CN106124777A - 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒，吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白；所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽；所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽。这种吖啶标记结合物的载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成‑NH‑CO‑结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的活性相对较高。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒。
背景技术
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原、半抗原或抗体的免疫分析方法。用于标记的化学发光物质包括吖啶取代物，根据取代基的不同，吖啶取代物分为两类：吖啶酯(acridinium ester，AE)和吖啶磺酰胺，二者均为有效的发光标记物，通过起动发光试剂(NaOH、H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。
吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂，检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低，与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。这类化合物从发光的机理来说特点是：1、发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。2、吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性，优点主要有：①背景发光低，信噪比高；②发光反应干扰因素少；③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)。因此吖啶取代物是一类非常有效、非常好的化学发光标记物。
吖啶标记结合物为吖啶取代物与待标记物(抗体、抗原，等)结合得到的复合物。吖啶标记结合物质量的好坏直接关系到化学发光免疫分析技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
目前常用的吖啶标记结合物的制备方法是碳二亚胺交联法，以碳二亚胺交联剂为桥，使吖啶取代物与待标记蛋白结合。然而，传统方法制得的吖啶标记结合物中，吖啶取代物与待标记蛋白通过碳二亚胺结合，吖啶取代物往往会对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，造成吖啶标记结合物的活性降低，影响免疫分析的灵敏度。
发明内容
基于此，有必要提供一种活性相对较高的吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒。
一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白；
所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
在一个实施例中，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。
在一个实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白或血蓝蛋白。
在一个实施例中，所述待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。
一种上述的吖啶标记结合物的制备方法，包括如下步骤：
用吖啶取代物和载体蛋白共价交联，充分反应后得到吖啶取代物-载体蛋白结合物，其中，所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
对所述吖啶取代物-载体蛋白结合物进行纯化；
用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基进行活化；以及
用羧基活化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联，充分反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白，所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
在一个实施例中，所述用吖啶取代物和载体蛋白共价交联的操作中，所述吖啶取代物和所述载体蛋白的摩尔比为100～20000：1。
在一个实施例中，所述用羧基活化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联的操作中，所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与所述待标记蛋白的摩尔比为5：1～1：5。
在一个实施例中，所述用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基进行活化的操作中，所述交联剂包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺。
在一个实施例中，所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述吖啶取代物-载体蛋白结合物的摩尔比为10～5000：1；
所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：1～1：10。
一种化学发光试剂盒，用于结合待标记蛋白形成上述的吖啶标记结合物，所述化学发光试剂盒包括：吖啶取代物和载体蛋白；
所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白可以通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基可以与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
这种吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白， 载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的活性相对较高。此外，载体蛋白可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
