
术语“人源化抗体”在本文中用于描述包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列但其中VH和/或VL序列中的至少一部分已变得更“类人”，即与人生殖系可变序列更相似的抗体。“人源化抗体”为抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其免疫特异性地结合目标抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用，在CDR的背景下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方式中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体CDR或共有框架进行诱变以使该位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的实施方式中，此类突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地出现，那么共有序列中可包括任一者。
如本文在两种或更多种多肽或多核苷酸序列的背景下所使用的“相同的”或“同一性”可意指序列在指定区域上具有指定百分比的相同残基。可通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区域仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。
如本文中可互换使用的“对头部的损伤”或“头部损伤”是指对头皮、颅骨或大脑的任何创伤。此类损伤可能包括颅骨上的仅轻微的撞击或可能是严重的脑损伤。此类损伤包括大脑的原发性损伤和/或大脑的继发性损伤。原发性脑损伤发生在最初的侵害期间，并且由大脑的物理结构的移位引起。更具体地，原发性脑损伤是在创伤事件期间发生的对实质(组织、血管)的物理损伤，导致对周围脑组织的剪切和压迫。继发性脑损伤发生在原发性损伤之后，并且可能涉及一系列细胞过程。更具体地，继发性脑损伤是指在原发性脑损伤后的一段时间(从数小时到数天)内发展出的变化。它包括促成进一步破坏脑组织的大脑中细胞、化学、组织或血管变化的整个级联。
对头部的损伤可以是闭合性的或开放性的(穿透性的)。闭合性头部损伤是指其中颅骨没有被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。开放性头部损伤是指其中颅骨被撞击物体穿透的头皮、颅骨或大脑的创伤。头部损伤可以是由人的身体摇动、由导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械或其他力(例如，诸如汽车、飞机、火车等情况下的交通事故；诸如用棒球棒或来自枪械的头部猛击)产生的钝性冲击、脑血管意外(例如中风)、一次或多次跌倒(例如，如运动或其他活动)、爆炸或冲击波(统称为“冲击波伤”)以及由其他类型的钝力创伤引起的。可替换地，对头部的损伤可能由摄入和/或暴露于火、化学品、毒素或化学品和毒素的组合引起。此类化学品和/或毒素的示例包括霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。可替换地，对头部的损伤可能是由于受试者患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合。在一些情况下，无法确定是否发生过任何此类事件或损伤。例如，患者或受试者可能没有病史，受试者可能无法说话，受试者可能意识到他们所暴露于的事件等。此类情况在本文中描述为受试者“可能已遭受头部损伤”。在本文的某些实施方式中，闭合性头部损伤不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用，“颅内病变”是指脑内的损伤区域。颅内病变可以是在CT扫描或脑成像测试(诸如磁共振成像(MRI))中看到的异常。在CT或MRI扫描中，脑部病变可能表现为看起来不像正常脑组织的暗点或亮点。
如本文所用的“分离的多核苷酸”可以意指多核苷酸(例如基因组、cDNA或合成来源或其组合的多核苷酸)，根据其来源，所述多核苷酸不与“分离的聚核苷酸”见于自然界中所处的多核苷酸的全部或一部分缔合；可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸；或不作为较大序列的一部分存在于自然界中。
如本文所用的“标记”和“可检测标记”是指附接至抗体或分析物以使抗体与分析物之间的反应可检测的部分，并且如此标记的抗体或分析物被称为“可检测地标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器手段检测到的信号。各种标记包括产生信号的物质，诸如发色团、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。标记的代表性实例包括产生光的部分例如吖啶鎓化合物，以及产生荧光的部分例如荧光素。本文描述了其它标记。在这方面，所述部分本身可以是不可检测的，但在与另一部分反应时可以变得可检测。使用术语“可检测地标记的”旨在涵盖这种标记。
可使用如在本领域中已知的任何适合可检测标记。例如，可检测标记可为放射性标记(诸如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm)、酶标记(诸如辣根过氧化酶、碱性过氧化酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(诸如吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光标记(诸如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、若丹明、藻胆蛋白、R-藻红素、量子点(例如硫化锌封盖的硒化镉)、测温标记或免疫聚合酶链反应标记。标记、标记程序和标记检测的绪论见于Polak和Van Noorden,Introduction to Immunocytochemistry,第2版,Springer Verlag,N.Y.(1997)；和Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(1996)(其是由Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon出版的组合手册和目录)中。荧光标记可用于FPIA中(参见例如美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其通过引用整体并入本文)。吖啶化合物可在均质化学发光测定法中用作可检测标记(参见例如Adamczyk等人，Bioorg.Med Ghem.Lett.16:1324-1328(2006)；Adamczyk等人，Bioorg.MedChem.Lett.4:2313-2317(2004)；Adamczyk等人，Biorg.Med Chem.Lett.14:3917-3921(2004)；和Adamczyk等人，Org.Lett.5:3779-3782(2003))。
在一个方面，吖啶化合物是吖啶-9-甲酰胺。用于制备吖啶-9-甲酰胺的方法描述于Mattingly,J.Biolumin.Chemilumin.6:107-114(1991)；Adamczyk等人，J.Org.Chem.63:5636-5639(1998)；Adamczyk等人，Tetrahedron 55:10899-10914(1999)；Adamczyk等人，Org.Lett.1:779-781(1999)；Adamczyk等人，Bioconjugate Chem.11:714-724(2000)；Mattingly等人，Luminescence Biotechnology:Instruments and Applications；Dyke,K.V.编；CRC Press:Boca Raton,77–105(2002)；Adamczyk等人，Org.Lett.5:3779-3782(2003)；以及美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699(其各自通过引用整体并入本文用于其在关于该方面的教导)。
吖啶化合物的另一个实例是吖啶-9-羧酸芳基酯。具有式II的吖啶-9-羧酸芳基酯的一实例是10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶氟磺酸酯(可购自Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)。用于制备吖啶-9-羧酸芳基酯的方法描述于McCapra等人，Photochem.Photobiol.4:1111-21(1965)；Razavi等人，Luminescence 15:245-249(2000)；Razavi等人，Luminescence 15:239-244(2000)；和美国专利号5,241,070(其各自通过引用整体并入本文用于其在关于该方面的教导)中。此类吖啶-9-羧酸芳基酯是针对在由至少一种氧化酶氧化分析物中产生的过氧化氢在信号强度和/或信号迅速度方面均高效的化学发光指示剂。吖啶-9-羧酸芳基酯的化学发光发射过程迅速完成，即，在1秒内完成，而吖啶-9-甲酰胺化学发光发射延续到2秒。然而，吖啶-9-羧酸芳基酯在蛋白质存在下失去其化学发光特性。因此，其使用需要在信号生成和检测期间不存在蛋白质。用于分离或去除样品中蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于超滤、提取、沉淀、透析、色谱法和/或消化(参见例如Wells,High Throughput Bioanalytical Sample Preparation.Methods andAutomation Strategies,Elsevier(2003))。从测试样品中去除或分离的蛋白质的量可以是约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。关于吖啶-9-羧酸芳基酯及其用途的更多细节阐述于2007年4月9日提交的美国专利号11/697,835中。吖啶-9-羧酸芳基酯可以溶解在任何合适的溶剂中，诸如脱气的无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或含水胆酸钠。
“连接序列”或“连接肽序列”是指与一种或多种目标多肽序列(例如全长、片段等)连接的天然或人工多肽序列。术语“连接的”是指连接序列与目标多肽序列的接合。此类多肽序列优选地通过一个或多个肽键接合。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度为约6至约30个氨基酸。可以通过氨基酸取代、添加或缺失来修饰天然连接序列以产生人工连接序列。连接序列可用于许多目的，包括用于重组Fab中。示例性连接序列包括但不限于：(i)组氨酸(His)标签，诸如6X His标签，其具有HHHHHH(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列，可用作连接序列以有利于分离和纯化目标多肽和抗体；(ii)肠激酶裂解位点，如His标签，用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。常常，将肠激酶裂解位点与His标签一起用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。各种肠激酶裂解位点在本领域中是已知的。肠激酶裂解位点的示例包括但不限于DDDDK(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列及其衍生物(例如ADDDDK(SEQ ID NO:5)等)；(iii)杂项序列可用于链接或连接单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其他连接序列的示例可见于Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA85:5879-5883(1988)；和McCafferty等人，Nature 348:552-554(1990)中。还可以修饰连接序列以用于另外的功能，诸如药物的附接或附接于固体支持物。在本公开的上下文中，单克隆抗体例如可以含有连接序列，诸如His标签、肠激酶裂解位点或两者。
在本文中可互换使用的“磁共振成像”或“MRI”是指在放射学中使用的医学成像技术，以形成人体在健康和疾病中的解剖结构和生理过程的图片(例如，在本文可互换地称为“MRI”、“MRI程序”或“MRI扫描”)。MRI是医学成像的一种形式，可测量人体组织的原子核在强磁场中时对高频无线电波的响应，并产生内部器官的图像。基于核磁共振(NMR)科学的MRI扫描仪使用强磁场、无线电波和场梯度来生成人体内部图像。
如本文所用的“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性。
“多价结合蛋白”在本文中用于指包含两个或更多个抗原结合位点(在本文中也称为“抗原结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选地被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指可以结合两个或更多个相关或不相关靶标的结合蛋白，包括能够结合相同靶分子的两个或更多个不同表位的结合蛋白。
如本文可互换使用的“阴性预测值”或“NPV”是指受试者具有阴性结局的概率，假设他们具有阴性测试结果。
如本文所用的“参考水平”是指用于评估诊断、预后或治疗功效的测定截止值，并且在本文中已与各种临床参数(例如疾病的存在、疾病的阶段、疾病的严重程度、疾病的进展、未进展或改善等)链接或关联。如本文所用，“绝对量”是指在不同时间点取得或取样的至少两个测定结果之间的变化或差异的绝对值，并且其与参考水平相似，在本文中已与各种临床参数有联系或相关联(例如，疾病的存在、疾病的阶段、疾病的严重程度、进展、未进展或疾病改善等)。本文使用的“绝对值”是指不考虑其符号的实数大小(例如，两个比较水平(例如在第一时间点采集的水平和在第二时间点采集的水平)之间的差)，即不管它是正还是负。
本公开提供示例性参考水平和绝对量(例如通过比较不同时间点的参考水平来计算)。但是，众所周知，参考水平和绝对量可以根据免疫测定法的性质(例如所用抗体、反应条件、样品纯度等)而变化，并且可以对测定进行比较和标准化。基于本公开提供的描述，将本文的公开适合于其他免疫测定法来获得那些其他免疫测定法的免疫测定特异性参考水平和绝对量也完全在本领域普通技术人员的能力范围内。尽管在测定之间参考水平和绝对量的精确值可能会有所不同，但本文所述的发现应普遍适用，并能够推断到其他测定中。
“定点照护装置”是指用于在定点照护处或附近(即在实验室外)、在患者护理的时间和地方(诸如在医院、医师办公室、紧急或其他医疗护理机构、患者家、养老院和/或长期护理和/或临终关怀设施中)提供医学诊断测试的装置。定点照护装置的示例包括由AbbottLaboratories(Abbott Park，IL)生产的装置(例如i-STAT和i-STAT Alinity，普适的生物传感器(Rowville，Australia)(参见US 2006/0134713)、Axis-Shield PoC AS(Oslo，Norway)和临床实验室产品(Los Angeles，USA)。
如本文可互换使用的“阳性预测值”或“PPV”是指受试者具有阳性结局的概率，假设他们具有阳性测试结果。
在本文所述的免疫测定法和试剂盒的背景下的“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照物和敏感性组。通常使用“校准物”或“标准物”(例如一种或多种，诸如复数种)来建立校正(标准)曲线以内插分析物(诸如抗体或分析物)的浓度。可替换地，可以使用接近参考水平或对照水平(例如“低”、“中等”或“高”水平)的单一校准物。可联合使用多种校准物(即多于一种的校准物或不同量的校准物)以构成“敏感性组”。
“接受者操作特征”曲线或“ROC”曲线是指说明二元分类器系统在其鉴别阈值变化时的性能的图表。例如，ROC曲线可以是诊断测试的不同可能截止点的真阳性率与假阳性率的曲线图。它是通过在各种阈值设定下对阳性中真阳性的分数(TPR＝真阳性率)与阴性中假阳性的分数(FPR＝假阳性率)作图来产生的。TPR也称为敏感性，并且FPR是一减去特异性或真阴性率。ROC曲线展示敏感性与特异性之间的权衡(任何敏感性的增加都将伴随着特异性的降低)；曲线越靠近ROC空间的左侧边界，然后是顶部边界，测试越准确；曲线越接近ROC空间的45度对角线，测试越不准确；截止点处切线的斜率给出了该测试的值的似然比(LR)；并且曲线下面积是测试准确性的量度。
“重组抗体”和“多种重组抗体”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体的全部或部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达抗体。所述术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(全部或部分人源化)、由抗体片段形成的多特性或多价结构、双功能抗体、异型缀合Ab、和本文(i)中描述的其它抗体。(双可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu,C等人，Nature Biotechnology,25:1290-1297(2007)中)。本文中使用的术语“双功能抗体”是指包括具有针对一个抗原位点的特异性的第一臂和具有针对不同抗原位点的特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双重特异性。
如本文所用的对受试者(例如患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险鉴定”或“风险分层”是指评价包括生物标志物的因素，以预测包括疾病发作或疾病进展的未来事件发生的风险，以便可以在更加知情的基础上做出关于受试者的治疗决策。
如本文可互换使用的“样品”、“测试样品”、“标本”、“来自受试者的样品”、“生物样品”和“患者样品”可以是血液(诸如全血(包括例如，毛细血管血、静脉血、干血斑等)、血清或血浆)样品、或组织、唾液、尿液、羊水、口咽标本、鼻咽标本、下呼吸道标本(例如但不限于痰、气管内抽出物或支气管肺泡灌洗液)、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以如从患者获得地直接使用，或者可预处理，诸如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、对干扰组分进行灭活、添加试剂等，从而以本文中讨论的或其它本领域已知的一些方式来修饰样品的特征。此外，样品可以是使用一个或多个拭子获得的鼻咽或口咽标本，一旦获得，就将其置于含有病毒传输培养基(VTM)或通用传输培养基(UTM)的无菌管中，并保留在其中或转移到另一种用于测试的培养基。
可以利用多种细胞类型、组织或体液来获得样品。此类细胞类型、组织和流体可以包括组织切片，诸如活检和尸检样品、口咽标本、鼻咽标本、取得用于组织学目的的冷冻切片、血液(例如全血、干血斑等)、血浆、血清、唾液、红细胞、血小板、间质液、脑脊髓液等。细胞类型和组织还可以包括淋巴液、脑脊液或任何通过抽吸收集的流体。组织或细胞类型可以通过从人类和非人类动物中取出细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人、在另一个时间和/或出于另一个目的分离)来完成。也可以使用归档组织，例如具有治疗或结局史的那些。可能不需要蛋白质或核苷酸分离和/或纯化。在一些实施方式中，样品为血液样品(例如，全血样品、血清样品或血浆样品)。在一些实施方式中，样品为全血样品。在一些实施方式中，样品为毛细血管血液样品。在一些实施方式中，样品为干血斑。在一些实施方式中，样品为血清样品。在又其他实施方式中，样品为血浆样品。在一些实施方式中，样品为口咽标本。在其他实施方式中，样品为鼻咽标本。在其他实施方式中，样品为痰。在其他实施方式中，样品为气管内抽出物。在又其他实施方式中，样品为支气管肺泡灌洗液。在又其他实施方式中，样品为唾液样品。
如本文所用，测定的“敏感性”是指结局为阳性的受试者被正确鉴定为阳性的比例(例如，正确地鉴定出患有所测试的疾病或医学病状的那些受试者)。例如，这可能包括正确地将患有TBI的受试者鉴定为与未患有TBI的受试者不同，正确地将患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者鉴定为与患有轻度TBI的受试者不同，正确地将患有轻度TBI的受试者鉴定为与患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者不同，正确地将患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者鉴定为与未患有TBI的受试者不同，或正确地将患有轻度TBI的受试者鉴定为与未患有TBI的受试者不同等等。
如本文所用，测定的“特异性”是指结局为阴性的受试者被正确地鉴定为阴性的比例(例如，正确地鉴定出未患有所测试的疾病或医学病状的那些受试者)。例如，这可能包括正确地将未患有TBI的受试者鉴定为与患有TBI的受试者不同，正确地将未患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者鉴定为与患有轻度TBI的受试者不同，正确地将未患有轻度TBI的受试者鉴定为与患有中度、重度或中度至重度TBI的受试者不同等等。
“校准组合物系列”是指包含已知浓度的UCH-L1的多种组合物，其中每种组合物与该系列中的其他组合物的区别在于UCH-L1的浓度。
如本文中可互换使用的“固相”或“固体支持物”是指可用于附接和/或吸引且固定化(1)一种或多种捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)一种或多种检测剂或检测特异性结合配偶体的任何材料。固相可以就其吸引和固定化捕获剂的固有能力进行选择。可替换地，固相可以具有在其上粘附的连接剂，所述连接剂具有吸引和固定化(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体。例如，连接剂可包括带电物质，其相对于捕获剂(例如捕获特异性结合配偶体)或检测剂(例如检测特异性结合配偶体)本身或相对于与(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体缀合的带电物质是带相反电荷的。通常，连接剂可以是任何结合配偶体(优选是异性的)，其固定化在(附接至)固相上并且具有通过结合反应来固定化(1)捕获剂或捕获特异性结合配偶体，或(2)检测剂或检测特异性结合配偶体的能力。连接剂使得捕获剂在性能测定之前或性能测定期间间接地与固相材料结合。例如，固相可以是塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、薄片、珠粒、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它构造。
如本文所用的“特异性结合”或“特异性地结合”可以是指抗体、蛋白质或者肽与第二化学品的相互作用，其中相互作用依赖于化学品上具体结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是广泛结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含被标记的“A”和抗体的反应中，含表位A的分子(或者游离的未标记A)的存在将会降低与抗体结合的被标记的A的量。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同分子，其通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除常见免疫测定法的抗原与抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可包括生物素与抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)；碳水化合物与凝集素；互补核苷酸序列；效应分子与受体分子；辅因子与酶；酶和酶抑制剂等。此外，特异性结合对可包括是原始特异性结合配偶体的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合配偶体包括分离的或重组产生的抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物和片段。
如本文所用，“统计学显著”是指两个或多个变量之间的关系由除随机机会之外的因素引起的可能性。统计假设检验用于确定数据集的结果是否统计学显著。在统计假设检验中，每当观察到的检验统计值的p值小于研究定义的显著性水平，就会获得统计学显著的结果。p值是获得至少与观察到的结果一样极端的结果的概率，前提是零假设为真。统计假设分析的示例包括Wilcoxon符号秩检验、t检验、卡方检验或Fisher精确检验。如本文所用，“显著”是指尚未确定为统计学显著的变化(例如，它可能尚未经过统计假设检验)。
如本文可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠，非人类灵长类动物(例如，猴子，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在一些实施方式中，受试者可以是人或非人。在一些实施方式中，受试者是人。受试者或患者可以正在接受其他形式的治疗。
