CN102269762B - 结合物的制备方法及相关试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制备结合物如酶标记物、尤其是碱性磷酸酶标记物的方法以及试剂盒。所述方法采用羧基化合物封闭含有氨基和羧基的待结合物A(如酶)分子表面的氨基基团，封闭了氨基的待结合物A(如酶)经碳二亚胺活化，之后将碳二亚胺失活或去除，加入含有氨基的待结合物B(如待标记物)，反应一段时间后，得到结合物(如酶标记物)。

Description

结合物的制备方法及相关试剂盒
发明领域
本申请涉及免疫分析领域，具体而言涉及结合物如酶标记物、尤其碱性磷酸酶标记物的制备方法以及用于该方法的试剂盒。
背景技术
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记葡萄球菌蛋白A等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体主要应用于免疫印迹杂交(Western blotting)、酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)及免疫组化等免疫检测和定量分析。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前常用的酶标记抗体(抗原)的方法主要有三种(BioconjugateTechniques，Academic Press/2008年第二版)：
1.戊二醛交联法：此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。碱性磷酸酶一般用此法进行标记。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。在一步法中戊二醛直接加入酶与待标记物的混合物中，反应后即得酶标记物。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与待标记物作用而形成酶标记物。也可先将待标记物与戊二醛作用，再与酶联结。这两种方法标记的碱性磷酸酶标记物的活性和标记率都不够理想，影响免疫分析的灵敏度。
2.过碘酸盐氧化法：此法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将辣根过氧化物酶分子表面的多糖氧化为很活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。该方法的操作较为复杂，酶和抗体(抗原)活性损失多，不太适合制备碱性磷酸酶标记物。
3.琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联法：一种同时带有可与氨基反应的琥珀酰亚胺酯类和可与巯基反应的马来酰亚胺基团的异源双功能交联试剂常用于制备酶标记物。这种交联试剂常用的有4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)或其水溶性类似物4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)，它们可通过活化酶分子的氨基得到带有马来酰亚胺基团的酶分子，酶分子上的马来酰亚胺基团可以和巯基化待标记物上的巯基基团反应，最后得到酶标记物。该方法所用试剂昂贵，而且，待标记物通常需经过巯基化处理，操作复杂。
本发明提供制备结合物如酶标记物、尤其是碱性磷酸酶标记物的方法以及试剂盒。该方法简便易行、成本低廉，标记后结合物中各成分如酶和待标记物活性保持好，酶标记物试剂灵敏度高。
发明内容
本发明的一个方面涉及由待结合物A和待结合物B物制备结合物的方法，其中待结合物A含有氨基和羧基，待结合物B含有氨基，所述方法包括以下步骤：
1)在交联剂存在下，用通式I的羧基化合物将待结合物A的氨基封闭：
通式I中R1为H、C1-6烷基、CnH2nCOOH、苯基或苯基C1-6烷基，其中n为0-4的整数，苯基或苯基C1-6烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基和羧基；R2为H、Na、K等在水中发生解离的基团，
所述交联剂为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺；
2)纯化氨基封闭后的待结合物A；
3)用交联剂使经纯化的氨基封闭后待结合物A的羧基活化，其中所述交联剂为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺；以及
4)使活化后的待结合物A与待结合物B交联。
在本发明该方面的一个实施方案中，所述结合物为酶标记物，所述待结合物A为标记用酶。
在另一个实施方案中，所述结合物为酶标记物；所述待结合物A为肽或蛋白质，例如为抗体；所述待结合物B为标记用酶。
在上述两个实施方案中，所述标记用酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶，优选为碱性磷酸酶。
在再一个实施方案中，所述待结合物A为载体蛋白，而所述待结合物B为半抗原。
在又一个实施方案中，所述待结合物A为肽或蛋白质，而待结合物B为固体支持体。
在另一个实施方案中，所述待结合物A为选自抗体和配体的靶向部分，而待结合物B为含氨基的药物；或者所述待结合物A为肽或蛋白类药物，而待结合物B为选自抗体和配体的靶向部分。
在上述实施方案中，在待结合物A的羧基被活化后，可以通过加入巯基化合物猝灭交联剂活性，或者经纯化除去交联剂，得到羧基活化的氨基封闭的待结合物A。