附图说明
图1为一实施方式的吖啶标记结合物的制备方法的流程图；
图2为测试例中得到的系列浓度TSH抗原样本检验结果散点图；
图3为测试例中得到的系列浓度E2抗原样本检验结果散点图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种吖啶标记结合物，包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白。
载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接。
载体蛋白可以为本身就具有羧基和氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引入羧基和氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，载体蛋白可以为牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白或血蓝蛋白。
待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起。
待标记蛋白可以为本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引 入氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。
吖啶取代物可以为吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-吖啶甲酸)、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根据吖啶取代物的具体不同，载体蛋白上的氨基与吖啶取代物上的不同基团(羧基、琥珀酰亚胺酯等)反应形成化学键连接。
具体的，吖啶酯可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亚胺酯甲酸酯)、DMAE-NHS(2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯)、ME-DMAE-NHS(2’,6’-二甲基羰基苯基-10-甲基-9-吖啶甲酸酯-4’-N-琥珀酰亚胺酯-三氟甲基磺酸盐)等。
以吖啶酯为AE-NHS为例，此时，吖啶标记结合物具有如下结构式：
其中，为载体蛋白，载体蛋白上带有氨基残基和羧基残基，为待标记蛋白，待标记蛋白上带有氨基残基。
这种吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白，载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的活性相对较高。此外，载体蛋白可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
此外，载体蛋白可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
与传统技术相比，这种含有载体蛋白的吖啶标记结合物中，待标记蛋白的活性位点得到有效保护，避免待标记蛋白失活，通过化学键将吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白依次连接，具有稳定、连接量可控等特点。
这种吖啶标记结合物可以直接用于化学发光免疫分析的检测和定量分析，并且能解决传统的碳二亚胺交联法等方法制备的吖啶标记结合物原料失活、信号差等缺点。
如图1所示的上述的吖啶标记结合物的制备方法，包括如下步骤：
S10、用吖啶取代物和载体蛋白共价交联，充分反应后得到吖啶取代物-载体蛋白结合物。
用吖啶取代物和载体蛋白共价交联的操作中，吖啶取代物和载体蛋白的摩尔比为100～20000：1。
优选的，吖啶取代物和载体蛋白的摩尔比为500～5000：1。
载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接。
载体蛋白可以为本身就具有羧基和氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引入羧基和氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，载体蛋白可以为牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白或血蓝蛋白。
吖啶取代物可以为吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-吖啶甲酸)、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根据吖啶取代物的具体不同，载体蛋白上的氨基与吖啶取代物上的不同基团(羧基、琥珀酰亚胺酯等)反应形成化学键连接。
具体的，吖啶酯可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亚胺酯甲酸酯)、DMAE-NHS(2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯)、ME-DMAE-NHS(2’,6’-二甲基羰基苯基-10-甲基-9-吖啶甲酸酯-4’-N-琥珀酰亚胺酯-三氟甲基磺酸盐)等。
以吖啶酯为AE-NHS为例，吖啶取代物和载体蛋白共价交联得到吖啶取代物-载体蛋白结合物的反应式如下：
其中，为载体蛋白，载体蛋白上带有氨基和羧基，AE-NHS与载体蛋白通过酰胺键连接。
上述反应式的具体反应过程为：在缓冲液中加入载体蛋白，充分溶解后加入过量的吖啶酯，于4℃～37℃反应0.5h～12h，反应后经过纯化得到吖啶酯-载体蛋白结合物。其中，缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液或哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液，反应过程的pH为4～10。
由于吖啶酯相对于载体蛋白是过量的，因此载体蛋白上的氨基可以视为反应完全，不会与下一步中待标记蛋白上的氨基进行竞争，从而可以不必封闭吖啶酯-载体蛋白结合物上的氨基。
S20、对S10得到的吖啶取代物-载体蛋白结合物进行纯化。
对吖啶取代物-载体蛋白结合物进行纯化的操作可以为超滤纯化、脱盐柱纯化和透析纯化几种操作中的一种或几种联用。
S30、用交联剂对S20得到的纯化后的吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基进行活化。
