CN113214380B - 碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法。本发明提供的制备方法将碱性磷酸酶活化后直接与甲状腺素进行连接，不需要对T4进行活化，且不需要偶联BSA等大分子。制得的ALP‑T4复合物具有良好的活性且不含有副产物。并且该制备方法工艺简单，成本低廉。经验证，以该方法制备的ALP‑T4检测游离甲状腺素或总甲状腺素能够具有良好的灵敏度、准确性、精密度和特异性。

Description

碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法。
背景技术
甲状腺素(T4)的检测包括对游离甲状腺素(FT4)和总甲状腺素(TT4)的检测，该检测的结果能够直接反映甲状腺功能。因放射免疫分析法对环境存在污染，且影响检测结果的因素较多，目前常采用化学发光法对甲状腺素进行检测。
游离甲状腺素(FT4)和总甲状腺素(TT4)化学发光试剂盒中，需包含的组分包括碱性磷酸酶(ALP)标记的甲状腺素(ALP-T4)。目前，对T4进行标记的方法大多数为通过T4偶联大分子(如BSA)之后再标记ALP酶或者包被磁珠；或者是给T4偶联上NHS之后再标记ALP酶；还有一些方法是通过分别活化ALP酶和T4再进行偶联。
而这些技术中，有些工艺复杂且成本较高，而有些则因偶联工艺较复杂且耗时，还有些因所用交联剂戊二醛的活化效率不高，活化过程中会造成T4分子的自连，最终得到的产物里面的副产物也很多影响检测的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法，该甲状腺素标记碱性磷酸酶用于甲状腺素的检测更准确。
本发明提供的碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法，包括：
碱性磷酸酶于酸性溶液活化后，去除游离的活化剂，然后与甲状腺素在碱性溶液中偶联，终止反应后获得碱性磷酸酶标记的甲状腺素。
本发明中所述酸性溶液为pH＜7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。
本发明中，所述活化剂选自EDC/NHS、戊二醛或Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)中至少一种。
本发明中，所述去除活化剂的方法包括透析或超滤。
本发明中，所述碱性溶液为pH＞7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。
本发明中，所述偶联步骤中，碱性磷酸酶的羧基与甲状腺素的氨基偶联。
本发明中，所述终止反应采用含有氨基的缓冲液。
本发明所述终止反应后还包括：将产物与保存液混合，去除副产物步骤。
一些实施例中，所述保存液为pH为7.0～7.5的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液；
所述副产物包括游离的甲状腺素；
所述去除的方法包括透析或超滤。
本发明还提供了一种甲状腺素检测试剂，其包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
所述R1试剂为包被T4抗体的磁珠悬液；
所述R2试剂为碱性磷酸酶标记的甲状腺素溶液；
所述R3试剂为磁珠缓冲液；
所述R2试剂中，包括本发明所述制备方法制得的碱性磷酸酶标记的甲状腺素、酶标记缓冲液C和甘油。
本发明提供的制备方法将碱性磷酸酶活化后直接与甲状腺素进行连接，不需要对T4进行活化，且不需要偶联BSA等大分子。制得的ALP-T4复合物具有良好的活性且不含有副产物。并且该制备方法工艺简单，成本低廉。经验证，以该方法制备的ALP-T4检测游离甲状腺素或总甲状腺素能够具有良好的灵敏度、准确性、精密度和特异性。
具体实施方式
本发明提供了碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法中，首先在酸性条件下，ALP酶的羧基上连接上活化基团，形成稳定的中间产物，然后去除游离的活化剂。然后在碱性条件中，在不进一步添加活化剂的条件下，ALP酶上的活化基团脱落，ALP酶的羧基与T4的氨基偶联。此后，以含有氨基的缓冲液封闭ALP上未偶联的羧基基团，再去除游离的T4等小分子，获得ALP-T4。所得ALP-T4中，T4的氨基直接与ALP的羧基偶联，中间不连接其他基团或分子。
本发明中，所述酸性溶液为pH＜7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。在本发明实施例中，所述酸性溶液记为酶标记缓冲液A。一些实施例中，所述酶标记缓冲液A包括水和：MES和NaCl。所述酶标记缓冲液A的pH值为4.5。一些具体实施例中，所述酶标记缓冲液A由水和5.33g/L MES、7.305g/L NaCl制成。以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝4.5。