在上述实施方案中，在氨基封闭后的待结合物A的纯化以及羧基活化的氨基封闭的待结合物A的纯化可以为超滤纯化、脱盐柱纯化和/或透析纯化。
所述羧基化合物可以选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸和它们的盐，优选选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸和它们的盐，更优选为乙酸钠。
所述碳二亚胺可以选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N，N′-二异丙基碳二亚胺；所述羟基琥珀酰亚胺可以选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺。
在步骤1)中，羧基化合物的摩尔数可以为酶分子或待标记物摩尔数的500-200000倍，优选1000-20000倍。交联剂的摩尔数可以是酶分子或待标记物摩尔数的50-5000倍，优选100-1000倍。碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例可以为5∶1-1∶10，优选2∶1-1∶5。
在步骤2)中，碳二亚胺的摩尔数可以是酶分子的摩尔数的10-5000倍，优选50-1000倍；碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例可以为5∶1-1∶10，优选2∶1-1∶5。
所述巯基化合物可以选自巯基乙醇和巯基苏糖醇，优选巯基乙醇。
本发明的另一方面涉及用于制备酶标记物的试剂盒，其包含：
1)标记用酶，其可以选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、丙酮酸激酶和苹果酸脱氢酶，优选为碱性磷酸酶；
2)通式I的羧基化合物：
通式I中R1为H、C1-6烷基、CnH2nCOOH、苯基或苯基C1-6烷基，其中n为0-4的整数，苯基或苯基C1-6烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基和羧基；R2为H、Na、K等在水中发生解离的基团；
3)交联剂，其为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺；和
4)任选的巯基化合物。
在该实施方案中，所述羧基化合物可以选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸和它们的盐。
所述碳二亚胺可以选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N，N′-二异丙基碳二亚胺；所述羟基琥珀酰亚胺可以选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺。
所述巯基化合物可以选自巯基乙醇和巯基苏糖醇，优选巯基乙醇。
所述试剂盒还含有离心超滤管、指示操作者按照本发明方法进行操作的说明或这两者。
附图说明
图1为本发明技术方案的示意图。
图2为TSH抗原系列浓度与发光值的线性拟合。
具体实施方式
本发明公开了一种结合物(特别是酶标记物、尤其是碱性磷酸酶酶标记物)的制备方法。本发明通过使用羧基化合物对含有氨基和羧基的待结合物A(如酶)分子的表面氨基进行封闭，除去羧基化合物后，封闭了氨基的待结合物A(如酶)分子中的羧基经碳二亚胺活化，之后将碳二亚胺失活或去除，加入含氨基的待结合物B(如待标记物)，活化的羧基与待结合物B(如待标记物)反应一段时间后，得到结合物(如酶标记物)。通过先封闭待结合物A(如酶)表面的氨基，有效地抑制了自交联反应，有助于提高结合物(如酶标记物)的活性和标记率。如实施例部分所表明的，与使用常规方法(戊二醛法和过碘酸钠法)获得的酶标记物(酶标物)相比，用本发明方法制备的碱性磷酸酶标记物的活性显著提高。此外，本发明的方法使用相对价廉的羧基化合物，而且无需脱除用于封闭氨基的基团，因此简便易行、成本低廉。
本发明的待结合物A为含有氨基和羧基的化合物，也包括通过修饰从而引入所述基团的化合物，例如为半抗原、抗原、抗体、其他肽或蛋白类物质等，其实例有酶、配体、载体蛋白、肽或蛋白类药物等。
本发明的待结合物B为含有氨基或通过修饰而引入氨基的物质，例如为下述的待标记物，包括肽或蛋白类，其实例有抗原、半抗原、酶、配体、肽或蛋白类药物和含有氨基的固体支持体等。
本发明所指的酶可以是用于酶免疫技术(包括化学发光酶免疫测定、酶联免疫测定和蛋白质印迹分析等)的各种来源的标记用酶，包括自然提取和各种工程改造制备的标记用酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、丙酮酸激酶和苹果酸脱氢酶等。
本发明所指的碱性磷酸酶可以是各种来源的碱性磷酸酶，包括自然提取和各种工程改造制备的碱性磷酸酶等。
本发明所指待标记物包括待标记的含有氨基的化合物以及通过氨基修饰从而引入氨基的待标记化合物，例如含有氨基的小分子半抗原、抗原和抗体等。小分子半抗原例如有三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、肽类等。
抗体包括各种动物源的单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段等，包括不同的抗体种类，例如免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白Y。