交联剂包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，碳二亚胺与吖啶取代物-载体蛋白结合物的摩尔比为10～5000：1，碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：1～1：10。
优选的，碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种。
优选的，碳二亚胺与吖啶取代物-载体蛋白结合物的摩尔比为50～1000：1。
优选的，羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺中的至少一种。
优选的，碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2：1～1：5。
优选的，S30还包括在吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基被活化后，加入巯基乙醇淬灭交联剂活性(或者经纯化除去交联剂)，得到羧基活化后的吖啶 取代物-载体蛋白结合物，并且该羧基活化后的吖啶取代物-载体蛋白结合物中的氨基封闭。
S40、用S30得到的羧基活化后的吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联，充分反应后得到吖啶标记结合物。
得到的吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白。
待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起。
待标记蛋白可以为本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引入氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。
用羧基活化后的吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联的操作中，吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白的摩尔比为5：1～1：5。
优选的，吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白的摩尔比为2：1～1：2。
以吖啶酯为AE-NHS为例，采用碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺对吖啶取代物-载体蛋白结合物的羧基进行活化，羧基活化后的吖啶取代物-载体蛋白结合物和待标记蛋白交联，得到吖啶标记结合物的反应式如下：
其中，为载体蛋白，载体蛋白上带有氨基残基和羧基残基，为待标记蛋白，待标记蛋白上带有氨基残基。
上述反应式的具体反应过程为：在缓冲液中加入吖啶取代物-载体蛋白结合物，充分溶解后，加入EDC和NHS，于25℃反应10min，然后加入待标记蛋白，于4℃～37℃反应0.5h～12h，反应后经过纯化得到吖啶标记结合物。其中，缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液或哌嗪-N， N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液，反应过程的pH为4～10。
这种吖啶标记结合物的制备方法，载体蛋白通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起，结合位点相对确定，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，这种吖啶标记结合物的制备方法制得的吖啶标记结合物的活性相对较高。
此外，载体蛋白可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
本发明还公开了一种化学发光试剂盒，用于结合待标记蛋白形成上述的吖啶标记结合物。
化学发光试剂盒包括：吖啶取代物和载体蛋白。
吖啶取代物可以为吖啶酯(DMAE-NHS、AE-NHS)、吖啶酸(9-吖啶甲酸)、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。根据吖啶取代物的具体不同，载体蛋白上的氨基与吖啶取代物上的不同基团(羧基、琥珀酰亚胺酯等)反应形成化学键连接。
具体的，吖啶酯可以为AE-NHS(10-甲基-吖啶-9-N-琥珀酰亚胺酯甲酸酯)、DMAE-NHS(2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧羰基)苯基-吖啶-9-甲酸酯)、ME-DMAE-NHS(2’,6’-二甲基羰基苯基-10-甲基-9-吖啶甲酸酯-4’-N-琥珀酰亚胺酯-三氟甲基磺酸盐)等。
载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，载体蛋白可以通过载体蛋白上的氨基与吖啶取代物反应形成化学键连接。
载体蛋白可以为本身就具有羧基和氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引入羧基和氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，载体蛋白可以为牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白或血蓝蛋白。
待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，待标记蛋白上的氨基与载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将载体蛋白和待标记蛋白连接到一起。
待标记蛋白可以为本身就具有氨基的蛋白或多肽，也可以为通过修饰后引 入氨基的改性蛋白或改性多肽。
本实施方式中，待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。
优选的，这种化学发光试剂盒还包括离心脱盐柱和离心超滤管中的至少一种。
这种化学发光试剂盒可以通过吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白依次形成化学键连接，结合位点相对确定，避免了吖啶取代物对待标记蛋白上的活性位点形成干扰，形成的吖啶标记结合物的活性相对较高。
此外，载体蛋白可使吖啶标记结合物的空间位阻增大，从而增加了吖啶标记结合物的使用灵敏度。
以下为具体实施例。
实施例1
将1mg BSA溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入40μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-BSA溶液。