本发明所述的活化剂用于活化ALP的羧基。经过活化后，ALP的羧基上与活化基团连接。活化剂的选择，以其活化ALP的性能为选择标准，活化性能越好的活化剂作为优选，常用的活化剂包括EDC/NHS，或者戊二醛，或者Sulfo-SMCC。本发明实施例中，所述活化剂为EDC/NHS，将EDC和NHS用作ALP的活化剂。具体的，其中NHS为sulfo-NHS。所述EDC与sulfo-NHS的质量比为500：50。碱性磷酸酶、EDC与sulfo-NHS的质量比为250：500：50。所述活化的体系中碱性磷酸酶的浓度为1μg/μL，EDC的浓度为2μg/μL、sulfo-NHS的浓度为0.1μg/μL；所述活化的条件包括25℃，1100rpm振荡活化1h。
本发明中，在偶联之前去除游离的活化剂，同时也去除其他可能存在的小分子杂质，从而保证ALP-T4的准确偶联。所述去除的方法可以包括透析或超滤。在本发明实施例中，采用超滤的方法。在超滤步骤中，所述超滤管的滤膜的截留分子量为30kDa。所述超滤的条件为9000rpm/min离心25min。为了保证超滤的效果，超滤在低温条件下进行。所述低温条件为0～4℃。
本发明中，所述碱性溶液为pH＞7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。在本发明实施例中，所述酸性溶液记为酶标记缓冲液B。一些实施例中，所述酶标记缓冲液B包括水和：Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O和NaCl。所述酶标记缓冲液B的pH值为9.0。所述酶标记缓冲液B由水和25.786g/L Na2HPO4·12H2O、4.36g/L NaH2PO4·2H2O和8.78g/L NaCl制成。以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝9.0。
所述偶联步骤中，不再添加活化剂，也不再添加偶联剂等其他成分，仅使活化后的ALP与T4在碱性溶液中进行偶联反应。经不断摸索确定本发明所述的反应条件为最适条件。在该条件下进行偶联，不仅避免T4分子的自连，也避免了其他副产物的产生，从而提高了偶联的准确性，对提高检测的准确性存在积极意义。所述偶联步骤具体包括：将所述活化的ALP溶液与甲状腺素混合，以酶标记缓冲液B定容后进行孵育。所述活化ALP溶液的体积与酶标记缓冲液B的体积比为250:150。所述碱性磷酸酶与甲状腺素的质量比为250:20。所述以酶标记缓冲液B定容至甲状腺素的浓度为0.2μg/μL。所述孵育的条件为25℃反应3h。
偶联步骤之后，以含有氨基的缓冲液处理，终止偶联反应并封闭掉未偶联的活化羧基基团，以避免副产物的形成。所述含有氨基的缓冲液在本发明中记做封闭液。所述封闭液为Tris缓冲液，一些实施例中，所述封闭液为pH值为8.0的Tris缓冲液。所述封闭液由水和0.3mol/L Tris制成，以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝8.0。所述封闭液与酶标记缓冲液B定容后的体积比为50:100。本发明中，所述封闭的条件为室温封闭0.5h。所述室温优选为18～30℃。
本发明中，所述终止反应后还包括：将产物与保存液混合，然后去除副产物步骤。所述副产物包括游离的T4未偶联的ALP，还可能包括其他小分子杂质。所述去除副产物的方法包括透析或超滤。在超滤步骤中，所述超滤管的滤膜的截留分子量为30kDa。所述超滤的条件为9000rpm/min离心25min。为了保证超滤的效果，超滤在低温条件下进行。所述低温条件为0～4℃。超滤后收集超滤后超滤管内的液体。
本发明中，产物的保存液记做酶标记缓冲液C。所述酶标记缓冲液C包括水Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O和NaCl。本发明中，所述酶标记缓冲液C的pH值为7.4。一些实施例中，所述酶标记缓冲液C由水和25.786g/L Na2HPO4·12H2O、4.36g/L NaH2PO4·2H2O和8.78g/L NaCl制成。以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝7.4。终止反应后，所述酶标记缓冲液C与封闭液混合的体积比为50:350。
在经超滤后，超滤管中的液体可直接用于T4的检测。但通常在使用前经过稀释和定容。本发明中，以酶标记缓冲液C进行定容，并加入甘油作为冻存保护剂。
一些实施例中，本发明提供的碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法包括：
步骤1：将碱性磷酸酶、EDC、sulfo-NHS和酶标记缓冲液A混合，进行活化后，与酶标记缓冲液B混合，进行超滤，获得活化的碱性磷酸酶溶液；
步骤2：将所述活化的碱性磷酸酶溶液与甲状腺素混合，以酶标记缓冲液B定容，孵育后经封闭，与酶标记缓冲液C混合，经超滤后制得碱性磷酸酶标记的甲状腺素；
所述酶标记缓冲液A由水和5.33g/L MES、7.305g/L NaCl制成，以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝4.5。
所述酶标记缓冲液B由水和25.786g/L Na2HPO4·12H2O、4.36g/L NaH2PO4·2H2O和8.78g/L NaCl制成，以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝9.0。