“治疗(Treat/treating/treatment)”各自在本文中可互换用于描述逆转、减轻或抑制这种术语所适用的疾病和/或损伤的进展，或这种疾病的一种或多种症状。根据受试者的病状，该术语还是指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。所述术语还是指在受疾病折磨之前降低与这种疾病相关的疾病或症状的严重性。在折磨之前的这种预防疾病或降低疾病严重性是指不在受疾病折磨的施用时间将药物组合物施用至受试者。“预防”还是指预防疾病或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。“治疗”和“治疗性地”是指治疗的行为，正如“治疗”如上所定义的。
如本文可互换使用的“创伤性脑损伤”或“TBI”是指具有广谱症状和失能的复杂损伤。TBI很多时候是类似于其它损伤的急性事件。TBI可分为“轻度”、“中度”或“重度”。TBI的原因是多种多样的，并且包括例如人的身体摇动、车祸、枪械损伤、脑血管意外(例如中风)、跌倒、爆炸或冲击波以及其他类型的钝力创伤。TBI的其他原因包括摄入和/或暴露于以下中的一种或多种：火、化学品或毒素(诸如霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)、一种或多种滥用药物或其组合)。可替换地，TBI可能发生在患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2、脑膜炎等)、真菌感染(例如，脑膜炎)、细菌感染感染(例如，脑膜炎)或其任何组合的受试者中。青年人和老年人是TBI风险最高的年龄组。在本文的某些实施方式中，创伤性脑损伤或TBI不包括并且特别地排除脑血管意外，诸如中风。
如本文所用，“轻度TBI”是指受试者可能或可能不经历意识丧失的头部损伤。对于经历意识丧失的受试者，它通常是短暂的，通常只持续几秒钟或几分钟。轻度TBI也被称为脑震荡、轻微头部创伤、轻微TBI、轻微脑损伤和轻微头部损伤。虽然MRI和CT扫描常常是正常的，但患有轻度TBI的个体可能具有认知问题，诸如头痛、思维困难、记忆问题、注意力缺陷、情绪波动和沮丧。
轻度TBI是最普遍的TBI，并且在初始损伤时常常被遗漏。通常，受试者具有在13-15之间(诸如13-15或14-15)的格拉斯哥昏迷量表数。百分之十五(15％)的轻度TBI患者的症状持续3个月或更长时间。轻度TBI的常见症状包括疲劳、头痛、视力障碍、记忆力丧失、注意力/集中力差、睡眠障碍、头晕/失去平衡、应激性情绪障碍、抑郁情感和癫痫。与轻度TBI相关的其它症状包括恶心、嗅觉丧失、对光和声音的敏感性、情绪变化、迷茫或混乱、和/或思维迟钝。
如本文所用，“中度TBI”是指脑损伤，其中意识丧失和/或混乱和定向障碍在1至24小时之间并且受试者具有9-13(诸如9-12或9-13)之间的格拉斯哥昏迷量表数。患有中度TBI的个体可能具有异常的脑成像结果。如本文所用的“重度TBI”是指脑损伤，其中意识丧失超过24小时并且在损伤或穿透性颅骨损伤后记忆丧失长过24小时并且受试者具有3-8之间的格拉斯哥昏迷量表数。缺陷的范围为从较高水平的认知功能损害到昏迷状态。幸存者可能具有有限的手臂或腿部功能、言语或语言异常、思维能力丧失或情绪问题。具有重度损伤的个体可能会长期处于无反应状态。对于许多患有重度TBI的人来说，通常需要长期康复以最大限度地发挥功能和独立性。
如本文所用，“中度至重度”TBI是指一系列脑损伤，其包括随时间从中度到重度TBI的变化，并且因此包括(例如，时间上)单独中度TBI、单独重度TBI和组合的中度至重度TBI。例如，在一些临床情况下，受试者可能最初被诊断为患有中度TBI，但随着时间的推移(几分钟、几小时或几天)，进展为患有重度TBI(例如，在当有脑出血的情况下)。可替换地，在一些临床情况下，受试者最初可能被诊断为患有重度TBI，但随着时间的推移(数分钟、数小时或数天)，进展为患有中度TBI。此类受试者将是可归类为“中度至重度”的患者的示例。中度至重度TBI的常见症状包括认知缺陷，包括注意力、集中力、注意力分散性、记忆力、运算速度方面的困难、混乱、持续言语、冲动、语言处理和/或“执行功能”、不理解口语词(感觉性失语症)、说话和被理解困难(表达性失语症)、言语不清、说话速度很快或很慢、阅读问题、写作问题、解释触摸、温度、运动、肢体位置和精细辨别困难、将感觉印象整合或模式化成对心理有意义的数据、部分或全部视力丧失、眼肌无力和双视(复视)、视力模糊、判断距离的问题、不自主的眼球运动(眼球震颤)、不耐受光(畏光)、听力问题(诸如听力减弱或丧失、耳中有鸣声(耳鸣)、对声音的敏感性增加)、嗅觉丧失或减弱(嗅觉缺失症)、味觉丧失或减弱、与癫痫相关的惊厥，所述惊厥可能是几种类型并且可能涉及意识、感官知觉或运动肌移动、对肠和膀胱的控制问题、失眠、耐力丧失、食欲改变、体温调节问题、月经困难、依赖行为、情绪能力或稳定性问题、缺乏动力、易怒、攻击性、抑郁、去抑制或拒绝/缺乏意识。患有中度至重度TBI的受试者可能具有3-12的格拉斯哥昏迷量表评分(其包括中度TBI的9-12范围和重度TBI的3-8范围)。
如本文可互换使用的“泛素羧基末端水解酶L1”或“UCH-L1”是指由人体内的UCH-L1基因编码的去泛素化酶。UCH-L1，也称为泛素羧基末端酯酶L1和泛素硫酯酶，是产物水解泛素的小C-末端加合物以生成泛素单体的基因家族的成员。
“UCH-L1状态”可以表示在某个时间点的UCH-L1水平或量(例如单次测量UCH-L1)，与监测相关的UCH-L1水平或量(例如通过对受试者的重复测试确定UCH-L1量的增加或减少)，与创伤性脑损伤(无论是原发性脑损伤和/或继发性脑损伤)的治疗相关的UCH-L1的水平或量，或其组合。
“变体”在本文中用于描述因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还在本文中用于描述具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来，替换氨基酸，在本领域中被公认为通常涉及微小变化。如本领域中所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知的是相似的疏水性指数的氨基酸可被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽最大的局部平均亲水性，其是一种已经被报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度。美国专利号4,554,101以引用的方式全部并入本文。如本领域中所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸、并且特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。“变体”也可以用于指抗UCH-L1抗体的抗原反应片段，其在氨基酸序列上不同于抗UCH-L1抗体的对应片段，但仍具有抗原反应性并可与对应的抗UCH-L1抗体片段竞争结合UCH-L1。“变体”也可以用于描述诸如通过蛋白水解、磷酸化或其他翻译后修饰被差异加工但仍保留其抗原反应性的多肽或其片段。
“载体”在本文中用于描述可以转运其已连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将额外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，适用于重组DNA技术中的表达载体常常呈质粒形式。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，可以使用起等同功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。就这方面而言，载体的RNA型式(包括RNA病毒载体)也可以用于本公开的上下文中。
除非本文另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交使用的任何命名法以及其技术是本领域中熟知并且常用的那些。术语的含义和范围应为清晰的；然而，如果存在任何隐含歧义，则本文中所提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
2.帮助确定头部计算机断层(CT)扫描对TBI呈阴性的受试者的创伤性脑损伤(TBI)的方法
除其他方法外，本公开涉及一种帮助确定已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受对头部的损伤的受试者(诸如人类受试者)是否较有可能遭受创伤性脑损伤(TBI)的方法，其中受试者已经接受了一次或多次头部CT扫描，其对TBI呈阴性。具体地，这种方法可以包括以下步骤：(a)同时或依次(以任何顺序)进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，至少一次对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关的时间范围内至少一次对所述受试者的CT扫描；以及(b)如果生物标志物的水平高于参考水平并且头部CT扫描对TBI呈阴性，则将受试者诊断为较有可能患有TBI。样品可以是生物样品。
在另一方面，本公开涉及一种帮助确定已经遭受、可能已经遭受或怀疑遭受头部损伤的受试者(诸如人类受试者)的方法。具体地，所述方法包括对在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内获自所述受试者的样品进行测定，以测量或检测所述样品中生物标志物的水平，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；并且其中所述方法包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平，并且在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描对TBI呈阴性，或者没有对所述受试者进行头部CT扫描，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。样品可以是生物样品。在一些方面，对受试者进行头部CT扫描。在其他方面，不对受试者进行头部CT扫描。
如所提及的，至少一种测定和任选地，如果进行的话，至少一次头部CT扫描可以同时或以任何顺序依次进行。在依次进行时，测定和头部CT扫描可以在临床相关时间范围内进行，诸如，例如，彼此相隔约1分钟内、彼此相隔约2分钟内、彼此相隔约3分钟内、彼此相隔约4分钟内、彼此相隔约5分钟内、彼此相隔约10分钟内、彼此相隔约15分钟内、彼此20分钟内、彼此相隔约25分钟内、彼此相隔约30分钟内、彼此相隔约45分钟内、彼此相隔约50分钟内、彼此相隔约60分钟内、彼此相隔约1小时内、彼此相隔约1.5小时内、彼此相隔约2小时内、彼此相隔约3小时内、彼此相隔约4小时内、彼此相隔约5小时内、彼此相隔约6小时内、彼此相隔约7小时内、彼此相隔约8小时内、彼此相隔约9小时内、彼此相隔约10小时内、彼此相隔约11小时内或彼此相隔约12小时内。
在一些方面，本文所述的方法允许在某些情况下基于一种或多种生物标志物水平将已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者鉴定为患有TBI，其中此类受试者已经接受了头部CT扫描，其对TBI呈阴性。本文所述的方法允许鉴定已经患有TBI但可能以其他方式被错误诊断为未患有TBI的受试者，如果这种诊断仅基于一次或多次头部CT扫描的结果。
在一些实施方式中，所述方法可以包括在怀疑受试者损伤的约24小时内取样以及将样品与TBI生物标志物(诸如泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合)的抗体接触，以允许形成抗体和生物标志物的复合物。该方法还包括检测所得的抗体-生物标志物复合物。
在一些实施方式中，样品在对头部的损伤(例如，实际损伤)或怀疑损伤的约24小时内取自受试者(诸如人类受试者)，诸如约0至约6小时内、约0至约8小时内、约0至约10小时内、约0至约12小时内、约0至约18小时内、约6小时至约12小时内、约6小时至约18小时或约12小时至约18小时内。例如，样品可以在对头部的损伤或怀疑损伤的约0分钟、约30分钟、约60分钟内、约90分钟、约120分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时内取自受试者(诸如人类受试者)。在一些实施方式中，生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)的存在的开始在对头部的损伤或怀疑损伤之后约0分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟、约120分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时内出现。
通常，生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)的参考水平也可以用作基准，针对其评估在测定测试样品中的UCH-L1标志物时所获得的结果。通常，在进行这种比较时，生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)的参考水平是通过在适当的条件下进行足够多次的特定测定，以使分析物的存在、量或浓度与TBI的特定阶段或终点或特定标记可以相联系或关联。通常，通过参考受试者(或受试者群体)的测定获得生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)的参考水平。所测量的生物标志物(诸如UCH-L1、GFAP或其组合)可以包括其片段、其降解产物和/或其酶促裂解产物。
在一些实施方式中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗来治疗受试者(诸如人类受试者)和/或监测受试者，如下文所述。
本文所述的方法中采用的测定的本质并不重要，并且测试可以是本领域已知的任何测定，例如免疫测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、化学分析、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析、或蛋白质免疫染色、电泳分析、蛋白质测定、竞争性结合测定、功能性蛋白质测定或色谱法或光谱法，诸如高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱-质谱法(LC/MS)。而且，测定可以以本领域的普通技术人员已知的临床化学形式进行。此类测定在本文第4-8部分中有更详细的描述。在本领域中已知的是，在采用特定样品类型的测定(例如像利用血清的免疫测定或使用全血的定点照护装置)中所用的值(例如，参考水平、截止值、阈值、特异性、敏感性、校准物和/或对照物的浓度)可以使用本领域中已知的技术(诸如测定标准化)外推到其他测定形式。例如，可以进行测定标准化的一种方式是通过对测定中使用的校准物应用因数，使样品浓度读数更高或更低，以获得与比较方法对准的斜率。将在一种测定上获得的结果标准化为另一种测定的其他方法是众所周知的，并已在文献中进行了描述(参见，例如，DavidWild,Immunoassay Handbook,第4版,第3.5章,第315-322页，其内容以引用的方式并入本文)。3.对已经遭受对头部的损伤的受试者的治疗和监测
可以治疗或监测在上述方法中鉴定的受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括用创伤性脑损伤治疗(诸如本领域中已知的任何治疗)来治疗受试者(诸如人类受试者)。例如，创伤性脑损伤的治疗可以根据对头部的损伤的严重程度采取多种形式。例如，对于患有轻度TBI的受试者，治疗可以包括一次或多次休息，放弃体育锻炼(如运动)，避光或在阳光下戴太阳眼镜，缓解头痛或偏头痛的药物，抗恶心药物等。对患有中度、重度或中度至重度TBI的患者的治疗可能包括施用一种或多种合适的药物(例如利尿药、抗惊厥药物、用于使人镇静并使之陷入药物性昏迷的药物，或其他药学或生物药学药物(已知或未来开发用于TBI的治疗))、一种或多种外科手术(例如血肿切除、颅骨骨折修复、减压颅骨切除术等)、保护气道和一种或多种疗法(例如一种或多种康复、认知行为疗法、愤怒管理、心理咨询等)。在一些实施方式中，所述方法还包括监测受试者(诸如人类受试者)。在一些实施方式中，可以用CT扫描或MRI程序监测受试者。
4.测量UCH-L1水平的方法
在上述方法中，可以通过任何手段来测量UCH-L1物水平，例如抗体依赖性方法，例如免疫测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、化学分析、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析、蛋白质免疫染色、电泳分析、蛋白质分析、竞争结合分析、功能蛋白质分析、或色谱或光谱法，例如高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-质谱法(LC/MS)。而且，该测定可以以本领域技术人员已知的临床化学形式进行。
在一些实施方式中，测量UCH-L1的水平包括使样品与第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体接触。在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体是捕获抗体，而第二特异性结合配偶体是检测抗体。在一些实施方式中，测量UCH-L1的水平包括使样品同时或以任何顺序依次地与以下接触：(1)与UCH-L1或UCH-L1片段上的表位结合的捕获抗体(例如UCH-L1-捕获抗体)，以形成捕获抗体-UCH-L1抗原复合物(例如UCH-L1捕获抗体-UCH-L1抗原复合物)，以及(2)包括可检测标记并与UCH-L1上未被捕获抗体结合的表位结合的检测抗体(例如UCH-L1检测抗体)，以形成UCH-L1抗原-检测抗体复合物(例如UCH-L1抗原-UCH-L1-检测抗体复合物)，从而形成捕获抗体-UCH-L1抗原-检测抗体复合物(例如UCH-L1-捕获抗体-UCH-L1抗原-UCH-L1-检测抗体复合物)，并基于捕获抗体-UCH-L1抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，测量样品中UCH-L1的量或浓度。
在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第二特异性结合配偶体被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体是如下所述的UCH-L1抗体。
在一些实施方式中，将样品稀释或不稀释。样品可以是约1至约25μL、约1至约24μL、约1至约23μL、约1至约22μL、约1至约21μL、约1至约20μL、约1至约18μL、约1至约17μL、约1至约16μL、约15μL或约1μL、约2μL、约3μL、约4μL、约5μL、约6μL、约7μL、约8μL、约9μL、约10μL、约11μL、约12μL、约13μL、约14μL、约15μL、约16μL、约17μL、约18μL、约19μL、约20μL、约21μL、约22μL、约23μL、约24μL或约25μL。在一些实施方式中，样品为约1至约150μL或更少、或约1至约25μL或更少。
除定点照护装置外的一些仪器(如像Abbott Laboratories仪器ARCHITECT和其他核心实验室仪器)可能能够测量样品中高于或大于25,000pg/mL的UCH-L1水平。
其他检测方法包括使用纳米孔装置或纳米井装置或可适于在它们上使用。纳米孔装置的实例在国际专利公开号WO 2016/161402中描述，其通过引用整体并入本文。纳米孔装置的示例在国际专利公开号WO 2016/161400中描述，其通过引用整体并入本文。
5.UCH-L1抗体
本文所述的方法可以使用与泛素羧基末端水解酶L1(“UCH-L1”)(或其片段)特异性结合的分离的抗体，称为“UCH-L1抗体”。UCH-L1抗体可用于评估UCH-L1状态作为创伤性脑损伤的量度，检测样品中UCH-L1的存在，定量样品中存在的UCH-L1的量，或检测样品中UCH-L1的存在并定量其量。
a.泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)
泛素羧基末端水解酶L1(“UCH-L1”)也称为“泛素C-末端水解酶”，是去泛素化酶。UCH-L1是其产物水解泛素的小C-末端加合物以生成泛素单体的基因家族的成员。UCH-L1的表达对神经元并且对弥漫性神经内分泌系统的细胞及其肿瘤具有高度特异性。它大量存在于所有神经元中(占总脑蛋白的1-2％)，特别在神经元和睾丸/卵巢中表达。UCH-L1的催化三联体含有在90位的半胱氨酸、在176位的天冬氨酸和在161位的组氨酸，它们负责其水解酶活性。
人UCH-L1可能具有以下氨基酸序列：
MQLKPMEINPEMLNKVLSRLGVAGQWRFVDVLGLEEESLGSVPAPACALLLLFPLTAQHENFRKKQIEELKGQEVSPKVYFMKQTIGNSCGTIGLIHAVANNQDKLGFEDGSVLKQFLSETEKMSPEDRAKCFEKNEAIQAAHDAVAQEGQCRVDDKVNFHFILFNNVDGHLYELDGRMPFPVNHGASSEDTLLKDAAKVCREFTEREQGEVRFSAVALCKAA(SEQ ID NO:1)。
人UCH-L1可以是SEQ ID NO:1的片段或变体。UCH-L1的片段的长度可以是5至225个氨基酸、10至225个氨基酸、50至225个氨基酸、60至225个氨基酸、65至225个氨基酸、100至225个氨基酸、150至225个氨基酸、100至175个氨基酸或175至225个氨基酸。所述片段可以包含来自SEQ ID NO:1的许多连续的氨基酸。
b.UCH-L1识别抗体
该抗体是与UCH-L1、其片段、UCH-L1的表位或其变体结合的任何抗体。该抗体可以是抗UCH-L1抗体的片段或其变体或衍生物。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟的抗体、人抗体、人源化抗体、完全人抗体或抗体片段，例如Fab片段，或其混合物。抗体片段或衍生物可以包含F(ab')2、Fv或scFv片段。抗体衍生物可以由模拟肽产生。此外，描述用于生产单链抗体的技术可以适于生产单链抗体。
抗UCH-L1抗体可以是嵌合抗UCH-L1或人源化抗UCH-L1抗体。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体均包含连接至Fc区的单个Fab区。
人抗体可源自噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫应答的结果而产生并被分离。参见例如Funaro等人，BMCBiotechnology,2008(8):85。因此，该抗体可能是人而不是动物库的产物。由于它是人类起源，因此可以降低自身抗原反应的风险。可替换地，可以使用标准的酵母展示库和展示技术来选择和分离人抗UCH-L1物抗体。例如，可以使用原始的人类单链可变片段(scFv)库来选择人类抗UCH-L1抗体。转基因动物可用于表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
该抗体与已知抗体的区别在于，它具有与本领域已知的生物学功能不同的生物学功能。
(1)表位
该抗体可以免疫特异性结合UCH-L1(SEQ ID NO:1)、其片段或其变体。该抗体可以免疫特异性识别并结合表位区域内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、或至少有十个氨基酸。该抗体可以免疫特异性识别并结合具有表位区域的至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个氨基酸连续氨基酸、至少九个连续氨基酸、或至少十个连续氨基酸的表位。
c.抗体制备/生产
抗体可以通过多种技术中的任一种来制备，包括本领域技术人员众所周知的那些。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术、或通过将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中来产生单克隆抗体，以实现抗体的生产，其中抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，与DHFR选择性标记一起使用，例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述的NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解的是，可以执行以上过程的变型。例如，可能希望用编码抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码与目标抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被抗体涵盖。另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗体(即，结合人UCH-L1)，而另一条重链和轻链通过将抗体通过标准化学交联方法与第二抗体交联而对除人UCH-L1之外的抗原具有特异性。