本发明所用的碳二亚胺是一种化学性质活跃的双功能试剂，它使羧基和氨基间脱水形成酰胺键，一个蛋白质或肽等上的羧基先与碳二亚胺反应生成中间物，然后再与另一蛋白质或肽等上的氨基反应，形成蛋白质或肽间的结合物。使用该交联方法，可使蛋白或肽等交联后活性保持较好，交联效率相对较高。常用的碳二亚胺例如有二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)等。
本发明所用的羟基琥珀酰亚胺用于提高碳二亚胺交联反应的产率，减少副反应发生。常用的羟基琥珀酰亚胺有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)等。
本发明所用的羧基化合物是水溶性的、能在水溶液中解离产生羧酸根的化合物，该化合物至少含有一个羧酸基团，具有如下结构通式Ⅰ：
通式Ⅰ中R1为H、C1-6烷基、CnH2nCOOH、苯基或苯基C1-6烷基，其中n为0-4的整数，苯基或苯基C1-6烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基和羧基；R2为在水中发生解离的基团，例如H、Na、K等。
上述具有通式Ⅰ结构的化合物的具体实例是甲酸、乙酸(醋酸)、草酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸或它们的盐等。
以下以酶标记物为例说明本发明方法的实施步骤。如图1所示，步骤一为酶分子的氨基封闭，步骤二为氨基封闭后酶分子的羧基活化，步骤三为活化后的酶分子与待标记物的交联。
步骤一：在含有过量羧基化合物的缓冲液中加入交联剂和酶，也可以加交联剂后1小时内(如5-60分钟，优选15-30分钟)加入酶，进行封闭反应，反应后经过纯化得到氨基封闭的酶分子。在这一步骤中，羧基化合物的羧基被交联剂活化从而与酶上的氨基反应，封闭酶上的氨基。由于羧基化合物相对于酶是过量的，因此抑制了交联剂对酶上羧基的活化。该步骤的pH值范围在4-8之间。缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液和哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液等。这里羧基化合物相对酶是过量的，例如其摩尔数为酶分子摩尔数的500-200000倍，优选1000-20000倍。所加入交联剂的种类为碳二亚胺、或者碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺两者。交联剂的使用浓度比较宽，可以是酶分子摩尔数的50-5000倍，优选100-1000倍；碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为5∶1-1∶10，优选2∶1-1∶5。由于在过高温度下蛋白质不稳定，因此反应温度通常在4-37℃之间；封闭反应时间为0.5-48小时之间，普通技术人员能够理解，反应温度与反应时间相关，温度越高，反应时间可相应缩短；纯化的方式可为超滤纯化、脱盐柱纯化或透析纯化。
步骤二：将经步骤一纯化好的氨基封闭的酶分子加入到缓冲溶液中，加入交联剂，反应5-60分钟后，加入巯基化合物猝灭交联剂活性，或者经纯化除去交联剂，得到羧基活化的氨基封闭的酶。该步骤的pH值范围在4-8之间。缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液和哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液等。所加入交联剂的种类为碳二亚胺、或者碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺两者。碳二亚胺的摩尔数可以是酶分子的摩尔数的10-5000倍，优选50-1000倍；碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例可以为5∶1-1∶10，优选2∶1-1∶5。反应温度为4-37℃；反应时间为5-300分钟。巯基化合物可为巯基乙醇、巯基苏糖醇等巯基化合物，优选巯基乙醇，巯基化合物的工作浓度为5mM-50mM。羧基活化的氨基封闭的酶的纯化方式可为超滤纯化、脱盐柱纯化和透析纯化。
步骤三：将通过步骤二得到的羧基活化的氨基封闭的酶加入到含待标记物的缓冲溶液中，反应后得到酶标记物，还可经过纯化得到纯化的酶标记物。该步骤中pH值范围在4-8.5之间，缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、哌嗪-N，N’双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液和N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液等。酶分子与待标记物的摩尔比为5∶1-1∶15；反应温度为4-37℃；反应时间为0.5-36小时。酶标记物的纯化方式可为凝胶过滤纯化、Protein A或G亲和柱纯化和硫酸铵沉淀纯化。
本发明的方法不仅适用于碱性磷酸酶，也适用于其他标记用酶，例如葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶含有较多的氨基，使用现有的方法标记时易形成广泛的聚合，从而影响酶的活性。使用本发明的方法进行标记时，可以抑制该酶自身交联，从而提高酶活性。
对于本领域普通技术人员显而易见的是，也可以先用羧基化合物将待标记物的氨基封闭，然后用交联剂将其与酶交联。
本发明的方法和试剂盒可以用来制备含氨基半抗原的人工抗原。可以采用本发明的方法，先用羧基化合物将载体蛋白的氨基封闭，再用交联剂将其与半抗原交联。