所述酶标记缓冲液C由水和25.786g/L Na2HPO4·12H2O、4.36g/L NaH2PO4·2H2O和8.78g/L NaCl制成，以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝7.4。
所述封闭液由水和0.3mol/L Tris制成，以1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调整pH＝8.0。
本发明还提供了一种甲状腺素检测试剂，其包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
所述R1试剂为包被T4抗体的磁珠悬液；
所述R2试剂为碱性磷酸酶标记的甲状腺素溶液；
所述R3试剂为磁珠缓冲液。
所述R2试剂中，包括本发明所述制备方法制得的碱性磷酸酶标记的甲状腺素、酶标记缓冲液C和甘油。
对于检测总甲状腺素的试剂，其中还包括解离剂，所述解离剂为0.5mg/mL的ANS溶液。
本发明还提供了一种检测甲状腺素的方法，其为采用本发明所述的检测试剂进行检测。所述甲状腺素为游离甲状腺素或总甲状腺素。
本发明提供的制备方法将碱性磷酸酶活化后直接与甲状腺素进行连接，不需要对T4进行活化，且不需要偶联BSA等大分子。制得的ALP-T4复合物具有良好的活性且不含有副产物。前期实验表明，相对于采用其他活化剂的方案，本发明提供的技术方案工艺参数选择合理，不仅大幅缩短了制备工艺，还提高了偶联效果，降低了副产物的含量，从而使制得的试剂能够更准确的对甲状腺素进行检测。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
一、试剂配制：
酶标记缓冲液A(pH＝4.5)
物料 单位 用量
MES g 10.66
NaCl g 14.61
配置方法：称取上述试剂于一干净烧杯中，加入400mL双蒸水，充分搅拌溶解完全，用1M NaOH或1M HCl溶液调整pH＝4.5；定容至500mL，用0.45μm滤头过滤备用。
酶标记缓冲液B(pH＝9.0)
物料 单位 用量
<![CDATA[Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O]]> g 25.786
<![CDATA[NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O]]> g 4.36
NaCl g 8.78
配置方法：称取上述试剂于一干净烧杯中，加入800mL双蒸水，充分搅拌溶解完全，用1M NaOH或1M HCl溶液调整pH＝9.0；定容至1000mL，用0.45μm滤头过滤备用。
封闭液(0.3M Tris，pH＝8.0)
物料 单位 用量
Tris g 36.342
配置方法：称取上述试剂于一干净烧杯中，加入800mL双蒸水，充分搅拌溶解完全，用1M NaOH或1M HCl溶液调整pH＝8.0；定容至1000mL，用0.45μm滤头过滤备用。
酶标记缓冲液C(pH＝7.4)
物料 单位 用量
<![CDATA[Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O]]> g 25.786
<![CDATA[NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O]]> g 4.36
NaCl g 8.78
配置方法：称取上述试剂于一干净烧杯中，加入800mL双蒸水，充分搅拌溶解完全，用1M NaOH或1M HCl溶液调整pH＝7.4；定容至1000mL，用0.45μm滤头过滤备用。
二、ALP-T4母液的制备
1)取ALP酶250ug，EDC 10μL(50mg/mL母液，酶标记缓冲液A配置)，sulfo-NHS 1μL(50mg/mL母液，酶标记缓冲液A配置)，酶标记缓冲液A调整体积至250μL，25℃，1100rpm振荡活化1h。
2)加入酶标记缓冲液B至400μL，进行超滤(30k超滤管)，9000rpm/min，25min。
3)吸取离心后的活化ALP液，再加入T4 20ug，酶标记缓冲液B调整体积至100μL，25℃反应3h。
4)50μL封闭液封闭0.5h。
5)封闭之后，加入酶标记缓冲液C至400μL于超滤管中，9000rpm/min，25min。
6)吸取离心后的ALP-T4溶液，加入酶标记缓冲液C将ALP-T4补充体积至125μL，再加入甘油125μL，-20℃保存备用，制得ALP-T4母液。
三、游离甲状腺素试剂配制及检测
3.1试剂配制
R1：用磁珠缓冲液将磁珠包被的T4抗体稀释成0.2mg/mL，制备成R1。
R2：用酶标缓冲液将ALP-T4母液稀释16000倍，制备成R2。
R3：磁珠缓冲液。
3.2测试方法
线性范围：在[2.00～100.00]pmol/L区间内，用四参数拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)≥0.9900。拟合曲线为：
y＝(4538520.61943-81.4275)/(1+(x/6.1623)1.29662)+81.4275
R2＝0.9994
最低检测限：测试20次零浓度校准品，计算发光值的平均值
Figure BDA0003052420620000082
和标准差SD，将