在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。更进一步地，合成重组抗体的方法可以是通过在合适的培养基中培养宿主细胞直到合成重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法包括制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。这样的细胞系可由获自免疫动物的脾细胞产生。可以用UCH-L1或其片段和/或变体免疫动物。用于免疫动物的肽可包含编码人Fc的氨基酸，例如人抗体的可结晶片段或尾部片段。然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合来使脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度接种在支持杂交细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察到杂种的集落。选择单个集落，并测试其培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主例如小鼠的腹膜腔中。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术，例如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取，从抗体中去除污染物。亲和色谱法是可用于纯化抗体的方法的示例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供多个包含两个抗原结合位点的片段，包括F(ab')2片段。
Fv片段可以优选通过IgM的蛋白水解切割而产生，并且在极少数情况下可以是IgG或IgA免疫球蛋白分子。Fv片段可以使用重组技术衍生。Fv片段包括非共价的VH::VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包含分别插入重链和轻链构架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述FR组提供支持CDR并限定CDR彼此之间的空间关系。CDR组可包含重链或轻链V区的三个高变区。
可以使用产生或分离具有必要特异性的抗体的其他合适方法，包括但不限于从肽或蛋白质库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA或酵母等展示库)中选择重组抗体的方法；例如，可使用本领域已知的方法从各种商业供应商购得，例如CambridgeAntibody Technologies(Cambridgeshire,UK)，MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)，Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)BioInvent(Lund,Sweden)。参见美国专利号4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862。替代方法依赖于对转基因动物的免疫(例如SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41:901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)，其如本领域已知和/或本文所述能产生人抗体库。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如，选定的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利号5,627,052；Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337；One Cell Systems,(Cambridge,Mass).；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports 19:125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来产生。例如，参见Marks等人，BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在美国专利号6,914,128B1中描述了在选择性诱变位置以及在接触或超突变位置处具有增强活性的氨基酸残基的选择性突变。
抗体变体还可以通过将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主以提供转基因动物或哺乳动物来制备，例如山羊、牛、马和绵羊等，在其乳汁中产生此类抗体。这些方法在本领域中是已知的，并且例如在美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362和5,304,489中描述。
抗体变体还可以通过递送多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备，所述转基因植物和植物细胞在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了表达大量重组蛋白的转基因烟草叶的生产，例如使用诱导型启动子。转基因玉米已用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的生物活性相同。参见例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。还已经从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体变体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv)。参见例如Conrad等人(1998)Plant Mol.Biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知方法使用转基因植物产生抗体。
抗体衍生物可以例如通过添加外源序列以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征来产生。通常，保持部分或全部非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸取代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中片段包含与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。还参见Chen等人的美国专利号6,632,926，其全部内容通过引用并入本文，并公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且对靶抗原的结合亲和力比抗原的亲本抗体的结合亲和力强至少约两倍的抗体变体。
抗体可以是线性抗体。制备线性抗体的方法是本领域已知的，并在Zapata等人，(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062中描述。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。
可检测地标记抗体可能是有用的。偶联针对这些试剂的抗体的方法是本领域已知的。仅出于说明的目的，抗体可以用可检测部分标记，例如放射性原子、发色团或荧光团等。这种标记的抗体可以用于体内或分离的测试样品中的诊断技术。它们可以与细胞因子、配体和另一种抗体连接。用于与抗体偶联以实现抗肿瘤作用的合适试剂包括细胞因子，例如白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；用于光动力疗法的光敏剂，包括铝(III)酞菁铝四磺酸盐、血卟啉和酞菁；放射性核素，例如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，例如亚德里亚霉素、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新卡他汀和卡铂；细菌、植物和其他毒素，例如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、Abrin-A毒素、蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)、TGF-α毒素、中华眼镜蛇(眼镜蛇)的细胞毒素和白树毒素(植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，例如局限曲霉素(由限制曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(来自肥皂草的核糖体失活蛋白)和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟嘌呤核苷)；含有抗囊性药物的脂质体(例如反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；和其他抗体或抗体片段，例如F(ab)。
通过使用杂交瘤技术、选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)、转基因动物和重组抗体库的抗体生产在下文中更详细地描述。
(1)使用杂交瘤技术的抗UCH-L1单克隆抗体
可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括那些本领域已知以及例如以下中教示的技术，Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,第二版,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,(Elsevier,N.Y.,1981)。还应注意，本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。
生成单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体可包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，杂交瘤通过以下生成：将从用UCH-L1免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选由融合得到的杂交瘤以实现分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。简而言之，可以用UCH-L1抗原免疫大鼠。在一个优选的实施方式中，UCH-L1抗原与佐剂一起施用以刺激免疫反应。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护多肽免于快速扩散，或者它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其他组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫方案将涉及两次或更多次施用多肽，在数周内开展；然而，也可以使用多肽的单次施用。
在用UCH-L1抗原免疫动物后，可从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。含有抗UCH-L1抗体的血清是通过放血或处死动物而从动物获得的。可以使用从动物获得的血清，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或者可以从血清纯化抗UCH-L1抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质性。
一旦检测到免疫反应，例如，在大鼠血清中检测到对抗原UCH-L1具有特异性的抗体，收集大鼠脾并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.,US)的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合UCH-L1的抗体的细胞。腹水通常含有高水平的抗体，可以通过用阳性杂交瘤克隆对大鼠进行免疫来生成。
在另一实施方式中，可从免疫动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。免疫之后，将动物处死，并且将脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，和在本领域中众所周知的那样。参见例如，Harlow和Lane,同上。在一个优选的实施方式中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。在融合和抗生素选择之后，使用UCH-L1、或其一部分、或表达UCH-L1的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方式中，初始筛选使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选地ELISA进行。PCT公开号WO 00/37504中提供了ELISA筛选的示例。
选择、克隆产生抗UCH-L1抗体的杂交瘤，并进一步筛选其所需特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产量和所需的抗体特征。杂交瘤可以在体内在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物(例如，裸小鼠)中或在体外在细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法为本领域普通技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方式中，杂交瘤在非人类、非大鼠物种中产生，诸如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个优选的实施方式中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗UCH-L1抗体的人细胞融合。
可通过已知技术生成识别特定表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab')2片段可以通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子来产生。IgG分子的F(ab')2片段保留较大(“亲本”)IgG分子的两个抗原结合位点，包括两条轻链(其含有可变轻链和恒定轻链区)、重链的CH1结构域和亲本IgG分子的二硫键形成铰链区。因此，F(ab')2片段仍然能够像亲本IgG分子一样交联抗原分子。
(2)使用SLAM的抗UCH-L1单克隆抗体
在本发明的另一个方面，使用在本领域中称为选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)的程序从单个分离的淋巴细胞生成重组抗体，如以下中所述：美国专利号5,627,052；PCT公开号WO 92/02551；以及Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)。在这种方法中，分泌感兴趣的抗体的单细胞，例如源自任一个免疫的动物的淋巴细胞，使用抗原特异性溶血蚀斑测定来筛选，其中使用接头(诸如，生物素)将抗原UCH-L1、UCH-L1的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，并且用于鉴定分泌对UCH-L1具有特异性的抗体的单细胞。在鉴定出感兴趣的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞中拯救重链和轻链可变区cDNA，然后可以在哺乳动物宿主细胞(诸如COS或CHO细胞)中的适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人类恒定区)中的情况下表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞(源自体内选择的淋巴细胞)然后可以在体外进行进一步的分析和选择，例如，通过淘选转染的细胞以分离表达针对UCH-L1的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列可进一步在体外操作，诸如通过体外亲和力成熟法。参见例如，PCT公开号WO 97/29131和PCT公开号WO 00/56772。
(3)使用转基因动物的抗UCH-L1单克隆抗体
在本发明的另一个实施方式中，通过用UCH-L1抗原免疫包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物来产生抗体。在一个实施方式中，非人动物是转基因小鼠，其为一种工程化的小鼠品系，其包含人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体产生方面存在缺陷。参见例如Green等人，Nature Genetics,7:13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见PCT公开号WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/37504。/>转基因小鼠产生成人样的全人类抗体库，并且生成抗原特异性人类单克隆抗体。/>转基因小鼠通过引入人类重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小、种系构型YAC片段，包含大约80％的人类抗体库。参见Mendez等人，NatureGenetics,15:146-156(1997)；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。/>
(4)使用重组抗体文库的抗UCH-L1单克隆抗体
体外方法也可用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需UCH-L1结合特异性的抗体。重组抗体文库的此类筛选的方法是本领域中熟知的，并且包括以下所述的方法，例如，美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公开号WO 92/18619(Kang等人)；PCT公开号WO 91/17271(Dower等人)；PCT公开号WO 92/20791(Winter等人)；PCT公开号WO92/15679(Markland等人)；PCT公开号WO 93/01288(Breitling等人)；PCT公开号WO 92/01047(McCafferty等人)；PCT公开号WO 92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人，Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人，Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.,12:725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人，Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公开号2003/0186374；以及PCT公开号WO 97/29131，其各自的内容以引用的方式并入本文。
重组抗体文库可来自用UCH-L1或UCH-L1的一部分免疫的受试者。可替换地，重组抗体文库可以来自初始受试者，即，未用UCH-L1免疫的人，诸如来自未用人UCH-L1免疫的人类受试者的人抗体文库。本发明的抗体是通过用包含人UCH-L1的肽筛选重组抗体文库来选择的，从而选择那些识别UCH-L1的抗体。用于进行此类筛选和选择的方法是本领域中熟知的，诸如在上一段的参考文献中描述的。为了选择对UCH-L1具有特定结合亲和力的本发明抗体，诸如以特定Koff速率常数从人类UCH-L1解离的那些，可以使用本领域已知的表面等离振子共振方法选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对hUCH-L1具有特定中和活性的本发明抗体，诸如具有特定IC50的那些，可以使用本领域已知的用于评估UCH-L1活性的抑制的标准方法。
在一个方面，本发明涉及结合人UCH-L1的分离抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。在各种实施方式中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法生成抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。此类噬菌体可用于展示从库或组合抗体文库(例如，人类或小鼠)表达的抗原结合结合域。表达结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合。可用于制备抗体的噬菌体展示方法的示例包括以下公开的那些：Brinkmann等人，J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人，Gene,187:9-18(1997)；Burton等人，Advances inImmunology,57:191-280(1994)；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如上述参考文献所述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离抗体编码区并用于生成完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文所详述。例如，重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可以使用本领域已知的方法，诸如PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques,12(6):864-869(1992)；Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；以及Better等人，Science,240:1041-1043(1988)中所公开的那些来采用。可用于产生单链Fv和抗体的技术的示例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology,203:46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science,240:1038-1041(1988)中所述的那些。
除了通过噬菌体展示筛选重组抗体文库之外，本领域已知的用于筛选大型组合文库的其他方法也可以应用于本发明的抗体的鉴定。一种类型的替代表达系统是其中重组抗体文库表达为RNA-蛋白质融合物的系统，如PCT公开号WO 98/31700(Szostak和Roberts)以及Roberts和Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997)中所述。在这个系统中，共价融合是在mRNA与它编码的肽或蛋白质之间，通过体外翻译在其3'末端携带嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA来产生的。因此，可以基于编码的肽或蛋白(例如抗体)或其一部分的性质，诸如抗体或其一部分与双特异性抗原的结合，来从mRNA的复杂混合物(例如，重组文库)富集特定mRNA。从此类文库的筛选回收的编码抗体或其一部分的核酸序列可以通过如上文所述的重组手段(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，并且此外，可以通过额外数轮mRNA-肽融合筛选(其中突变已被引入最初选择的序列中)或通过其他的重组抗体的体外亲和力成熟方法来进行进一步亲和力成熟，如上文所述。这种方法的优选示例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，还可以使用本领域已知的酵母展示方法生成抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法将抗体结构域拴系到酵母细胞壁并将它们展示在酵母表面上。此类酵母可用于展示从库或组合抗体文库(例如，人类或小鼠)表达的抗原结合结合域。可用于制备抗体的酵母展示方法的示例包括在美国专利号6,699,658(Wittrup等人)中公开的那些方法，该专利以引用的方式并入本文。
d.重组UCH-L1抗体的产生
抗体可以通过本领域已知的许多技术中的任一种来产生。例如，从宿主细胞的表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，与DHFR选择性标记一起使用，例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述的NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解的是，可以执行以上过程的变型。例如，可能希望用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码与目标抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被本发明的抗体涵盖。另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明抗体(即，结合人UCH-L1)，而另一条重链和轻链通过将本发明抗体通过标准化学交联方法与第二抗体交联而对除人UCH-L1之外的抗原具有特异性。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供一种合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直到合成本发明的重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