本发明的方法和试剂盒也可以用来制备靶向药物，只要靶向部分或者肽或蛋白类药物部分的氨基的封闭不会显著影响其功能即可。可以用羧基化合物封闭蛋白类或肽类靶向部分(如抗体、配体等)的氨基，然后用交联剂将其与含氨基或者通过化学修饰而引入氨基的药物交联。或者，可以先将肽或蛋白类药物部分的氨基封闭，再与靶向部分(如抗体、配体等)交联。
本发明的方法和试剂盒还可以用来将蛋白质(包括抗体和酶)或肽连接到含氨基的表面，如固相支持体。可以先用羧基化合物将蛋白质或肽的氨基封闭，再用交联剂将其连接到含氨基的表面。
以下以碱性磷酸酶标记物作为实例，通过具体实施例来说明本发明，但本发明范围并不受这些所限制。在以下实施例中，除非特殊说明，否则所使用的试剂购自Sigma-aldrich公司，为分析纯。
                        实施例
                        实施例1
将乙酸钠(醋酸钠)溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 6.0)中，加入EDC和NHS，加缓冲液至1000μl，乙酸钠终浓度为1.8mol/L，EDC终浓度为18mmol/L，NHS终浓度为18mmol/L。22℃反应30分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。22℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES(pH 6.0)缓冲液作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的乙酸钠、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。22℃反应30分钟后，加入终浓度为10mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入1.5mg(10nmol)抗促甲状腺素(TSH)的山羊多克隆抗体和2ml pH 7.2 0.1M磷酸盐缓冲液。37℃交联反应3小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液。
                    实施例2
将乙酸溶解于2000μl 30mM MES缓冲液(pH 5.0)中，调pH值为5.0，加入EDC和NHS，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶，加30mMMES缓冲液(pH 5.0)至3000μl，乙酸的终浓度为0.06mol/L，EDC终浓度为24mmol/L，NHS终浓度为6mmol/L，碱性磷酸酶终浓度6μmol/L。22℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH 6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的乙酸、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为5mmol/L)和NHS(终浓度为25mmol/L)。22℃反应60分钟后，加入终浓度为10mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入0.75mg(5nmol)抗促甲状腺素(TSH)的山羊多克隆抗体和2ml 0.1M HEPES缓冲液(pH 8.0)。37℃反应3小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液。
                    实施例3
将甲酸溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 6.0)中，调pH值为6.0，加入EDC和NHS，加缓冲液至1000μl，甲酸终浓度为13.5mmol/L，EDC终浓度为0.36mmol/L，NHS终浓度为1.8mmol/L。37℃反应5分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。4℃反应20小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH 6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的甲酸、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。37℃反应10分钟后，加入终浓度为10mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入3mg(20nmol)抗促甲状腺素(TSH)的山羊多克隆抗体和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。4℃反应24小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液。
                    实施例4
