CN114295824A - 一种基于黄原胶的hrp标记鼠抗人肌钙蛋白i单克隆抗体及其制备方法、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体及其制备方法、试剂盒。该制备方法包括：步骤一、氧化黄原胶得到含醛基的黄原胶；步骤二、将所述含醛基的黄原胶与辣根过氧化物酶聚合得到辣根过氧化物酶多聚物；步骤三、对所述辣根过氧化物酶多聚物进行纯化；步骤四、鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体连接到纯化后的辣根过氧化物酶多聚物上；步骤五、对步骤四的产物纯化，得所述HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。本发明的鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体具有较高的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体及其制备方法，还涉及一种用于检测急性心肌梗死的试剂盒。
背景技术
肌钙蛋白是心肌损伤坏死的标志物，检测人血清中肌钙蛋白I对急性心肌梗死的诊断和危险分层有重要的临床意义。心肌肌钙蛋白I在人血清中含量特别低，需要采用高灵敏度的方法来检测。
目前，酶免疫检测法中抗体或抗原酶标记物对免疫检测分析的灵敏度及特异性具有重要的作用，是酶免疫分析检测中的关键试剂。辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)比活性高、稳定、分子量小、纯酶容易制备，因而是现在最常用的蛋白酶标记物的制备原料。传统的辣根过氧化物酶标抗体，是应用酶和抗体上氨基、巯基或糖蛋白上的羟基作为交联的基团，通过过碘酸钠或戊二醛法将抗体与酶直接连接在一起。由于分子大小不同，一般一个抗体分子上仅能联接1～2个HRP分子。免疫反应通过HRP催化底物来显现，该传统的HPR标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的检测灵敏度有限。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，具有较高的检测灵敏度。
本发明还提供一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其制得的看题检测灵敏度较高，且产物应用效果良好。
本发明还提供一种用于检测急性心肌梗死的试剂盒，其具有较高的检测灵敏度。
根据本发明的第一个方面，一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，包括：
步骤一、氧化黄原胶得到含醛基的黄原胶；
步骤二、将所述含醛基的黄原胶与辣根过氧化物酶聚合得到辣根过氧化物酶多聚物；
步骤三、对所述辣根过氧化物酶多聚物进行纯化；
步骤四、鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体连接到纯化后的辣根过氧化物酶多聚物上；
步骤五、对步骤四的产物纯化，得所述HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
在一具体且优选的实施例中，所述制备方法具体实施如下：
步骤一、5-8mg黄原胶与15-25mg高碘酸钠反应，得到含醛基的黄原胶；
步骤二、步骤一得到的含醛基的黄原胶中加入5-15mg辣根过氧化物酶，充分混匀后再加入35-45mg三乙酰基硼氢化钠，3-5℃旋转，得辣根过氧化物酶多聚物；
步骤三、步骤二得到的辣根过氧化物酶多聚物用磷酸盐缓冲液透析，得透析物；
步骤四、步骤三得到的透析物中加入2-4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3-5小时；
步骤五、磷酸盐缓冲液透析换液，取出透析物，得所述HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
在一优选的实施例中，步骤一中，通过高碘酸钠氧化黄原胶。
更优选地，步骤一中，5-8mg黄原胶与15-25mg高碘酸钠反应，得到含醛基的黄原胶。
更优选地，黄原胶先溶解于10-100mM pH为9-10的碳酸盐缓冲液中，再加入高碘酸钠。
在一优选的实施例中，步骤二中，步骤一得到的含醛基的黄原胶中加入5-15mg辣根过氧化物酶，混匀后加入35-45mg三乙酰基硼氢化钠，3-5℃旋转过夜得辣根过氧化物酶多聚物。
在一优选的实施例中，步骤三中，用磷酸盐缓冲液透析进行纯化。进一步地，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3-5℃下透析8-12小时以进行纯化，得透析产物。
在一优选的实施例中，步骤五中，用磷酸盐缓冲液透析进行纯化。进一步地，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3-5℃下透析8-12小时以进行纯化，得透析产物。
在一优选的实施例中，步骤四中，步骤三得到的透析物中加入2-4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3-5小时。
在一实施例中，所述制备方法具体实施如下：
步骤一、高碘酸钠法氧化黄原胶形成游离醛基：取5-8mg黄原胶，充分溶解于10-100mM pH为9-10的碳酸盐缓冲液中，加15-25mg高碘酸钠，反应30分钟，得到含醛基的黄原胶；
步骤二、黄原胶骨架与HRP的聚合：步骤一得到的含醛基的黄原胶中加入5-15mgHRP，充分混匀后往溶液中加入35-45mg三乙酰基硼氢化钠，3-5℃旋转过夜得HRP多聚物；
步骤三、纯化：步骤二得到的HRP多聚物用10mM磷酸盐缓冲液透析换液3次，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3-5℃下透析8-12小时，得透析物；
步骤四、连接鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体：取出步骤三得到的透析物，加入2-4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3-5小时；