(1)人源化抗体
“人源化抗体”可以是抗体或其变体、衍生物、类似物或部分，其免疫特异性地结合目标抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人源化抗体可以来自非人类物种抗体，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
如本文所用，在CDR的背景下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。根据一个方面，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方式中，人源化抗体仅含有轻链和/或重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体CDR或共有框架进行诱变以使该位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在一个实施方式中，此类突变将不是广泛的。通常，至少90％、至少95％、选至少98％或至少99％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地出现，那么共有序列中可包括任一者。
人源化抗体可以被设计成最小化对啮齿类动物抗人抗体的不需要的免疫反应，这限制了那些部分在人类接受者中的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类残基通常被称为“输入”残基，通常取自可变结构域。人源化可以通过用高变区序列代替人类抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。例如，参见美国专利号4,816,567，其内容以引用的方式并入本文。人源化抗体可以是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。可以使用任何已知方法进行本发明抗体的人源化或工程化，诸如但不限于美国专利号5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539和4,816,567中所述的那些。
人源化抗体可以保留对UCH-L1的高亲和力和其他有利的生物学性质。人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型很常见。说明并且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。通过这种方式，可以从接受体和输入序列中选择并组合FR残基，以使得实现所需的抗体特征，诸如对UCH-L1的亲和力增加。总体上，高变区残基可以直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
作为人源化的替代方案，可以生成人抗体(在本文中也称为“完全人抗体”)。例如，有可能经由PROfusion和/或酵母相关技术从文库分离出人抗体。还有可能生产转基因动物，例如，在免疫之后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人类抗体库的小鼠。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。人源化或全人抗体可根据美国专利号5,770,429、5,833,985、5,837,243、5,922,845、6,017,517、6,096,311、6,111,166、6,270,765、6,303,755、6,365,116、6,410,690、6,682,928和6,984,720中描述的方法制备，所述专利中每一个的内容都以引用的方式并入本文。
e.抗UCH-L1抗体
可以使用上文所述的技术以及使用本领域已知的常规技术生成抗UCH-L1抗体。在一些实施方式中，抗UCH-L1抗体可以是未缀合的UCH-L1抗体，诸如可购自以下的UCH-L1：United State Biological(目录号：031320)；Cell Signaling Technology(目录号：3524)；Sigma-Aldrich(目录号：HPA005993)；Santa Cruz Biotechnology,Inc.(目录号：sc-58593或sc-58594)；R&D Systems(目录号：MAB6007)；Novus Biologicals(目录号：NB600-1160)；Biorbyt(目录号：orb33715)；Enzo Life Sciences,Inc.(目录号：ADI-905-520-1)；Bio-Rad(目录号：VMA00004)；BioVision(目录号：6130-50)；Abcam(目录号：ab75275或ab104938)；Invitrogen Antibodies(目录号：480012)；ThermoFisherScientific(目录号：MA1-46079、MA5-17235、MA1-90008或MA1-83428)；EMD Millipore(目录号：MABN48)；或Sino Biological Inc.(目录号：50690-R011)。抗UCH-L1抗体可以与荧光团缀合，诸如可购自BioVision(目录号：6960-25)或Aviva Systems Biology(目录号OAAF01904-FITC)的缀合的UCH-L1抗体。
6.测量GFAP水平的方法
在上述方法中，可以通过任何手段来测量GFAP物水平，例如抗体依赖性方法，例如免疫测定、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、化学分析、SDS-PAGE和蛋白质印迹分析、蛋白质免疫染色、电泳分析、蛋白质分析、竞争结合分析、功能蛋白质分析、或色谱或光谱法，例如高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-质谱法(LC/MS)。而且，该测定可以以本领域技术人员已知的临床化学形式进行。
在一些实施方式中，测量GFAP的水平包括使样品与第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体接触。在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体是捕获抗体，而第二特异性结合配偶体是检测抗体。在一些实施方式中，测量GFAP的水平包括使样品同时或以任何顺序依次地与以下接触：(1)与GFAP或GFAP片段上的表位结合的捕获抗体(例如GFAP-捕获抗体)，以形成捕获抗体-GFAP抗原复合物(例如GFAP捕获抗体-GFAP抗原复合物)，以及(2)包括可检测标记并与GFAP上未被捕获抗体结合的表位结合的检测抗体(例如GFAP检测抗体)，以形成GFAP抗原-检测抗体复合物(例如GFAP抗原-GFAP-检测抗体复合物)，从而形成捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物(例如GFAP-捕获抗体-GFAP抗原-GFAP-检测抗体复合物)，并基于捕获抗体-GFAP抗原-检测抗体复合物中可检测标记产生的信号，测量样品中GFAP的量或浓度。
在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第二特异性结合配偶体被固定在固体支持物上。在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体是如下所述的GFAP抗体。
在一些实施方式中，将样品稀释或不稀释。样品可以是约1至约25μL、约1至约24μL、约1至约23μL、约1至约22μL、约1至约21μL、约1至约20μL、约1至约18μL、约1至约17μL、约1至约16μL、约15μL或约1μL、约2μL、约3μL、约4μL、约5μL、约6μL、约7μL、约8μL、约9μL、约10μL、约11μL、约12μL、约13μL、约14μL、约15μL、约16μL、约17μL、约18μL、约19μL、约20μL、约21μL、约22μL、约23μL、约24μL或约25μL。在一些实施方式中，样品为约1至约150μL或更少、或约1至约25μL或更少。
除定点照护装置外的一些仪器(如像Abbott Laboratories仪器ARCHITECT和其他核心实验室仪器)可能能够测量样品中高于或大于25,000pg/mL的GFAP水平。
其他检测方法包括使用纳米孔装置或纳米井装置或可适于在它们上使用。纳米孔装置的实例在国际专利公开号WO 2016/161402中描述，其通过引用整体并入本文。纳米孔装置的示例在国际专利公开号WO 2016/161400中描述，其通过引用整体并入本文。
7.GFAP抗体
本文所述的方法可以使用与胶质纤维酸性蛋白(“GFAP”)(或其片段)特异性结合的分离的抗体，称为“GFAP抗体”。GFAP抗体可用于评估GFAP状态作为创伤性脑损伤的量度，检测样品中GFAP的存在，定量样品中存在的GFAP的量，或检测样品中GFAP的存在并定量其量。
a.胶质纤维酸性蛋白(GFAP)
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种50kDa的胞质内丝状蛋白，其构成星形胶质细胞中细胞骨架的一部分，并且已被证明是星形胶质细胞起源细胞的最具特异性的标志物。GFAP蛋白由人体内的GFAP基因编码。GFAP是成熟星形胶质细胞的主要中间丝。在分子的中央杆状结构域中，GFAP与其他中间丝具有相当大的结构同源性。GFAP通过为星形胶质细胞过程提供结构稳定性来参与星形胶质细胞的运动和形状。胶质纤维酸性蛋白及其分解产物(GFAP-BDP)是作为创伤性脑损伤(TBI)之后的病理生理反应的一部分释放到血液中的脑特异性蛋白质。在创伤、遗传病症或化学品对人CNS造成损伤之后，星形胶质细胞增殖并表现出细胞体和过程的广泛肥大，并且GFAP显著上调。相比之下，随着星形胶质细胞恶性肿瘤递增，GFAP产生逐渐减少。GFAP还可以在雪旺细胞、肠神经胶质细胞、唾液腺肿瘤、转移性肾癌、会厌软骨、垂体细胞、未成熟少突胶质细胞、乳头状脑膜瘤和乳腺肌上皮细胞中检测到。
人GFAP可能具有以下氨基酸序列：
MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVK TVEMRDGEVIKESKQEHKDVM(SEQ ID NO:2)。
人GFAP可以是SEQ ID NO:2的片段或变体。GFAP的片段的长度可以是5至400个氨基酸、10至400个氨基酸、50至400个氨基酸、60至400个氨基酸、65至400个氨基酸、100至400个氨基酸、150至400个氨基酸、100至300个氨基酸或200至300个氨基酸。所述片段可以包含来自SEQ ID NO:2的许多连续的氨基酸。SEQ ID NO:2的人类GFAP片段或变体可以是GFAP分解产物(BDP)。GFAP BDP可以是38kDa、42kDa(较弱41kDa)、47kDa(较弱45kDa)；25kDa(较弱23kDa)；19kDa或20kDa。
b.GFAP识别抗体
该抗体是与GFAP、其片段、GFAP的表位或其变体结合的任何抗体。该抗体可以是抗GFAP抗体的片段或其变体或衍生物。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体，单链抗体，亲和力成熟的抗体，人抗体，人源化抗体，完全人抗体或抗体片段，例如Fab片段，或其混合物。抗体片段或衍生物可以包含F(ab')2、Fv或scFv片段。抗体衍生物可以由拟肽产生。此外，描述用于生产单链抗体的技术可以适于生产单链抗体。
抗GFAP抗体可以是嵌合抗GFAP或人源化抗GFAP抗体。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方式中，人源化抗体和嵌合抗体均包含连接至Fc区的单个Fab区。
人抗体可源自噬菌体展示技术或表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫应答的结果而产生并被分离。参见例如Funaro等人，BMCBiotechnology,2008(8):85。因此，该抗体可能是人而不是动物库的产物。由于它是人类起源，因此可以降低自身抗原反应的风险。可替换地，可以使用标准的酵母展示库和展示技术来选择和分离人抗GFAP抗体。例如，可以使用原始的人类单链可变片段(scFv)库来选择人类抗GFAP抗体。转基因动物可用于表达人抗体。
人源化抗体可以是来自非人类物种抗体的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
该抗体与已知抗体的区别在于，它具有与本领域已知的生物学功能不同的生物学功能。
(1)表位
该抗体可以免疫特异性结合GFAP(SEQ ID NO:2)、其片段或其变体。该抗体可以免疫特异性识别并结合表位区域内的至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、或至少有十个氨基酸。该抗体可以免疫特异性识别并结合具有表位区域的至少三个连续氨基酸、至少四个连续氨基酸、至少五个连续氨基酸、至少六个连续氨基酸、至少七个连续氨基酸、至少八个氨基酸连续氨基酸、至少九个连续氨基酸、或至少十个连续氨基酸的表位。
c.抗体制备/生产
抗体可以通过多种技术中的任一种来制备，包括本领域技术人员众所周知的那些。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术、或通过将抗体基因、重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中来产生单克隆抗体，以实现抗体的生产，其中抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，与DHFR选择性标记一起使用，例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述的NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解的是，可以执行以上过程的变型。例如，可能希望用编码抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码与目标抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被抗体涵盖。另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗体(即，结合人GFAP)，而另一条重链和轻链通过将抗体通过标准化学交联方法与第二抗体交联而对除人GFAP之外的抗原具有特异性。
在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。更进一步地，合成重组抗体的方法可以是通过在合适的培养基中培养宿主细胞直到合成重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
制备单克隆抗体的方法包括制备能够产生具有所需特异性的抗体的永生细胞系。这样的细胞系可由获自免疫动物的脾细胞产生。可以用GFAP或其片段和/或变体免疫动物。用于免疫动物的肽可包含编码人Fc的氨基酸，例如人抗体的可结晶片段或尾部片段。然后可以通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合来使脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度接种在支持杂交细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。一种这样的技术使用次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT)选择。另一种技术包括电融合。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察到杂种的集落。选择单个集落，并测试其培养上清液对多肽的结合活性。可以使用具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主例如小鼠的腹膜腔中。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术，例如色谱法、凝胶过滤、沉淀和提取，从抗体中去除污染物。亲和色谱法是可用于纯化抗体的方法的示例。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供多个包含两个抗原结合位点的片段，包括F(ab')2片段。
Fv片段可以优选通过IgM的蛋白水解切割而产生，并且在极少数情况下可以是IgG或IgA免疫球蛋白分子。Fv片段可以使用重组技术衍生。Fv片段包括非共价的VH:VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。
抗体、抗体片段或衍生物可以包含分别插入重链和轻链构架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述FR组提供支持CDR并限定CDR彼此之间的空间关系。CDR组可包含重链或轻链V区的三个高变区。
可以使用产生或分离具有必要特异性的抗体的其他合适方法，包括但不限于从肽或蛋白质库(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA或酵母等展示库)中选择重组抗体的方法；例如，可使用本领域已知的方法从各种商业供应商购得，例如CambridgeAntibody Technologies(Cambridgeshire,UK)，MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)，Biovation(Aberdeen,Scotland,UK)BioInvent(Lund,Sweden)。参见美国专利号4,704,692；5,723,323；5,763,192；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862。替代方法依赖于对转基因动物的免疫(例如SCID小鼠，Nguyen等人(1997)Microbiol.Immunol.41:901-907；Sandhu等人(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等人(1998)Immunol.93:154-161)，其如本领域已知和/或本文所述能产生人抗体库。此类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942；Hanes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135)；单细胞抗体生产技术(例如，选定的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利号5,627,052；Wen等人(1987)J.Immunol.17:887-892；Babcook等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人(1990)Biotechnol.8:333-337；One Cell Systems,(Cambridge,Mass).；Gray等人(1995)J.Imm.Meth.182:155-163；Kenny等人(1995)Bio/Technol.13:787-790)；B细胞选择(Steenbakkers等人(1994)Molec.Biol.Reports 19:125-134(1994))。
亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来产生。例如，参见Marks等人，BioTechnology,10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene,169:147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)。在美国专利号6,914,128B1中描述了在选择性诱变位置以及在接触或超突变位置处具有增强活性的氨基酸残基的选择性突变。
抗体变体还可以通过将编码抗体的多核苷酸递送至合适的宿主以提供转基因动物或哺乳动物来制备，例如山羊、牛、马和绵羊等，在其乳汁中产生此类抗体。这些方法在本领域中是已知的，并且例如在美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362和5,304,489中描述。
抗体变体还可以通过递送多核苷酸以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草、玉米和浮萍)来制备，所述转基因植物和植物细胞在植物部分或从中培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体。例如，Cramer等人(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240:95-118和其中引用的参考文献描述了表达大量重组蛋白的转基因烟草叶的生产，例如使用诱导型启动子。转基因玉米已用于以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的生物活性相同。参见例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.(1999)464:127-147和其中引用的参考文献。还已经从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体变体，包括抗体片段，例如单链抗体(scFv)。参见例如Conrad等人(1998)Plant Mol.Biol.38:101-109和其中引用的参考文献。因此，还可以根据已知方法使用转基因植物产生抗体。
抗体衍生物可以例如通过添加外源序列以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征来产生。通常，保持部分或全部非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸取代。
小抗体片段可以是具有两个抗原结合位点的双抗体，其中片段包含与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。还参见Chen等人的美国专利号6,632,926，其全部内容通过引用并入本文，并公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区中并且对靶抗原的结合亲和力比抗原的亲本抗体的结合亲和力强至少约两倍的抗体变体。
抗体可以是线性抗体。制备线性抗体的方法是本领域已知的，并在Zapata等人，(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062中描述。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
可通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化抗体，所述方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。
可检测地标记抗体可能是有用的。偶联针对这些试剂的抗体的方法是本领域已知的。仅出于说明的目的，抗体可以用可检测部分标记，例如放射性原子、发色团或荧光团等。这种标记的抗体可以用于体内或分离的测试样品中的诊断技术。它们可以与细胞因子、配体和另一种抗体连接。用于与抗体偶联以实现抗肿瘤作用的合适试剂包括细胞因子，例如白介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；用于光动力疗法的光敏剂，包括铝(III)酞菁铝四磺酸盐、血卟啉和酞菁；放射性核素，例如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素，例如亚德里亚霉素、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、道诺霉素、新卡他汀和卡铂；细菌、植物和其他毒素，例如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、Abrin-A毒素、蓖麻毒素A(去糖基化蓖麻毒素A和天然蓖麻毒素A)、TGF-α毒素、中华眼镜蛇(眼镜蛇)的细胞毒素和白树毒素(植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，例如局限曲霉素(由限制曲霉产生的核糖体失活蛋白)、皂草素(来自肥皂草的核糖体失活蛋白)和RNA酶；酪氨酸激酶抑制剂；ly207702(二氟嘌呤核苷)；含有抗囊性药物的脂质体(例如反义寡核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨蝶呤等)；和其他抗体或抗体片段，例如F(ab)。