Figure BDA0003052420620000083
代入剂量-反应曲线方程，得出的浓度值即为最低检测限，应不高于2.00pmol/L。检测结果如表1
表1游离甲状腺素试剂最低检测限测试
Figure BDA0003052420620000081
准确度：对具有溯源性的企业参考品进行检测，计算测试偏差，应不超过±10.0％。结果如表2：
表2游离甲状腺素试剂准确度测试
Figure BDA0003052420620000091
精密度：高浓度和低浓度的质控品，分别测试10次，计算变异系数(CV)，应不大于8.0％。结果如表3：
表3游离甲状腺素试剂分析内精密度测试
Figure BDA0003052420620000092
特异性：浓度不低于200ng/mL的T3、100ng/mL的rT3、200ng/mL的3,3’-二碘甲腺原氨酸，测试结果应不高于2.00pmol/L。结果如表4：
表4游离甲状腺素试剂特异性测试
交叉物 浓度(ng/mL) 计算浓度(pmol/L)
T3 200 0.42
rT3 100 0.21
3,3’-二碘甲腺原氨酸 200 0.18
四、游离甲状腺素试剂配制及检测
4.1试剂配制
R1：用磁珠缓冲液将磁珠包被的T4抗体稀释成0.2mg/mL，制备成R1。
R2：用酶标缓冲液将ALP-T4母液稀释8000倍，制备成R2。
R3：解离剂ANS，0.5mg/mL。
4.2测试方法
线性范围：在[10.0～300.0]nmol/L区间内，用四参数拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)≥0.9900。
拟合曲线为：
y＝(2984616.30526-4925.28)/(1+(x/10.3169)0.90479)+4925.28
R2＝0.9981
最低检测限：测试20次零浓度校准品，计算发光值的平均值
Figure BDA0003052420620000102
和标准差SD，将
Figure BDA0003052420620000103
代入剂量-反应曲线方程，得出的浓度值即为最低检测限，应不高于10.0nmol/L。结果如表5
表5 TT4试剂最低检测限测试
Figure BDA0003052420620000101
准确度：对具有溯源性的企业参考品进行检测，计算测试偏差，应不超过±10.0％。结果如表6：
表6 TT4试剂准确度测试
Figure BDA0003052420620000111
精密度：高浓度和低浓度的质控品，分别测试10次，计算变异系数(CV)，应不大于8.0％。结果如表7：
表7 TT4试剂分析内精密度测试
Figure BDA0003052420620000112
特异性：浓度不低于500ng/mL的T3、50ng/mL的rT3，测试结果应不高于10.0nmol/L。结果如表8：
表8 TT4试剂特异性测试
交叉物 浓度(ng/mL) 计算浓度(nmol/L)
T3 500 0.3
rT3 50 0.1
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法，其包括：
碱性磷酸酶于酸性溶液活化后，去除游离的活化剂，然后与甲状腺素在碱性溶液中偶联，终止反应后获得碱性磷酸酶标记的甲状腺素；
所述去除游离的活化剂采用超滤的方法，其中超滤管的滤膜的截留分子量为30kDa，超滤的条件为0～4℃，9000rpm/min离心25min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液为pH＜7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂选自EDC/NHS、戊二醛、Sulfo-SMCC中至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为pH＞7的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联步骤中，碱性磷酸酶的羧基与甲状腺素的氨基偶联。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述终止反应采用含有氨基的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述终止反应后还包括：将产物与保存液混合，去除副产物步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
所述保存液为pH为7.0～7.5的MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或甘氨酸缓冲液；
所述副产物包括游离的甲状腺素和/或碱性磷酸酶；
所述去除的方法包括透析或超滤。
9.一种甲状腺素检测试剂，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
所述R1试剂为包被T4抗体的磁珠悬液；
所述R2试剂为碱性磷酸酶标记的甲状腺素溶液；
所述R3试剂为磁珠缓冲液；
所述R2试剂中，包括权利要求1～8任一项所述制备方法制得的碱性磷酸酶标记的甲状腺素、酶标记缓冲液C和甘油。
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