向上述纯化过的吖啶-BSA溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入TSH抗体(厂家：Santa cruz biotechnology，货号：sc-418393)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带BSA的TSH单克隆抗体溶液。
实施例2
将1mg BSA溶解于1mL 150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入40μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-BSA溶液。
向上述纯化过的吖啶-BSA溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入雌二醇抗原(厂家：abcam，货号：ab120657)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带BSA的雌二醇抗原溶液。
实施例3
将1mg OVA溶解于1mL 150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入60μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-OVA溶液。
向上述纯化过的吖啶-OVA溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入TSH抗体(厂家：Santa cruz biotechnology，货号：sc-418393)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带OVA的TSH单克隆抗体溶液。
实施例4
将1mg OVA溶解于1mL 150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入60μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-OVA溶液。
向上述纯化过的吖啶-OVA溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入雌二醇抗原(厂家：abcam，货号：ab120657)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3 遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带OVA的雌二醇抗原溶液。
实施例5
将1mg KLH溶解于1mL 150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入5μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-KLH溶液。
向上述纯化过的吖啶-KLH溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入TSH抗体(厂家：Santa cruz biotechnology，货号：sc-418393)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带KLH的TSH单克隆抗体溶液。
实施例6
将1mg KLH溶解于1mL 150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入5μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯及反应副产物，得到吖啶-KLH溶液。
向上述纯化过的吖啶-KLH溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。25℃反应10分钟后，加入雌二醇抗原(厂家：abcam，货号：ab120657)，混匀，置于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的带KLH的雌二醇抗原溶液。
对比例1
将1mg TSH抗体(厂家：Santa cruz biotechnology，货号：sc-418393)溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH 7.4)中，EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)，25℃反应10分钟后，加入16μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)，混匀于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离吖啶酯的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的TSH单克隆抗体溶液。
对比例2
将1mg雌二醇抗原(厂家：abcam，货号：ab120657)溶解于1mL150mM PBS缓冲液(pH7.4)中，EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)，25℃反应10分钟后，加入40μL吖啶酯(10mg/mL溶解于DMF)，混匀于25℃反应4h，用5mL 7KD截留分子量的脱盐柱(Thermofish公司)以150mM PBS(pH 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离吖啶酯的EDC、NHS及反应副产物，得到吖啶酯标记的雌二醇抗原溶液。
测试例
分别对实施例1、3、5中得到的吖啶酯标记带载体蛋白的抗TSH抗体溶液以及对比例1用碳二亚胺法得到的吖啶酯标记的抗TSH抗体溶液用于化学发光免疫分析检测。
向20μIU/mL的TSH样本中，加入20μg TSH单克隆抗体包被的磁珠，再分别加入各方法制备的40ng/mL吖啶酯标记抗TSH抗体，置于全自动化学发光免疫分析仪(深圳市亚辉龙生物技术股份有限公司，型号：iFlash 3000)测量发光值，平行进行3分测量，取平局值，结果见表1。免疫分析所得结果的发光值越大，说明吖啶标记物的活性越好。
表1：各方法标记的吖啶标记物检测TSH对比结果
由表1结果可知，实施例1、3、5制备的吖啶标记物试剂，试剂的活性显著优于对比例1制备的吖啶标记物试剂。
将实施例1中得到的吖啶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液用于系列浓度的TSH的化学发光免疫分析检测。向系列浓度的TSH样本溶液中分别加入20ug TSH单克隆抗体包被的磁珠试剂和再分别加入各方法制备的40ng/mL吖啶酯标记抗TSH抗体，置于全自动化学发光免疫分析仪(深圳市亚辉龙生物技术股份有限公司，型号：iFlash 3000)测量发光值，平行进行3分测量，取平局值，结果见表2。以TSH抗原浓度为X轴，以相对发光值为Y轴，由表2数据作图，得图2。