通过使用杂交瘤技术、选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)、转基因动物和重组抗体库的抗体生产在下文中更详细地描述。
(1)使用杂交瘤技术的抗GFAP单克隆抗体
可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括那些本领域已知以及例如以下中教示的技术，Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,第二版,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,(Elsevier,N.Y.,1981)。还应注意，本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。
生成单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体可包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，杂交瘤通过以下生成：将从用GFAP免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选由融合得到的杂交瘤以实现分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆。简而言之，可以用GFAP抗原免疫大鼠。在一个优选的实施方式中，GFAP抗原与佐剂一起施用以刺激免疫反应。此类佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可以通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护多肽免于快速扩散，或者它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统其他组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果施用多肽，则免疫方案将涉及两次或更多次施用多肽，在数周内开展；然而，也可以使用多肽的单次施用。
在用GFAP抗原免疫动物后，可从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。含有抗GFAP抗体的血清是通过放血或处死动物而从动物获得的。可以使用从动物获得的血清，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或者可以从血清纯化抗GFAP抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有一系列异质性。
一旦检测到免疫反应，例如，在大鼠血清中检测到对抗原GFAP具有特异性的抗体，收集大鼠脾并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Va.,US)的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合GFAP的抗体的细胞。腹水通常含有高水平的抗体，可以通过用阳性杂交瘤克隆对大鼠进行免疫来生成。
在另一实施方式中，可从免疫动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。免疫之后，将动物处死，并且将脾B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，和在本领域中众所周知的那样。参见例如，Harlow和Lane,同上。在一个优选的实施方式中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。在融合和抗生素选择之后，使用GFAP、或其一部分、或表达GFAP的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方式中，初始筛选使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选地ELISA进行。PCT公开号WO 00/37504中提供了ELISA筛选的示例。
选择、克隆产生抗GFAP抗体的杂交瘤，并进一步筛选其所需特征，包括稳健的杂交瘤生长、高抗体产量和所需的抗体特征。杂交瘤可以在体内在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物(例如，裸小鼠)中或在体外在细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法为本领域普通技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤是大鼠杂交瘤。在另一个实施方式中，杂交瘤在非人类、非大鼠物种中产生，诸如小鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个优选的实施方式中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗GFAP抗体的人细胞融合。
可通过已知技术生成识别特定表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab')2片段可以通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(产生两个相同的Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子来产生。IgG分子的F(ab')2片段保留较大(“亲本”)IgG分子的两个抗原结合位点，包括两条轻链(其含有可变轻链和恒定轻链区)、重链的CH1结构域和亲本IgG分子的二硫键形成铰链区。因此，F(ab')2片段仍然能够像亲本IgG分子一样交联抗原分子。
(2)使用SLAM的抗GFAP单克隆抗体
在本发明的另一个方面，使用在本领域中称为选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)的程序从单个分离的淋巴细胞生成重组抗体，如以下中所述：美国专利号5,627,052；PCT公开号WO 92/02551；以及Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)。在这种方法中，分泌感兴趣的抗体的单细胞，例如源自任一个免疫的动物的淋巴细胞，使用抗原特异性溶血蚀斑测定来筛选，其中使用接头(诸如，生物素)将抗原GFAP、GFAP的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，并且用于鉴定分泌对GFAP具有特异性的抗体的单细胞。在鉴定出感兴趣的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR(RT-PCR)从细胞中拯救重链和轻链可变区cDNA，然后可以在哺乳动物宿主细胞(诸如COS或CHO细胞)中的适当的免疫球蛋白恒定区(例如，人类恒定区)中的情况下表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞(源自体内选择的淋巴细胞)然后可以在体外进行进一步的分析和选择，例如，通过淘选转染的细胞以分离表达针对GFAP的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列可进一步在体外操作，诸如通过体外亲和力成熟法。参见例如，PCT公开号WO 97/29131和PCT公开号WO 00/56772。
(3)使用转基因动物的抗GFAP单克隆抗体
在本发明的另一个实施方式中，通过用GFAP抗原免疫包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物来产生抗体。在一个实施方式中，非人动物是转基因小鼠，其为一种工程化的小鼠品系，其包含人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体产生方面存在缺陷。参见例如Green等人，Nature Genetics,7:13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见PCT公开号WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/37504。/>转基因小鼠产生成人样的全人类抗体库，并且生成抗原特异性人类单克隆抗体。/>转基因小鼠通过引入人类重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小、种系构型YAC片段，包含大约80％的人类抗体库。参见Mendez等人，NatureGenetics,15:146-156(1997)；Green和Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483-495(1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。
(4)使用重组抗体文库的抗GFAP单克隆抗体
体外方法也可用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需GFAP结合特异性的抗体。重组抗体文库的此类筛选的方法是本领域中熟知的，并且包括以下所述的方法，例如，美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公开号WO 92/18619(Kang等人)；PCT公开号WO 91/17271(Dower等人)；PCT公开号WO 92/20791(Winter等人)；PCT公开号WO92/15679(Markland等人)；PCT公开号WO 93/01288(Breitling等人)；PCT公开号WO 92/01047(McCafferty等人)；PCT公开号WO 92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人，Bio/Technology,9:1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas,3:81-85(1992)；Huse等人，Science,246:1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J.,12:725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)；Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Garrard等人，Bio/Technology,9:1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)；美国专利申请公开号2003/0186374；以及PCT公开号WO 97/29131，其各自的内容以引用的方式并入本文。
重组抗体文库可来自用GFAP或GFAP的一部分免疫的受试者。可替换地，重组抗体文库可以来自初始受试者，即，未用GFAP免疫的人，诸如来自未用人GFAP免疫的人类受试者的人抗体文库。本发明的抗体是通过用包含人GFAP的肽筛选重组抗体文库来选择的，从而选择那些识别GFAP的抗体。用于进行此类筛选和选择的方法是本领域中熟知的，诸如在上一段的参考文献中描述的。为了选择对GFAP具有特定结合亲和力的本发明抗体，诸如以特定Koff速率常数从人类GFAP解离的那些，可以使用本领域已知的表面等离振子共振方法选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对GFAP具有特定中和活性的本发明抗体，诸如具有特定IC50的那些，可以使用本领域已知的用于评估GFAP活性的抑制的标准方法。
在一个方面，本发明涉及结合人GFAP的分离抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体是中和抗体。在各种实施方式中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法生成抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。此类噬菌体可用于展示从库或组合抗体文库(例如，人类或小鼠)表达的抗原结合结合域。表达结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域以重组方式与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合。可用于制备抗体的噬菌体展示方法的示例包括以下公开的那些：Brinkmann等人，J.Immunol.Methods,182:41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人，Gene,187:9-18(1997)；Burton等人，Advances inImmunology,57:191-280(1994)；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
如上述参考文献所述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离抗体编码区并用于生成完整抗体，包括人抗体或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文所详述。例如，重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可以使用本领域已知的方法，诸如PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques,12(6):864-869(1992)；Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunol.,34:26-34(1995)；以及Better等人，Science,240:1041-1043(1988)中所公开的那些来采用。可用于产生单链Fv和抗体的技术的示例包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology,203:46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science,240:1038-1041(1988)中所述的那些。
除了通过噬菌体展示筛选重组抗体文库之外，本领域已知的用于筛选大型组合文库的其他方法也可以应用于本发明的抗体的鉴定。一种类型的替代表达系统是其中重组抗体文库表达为RNA-蛋白质融合物的系统，如PCT公开号WO 98/31700(Szostak和Roberts)以及Roberts和Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997)中所述。在这个系统中，共价融合是在mRNA与它编码的肽或蛋白质之间，通过体外翻译在其3'末端携带嘌呤霉素(肽基受体抗生素)的合成mRNA来产生的。因此，可以基于编码的肽或蛋白(例如抗体)或其一部分的性质，诸如抗体或其一部分与双特异性抗原的结合，来从mRNA的复杂混合物(例如，重组文库)富集特定mRNA。从此类文库的筛选回收的编码抗体或其一部分的核酸序列可以通过如上文所述的重组手段(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，并且此外，可以通过额外数轮mRNA-肽融合筛选(其中突变已被引入最初选择的序列中)或通过其他的重组抗体的体外亲和力成熟方法来进行进一步亲和力成熟，如上文所述。这种方法的优选示例是PROfusion展示技术。
在另一种方法中，还可以使用本领域已知的酵母展示方法生成抗体。在酵母展示方法中，使用遗传方法将抗体结构域拴系到酵母细胞壁并将它们展示在酵母表面上。此类酵母可用于展示从库或组合抗体文库(例如，人类或小鼠)表达的抗原结合结合域。可用于制备抗体的酵母展示方法的示例包括在美国专利号6,699,658(Wittrup等人)中公开的那些方法，该专利以引用的方式并入本文。
d.重组GFAP抗体的产生
抗体可以通过本领域已知的许多技术中的任一种来产生。例如，从宿主细胞的表达，其中通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体，但是在真核细胞中表达抗体是优选的，并且在哺乳动物宿主细胞中最优选，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能表达组装并分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220(1980))，与DHFR选择性标记一起使用，例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.,159:601-621(1982)中所述的NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解的是，可以执行以上过程的变型。例如，可能希望用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码与目标抗原结合不必要的轻链或重链中一个或两个的部分或全部DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也被本发明的抗体涵盖。另外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明抗体(即，结合人GFAP)，而另一条重链和轻链通过将本发明抗体通过标准化学交联方法与第二抗体交联而对除人GFAP之外的抗原具有特异性。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，该基因允许使用甲氨蝶呤的选择/扩增来选择已被该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供一种合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直到合成本发明的重组抗体。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
(1)人源化抗体
“人源化抗体”可以是抗体或其变体、衍生物、类似物或部分，其免疫特异性地结合目标抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。人源化抗体可以来自非人类物种抗体，其结合具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。
如本文所用，在CDR的背景下的术语“基本上”是指氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的CDR。人源化抗体包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。根据一个方面，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方式中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方式中，人源化抗体仅含有轻链和/或重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且可以使用本领域中熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如可以通过取代、插入或/或缺失至少一个氨基酸残基来对供体抗体CDR或共有框架进行诱变以使该位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在一个实施方式中，此类突变将不是广泛的。通常，至少90％、至少95％、选至少98％或至少99％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中最常出现在那个位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地出现，那么共有序列中可包括任一者。
人源化抗体可以被设计成最小化对啮齿类动物抗人抗体的不需要的免疫反应，这限制了那些部分在人类接受者中的治疗应用的持续时间和有效性。人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类残基通常被称为“输入”残基，通常取自可变结构域。人源化可以通过用高变区序列代替人类抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。例如，参见美国专利号4,816,567，其内容以引用的方式并入本文。人源化抗体可以是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。可以使用任何已知方法进行本发明抗体的人源化或工程化，诸如但不限于美国专利号5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539和4,816,567中所述的那些。
人源化抗体可以保留对GFAP的高亲和力和其他有利的生物学性质。人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型很常见。说明并且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。通过这种方式，可以从接受体和输入序列中选择并组合FR残基，以使得实现所需的抗体特征，诸如对GFAP的亲和力增加。总体上，高变区残基可以直接地并且最实质性地涉及影响抗原结合。
作为人源化的替代方案，可以生成人抗体(在本文中也称为“完全人抗体”)。例如，有可能经由PROfusion和/或酵母相关技术从文库分离出人抗体。还有可能生产转基因动物，例如，在免疫之后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人类抗体库的小鼠。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。人源化或全人抗体可根据美国专利号5,770,429、5,833,985、5,837,243、5,922,845、6,017,517、6,096,311、6,111,166、6,270,765、6,303,755、6,365,116、6,410,690、6,682,928和6,984,720中描述的方法制备，所述专利中每一个的内容都以引用的方式并入本文。
e.抗GFAP抗体
可以使用上文所述的技术以及使用本领域已知的常规技术生成抗GFAP抗体。在一些实施方式中，抗GFAP抗体可以是未缀合的GFAP抗体，诸如可购自以下的GFAP抗体：Dako(目录号：M0761)；ThermoFisher Scientific(目录号：MA5-12023、A-21282、13-0300、MA1-19170、MA1-19395、MA5-15086、MA5-16367、MA1-35377、MA1-06701或MA1-20035)；AbCam(目录号：ab10062、ab4648、ab68428、ab33922、ab207165、ab190288、ab115898或ab21837)；EMDMillipore(目录号：FCMAB257P、MAB360、MAB3402、04-1031、04-1062、MAB5628)；Santa Cruz(目录号：sc-166481、sc-166458、sc-58766、sc-56395、sc-51908、sc-135921、sc-71143、sc-65343或sc-33673)；Sigma-Aldrich(目录号：G3893或G6171)；Sino Biological Inc.(目录号：100140-R012-50)。抗GFAP抗体可以与荧光团缀合，诸如可购自以下的缀合的GFAP抗体：ThermoFisher Scientific(目录号：A-21295或A-21294)；EMD Millipore(目录号：MAB3402X、MAB3402B、MAB3402B或MAB3402C3)；或AbCam(目录号：ab49874或ab194325)。
8.方法的变型
所公开的确定样品中存在的感兴趣分析物(UCH-L1和/或GFAP)的存在或量的方法可以如本文所述。所述方法还可以根据用于分析分析物的其它方法进行调整。熟知的变型的示例包括但不限于免疫测定法，诸如夹心免疫测定法(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定法、单克隆-多克隆夹心免疫测定法，包括酶检测(酶免疫测定法(EIA)或酶联免疫吸附测定法)(ELISA)，竞争性抑制免疫测定法(例如正向和反向)、酶扩大免疫测定技术(EMIT)、竞争性结合测定法、生物发光共振能量转移(BRET)、一步抗体检测测定法、均质测定法、异质测定法、即时捕获测定法等。
a.免疫测定
感兴趣的分析物和/或肽或其片段(例如，UCH-L1和/或GFAP，和/或肽或其片段，即，UCH-L1和/或GFAP片段)可以在免疫测定中使用UCH-L1和/或GFAP抗体进行分析。可以使用抗体并且检测与分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的特异性结合来确定分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的存在或量。例如，抗体或其抗体片段可以特异性结合于分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)。如果需要，可以将一种或多种抗体与一种或多种可商购获得的单克隆/多克隆抗体组合使用。这类抗体可从诸如R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN)和EnzoLife Sciences International,Inc.(Plymouth Meeting,PA)的公司获得。