步骤五、纯化：10mM磷酸盐缓冲液透析换液3次，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3-5℃下透析8-12小时，取出透析物，得抗体与HRP多聚物。
根据本发明的第二个方面，一种根据上述的制备方法制得的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
根据本发明的第三个方面，一种用于检测急性心肌梗死的试剂盒，包括根据上述的制备方法制得的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，或包括根据上述的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
相比现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：
本发明利用黄原胶作为骨架，将鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶偶联在黄原胶骨架上，黄原胶骨架重复单元的数目较多，且每个重复单元上的可接枝集团数目也更多，放大的强度与偶联的分子数量成正比，每一个抗体与抗原反应信号可以通过连接的多倍数量的HRP催化底物系统而体现，从而实现放大抗体与抗原反应信号的效果，极大地提高了肌钙蛋白I检测灵敏度，对急性心肌梗死的诊断和危险分层具有重要的临床意义；制备方法步骤简单，所得产物应用效果良好，具有更好的应用前景。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以互相结合。
传统的辣根过氧化物酶标抗体，是应用酶和抗体上氨基、巯基或糖蛋白上的羟基作为交联的基团，通过过碘酸钠或戊二醛法将抗体与酶直接连接在一起。由于分子大小不同，一般一个抗体分子上仅能联接1～2个HRP分子。免疫反应通过HRP催化底物来显现。本文以多聚体作为载体将抗体与HRP连接在一起，由于多聚体的延伸，可使一个抗体连接10个以上HRP分子，每1个抗体与抗原反应信号可以通过连接的10倍数量的HRP催化底物系统而体现，因此，检测灵敏度大幅提高。经检索，采用以黄原胶为骨架的HRP-鼠抗人肌钙蛋白I标记抗体的文献与产品还未见报道。
本文中，采用高碘酸钠法氧化黄原胶上的邻羟基形成醛基，然后，将氧化后的黄原胶骨架通过醛基与HRP上的氨基相连形成XG-HRP聚合物，最后，将鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体与XG-HRP连接，经过纯化、透析以及防腐处理后，得到基于黄原胶偶联的HRP-鼠抗人肌钙蛋白I标记抗体，该方法得到的鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体-HRP多聚物相比现有技术的商品化Medix的正常标记HRP-鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体具有更高的灵敏性以及更好的应用前景。
实施例1
①将15mg高碘酸钠与5mg黄原胶(溶解于0.1M碳酸盐缓冲溶液中)混合，37℃条件下反应30分钟，得含醛基的黄原胶溶液。
②向含醛基的黄原胶溶液中加入5mg HRP，充分混匀后加入35mg三乙酰氧基硼氢化钠(溶解于0.6mM，碳酸盐缓冲液中)，3℃搅拌过夜得HRP多聚物。
③将HRP多聚物溶液纯化：采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，将HRP多聚物溶液在3℃下透析8小时，透析换液3次，得透析产物。
④向透析纯化后的HRP多聚物溶液中加入2mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入40mg三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3小时。
⑤将反应溶液采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3℃下透析8小时，透析换液3次，得透析产物，即HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
实施例2
①将20mg高碘酸钠与7.5mg黄原胶(溶解于0.1M碳酸盐缓冲溶液中)混合，37℃条件下反应30分钟，得含醛基的黄原胶溶液。
②向含醛基的黄原胶溶液中加入10mg HRP，充分混匀后加入40mg三乙酰氧基硼氢化钠(溶解于0.6mM，碳酸盐缓冲液中)，4℃搅拌过夜得HRP多聚物。
③将HRP多聚物溶液纯化：采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在4℃下透析10小时，透析换液3次，得透析产物。
④向透析纯化后的HRP多聚物溶液中加入3mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入45mg三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3小时。
⑤将反应溶液采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在4℃下透析10小时，透析换液3次，得透析产物，即HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
实施例3
①将25mg高碘酸钠与8mg黄原胶(溶解于0.1M碳酸盐缓冲溶液中)混合，37℃条件下反应30分钟，得含醛基的黄原胶溶液。
②向含醛基的黄原胶溶液中加入15mg HRP，充分混匀后加入45mg三乙酰氧基硼氢化钠(溶解于0.6mM，碳酸盐缓冲液中)，5℃搅拌过夜得抗体与HRP多聚物。
③将HRP多聚物溶液纯化：采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在5℃下透析12小时，透析换液3次，得透析产物。
④向透析纯化后的HRP多聚物溶液中加入4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入50mg三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3小时。