表2：系列浓度TSH抗原样本的免疫检测结果
| TSH抗原浓度(μIU/mL) | 平均发光值(RLU) |
| 0.02 | 698 |
| 0.18 | 2967 |
| 0.39 | 4847 |
| 2.28 | 25098 |
| 11.55 | 92288 |
| 48.44 | 403477 |
| 86.48 | 702871 |
由表2和图2结果可知，实施例1制备的吖啶标记物试剂可应用于化学发光免疫分析且效果良好。实施例1的吖啶酯标记物制备方法具有良好的适用性。
将实施例2、4、6中得到的吖啶酯标记带载体蛋白的雌二醇抗原溶液以及对比例2用碳二亚胺法得到的吖啶酯标记的雌二醇抗原溶液用于化学发光免疫分析检测。向500pg/mL的雌二醇样本中，加入40μg雌二醇单克隆抗体包被的磁珠，再分别加入各方法制备的40ng/mL吖啶酯标记雌二醇抗原溶液，置于全自动化学发光免疫分析仪(深圳市亚辉龙生物技术股份有限公司，型号：iFlash 3000)测量发光值，平行进行3分测量，取平局值，结果见表1。免疫分析所得结果的发光值越小，说明吖啶标记物的活性越好。
表3：各方法标记的吖啶标记物检测E2对比结果
| 吖啶标记物 | 平均发光值(RLU) |
| 实施例2 | 94734 |
| 实施例4 | 103267 |
| 实施例6 | 98247 |
| 对比例2 | 643026 |
由表3结果可知，实施例2、4、6制备的吖啶标记物试剂，试剂的活性显著优于对比例2，对比例2制得的吖啶标记物试剂几乎无信号。
将实施例2中得到的吖啶标记的带载体蛋白的雌二醇抗原溶液用于系列浓度的E2的化学发光免疫分析检测。向系列浓度的E2样本溶液中分别加入40ug雌二醇单克隆抗体包被的磁珠试剂和再分别加入各方法制备的40ng/mL吖啶酯标记抗TSH抗体，置于全自动化学发光免疫分析仪(深圳市亚辉龙生物技术股份有限公司，型号：iFlash 3000)测量发光值，平行进行3分测量，取平局值，结果见表4。以样本中E2抗原浓度为X轴，以相对发光值为Y轴，由表4数据作图，得图3。
表4：系列浓度E2抗原样本的免疫检测结果
由表4和图3结果可知，实施例2制备的吖啶标记物试剂可应用于化学发光免疫分析且效果良好。实施例2的吖啶酯标记物制备方法具有良好的适用性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种吖啶标记结合物，其特征在于，包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白；
所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
2.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述吖啶取代物为吖啶酯、吖啶酸、吖啶酰胺或吖啶磺酰胺。
3.根据权利要求1所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白或血蓝蛋白。
4.根据权利要求1或3所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述待标记蛋白为抗原、半抗原或抗体。
5.一种权利要求1～4中任一项所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
用吖啶取代物和载体蛋白共价交联，充分反应后得到吖啶取代物-载体蛋白结合物，其中，所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
对所述吖啶取代物-载体蛋白结合物进行纯化；
用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基进行活化；以及
用羧基活化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联，充分反应后得到吖啶标记结合物，其中，所述吖啶标记结合物包括依次连接的吖啶取代物、载体蛋白和待标记蛋白，所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
6.根据权利要求5所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，所述用吖啶取代物和载体蛋白共价交联的操作中，所述吖啶取代物和所述载体蛋白的摩尔比为100～20000：1。
7.根据权利要求6所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，所述用羧基活化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与待标记蛋白交联的操作中，所述吖啶取代物-载体蛋白结合物与所述待标记蛋白的摩尔比为5：1～1：5。
8.根据权利要求5所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，所述用交联剂对纯化后的所述吖啶取代物-载体蛋白结合物上的羧基进行活化的操作中，所述交联剂包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺。
9.根据权利要求8所述的吖啶标记结合物的制备方法，其特征在于，所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述吖啶取代物-载体蛋白结合物的摩尔比为10～5000：1；
所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺中的至少一种，所述碳二亚胺与所述羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：1～1：10。
10.一种化学发光试剂盒，用于结合待标记蛋白形成如权利要求1～4中任一项所述的吖啶标记结合物，其特征在于，所述化学发光试剂盒包括：吖啶取代物和载体蛋白；
所述载体蛋白为含有羧基和氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述载体蛋白可以通过所述载体蛋白上的氨基与所述吖啶取代物反应形成化学键连接；
所述待标记蛋白为含有氨基的蛋白、改性蛋白、多肽或改性多肽，所述待标记蛋白上的氨基可以与所述载体蛋白上的羧基反应形成-NH-CO-结构从而将所述载体蛋白和所述待标记蛋白连接到一起。
Priority Applications (1)
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