身体样品中分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的存在或存在量可以使用免疫测定法容易地确定，诸如夹心免疫测定法(例如单克隆-单克隆夹心免疫测定法、单克隆-多克隆夹心免疫测定法，包括放射性同位素检测(放射免疫测定法(RIA))和酶检测(酶免疫测定法(EIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)(例如Quantikine ELISAassays,R&D Systems,Minneapolis,MN))。可以使用的定点照护装置的示例是(Abbott,Laboratories,Abbott Park,IL)。可以使用的其它方法例如包括化学发光微粒免疫测定法，特别是采用自动分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)的方法。其他方法包括例如质谱法，和免疫组织化学法(例如利用来自组织活检的切片)，其使用抗分析物(例如，抗UCH-L1和/或抗GFAP)抗体(单克隆、多克隆、嵌合、人源化、人等)或其对分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的抗体片段。其它检测方法包括如美国专利号6,143,576、6,113,855、6,019,944、5,985,579、5,947,124、5,939,272、5,922,615、5,885,527、5,851,776、5,824,799、5,679,526、5,525,524和5,480,792中描述的那些，其各自通过引用整体并入本文。抗体与分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的特异性免疫结合可以经由附接至抗体的直接标记，诸如荧光或发光标签、金属和放射性核素，或经由间接标记，诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来检测。
固定化抗体或其抗体片段的使用可以结合到免疫测定法中。可以将抗体固定化在多种支持物上，诸如磁性或色谱基质颗粒、测定板(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料片等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。然后可以将此条浸入到测试样品中并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量信号，诸如显色的点。
可以使用均质形式。例如，在从受试者获得测试样品之后制备混合物。该混合物包含待评估分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的测试样品、第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体。加入测试样品、第一特异性结合配偶体和和第二特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不重要。测试样品同时与第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体接触。在一些实施方式中，第一特异性结合配偶体和包含在测试样品中的任何UCH-L1和/或GFAP可以形成第一特异性结合配偶体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-抗原复合物，并且第二特异性结合配偶体可以形成第一特异性结合配偶体-感兴趣的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。在一些实施方式中，第二特异性结合配偶体和包含在测试样品中的任何UCH-L1和/或GFAP可以形成第二特异性结合配偶体-分析物(例如，UCH-L1)-抗原复合物，并且第一特异性结合配偶体可以形成第一特异性结合配偶体-感兴趣的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。第一特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如，抗UCH-L1抗体，它与具有包含SEQ ID NO:1的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合；或抗GFAP抗体，它与具有包含SEQ ID NO:2的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合)。第二特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如，抗UCH-L1抗体，它与具有包含SEQ ID NO:1的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合；或抗GFAP抗体，它与具有包含SEQ ID NO:2的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合)。此外，第二特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记来标记或含有该可检测标记。
可以使用异质形式。例如，在从受试者获得测试样品之后制备第一混合物。混合物包含待评估分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的测试样品和第一特异性结合配偶体，其中第一特异性结合配偶体和测试样品中包含的任何UCH-L1和/或GFAP形成第一特异性结合配偶体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-抗原复合物。第一特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如，抗UCH-L1抗体，它与具有包含SEQ ID NO:1的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合；或抗GFAP抗体，它与具有包含SEQ ID NO:2的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合)。加入测试样品和第一特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不重要。
可以将第一特异性结合配偶体固定化在固相上。用于免疫测定法(针对第一特异性结合配偶体和任选地第二特异性结合配偶体)中的固相可以为在本领域中已知的任何固相，诸如但不限于磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、比色管、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘片和芯片。在固相是珠粒的那些实施方式中，珠粒可以是磁性珠粒或磁性颗粒。磁性珠粒/颗粒可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性铁磁材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO以及NiO/Fe。亚铁磁性材料的示例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(或FeO.Fe2O3)。珠粒可以具有磁性的实心核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。可替换地，磁性部分可以是围绕非磁性核心的层。其上固定化有第一特异性结合配偶体的固体支持物可以以干燥形式或以液体储存。磁性珠粒在与具有其上固定化有第一特异性结合配偶体的磁性珠粒的样品接触之前或之后可以经受磁场。
在形成含有第一特异性结合配偶体-分析物(例如，UCH-L1或GFAP)抗原复合物的混合物之后，使用本领域已知的任何技术从所述复合物中除去任何未结合的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)。例如，未结合的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)可以通过洗涤除去。然而，合乎需要的是第一特异性结合配偶体以超过测试样品中存在的任何分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的量存在，以使得测试样品中存在的所有分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)都被第一特异性结合配偶体结合。
在除去任何未结合的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)之后，将第二特异性结合配偶体添加到混合物中以形成第一特异性结合配偶体-感兴趣分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶体可以是抗分析物抗体(例如，抗UCH-L1抗体，它与具有包含SEQ ID NO:1的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合；或抗GFAP抗体，它与具有包含SEQ ID NO:2的至少三(3)个连续氨基酸的氨基酸序列的表位结合)。此外，第二特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记来标记或含有该可检测标记。
固定化抗体或其抗体片段的使用可以结合到免疫测定法中。可以将抗体固定化在多种支持物上，诸如磁性或色谱基质颗粒(诸如磁性珠粒)、胶乳颗粒或表面改性的胶乳颗粒、聚合物或聚合物薄膜、塑料或塑料薄膜、平面基材、测定板(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料片等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。然后可以将此条浸入到测试样品中并通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量信号，诸如显色的点。
在一些方面，有可能选择其他抗体，这些抗体相似地可以帮助维持免疫测定的动态范围和低端灵敏度。例如，选择至少一种与38kDa BDP的N-末端附近的表位结合的第一抗体(例如捕获抗体或第一特异性结合配偶体)和至少一种结合38kDa BDP的中间附近(例如，38kDa BDP的中间附近)的表位并且不与第一抗体重叠的第二抗体(例如检测抗体或第二特异性结合配偶体)可为有用的。其他变型是可能的，并且可以由普通技术人员容易地测试，诸如通过检查与短肽的结合来确认抗体与不同表位的结合，然后使用低校准物浓度筛选抗体对。此外，选择对GFAP具有不同亲和力的抗体也有助于维持或增加测定的动态范围。GFAP抗体已在文献中进行了描述，并且是可商购获得的。
(1)夹心免疫测定法
夹心免疫测定法测量抗体(即至少一种捕获抗体)和检测抗体(即，至少一种检测抗体)的两个层之间的抗原量。捕获抗体和检测抗体结合抗原上的不同表位，例如感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)。期望地，捕获抗体与表位的结合不会干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体均可用作夹心免疫测定法中的捕获抗体和检测抗体。
通常，采用至少两种抗体来分离和定量测试样品中的分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)。更具体地，至少两种抗体结合分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的某些表位，从而形成免疫复合物，其被称为“夹心”。可以将一种或多种抗体用于捕获测试样品中的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)(这些抗体常称为一种或多种“捕获”抗体)并且将一种或多种抗体用于使可检测(即可定量)标记结合夹心(这些抗体常称为一种或多种“检测抗体”)。在夹心测定法中，抗体与其表位的结合合乎需要地不会因测定中任何其它抗体与其相应表位的结合而减弱。选择抗体以使得与疑似含有分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的测试样品接触的一种或多种第一抗体不与第二或后续抗体所识别的表位的全部或部分结合，从而干扰一种或多种第二检测抗体结合分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的能力。
抗体可以在所述免疫测定法中用作第一抗体。抗体免疫特异性结合于分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)上的表位。除了本发明的抗体之外，所述免疫测定法可以包含第二抗体，所述第二抗体免疫特异性结合于未被第一抗体识别或结合的表位。
疑似含有分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的测试样品可以同时或依次地与至少一种第一捕获抗体(或多种抗体)和至少一种第二检测抗体接触。在夹心测定形式中，首先在允许形成第一抗体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)抗原复合物的条件下使疑似含有分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的测试样品与特异性结合于特定表位的至少一种第一捕获抗体接触。如果使用超过一种捕获抗体，则形成第一多重捕获抗体-UCH-L1和/或GFAP抗原复合物。在夹心测定法中，抗体、优选至少一种捕获抗体以测试样品中预期的分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)的最大量的摩尔过量量使用。例如，每ml微粒涂布缓冲液可以使用约5μg/mL至约1mg/mL抗体。
i.抗UCH-L1捕获抗体
任选地，在使测试样品与至少一种第一捕获抗体接触之前，至少一种第一捕获抗体可以结合至固体支持物，所述固体支持物有利于从测试样品分离第一抗体-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)复合物。可以使用本领域中已知的任何固体支持物，包括但不限于由聚合物材料制成、呈孔、管或珠粒(例如微粒)形式的固体支持物。一种(或多种)抗体可以通过吸附、通过使用化学偶联剂的共价键合或通过本领域中已知的其他手段与固体支持物结合，前提条件是这种结合不会干扰抗体结合分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的能力。此外，如果需要，可以将固体支持物衍生化以允许与抗体上的各种官能团反应。这种衍生化需要使用某些偶联剂，诸如但不限于顺丁烯二酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
此后将疑似含有分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的测试样品孵育以允许形成第一捕获抗体(或多重捕获抗体)-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)复合物。孵育可以在约4.5至约10.0的pH下，在约2℃至约45℃的温度下，并且持续至少约一(1)分钟至约十八(18)小时、约2-6分钟、约7-12分钟、约5-15分钟或约3-4分钟的时段来进行。
ii.检测抗体
在形成第一/多重捕获抗体-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)复合物之后，然后使复合物与至少一种第二检测抗体接触(在允许形成第一/多重抗体-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)抗原-第二抗体复合物的条件下)。在一些实施方式中，使测试样品与捕获抗体同时地与检测抗体接触。如果使第一抗体-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)复合物与超过一种检测抗体接触，则形成第一/多重抗体-分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)-多重抗体检测复合物。与第一抗体一样，当使至少第二(和后续)抗体与第一抗体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)复合物接触时，在与上述的那些类似的条件下孵育一段时间是形成第一/多重抗体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二/多重抗体复合物所需的。优选地，至少一种第二抗体含有可检测标记。在形成第一/多重抗体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二/多重抗体复合物之前、同时或之后，可检测标记可以结合至少一种第二抗体。可以使用本领域中已知的任何可检测标记。
化学发光测定法可以根据Adamczyk等人，Anal.Chim.Acta 579(1):61-67(2006)中所述的方法进行。虽然可以使用任何适合测定法形式，但微板化学发光计(Mithras LB-940,Berthold Technologies U.S.A.,LLC,Oak Ridge,TN)使得能够快速测定多个小体积样品。使用96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Costar#3792)时，化学发光计可以配备有多个试剂注射器。可以将每个样品添加至单独的孔中，然后同时/依次添加如由所采用的测定类型所确定的其它试剂。合乎需要地，避免采用吖啶芳基酯的中性或碱性溶液中的假碱形成，例如通过酸化。然后逐孔记录化学发光应答。就这一点而言，记录化学发光应答的时间部分地取决于添加试剂和所采用的特定吖啶之间的延迟。
添加测试样品和一种或多种特异性结合配偶体以形成用于化学发光测定法的混合物的顺序并不关键。如果第一特异性结合配偶体用吖啶化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-抗原(例如UCH-L1和/或GFAP)复合物。可替换地，如果使用第二特异性结合配偶体并且第二特异性结合配偶体用吖啶化合物可检测地标记，则形成可检测地标记的第一特异性结合配偶体-分析物(例如，UCH-L1和/或GFAP)-第二特异性结合配偶体复合物。任何未结合的特异性结合配偶体(无论标记或未标记的)都可以使用本领域中已知的任何技术(诸如洗涤)从混合物中除去。
过氧化氢可以在混合物中原位产生，或者在添加上述吖啶化合物之前、同时或之后提供或供应至混合物。过氧化氢可以许多方式(诸如将为本领域技术人员所显而易见的方式)原位产生。
可替换地，可以简单地将过氧化氢源添加至混合物。例如，过氧化氢源可以是已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其它溶液。就这一点而言，可以简单地添加过氧化氢溶液。
在同时或依次向样品中添加至少一种碱性溶液之后，产生指示分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱并且具有大于或等于10、优选大于或等于12的pH。碱性溶液的实例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。添加至样品中的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于所用碱性溶液的浓度，本领域技术人员可容易地确定添加至样品中的碱性溶液的量。可以采用除化学发光标记以外的其它标记。例如，可以采用酶标记(包括但不限于碱性磷酸酶)。
可以使用本领域技术人员已知的常规技术检测产生的化学发光信号或其他信号。基于产生信号的强度，可以定量样品中的感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的量。具体地，样品中分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的量与产生信号的强度成正比。所存在的分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的量可以通过将所产生的光的量与分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的标准曲线比较或通过与参考标准物比较来定量。可以通过质谱法、重量分析方法和本领域中已知的其他技术使用分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的已知浓度的连续稀释液或溶液来生成标准曲线。
(2)正向竞争抑制测定
在正向竞争形式中，使用已知浓度的标记的感兴趣分析物(例如，具有荧光标记(与可切割接头连接的标签)的分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)等)的等分试样与测试样品中的感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)竞争结合感兴趣分析物抗体(例如UCH-L1和/或GFAP抗体)。
在正向竞争测定中，固定化的特异性结合配偶体(诸如抗体)可以依次或同时与测试样品和标记的感兴趣分析物、其感兴趣分析物片段或感兴趣分析物变体接触。感兴趣分析物肽、感兴趣分析物片段或感兴趣分析物变体可以用任何可检测标记来标记，包括由用可裂解接头附接的标签组成的可检测标记。在此测定中，可以将抗体固定化在固体支持物上。可替换地，可以将抗体与固定化在固体支持物(诸如微粒或平面基材)上的抗体，诸如抗物种抗体偶联。
将标记的感兴趣分析物、测试样品和抗体在与上文结合夹心测定形式所述的那些类似的条件下孵育。然后可以产生两种不同物种的抗体-感兴趣分析物复合物。具体地，产生的抗体-感兴趣分析物复合物之一含有可检测标记(例如荧光标记等)，而另一种抗体-感兴趣分析物不含可检测标记。抗体-感兴趣分析物复合物可以但不必在定量可检测标记之前与测试样品的其余部分分离。无论抗体-感兴趣分析物复合物是否与测试样品的其余部分分离，然后都定量抗体-感兴趣分析物复合物中可检测标记物的量。然后可以确定测试样品中感兴趣分析物(诸如膜相关的感兴趣分析物、可溶性感兴趣分析物、可溶性感兴趣分析物的片段、感兴趣分析物的变体(膜相关的或可溶性感兴趣分析物)或其任何组合)的浓度，例如，如上所述的。
(3)反向竞争抑制测定
在反向竞争测定法中，固定化的感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)可以依次或同时地与测试样品和至少一种标记抗体接触。
感兴趣分析物可以与固体支持物，诸如上文结合夹心测定形式讨论的固体支持物结合。
将固定化的感兴趣分析物、测试样品和至少一种标记抗体在与上文结合夹心测定形式所述的那些类似的条件下孵育。然后产生两种不同物种的感兴趣分析物-抗体复合物。具体地，产生的感兴趣分析物-抗体复合物之一被固定化并且含有可检测标记(例如荧光标记等)，而另一种感兴趣分析物-抗体没有被固定化且不含可检测标记。通过本领域已知的技术，诸如洗涤，从固定化的感兴趣分析物-抗体复合物的存在中除去未固定化的感兴趣分析物-抗体复合物和测试样品的其余部分。一旦除去未固定化的感兴趣分析物抗体复合物则在裂解标签后定量固定化的感兴趣分析物-抗体复合物分析物中可检测标记的量。然后可以通过比较如上所述的可检测标记的数量来确定测试样品中每种感兴趣分析物的浓度。
(4)一步免疫测定法或“即时捕获”测定
在即时捕获免疫测定法中，将固体基质预先涂布有固定剂。将分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的捕获剂和检测剂共同添加至固体基质，之后进行洗涤步骤，然后检测。捕获剂可以结合分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)并且包含固定剂的配体。捕获剂和检测剂可以是抗体或如本文所述或本领域中已知的能够捕获或检测的任何其它部分。配体可以包含肽标签并且固定剂可以包含抗肽标签抗体。可替换地，配体和固定剂可以是能够结合在一起，以便用于即时捕获测定法的任何试剂对(例如特异性结合对，以及如本领域中已知的其他试剂对)。可以测量超过一种分析物。在一些实施方式中，可以用抗原涂布固体基质，并且待分析的分析物是抗体。