将乙酸钠(醋酸钠)溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 5.5)中，加入EDC，加缓冲液至1000μl，乙酸钠的终浓度为3.6mol/L，EDC终浓度为90mmol/L。22℃反应30分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。22℃反应3小时后，用15ml30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的乙酸钠、EDC及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为2mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。22℃反应30分钟后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH 6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离EDC和NHS，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入0.45mg(3nmol)抗促甲状腺素(TSH)的山羊多克隆抗体和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。37℃反应2小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液。
                    实施例5
将苯甲酸溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 6.0)中，调pH值为6.0，加入EDC和NHS，加缓冲液至1000μl，苯甲酸终浓度为1.8mol/L，EDC终浓度为10mmol/L，NHS终浓度为18mmol/L。22℃反应30分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。22℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES(pH 6.0)缓冲液作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的苯甲酸、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。22℃反应30分钟后，加入终浓度为10mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入1.5mg(10nmol)抗促甲状腺素(TSH)的山羊多克隆抗体和2ml pH 7.20.1M磷酸盐缓冲液。37℃交联反应3小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多抗溶液。
                    实施例6
将草酸钠溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 6.0)中，加入EDC和NHS，加缓冲液至1000μl，草酸钠的终浓度为1.8mol/L，EDC终浓度为18mmol/L，NHS终浓度为18mmol/L。22℃反应30分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。22℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH 6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的草酸钠、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)。22℃反应30分钟后，加入终浓度为5mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入1mg(6.67nmol)抗促甲状腺素(TSH)的小鼠单克隆抗体和2ml 30mM MES缓冲液(pH 6.0)。37℃反应3小时后，用Protein G亲和柱(GE公司)纯化酶标抗体，得到碱性磷酸酶标记的抗TSH的小鼠单克隆抗体溶液。
                    实施例7
参考Bioconjugate Techniques，Academic Press/2008年第二版中的戊二醛法和过碘酸钠法，制备碱性磷酸酶标记的抗TSH抗体溶液。将实施例1-5中得到的碱性磷酸酶标记的抗TSH抗体溶液以及用戊二醛法、过碘酸钠法得到的酶标记抗体用于TSH的化学发光酶免疫分析检测。向10μIU/ml的TSH样本中，加入50μg TSH单克隆抗体包被的磁珠，再分别加入各方法制备的0.4pmol碱性磷酸酶标记抗TSH抗体，孵育反应后清洗，加入200μl化学发光液Lumiphos 530(购自贝克曼库尔特公司，下同)，用BHP9507型化学发光免疫分析仪(中国北京滨松光子技术股份有限公司)测量发光值，平行进行3份测量，取平均值，结果见表1。免疫分析所得结果的发光值越大，说明酶标记物的活性越好。
表1各方法标记的酶标物检测TSH对比结果
  酶标物   平均发光值(RLU)
  实施例1酶标物   1100590
  实施例2酶标物   836522
  实施例3酶标物   706884
  实施例4酶标物   1003046
  实施例5酶标物   668521
  实施例6酶标物   725664
  戊二醛法酶标物   470467
  过碘酸钠法酶标物   456201
由表1结果可知，采用本发明的标记工艺制备的酶标记试剂，试剂的活性显著优于常规标记方法。
                    实施例8
