CN110108868B - 一种酶标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶标记的方法及其应用；本发明通过先将酶封闭并活化后冻干处理，再与抗原和/或抗体混合反应，摸索反应pH、组份比例和反应时间等条件，各步骤各条件相互配合，协同增效，短时间内完成酶标记的过程，缩短反应时间，简化反应步骤，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值；本发明工艺简单，可实现工业化大规模生产，可为企业带来良好的经济效益，具备广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种酶标记的方法及其应用。
背景技术
酶标记技术是一种将抗原、抗体与酶偶联起来的技术。酶标记物在酶联免疫吸附、免疫印迹实验和酶促化学发免疫实验中是至关重要的。现有的酶标记方法都过于繁琐。
目前常用的酶标记方法有三种，一：戊二醛交联法：利用戊二醛的两个醛基分别于酶和抗体(抗原)上的氨基反应。由于该方法极易造成酶与酶连接，抗体(抗原)和抗体(抗原)连接导致酶标记物效果不佳。二：高碘酸钠氧化法：利用高碘酸钠的氧化性将酶上的糖基氧化成醛基然后与抗体(抗原)上的氨基反应。三：异双功能基团交联法：该方法的实现形式多种多样，其中最常用的方式是利用一种偶联剂将酶和含有巯基的抗体(抗原)连接起来，这种偶联剂含有马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺其中马来酰亚胺基团能够与巯基反应，琥珀酰亚胺能够与氨基反应。上述三种方法都存在一个共同的问题就是完成整个酶标记的时间过长需要3-4天。
因此，提供一种快速实现酶标记的方法和试剂盒，在短时间内完成整个酶标记的过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
本发明提供了一种酶标记的方法及其应用，通过先将酶封闭并活化后冻干处理，再与抗原和/或抗体混合反应，短时间内完成酶标记的过程，缩短反应时间，简化反应步骤，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种酶标记的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)向酶中加入封闭剂，封闭反应后进行纯化；
(2)向步骤(1)纯化后的酶加入交联剂，活化反应后纯化并冻干保存，得到活化酶的冻干粉；
(3)将步骤(3)的活化酶的冻干粉加入助剂溶解，再加入抗原和/或抗体反应。
本发明中，发明人在长期的科研实践过程中，总结现有技术在酶标记领域的优缺点，为缩短反应时间，从固相标记的技术领域获得灵感，磁微粒固相为一种修饰后的四氧化三铁微粒，磁微粒上富含羧基；向磁微粒中加入一定量的EDC(碳二亚胺)和NHS(羟基琥珀酰亚胺)反应，将磁微粒上的羧基活化为易与氨基反应的琥珀酰亚胺酯，加入抗原抗体RT震荡反应，即将抗原抗体包被到了磁微粒固相上；而碱性磷酸酶上也存在羧基，先将酶封闭并活化后冻干处理，再与抗原抗体混合反应，酶冻干处理能够长期保存，摸索反应pH、组份比例和反应时间等条件，各步骤各条件相互配合，协同增效，短时间内完成酶标记的过程，各步骤各条件相互配合，协同增效，缩短反应时间，简化反应步骤，能够在数小时内内完成整个酶标记过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
优选地，步骤(1)所述的酶包括碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。
优选地，步骤(1)所述封闭剂包括琥珀酰亚胺酯。
优选地，步骤(1)所述封闭剂与酶的摩尔比为(100-10000):1，例如可以是100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、800:1、1000:1、2000:1、4000:1、8000:1或10000:1，优选为(200-2000):1。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为0.5-4h，例如可以是0.5h、1h、2h、3h或4h。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(1)所述反应的缓冲液包括PBS和/或MOPOS。
优选地，步骤(1)所述反应的pH为6.5-7.5，例如可以是6.5、6.7、6.9、7、7.3或7.5。
优选地，步骤(1)所述纯化的方法包括脱盐柱纯化和/或透析纯化。
优选地，步骤(2)所述交联剂包括碳二亚胺和/或羟基琥珀酰亚胺。
优选地，所述碳二亚胺与酶的摩尔比为(10-2000):1，优选为(50-1000):1。
优选地，所述碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(5-1):(1-5)，优选为(2-1):(1-2)。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。
优选地，步骤(2)所述反应的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h。
优选地，步骤(2)所述反应的缓冲液包括MES和/或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
优选地，步骤(2)所述反应的pH为4.5-5.5。
优选地，步骤(2)所述纯化方法包括脱盐柱纯化和/或透析纯化。
优选地，步骤(3)所述助剂的浓度为10-100nM，pH为6.5-7.5，优选为PBS和/或MOPSO。
优选地，步骤(3)所述活化酶的冻干粉与助剂的料液比为(8-12):1mg/mL，例如可以是8:1mg/mL、9:1mg/mL、10:1mg/mL、11:1mg/mL或12:1mg/mL。
优选地，步骤(3)所述反应的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(3)所述反应的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h。
优选地，步骤(3)所述抗原和/或抗体与活化酶的冻干粉的摩尔比为(4-1):(1-4)，例如可以是4:1、4:3、2:1、1:1、3:1、3:2、3:4、2:3、1:2或4:1。
作为优选技术方案，一种酶标记的方法，具体包括如下步骤：
(1)向碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶中加入封闭剂琥珀酰亚胺酯，封闭剂与酶的摩尔比为(100-10000):1，封闭反应，反应的时间为0.5-4h，温度为35-40℃，缓冲液包括PBS和/或MOPOS，pH为6.5-7.5，进行脱盐柱纯化和/或透析纯化；