在某些其他实施方式中，在一步免疫测定法或“即时捕获”中，使用了预先涂布有固定剂(诸如生物素、链霉抗生物素蛋白等)的固体支持物(诸如微粒)和至少第一特异性结合配偶体和第二特异性结合配偶体(分别用作捕获试剂和检测试剂)。第一特异性结合配偶体包含固定剂的配体(例如，如果固体支持物上的固定剂是链霉抗生物素蛋白，则第一特异性结合配偶体上的配体可以是生物素)并且还结合感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)。第二特异性结合配偶体包含可检测标记并且结合感兴趣分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)。可以将固体支持物和第一和第二特异性结合配偶体(依次或同时地)添加到测试样品中。第一特异性结合配偶体上的配体与固体支持物上的固定剂结合，形成固体支持物/第一特异性结合配偶体复合物。存在于样品中的任何感兴趣分析物与固体支持物/第一特异性结合配偶体复合物结合以形成固体支持物/第一特异性结合配偶体/分析物复合物。第二特异性结合配偶体与固体支持物/第一特异性结合配偶体/分析物复合物结合，并且检测到可检测标记。在检测之前可以采用任选的洗涤步骤。在某些实施方式中，在一步测定法中，可以测量超过一种分析物。在某些其它实施方式中，可以采用超过两种特异性结合配偶体。在某些其它实施方式中，可以添加多种可检测标记。在某些其他实施方式中，可以检测到多种感兴趣分析物，或者测量、确定或评估它们的量、水平或浓度。
即时捕获测定法的使用可以以如本文所述、并且在本领域中已知的多种形式进行。例如，所述形式可以是如上所述的夹心测定法，但另选地可以是竞争测定法，可以采用单一特异性结合配偶体、或使用诸如已知的其他变型。
9.其他因素
如上所述的诊断、预后和/或评估的方法可以进一步包括使用其他因素进行诊断、预后和评估。在一些实施方式中，可以使用格拉斯哥昏迷量表来诊断创伤性脑损伤。也可以单独使用或与格拉斯哥昏迷量表组合使用其它测试、量表或指数。一个实例是瑞秋洛斯阿米哥斯量表(Ranchos Los Amigos Scale)。瑞秋洛斯阿米哥斯量表测量意识、认知、行为和与环境的互动的水平。瑞秋洛斯阿米哥斯量表包括：I级：无反应；II级：总体反应；III级：局部反应；IV级：困惑-躁动；V级：困惑-不适当反应；VI级：困惑-适当反应；VII级：自动-适当反应；和VIII级：有目的-适当反应。另一个示例是Rivermead脑震荡后症状问卷，其为测量TBI之后脑震荡后症状的严重程度的自我报告量表。要求患者对过去24小时内所具有的16种症状(例如头痛、头晕、恶心、呕吐)中每一种的严重程度进行评分。在每种情况下，将症状与损伤发生之前(发病前)的严重程度进行比较。这些症状按0至4的严重程度报告：没有经历过、不再是问题、轻度问题、中度问题和重度问题。
10.样品
在一些实施方式中，在受试者(诸如人类受试者)遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得样品。在一些实施方式中，在受试者(诸如人类受试者)摄入或暴露于火、化学品、毒素或火、化学品和毒素的组合之后获得样品。此类化学品和/或毒素的示例包括霉菌、石棉、杀虫剂和杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体(诸如一氧化碳、硫化氢和氰化物)、有机金属(诸如甲基汞、四乙基铅和有机锡)和/或一种或多种滥用药物。在一些实施方式中，样品获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如，SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者(诸如人类受试者)。
在又另一个实施方式中，本文所述的方法使用的样品还可以用于通过使用下文所述的抗UCH-L1和/或抗GFAP抗体或其抗体片段确定受试者中的UCH-L1和/或GFAP的水平来确定受试者是否患有TBI(诸如轻度TBI、中度TBI、重度TBI或中度至重度TBI)或处于罹患其风险中。因此，在特定实施方式中，本公开还提供了一种用于确定患有本文所述且本领域已知的创伤性脑损伤或处于本文所述且本领域已知的创伤性脑损伤的风险中的受试者是否是用于疗法或治疗的候选者的方法。通常，受试者是以下中的至少一者：(i)经历过头部损伤；(ii)摄入和/或暴露于一种或多种化学品和/或毒素；(iii)罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；或者，实际上已被诊断患有TBI或处于TBI的风险下(诸如像，罹患自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染(例如SARS-CoV-2)、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者)和/或展现出不利的(即临床上不希望的)如本文所述的UCH-L1和/或GFAP或者UCH-L1和/或GFAP片段的浓度或量。
a.测试或生物样品
如本文所用，“样品”、“测试样品”、“生物样品”是指含有或疑似含有UCH-L1和/或GFAP的流体样品。样品可以源自任何适合的来源。在一些情况下，样品可以包含液体、流动的微粒固体或固体颗粒的流体悬浮液。在一些情况下，可以在本文所述的分析之前处理样品。例如，可以在分析之前将样品从其来源分离或纯化；然而，在某些实施方式中，可以直接测定含有UCH-L1和/或GFAP的未处理样品。在一个具体示例中，UCH-L1和/或GFAP的来源是人体物质(例如体液、血液(诸如全血、血清、血浆)、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊髓液、口咽标本、鼻咽标本、粪便、组织、器官等)。组织可以包括但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。样品可以是液体样品或固体样品的液体提取物。在某些情况下，样品的来源可以是器官或组织，诸如活检样品，其可以通过组织分解/细胞裂解而溶解。
可以分析广泛范围体积的流体样品。在一些示例性实施方式中，样品体积可以是约0.5nL、约1nL、约3nL、约0.01μL、约0.1μL、约1μL、约5μL、约10μL、约100μL、约1mL、约5mL、约10mL等。在一些情况下，流体样品的体积在约0.01μL与约10mL之间、在约0.01μL与约1mL之间、在约0.01μL与约100μL之间、或在约0.1μL与约10μL之间。
在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行稀释。例如，在UCH-L1和/或GFAP的来源为人体液(例如全血、血清或血浆)的实施方式中，流体可以用适当的溶剂(例如缓冲液，诸如PBS缓冲液)进行稀释。在使用之前可以将流体样品稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多。在其它情况下，流体样品在用于测定中之前不进行稀释。
在一些情况下，样品可以经历分析前处理。分析前处理可以提供额外的功能性，诸如非特异性蛋白质去除和/或有效但可廉价实现的混合功能性。分析前处理的一般方法可以包括使用电动力捕获、AC电动力学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳或本领域已知的其它预浓缩技术。在一些情况下，流体样品可以在用于测定中之前进行浓缩。例如，在UCH-L1和/或GFAP的来源为人体液(例如全血、血清或血浆)的实施方式中，流体可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩。在使用之前可以将流体样品浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多。
b.对照
可能希望包括对照样品。对照样品可以与如上所述的来自受试者的样品同时分析。可以将从受试者样品获得的结果与从对照样品获得的结果进行比较。可以提供标准曲线，可以将样品的测定结果与其进行比较。如果使用荧光标记，则这类标准曲线呈现作为测定单位，即，荧光信号强度的函数的标记物水平。使用取自多个供体的样品，可以提供针对正常健康组织中UCH-L1和/或GFAP的参考水平，以及针对取自可能具有上文阐述的一个或多个特征的供体的组织中UCH-L1和/或GFAP的“有风险”水平的标准曲线。
因此，鉴于上文，提供了一种用于确定测试样品中UCH-L1和/或GFAP的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过免疫测定法测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP，例如采用至少一种结合UCH-L1和/或GFAP上的表位的捕获抗体和至少一种结合UCH-L1和/或GFAP上的不同于捕获抗体表位的表位并且任选地包括可检测标记的检测抗体，并且包括将作为测试样品中UCH-L1和/或GFAP的存在、量或浓度的直接或间接指示的由可检测标记生成的信号与作为校准物中UCH-L1和/或GFAP的存在、量或浓度的直接或间接指示的生成信号进行比较。校准物任选地、且优选地是一系列校准物的一部分，其中每种校准物与系列中的其他校准物的不同之处在于UCH-L1和/或GFAP的浓度。
11.试剂盒
本文提供一种试剂盒，该试剂盒可以用于测定或评估测试样品的UCH-L1和/或GFAP或UCH-L1和/或GFAP片段。该试剂盒包含用于测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP的至少一种组分和用于测定测试样品UCH-L1和/或GFAP的说明书。例如，该试剂盒可包括用于通过免疫测定法(例如，化学发光微粒免疫测定法)测定测试样品的UCH-L1和/或GFAP的说明书。试剂盒中所包括的说明书可以粘贴于包装材料上或可以作为包装说明书包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖了能够存储这类说明并将其传达给最终使用者的任何介质。这类介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网网站的地址。
至少一种组分可以包括至少一种组合物，该组合物包含特异性结合于UCH-L1和/或GFAP的一种或多种分离抗体或其抗体片段。抗体可以是UCH-L1和/或GFAP捕获抗体和/或UCH-L1和/或GFAP检测抗体。
可选地或另外，试剂盒可以包含校准物或对照(例如纯化的且任选冻干的UCH-L1和/或GFAP)和/或用于进行测定的至少一个容器(例如管、微量滴定板或条，其可以已经用抗UCH-L1和/或GFAP单克隆抗体涂布)和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一者都可以提供为浓缩溶液、可检测标记(例如酶标记)的底物溶液、或终止溶液。优选地，试剂盒包含进行测定法所必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。说明书还可以包括用于生成标准曲线的说明书。
试剂盒可以进一步包含用于定量UCH-L1和/或GFAP的参考标准物。参考标准物可以用于建立标准曲线以内推和/或外推UCH-L1和/或GFAP的浓度。参考标准物可以包括高UCH-L1和/或GFAP浓度水平，例如，约100000pg/mL、约125000pg/mL、约150000pg/mL、约175000pg/mL、约200000pg/mL、约225000pg/mL、约250000pg/mL、约275000pg/mL或约300000pg/mL；中等UCH-L1和/或GFAP浓度水平，例如，约25000pg/mL、约40000pg/mL、约45000pg/mL、约50000pg/mL、约55000pg/mL、约60000pg/mL、约75000pg/mL或约100000pg/mL；和/或低UCH-L1和/或GFAP浓度水平，例如，约1pg/mL、约5pg/mL、约10pg/mL、约12.5pg/mL、约15pg/mL、约20pg/mL、约25pg/mL、约30pg/mL、约35pg/mL、约40pg/mL、约45pg/mL、约50pg/mL、约55pg/mL、约60pg/mL、约65pg/mL、约70pg/mL、约75pg/mL、约80pg/mL、约85pg/mL、约90pg/mL、约95pg/mL或约100pg/mL。
试剂盒中提供的任何抗体，诸如对UCH-L1和/或GFAP具有特异性的重组抗体可以合并可检测标记，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团或化学发光标记等，或者试剂盒可以包括用于标记抗体的试剂或用于检测抗体(例如检测抗体)的试剂和/或用于标记分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的试剂或用于检测分析物(例如UCH-L1和/或GFAP)的试剂。抗体、校准物和/或对照可以提供于独立容器中或预分配至适当测定形式中，例如预分配至微量滴定板中。
任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如敏感性组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备为本领域中所熟知且描述于各种免疫诊断产品的插页上。敏感性组成员任选地用于确立测定法性能特征，并且进一步任选地是免疫测定试剂盒试剂的完整性和测定法的标准化的可用指标。
试剂盒也可以任选地包括进行诊断测定法或有利于质量控制评价所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。用于分离和/或处理测试样品的其他组分(诸如缓冲液和溶液)(例如预处理试剂)也可以包括于试剂盒中。试剂盒可以另外包括一个或多个其它对照。试剂盒的一种或多种组分可以被冻干，在所述情况下试剂盒可以进一步包括适于复原冻干组分的试剂。
试剂盒的各种组分任选地根据需要提供于适合容器，例如微量滴定板中。试剂盒可以进一步包括用于容纳或存储样品的容器(例如用于尿液、全血、血浆或血清样品的容器或盒)。适当时，试剂盒任选地也可以含有反应器皿、混合器皿和有利于制备试剂或测试样品的其它组分。试剂盒也可以包括用于帮助获得测试样品的一种或多种仪器，诸如注射器、移液管、钳子、测量匙等。
如果可检测标记是至少一种吖啶化合物，则试剂盒可以包括至少一种吖啶-9-甲酰胺、至少一种吖啶-9-羧酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一种吖啶化合物，则试剂盒也可以包括过氧化氢来源，诸如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。如果需要，试剂盒可以含有固相，诸如磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、比色管、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘片或芯片。
如果需要，试剂盒可以进一步包括用于测定测试样品中的另一种分析物的一种或多种组分，这些组分单独地或与说明书进一步组合，所述另一种分析物可以是生物标志物，诸如创伤性脑损伤或病症的生物标志物。
a.试剂盒和方法的适应性
试剂盒(或其组分)以及用于通过本文所述的免疫测定法评估或测定测试样品中UCH-L1和/或GFAP的浓度的方法可以适用于多种自动化和半自动化系统(包括其中固相包括微粒的那些)，如例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164中所述的和如例如由Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)作为Abbott定点照护(或i-STAT Alinity,AbbottLaboratories)商业市售的，以及美国专利号5,089,424和5,006,309中所述的那些和如例如由Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)作为/>或Abbott Alinity装置系列商业市售的。
自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如ELISA)之间相比的一些差异包括第一特异性结合配偶体(例如分析物抗体或捕获抗体)所附接的底物(其可能影响夹心形成和分析物反应性)，以及捕获、检测和/或任何任选洗涤步骤的长度和时间。非自动化形式(诸如ELISA)关于样品和捕获试剂可能需要相对较长的孵育时间(例如约2小时)，而自动化或半自动化形式(例如和任何后继平台，Abbott Laboratories)可能具有相对较短的孵育时间(例如，对于/>为大约18分钟)。类似地，非自动化形式(诸如ELISA)可能以相对较长孵育时间(例如约2小时)孵育检测抗体(诸如缀合试剂)，而自动化或半自动化形式(例如/>和任何后继平台)可能具有相对较短的孵育时间(例如对于/>和任何后继平台为大约4分钟)。
可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于(参见例如美国专利号5,294,404，其据此通过引用整体并入)、/>EIA(珠粒)和QuantumTMII以及其他平台。另外，测定法、试剂盒和试剂盒组分可以在其它形式中，例如在电化学或其它手持型或定点照护型测定系统上采用。如先前所提及的，本公开例如适用于进行夹心免疫测定法的商业Abbott定点照护(/>Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。免疫传感器及其制造方法和在单次使用测试装置中操作的方法描述于例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、2004/0018577、2005/0054078和2006/0160164中，其关于此方面的教导均通过引用整体并入。
关于测定法对系统的适应性，优选以下配置。将微制作的硅芯片制造有一对金安培计工作电极和银-氯化银参考电极。在一个工作电极上，将具有固定化的捕获抗体的聚苯乙烯珠粒(直径0.2mm)粘附到电极上的图案化聚乙烯醇的聚合物涂层上。将该芯片组装成具有适于免疫测定法的流体形式的/>盒。在硅芯片的一部分上，存在UCH-L1和/或GFAP的特异性结合配偶体，诸如一种或多种UCH-L1和/或GFAP抗体(一种或多种单克隆/多克隆抗体或其片段、其变体或其变体的可以结合UCH-L1和/或GFAP的片段)或一种或多种抗UCH-L1和/或GFAP DVD-Ig(或其片段、其变体或其变体的可以结合UCH-L1和/或GFAP的片段)，其中的任一者都可以可检测地标记。在盒的流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸盐的含水试剂。
在操作中，将来自疑似患有TBI的受试者的样品添加到测试盒的保持室中，并且将盒插入到读取器中。盒内的泵元件将样品推入到含有芯片的管道中。使样品与传感器接触，从而使酶缀合物溶解到样品中。将样品在传感器上振荡，以促进大约2-12分钟的夹层形成。在测定法的倒数第二步中，将样品推入到废物室中并且使用含有针对碱性磷酸酶的底物的洗涤流体来洗涤过量的酶缀合物并从传感器芯片上取样。在测定的最后步骤中，碱性磷酸酶标记与对氨基苯酚磷酸酯反应以裂解磷酸酯基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极处被电化学氧化。基于所测量的电流，读取器能够通过嵌入算法和制造厂确定的校准曲线计算样品中UCH-L1和/或GFAP的量。
本文描述的用于本公开的方法的自动化和半自动化系统可以利用一个或多个计算机程序、软件或算法来确定(读出)是进行CT扫描(例如，基于阳性结果)还是不进行CT扫描(例如，基于阴性结果)。例如，计算机程序或软件(例如，利用算法)可以提供以下解释(无论是使用一个、两个还是更多样品)：(1)当GFAP和UCH-L1的水平低于参考水平(或截止值)时，结果为阴性，意味将不进行CT扫描；或(2)当GFAP和/或UCH-L1的水平大于或等于参考水平(或截止值)时，结果为阳性，意味将进行CT扫描。计算机程序或软件可以提供其他适当的解释，例如参考水平是否与头部CT阳性、颅内病变的存在或与未遭受创伤性脑损伤的对照受试者相关，罹患TBI的受试者是否应该被监测和/或用TBI治疗进行治疗等。此类计算机程序或软件在本领域中是众所周知的。
如本文所述的方法和试剂盒必然涵盖用于进行免疫测定法的其他试剂和方法。例如，涵盖各种缓冲液，诸如本领域中已知和/或可以易于制备或优化以例如用于洗涤、用作缀合物稀释剂、微粒稀释剂和/或用作校准物稀释剂的缓冲液。示例性缀合物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)中所采用且含有2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)、盐、蛋白阻断剂、抗微生物剂和洗涤剂的缀合物稀释剂。示例性校准物稀释剂是在某些试剂盒(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)中所采用的人校准物稀释剂，其包含含有MES、其它盐、蛋白阻断剂和抗微生物剂的缓冲液。另外，如2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142,048中所述，可以例如在盒形式中，使用与信号抗体连接的核酸序列作为信号放大剂获得改善的信号产生。
虽然本文的某些实施方式在用于评估疾病(诸如创伤性脑损伤)时是有利的，但是测定法和试剂盒也可以任选地在适当时用于评估其他疾病、病症和病状中的UCH-L1和/或GFAP。
测定方法也可用于鉴定改善疾病，诸如创伤性脑损伤的化合物。例如，可以使表达UCH-L1和/或GFAP的细胞与候选化合物接触。可以使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的UCH-L1和/或GFAP的表达水平与对照细胞中的表达水平进行比较。
本发明具有多个方面，这通过以下非限制性实施例说明。
实施例
实施例1
UCH-L1测定
将UCH-L1测定用于对CT扫描阴性的受试者进行的TBI患者群体研究。使用单克隆抗体对，例如作为捕获单克隆抗体的抗体A和作为检测单克隆抗体的抗体B和C。抗体A是在雅培实验室(Abbott Park,IL)内部开发的示例性抗UCH-L1抗体。抗体B和C识别UCH-L1的不同表位，并增强样品中抗原的检测，它们由Banyan Biomarkers(Alachua,Florida)开发。在Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)内部开发的其他抗体或其他可商购获得的抗体在以各种组合方式一起用作捕获抗体或检测抗体时，也显示或预期显示类似的信号增强。UCH-L1测定设计根据关键性能属性进行了评估。盒的配置是抗体配置：抗体A(捕获抗体)/抗体B+C(检测抗体)；试剂条件：0.8％的固体、125μg/mL Fab碱性磷酸酶簇缀合物；以及样品入口打印：UCH-L1标准物。测定时间为10-15min(样品捕获时间为7-12min)。
实施例2
GFAP测定
将GFAP测定用于TBI患者群体研究。使用单克隆抗体对，例如作为捕获单克隆抗体的抗体A和作为检测单克隆抗体的抗体B。抗体A和抗体B是在雅培实验室(Abbott Park,IL)内部开发的示例性抗GFAP抗体。抗体A和抗体B结合同一GFAP分解产物内的表位。GFAP测定设计根据关键性能属性进行了评估。盒的配置是抗体配置：抗体A(捕获抗体)/抗体B(检测抗体)；试剂条件：0.8％的固体、250μg/mL Fab碱性磷酸酶簇缀合物；以及样品入口打印：GFAP特有的。测定时间为10-15min(样品捕获时间为7-12min)。
实施例3
评估CT扫描阴性受试者的GFAP和UCH-L1水平
为了评估生物标志物诸如GFAP和UCH-L1在预测计算机断层扫描(CT)阴性TBI时的血液水平，从接受头部CT扫描的成人(即18岁或以上)创伤受试者中收集血液样品。评估了具有阴性(Marshall分类＝1)CT扫描的受试者的生物标志物浓度。
图1A-图1D显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与格拉斯哥昏迷评分(GCS)严重程度相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起12小时内(图1A、1C)或自损伤起约24小时内(即，在约24.1小时内)(图1B、1D)评定样品。GFAP水平示出于图1A和图1B中。UCH-L1水平示出于图1C和图1D中。
图2A-图2F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与损伤之后的意识丧失相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图2A、2D)、12小时内(图2B、2E)或约24小时内(即，在约24.1小时内)(图2C、2F)评定样品。GFAP水平示于图2A-图2C中。UCH-L1水平示于图2D-图2F中。
图3A-图3F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与MRI结果相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图3A、3D)、12小时内(图3B、3E)或约24小时内(即，在约24.1小时内)(图3C、3F)评定样品。GFAP水平示出于图3A-图3C中。UCH-L1水平示出于图3D-图3F中。
图4A-图4F显示针对CT扫描对TBI呈阴性的那些受试者的与创伤后健忘症(存在相对于不存在)相关的UCH-L1水平或GFAP水平的ROC分析。在自损伤起4小时内(图4A、4D)、12小时内(图4B、4E)或约24小时内(即，在约24.1小时内)(图4C、4F)评定样品。GFAP水平示于图4A-图4C中。UCH-L1水平示于图4D-图4F中。
对于本领域技术人员显而易见的是，本文所述的本公开方法的其他适合修改和变型是容易应用和了解的，并且可以在不脱离本公开或本文公开的方面和实施方式的范围下使用适合等同物来进行。现已详细描述本公开，通过参考以下实施例将对其有更明确理解，所述实施例仅旨在说明本公开的一些方面和实施方式，并且不应视为限制本公开的范围。本文中提及的所有期刊参考文献、美国专利和公布的公开内容均据此通过引用全文并入。