将实施例1中得到的碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体溶液用于系列浓度的TSH的化学发光酶免疫分析检测。向系列浓度的TSH样本溶液中分别加入50μg TSH单克隆抗体包被的磁珠试剂和0.4pmol碱性磷酸酶标记的抗TSH的山羊多克隆抗体试剂，孵育反应后清洗，加入200μl化学发光液Lumiphos 530，用BHP9507型化学发光免疫分析仪测量发光值，结果见表2。以TSH抗原浓度为X轴，以相对发光值为Y轴，由表2数据作图，得图2。
表2系列浓度TSH抗原样本的免疫检测结果
  TSH抗原浓度   发光值(RLU)
  0μIU/ml   5714
  0.1μIU/ml   14808
  0.5μIU/ml   53322
  4μIU/ml   368538
  10μIU/ml   931946
  50μIU/ml   2951268
  100μIU/ml   6136542
由表2和图2结果可知，采用本发明的标记工艺制备的酶标记抗体可应用于化学发光免疫分析且效果良好。本发明的碱性磷酸酶标记物制备方法具有良好的适用性。
                    实施例9
将乙酸钠(醋酸钠)溶解于800μl 30mM MES缓冲液(pH 6.0)中，加入EDC和NHS，加缓冲液至1000μl，乙酸钠的终浓度为1.8mol/L，EDC终浓度为18mmol/L，NHS终浓度为18mmol/L。22℃反应30分钟后，加入2mg(18nmol)碱性磷酸酶和2ml pH 7.20.1M磷酸盐缓冲液。22℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以30mM MES缓冲液(pH 6.0)作为换液缓冲液，超滤3遍，除去游离的乙酸钠、EDC、NHS及反应副产物，得到氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
向1ml 10mmol/L氨基封闭的碱性磷酸酶溶液中加入EDC(终浓度为10mmol/L)和NHS(终浓度为20mmol/L)。22℃反应30分钟后，加入终浓度为10mM的巯基乙醇，得到羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液。
接着向羧基活化的氨基封闭的碱性磷酸酶溶液加入100μg(128.7nmol)甲状腺素(溶于DMSO)和2ml 0.1M HEPES缓冲液(pH 7.2)。37℃反应3小时后，用15ml 30KD截留分子量的超滤管(Millipore公司)，以50mM三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液(pH 7.5)作为换液缓冲液，超滤3遍，得到碱性磷酸酶标记的甲状腺素。
参考Bioconjugate Techniques，Academic Press/2008年第二版中的戊二醛法，制备碱性磷酸酶标记的甲状腺素。
将本发明方法制备的碱性磷酸酶标记的甲状腺素溶液和用戊二醛法得到的酶标记抗原用于甲状腺素的化学发光酶免疫分析检测。分别在50μg甲状腺素多克隆抗体包被的磁珠中加入0.4pmol用这两种方法制备的碱性磷酸酶标记的甲状腺素，孵育反应后清洗，加入200μl化学发光液Lumiphos 530，用BHP9507型化学发光免疫分析仪测量发光值，结果见表3。免疫分析所得结果的发光值越大，说明酶标记物的活性越好。
表3各方法标记的酶标物检测TSH对比结果
  酶标物   发光值(RLU)
  本例酶标物   2154124
  戊二醛法酶标物   532457
由表3结果可知，采用本发明的标记工艺制备的酶标记试剂，试剂的活性明显优于戊二醛交联法。

Claims (32)

1.由待结合物A和待结合物B制备结合物的方法，其中待结合物A含有氨基和羧基，待结合物B含有氨基，所述方法包括以下步骤：
1)在交联剂存在下，用通式I的羧基化合物将待结合物A的氨基封闭：
通式I中R1为H、C1-6烷基、CnH2nCOOH、苯基或苯基C1-6烷基，其中n为0-4的整数，苯基或苯基C1-6烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、烷基、烷氧基和羧基；R2为H、Na、K等在水中发生解离的基团，
所述交联剂为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺，其中所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺；所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺；
2)纯化氨基封闭后的待结合物A；
3)用交联剂活化氨基封闭的待结合物A的羧基，其中所述交联剂为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺；以及
4)使活化后的待结合物A与待结合物B交联。
2.权利要求1的方法，其中所述结合物为酶标记物，所述待结合物A为标记用酶。
3.权利要求1的方法，其中所述结合物为酶标记物；所述待结合物A为肽或蛋白质；所述待结合物B为标记用酶。
4.权利要求3的方法，所述待结合物A为抗体。
5.权利要求2或3的方法，其中所述标记用酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶。
6.权利要求2或3的方法，所述标记用酶为碱性磷酸酶。
7.权利要求1的方法，其中所述待结合物A为载体蛋白，所述待结合物B为半抗原。
8.权利要求1的方法，其中所述待结合物A为肽或蛋白质，而待结合物B为固体支持体。