(2)向步骤(1)纯化后的酶加入交联剂碳二亚胺和/或羟基琥珀酰亚胺，碳二亚胺与酶的摩尔比为(10-2000):1碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(5-1):(1-5)，活化反应，反应的温度为35-40℃，时间为0.5-2h，缓冲液包括MES和/或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为4.5-5.5，脱盐柱纯化和/或透析纯化并冻干保存，得到活化酶的冻干粉；
(3)将步骤(3)的活化酶的冻干粉加入助剂溶解，助剂的浓度为10-100nM，pH为6.5-7.5，优选为PBS和/或MOPSO，活化酶的冻干粉与助剂的料液比为(8-12):1mg/mL，再加入抗原和/或抗体反应，抗原和/或抗体与活化酶的冻干粉的摩尔比为(4-1):(1-4)，反应的温度为35-40℃，时间为0.5-2h。
第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述方法制备得到的活化酶的冻干粉和第一方面所述方法的步骤(3)的助剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的方法制备的活化的酶冻干处理能够长期保存，本发明的试剂盒，能够在数小时内内完成整个酶标记过程，方法简洁高效，缩短反应时间，提高生产效率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应1h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为100:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
实施例2
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:10000，37℃反应4h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为2000:1，EDC和NHS的摩尔比为5:1，37℃反应2h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
实施例3
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为10:1，EDC和NHS的摩尔比为1:5，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例1
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:50，37℃反应1h，超滤将缓冲液置换为0.1M MESpH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为100:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例2
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应6h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为100:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例3
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μμL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应1h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为5:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例4
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应1h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为100:1，EDC和NHS的摩尔比为10:1，37℃反应0.5h，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例5
取碱性磷酸酶1mg用0.1MPBS(pH7.0)稀释至5mg/mL，加入醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加PBS缓冲液至250μL，碱性磷酸酶与醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:100，37℃反应1h，超滤将缓冲液置换为0.1M MES pH5.0；
加入EDC和NHS，加0.1M MES至1mL，EDC和碱性磷酸酶的摩尔比为100:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，37℃反应10min，超滤将缓冲液置换为0.1MPBS pH7.0对其进行冻干处理；
取100μg冻干的活化酶用0.1MPBS pH7.0溶解，加，0.1mgHBeAg抗体37℃反应1h，采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例6
取碱性磷酸酶0.2mg，超滤将缓冲液替换为1.25％戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25％戊二醛稀释为1.25％)；
室温(20℃左右)反应18小时。用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛。将100μg HBeAg抗体(缓冲液替换为0.15MNaCl)与醛化的酶溶液(10mg/mL)混合；
加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.6)，4℃电磁搅拌下结合24h。加入0.1mL 0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2小时，以封闭残留的醛基，终止反应；采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
对比例7
取碱性磷酸酶0.2mg，超滤将缓冲液替换50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)，加0.02mL0.1mol/L NaIO4溶液避光搅拌30分钟，加0.02mL 0.16mol/L乙二醇继续避光搅拌1小时，用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)4℃透析过夜，中间换液；