本发明具有多个方面，所述方面通过本文所述的非限制性实施例说明。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求及其等效物限定。
所公开的实施方式的各种改变和修改对本领域技术人员是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可以进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的这类改变和修改。
出于完整性的原因，在以下编号条款中列出本发明的各个方面：
条款1.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者的方法的改进，所述方法包括同时或依次进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描，其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述头部CT扫描对TBI呈阴性，则所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
条款2.如条款1所述的改进，其还包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述成像程序对TBI呈阴性，则治疗所述受试者的TBI。
条款3.如条款1或条款2中任一项所述的改进，其中所述参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
条款4.如条款1-3中任一项所述的改进，其中在所述实际或怀疑头部损伤之后的约0至约12小时内或在所述怀疑头部损伤之后的约12至约24小时内取得所述样品。
条款5.如条款1-4中任一项所述的改进，其中测量UCH-L1的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款6.如条款1-5中任一项所述的改进，其中测量GFAP的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款7.如条款1-6中任一项所述的改进，其中所述测定是使用定点照护测定或单分子检测进行的。
条款8.如条款1-7中任一项所述的改进，其中所述样品选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。
条款9.如条款1-8中任一项所述的改进，其中在所述受试者已经遭受或可能已经遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得所述样品。
条款10.如条款1-9中任一项所述的改进，其中在所述受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或火、化学品和毒素的组合之后获得所述样品。
条款11.如条款10所述的改进，其中所述化学品或毒素是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。
条款12.如条款1-11中任一项所述的改进，其中所述样品获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
条款13.如条款1-12中任一项所述的改进，其中所述方法可以对任何受试者进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP或UCH-L1和GFAP；以及所述受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
条款14.如条款1-13中任一项所述的改进，其还包括监测所述受试者。
条款15.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者的方法，所述方法包括：
a.同时或依次进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关时间范围内的头部计算机断层(CT)扫描；以及
b.如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述头部CT扫描对TBI呈阴性，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
条款16.如条款15所述的方法，其还包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述CT扫描对TBI呈阴性，则治疗所述受试者的TBI。
条款17.如条款15或条款16中任一项所述的方法，其中所述参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
条款18.如条款15-17中任一项所述的方法，其中在所述实际或怀疑头部损伤之后的约0至约12小时内或在所述怀疑头部损伤之后的约12至约24小时内取得所述样品。
条款19.如条款15-18中任一项所述的方法，其中测量UCH-L1的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款20.如条款15-19中任一项所述的方法，其中测量GFAP的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款21.如条款15-20中任一项所述的方法，其中所述测定是使用定点照护测定或单分子检测进行的。
条款22.如条款15-21中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。
条款23.如条款15-22中任一项所述的方法，其中在所述受试者已经遭受或可能已经遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的头部损伤之后获得所述样品。
条款24.如条款15-22中任一项所述的方法，其中在所述受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或火、化学品和毒素的组合之后获得所述样品。
条款25.如条款24所述的方法，其中所述化学品或毒素是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。
条款26.如条款15-22中任一项所述的方法，其中所述样品获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
条款27.如条款15-22中任一项所述的方法，其中所述方法可以对任何受试者进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或重度至中度至重度创伤性脑损伤的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP或UCH-L1和GFAP；以及所述受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
条款28.如条款15-27中任一项所述的方法，其还包括监测所述受试者。
条款29.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者的方法的改进，其中所述受试者在所述实际或怀疑头部损伤的临床相关时间范围内接受了对创伤性脑损伤(TBI)呈阴性的头部计算机断层(CT)扫描，所述方法包括与头部CT同时或依序对在所述实际或怀疑头部损伤之后约24小时内获自所述受试者的样品进行测定，以测量或检测所述样品中生物标志物的水平，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
条款30.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者的方法的改进，所述方法包括对在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内获自所述受试者的样品进行测定，以测量或检测所述样品中生物标志物的水平，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；并且其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平，并且在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描对TBI呈阴性，或者没有对所述受试者进行头部CT扫描，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
条款31.如条款30所述的改进，其还包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且任选地，如果进行的话，头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗所述受试者的TBI。
条款32.如条款30或条款31中任一项所述的改进，其中所述参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
条款33.如条款30-32中任一项所述的改进，其中在所述实际或怀疑头部损伤之后的约0至约12小时内或在所述实际或怀疑头部损伤之后的约12至约24小时内取得所述样品。
条款34.如条款30-33中任一项所述的改进，其中测量UCH-L1的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款35.如条款30-34中任一项所述的改进，其中测量GFAP的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
条款36.如条款30-35中任一项所述的改进，其中所述测定是使用定点照护测定或单分子检测进行的。
条款37.如条款30-36中任一项所述的改进，其中所述样品选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。
条款38.如条款30-37中任一项所述的改进，其中在所述受试者遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的实际头部损伤之后获得所述样品。
条款39.如条款30-37中任一项所述的改进，其中在所述受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或火、化学品和毒素的组合之后获得所述样品。
条款40.如条款39所述的改进，其中所述化学品或毒素是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。
条款41.如条款30-37中任一项所述的改进，其中所述样品获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
条款42.如条款30-41中任一项所述的改进，其中所述方法可以对任何受试者进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或重度至中度至重度创伤性脑损伤的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1；以及所述受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
条款43.如条款30-42中任一项所述的改进，其还包括监测所述受试者。
条款44.如条款1-14中任一项所述的改进，其中所述血液样品是全血样品、血清样品或血浆样品。
条款45.如条款1-14或44中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
条款46.如条款15-28中任一项所述的方法，其中所述血液样品是全血样品、血清样品或血浆样品。
条款47.如条款15-28或46中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
条款48.如条款29-42中任一项所述的改进，其中所述血液样品是全血样品、血清样品或血浆样品。
条款49.如条款29-42或48中任一项所述的改进，其中所述受试者是人类受试者。
序列表
<110> 雅培实验室
<120> 用一或多种生物标志物确定已受头部计算机断层扫描且对TBI呈阴性受试者的创伤性脑损伤TBI
<130> ABBTL-39073.601
<150> US 63/120,062
<151> 2020-12-01
<150> US 63/170,873
<151> 2021-04-05
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Met Gln Leu Lys Pro Met Glu Ile Asn Pro Glu Met Leu Asn Lys Val
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Gly Val Ala Gly Gln Trp Arg Phe Val Asp Val Leu
20 25 30
Gly Leu Glu Glu Glu Ser Leu Gly Ser Val Pro Ala Pro Ala Cys Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Thr Ala Gln His Glu Asn Phe Arg Lys
50 55 60
Lys Gln Ile Glu Glu Leu Lys Gly Gln Glu Val Ser Pro Lys Val Tyr
65 70 75 80
Phe Met Lys Gln Thr Ile Gly Asn Ser Cys Gly Thr Ile Gly Leu Ile
85 90 95
His Ala Val Ala Asn Asn Gln Asp Lys Leu Gly Phe Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Val Leu Lys Gln Phe Leu Ser Glu Thr Glu Lys Met Ser Pro Glu Asp
115 120 125
Arg Ala Lys Cys Phe Glu Lys Asn Glu Ala Ile Gln Ala Ala His Asp
130 135 140
Ala Val Ala Gln Glu Gly Gln Cys Arg Val Asp Asp Lys Val Asn Phe
145 150 155 160
His Phe Ile Leu Phe Asn Asn Val Asp Gly His Leu Tyr Glu Leu Asp
165 170 175
Gly Arg Met Pro Phe Pro Val Asn His Gly Ala Ser Ser Glu Asp Thr
180 185 190
Leu Leu Lys Asp Ala Ala Lys Val Cys Arg Glu Phe Thr Glu Arg Glu
195 200 205
Gln Gly Glu Val Arg Phe Ser Ala Val Ala Leu Cys Lys Ala Ala
210 215 220
<210> 2
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Met Glu Arg Arg Arg Ile Thr Ser Ala Ala Arg Arg Ser Tyr Val Ser
1 5 10 15
Ser Gly Glu Met Met Val Gly Gly Leu Ala Pro Gly Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Thr Arg Leu Ser Leu Ala Arg Met Pro Pro Pro Leu Pro Thr
35 40 45
Arg Val Asp Phe Ser Leu Ala Gly Ala Leu Asn Ala Gly Phe Lys Glu
50 55 60
Thr Arg Ala Ser Glu Arg Ala Glu Met Met Glu Leu Asn Asp Arg Phe
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Ile Glu Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Leu Arg Ala Lys Glu Pro Thr Lys Leu
100 105 110
Ala Asp Val Tyr Gln Ala Glu Leu Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Asp
115 120 125
Gln Leu Thr Ala Asn Ser Ala Arg Leu Glu Val Glu Arg Asp Asn Leu
130 135 140
Ala Gln Asp Leu Ala Thr Val Arg Gln Lys Leu Gln Asp Glu Thr Asn
145 150 155 160
Leu Arg Leu Glu Ala Glu Asn Asn Leu Ala Ala Tyr Arg Gln Glu Ala
165 170 175
Asp Glu Ala Thr Leu Ala Arg Leu Asp Leu Glu Arg Lys Ile Glu Ser
180 185 190
Leu Glu Glu Glu Ile Arg Phe Leu Arg Lys Ile His Glu Glu Glu Val
195 200 205
Arg Glu Leu Gln Glu Gln Leu Ala Arg Gln Gln Val His Val Glu Leu
210 215 220
Asp Val Ala Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Lys Glu Ile Arg Thr
225 230 235 240
Gln Tyr Glu Ala Met Ala Ser Ser Asn Met His Glu Ala Glu Glu Trp
245 250 255
Tyr Arg Ser Lys Phe Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ala Ala Arg Asn Ala
260 265 270
Glu Leu Leu Arg Gln Ala Lys His Glu Ala Asn Asp Tyr Arg Arg Gln
275 280 285
Leu Gln Ser Leu Thr Cys Asp Leu Glu Ser Leu Arg Gly Thr Asn Glu
290 295 300
Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Gln Glu Glu Arg His Val Arg Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Arg Leu Glu Glu Glu Gly Gln
325 330 335
Ser Leu Lys Asp Glu Met Ala Arg His Leu Gln Glu Tyr Gln Asp Leu
340 345 350
Leu Asn Val Lys Leu Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys
355 360 365
Leu Leu Glu Gly Glu Glu Asn Arg Ile Thr Ile Pro Val Gln Thr Phe
370 375 380
Ser Asn Leu Gln Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Val Ser
385 390 395 400
Glu Gly His Leu Lys Arg Asn Ile Val Val Lys Thr Val Glu Met Arg
405 410 415
Asp Gly Glu Val Ile Lys Glu Ser Lys Gln Glu His Lys Asp Val Met
420 425 430
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
His His His His His His
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Ala Asp Asp Asp Asp Lys
1 5

Claims (17)

1.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的受试者的方法的改进，所述方法包括同时或依次进行：(1)在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内，对获自所述受试者的样品的测定，以测量或检测所述样品中的生物标志物，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；以及(2)在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描，其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且所述头部CT扫描对TBI呈阴性，则所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
2.一种用于帮助诊断和评估已经遭受或可能已经遭受头部损伤的人类受试者的方法的改进，所述方法包括对在实际或怀疑头部损伤之后的约24小时内获自所述受试者的样品进行测定，以测量或检测所述样品中生物标志物的水平，所述生物标志物包括泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)或其组合；并且其中所述改进包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平，并且在临床相关的时间范围内对所述受试者的头部计算机断层(CT)扫描对TBI呈阴性或者没有对所述受试者进行头部CT扫描，则将所述受试者诊断为较有可能患有创伤性脑损伤(TBI)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的改进，其还包括如果所述生物标志物的所述水平高于参考水平并且任选地，如果进行的话，头部CT扫描对TBI呈阴性，则治疗所述受试者的TBI。
4.如权利要求1-3中任一项所述的改进，其中所述参考水平和与以下相关联的截止水平相关：(a)已经遭受头部损伤的受试者的水平；(b)受试者的TBI的发生；(c)受试者的TBI的阶段，诸如轻度、中度、重度或中度至重度；(d)受试者的意识丧失；(e)对TBI呈MRI阳性，而不是阴性；(f)受试者的健忘症的发生(即，存在健忘症相对于不存在健忘症)或(g)受试者的TBI的严重程度。
5.如权利要求1-4中任一项所述的改进，其中在所述实际或怀疑头部损伤之后的约0至约12小时内或在所述实际或怀疑头部损伤之后的约12至约24小时内取得所述样品。
6.如权利要求1-5中任一项所述的改进，其中测量UCH-L1的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的改进，其中测量GFAP的所述水平是通过免疫测定或临床化学测定进行的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的改进，其中所述测定是使用定点照护测定或单分子检测进行的。
9.如权利要求1-8中任一项所述的改进，其中所述样品选自由以下组成的组：血液样品、尿液样品、脑脊液样品、组织样品、体液样品、唾液样品、口咽标本和鼻咽标本。
10.如权利要求1-9中任一项所述的改进，其中在所述受试者已经遭受或可能已经遭受由身体摇动、导致闭合性或开放性头部创伤的外部机械力或其他力产生的钝性冲击、一次或多次跌倒、爆炸或冲击波或其他类型的钝力创伤引起的实际头部损伤之后获得所述样品。
11.如权利要求1-10中任一项所述的改进，其中在所述受试者摄入或暴露于火、化学品、毒素或火、化学品和毒素的组合之后获得所述样品。
12.如权利要求11所述的改进，其中所述化学品或毒素是霉菌、石棉、杀虫剂、杀昆虫剂、有机溶剂、油漆、胶水、气体、有机金属、滥用药物或其一种或多种组合。
13.如权利要求1-10中任一项所述的改进，其中所述样品获自患有自身免疫疾病、代谢紊乱、脑肿瘤、缺氧、病毒感染、真菌感染、细菌感染、脑膜炎、脑积水或其任何组合的受试者。
14.如权利要求1-13中任一项所述的改进，其中所述方法可以对任何受试者进行，而不考虑选自由以下组成的组的因素：所述受试者的临床状况；所述受试者的实验室值；所述受试者呈轻度、中度、重度或中度至重度创伤性脑损伤的分类；所述受试者表现出低、中或高水平的UCH-L1、GFAP或UCH-L1和GFAP；以及所述受试者已经遭受或可能已经遭受头部损伤的任何事件的时间。
15.如权利要求1-14中任一项所述的改进，其还包括监测所述受试者。
16.如权利要求1-15中任一项所述的改进，其中所述血液样品是全血、血清样品或血浆。
17.如权利要求1-16中任一项所述的改进，其中所述受试者是人类受试者。
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