9.权利要求1的方法，其中所述待结合物A为选自抗体和配体的靶向部分，而待结合物B为含氨基的药物；或者所述待结合物A为肽或蛋白类药物，而待结合物B为选自抗体和配体的靶向部分。
10.权利要求1的方法，其中所述纯化选自超滤纯化、脱盐柱纯化和透析纯化。
11.权利要求1的方法，其中在待结合物A的羧基被活化后，通过加入巯基化合物猝灭交联剂活性，或者经纯化除去交联剂，得到羧基活化的氨基封闭的待结合物A。
12.权利要求11的方法，其中所述巯基化合物选自巯基乙醇和巯基苏糖醇。
13.权利要求12的方法，所述巯基化合物为巯基乙醇。
14.权利要求11的方法，其中羧基活化的氨基封闭的待结合物A的纯化选自超滤纯化、脱盐柱纯化和透析纯化。
15.权利要求1的方法，其中所述羧基化合物选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸和它们的盐。
16.权利要求1的方法，其中所述羧基化合物选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸和它们的盐。
17.权利要求1的方法，其中所述羧基化合物为乙酸钠。
18.权利要求1的方法，其中在步骤1)中，羧基化合物的摩尔数为待标记物A或待标记物B摩尔数的500－200000倍；和/或交联剂的摩尔数是待标记物A或待标记物B摩尔数的50－5000倍；和/或碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为5:1－1:10。
19.权利要求1的方法，其中在步骤1)中，羧基化合物的摩尔数为待标记物A或待标记物B摩尔数的1000－20000倍。
20.权利要求1的方法，其中在步骤1)中，交联剂的摩尔数是待标记物A或待标记物B摩尔数的100－1000倍。
21.权利要求1的方法，其中在步骤1)中，碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为2:1－1:5。
22.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，碳二亚胺的摩尔数是氨基封闭的待结合物A的摩尔数的10－5000倍；碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为5:1－1:10。
23.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，碳二亚胺的摩尔数是氨基封闭的待结合物A的摩尔数的50－1000倍。
24.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为2:1－1:5。
25.用于制备酶标记物的试剂盒，其包含：
1)标记用酶，其可以选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和苹果酸脱氢酶；
2)通式I的羧基化合物：
通式I中R1为H、C1-6烷基、CnH2nCOOH、苯基或苯基C1-6烷基，其中n为0-4的整数，苯基或苯基C1-6烷基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、烷基、烷氧基和羧基；R2为H、Na、K等在水中发生解离的基团；
3)交联剂，其为碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺，其中所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N,N'-二异丙基碳二亚胺；所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺；和
4)任选的巯基化合物。
26.权利要求25的试剂盒，所述标记用酶为碱性磷酸酶。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述羧基化合物选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸和它们的盐。
28.权利要求25的试剂盒，其中所述羧基化合物选自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸和它们的盐。
29.权利要求25的试剂盒，其中所述羧基化合物为乙酸钠。
30.权利要求25的试剂盒，其中所述巯基化合物选自巯基乙醇和巯基苏糖醇。
31.权利要求25的试剂盒，其中所述巯基化合物为巯基乙醇。
32.权利要求25的试剂盒，其中所述的试剂盒还含有离心超滤管、指示操作者进行操作的说明或这两者。
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Application publication date: 20111207

Assignee: Shenzhen Mindray Animal Medical Technology Co.,Ltd.

Assignor: SHENZHEN MINDRAY BIO-MEDICAL ELECTRONICS Co.,Ltd.

Contract record no.: X2022440020009

Denomination of invention: Preparation method of conjugate and related kit

Granted publication date: 20141210

License type: Common License

Record date: 20220804