加入100μg HBeAg抗体(缓冲液替换为50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6))，室温下避光搅拌2小时，加0.01mL 4mg NaBH4溶液4℃反应过夜；采用TSK-SW3000液相色谱柱纯化得到HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物。
实验检测
将实施例和对比例中得到的HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物用于HBeAg的化学发光酶免疫分析检测。向各梯度浓度的HBeAg样本中，分别加入等量的HBeAg抗体包被的磁珠和HBeAg抗体-碱性磷酸酶结合物，孵育反应后清洗，加入化学发光液，用滨松9504化学发光仪测量发光值，结果见表1。
表1
实施例1和对比例7的发光值最高，说明此方法做出的酶结合物与高碘酸钠法在免疫活性上没有差别且均优于对比例6的戊二醛法；实施例2和实施例3的发光值较高，但略低于实施例1，对比例1-5的条件范围超过本技术方案的范围，发光值明显降低，因此，在保证试剂性能的情况下，本发明提供的技术方案可以将标记时间由3天缩短到几小时，有着明显的优势。
综上所述，本发明提供了一种酶标记的方法及其应用，通过先将酶封闭并活化后冻干处理，再与抗原和/或抗体混合反应，摸索反应pH、组份比例和反应时间等条件，各步骤各条件相互配合，协同增效，短时间内完成酶标记的过程，缩短反应时间，简化反应步骤，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值；本发明工艺简单，可实现工业化大规模生产，可为企业带来良好的经济效益，具备广阔的前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (12)
1.一种酶标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)向酶中加入封闭剂，封闭反应后进行纯化；
(2)向步骤(1)纯化后的酶加入交联剂，活化反应后纯化并冻干保存，得到活化酶的冻干粉；
(3)将步骤(2)的活化酶的冻干粉加入助剂溶解，再加入抗原和/或抗体反应；
步骤(1)所述反应的时间为1-4h，步骤(1)所述反应的pH为6.5-7.5；
步骤(1)所述封闭剂包括琥珀酰亚胺酯；步骤(1)所述封闭剂与酶的摩尔比为(200-2000):1；
步骤(2)所述交联剂包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺；
所述碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1-2)；
步骤(2)所述反应的时间为0.5-2h，步骤(2)所述反应的pH为4.5-5.5；
步骤(3)所述助剂的pH为6.5-7.5，步骤(3)所述助剂为PBS和/或MOPSO；步骤(3)所述助剂的浓度为10-100nM；
步骤(3)所述反应的时间为0.5-2h；步骤(3)所述反应的温度为35-40℃；
步骤(3)所述抗原和/或抗体与活化酶的冻干粉的摩尔比为(4-1):(1-4)；
步骤(3)所述活化酶的冻干粉与助剂的料液比为(8-12):1mg/mL；
步骤(1)-(3)在内的封闭、活化和加入抗原和/或抗体反应的总时间为1.5-8h内。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶包括碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的温度为35-40℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的缓冲液包括PBS和/或MOPOS。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述纯化的方法包括脱盐柱纯化和/或透析纯化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺与酶的摩尔比为(10-2000):1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺与酶的摩尔比为(50-1000):1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的温度为35-40℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的缓冲液包括MES和/或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化方法包括脱盐柱纯化和/或透析纯化。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)向碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶中加入封闭剂琥珀酰亚胺酯，封闭剂与酶的摩尔比为(100-10000):1，封闭反应，反应的时间为1-4h，温度为35-40℃，缓冲液包括PBS和/或MOPOS，pH为6.5-7.5，进行脱盐柱纯化和/或透析纯化；
(2)向步骤(1)纯化后的酶加入交联剂碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，碳二亚胺与酶的摩尔比为(10-2000):1；碳二亚胺与羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1-2)，活化反应，反应的温度为35-40℃，时间为0.5-2h，缓冲液包括MES和/或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为4.5-5.5，脱盐柱纯化和/或透析纯化并冻干保存，得到活化酶的冻干粉；
(3)将步骤(2)的活化酶的冻干粉加入助剂溶解，助剂的浓度为10-100mM，pH为6.5-7.5，所述助剂为PBS和/或MOPSO，活化酶的冻干粉与助剂的料液比为(8-12):1mg/mL，再加入抗原和/或抗体反应，抗原和/或抗体与活化酶的冻干粉的摩尔比为(4-1):(1-4)，反应的温度为35-40℃，时间为0.5-2h。
12.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-11中任一项所述方法中步骤(2)制备得到的活化酶的冻干粉和权利要求1-11中任一项所述方法中步骤(3)的助剂。
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