⑤将反应溶液采用10倍体积的0.1mM PBS作为透析液，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在5℃下透析12小时，透析换液3次，得透析产物。
对比例
购自Medix公司的正常标记HRP-鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。采用HRP酶和鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体上氨基、巯基或糖蛋白上的羟基作为交联的基团，通过过碘酸钠或戊二醛法将抗体与酶直接连接在一起。
评价实验：
将实施例1-3中制备得到的基于黄原胶的HRP鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体和对比例的商品化Medix的正常标记HRP-鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体进行如下实验：
①将各实施实例得到的HRP鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体和商品化Medix的正常标记HRP-鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体稀释至合适浓度使得空白检测信号值Δk/s在0.001-0.01左右；
②将稀释后的各HRP标记抗体吸取30-45ul至东方伊诺(苏州)医疗科技有限公司的MIA系列全自动免疫分析仪专用检测卡(单人份检测卡，含有已包被抗生物素抗体固相载体)中的酶标液孔位；
③将商品化Medix生物素化鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体按照商家指定稀释倍数稀释至合适浓度，吸取20-30ul添加至东方伊诺(苏州)医疗科技有限公司的MIA系列全自动免疫分析仪专用检测卡中的试剂空位；
④洗液孔位添加140-160ul MIA系列全自动免疫分析仪专用洗液，缓冲液孔位添加40-70ulMIA系列全自动免疫分析仪专用缓冲液，TMB孔位添加30-50ulMIA系列全自动免疫分析仪专用TMB；
⑤选取肌钙蛋白(cTnI)的各梯度浓度样本(依次为20ng/ml、10ng/ml、2ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0ng/ml)，添加20-40ul至检测卡样本孔位中；
⑥最终将28份检测卡用MIA系列全自动免疫分析仪进行自动检测，结果见下表1。
表1
由表1数据可知：相比对比例，实施例1、2、3在非零浓度下的信号值有很大的提高，并且对于本底值(即零浓度下的信号值)，实施例1、2、3比对比例低很多，因此实施例的基于黄原胶的HRP鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体能够有效地降低酶免疫反应中的本底值，且非零浓度下的信号值大幅提高，具有较高的检测灵敏度。
本发明中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的精神实质所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、氧化黄原胶得到含醛基的黄原胶；
步骤二、将所述含醛基的黄原胶与辣根过氧化物酶聚合得到辣根过氧化物酶多聚物；
步骤三、对所述辣根过氧化物酶多聚物进行纯化；
步骤四、鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体连接到纯化后的辣根过氧化物酶多聚物上；
步骤五、对步骤四的产物纯化，得所述HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体实施如下：
步骤一、5-8mg黄原胶与15-25mg高碘酸钠反应，得到含醛基的黄原胶；
步骤二、步骤一得到的含醛基的黄原胶中加入5-15mg辣根过氧化物酶，充分混匀后再加入35-45mg三乙酰基硼氢化钠，3-5℃旋转，得辣根过氧化物酶多聚物；
步骤三、步骤二得到的辣根过氧化物酶多聚物用磷酸盐缓冲液透析，得透析物；
步骤四、步骤三得到的透析物中加入2-4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3-5小时；
步骤五、磷酸盐缓冲液透析换液，取出透析物，得所述HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，通过高碘酸钠氧化黄原胶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，5-8mg黄原胶与15-25mg高碘酸钠反应，得到含醛基的黄原胶。
5.根据权利要求2至4任一项所述的制备方法，其特征在于，黄原胶先溶解于10-100mMpH为9-10的碳酸盐缓冲液中，再加入高碘酸钠。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，步骤一得到的含醛基的黄原胶中加入5-15mg辣根过氧化物酶，混匀后加入35-45mg三乙酰基硼氢化钠，3-5℃旋转过夜得辣根过氧化物酶多聚物。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三和/或步骤五中，用磷酸盐缓冲液透析进行纯化；和/或，步骤三和/或步骤五中，选用分子截留量为2000-4000D透析袋，在3-5℃下透析8-12小时以进行纯化，得透析产物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，步骤三得到的透析物中加入2-4mg鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体充分混合后加入三乙酰基硼氢化钠，旋转反应3-5小时。
9.一种根据权利要求1至8任一项所述的制备方法制得的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
10.一种用于检测急性心肌梗死的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1至8任一项所述的制备方法制得的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体，或包括根据权利要求9所述的基于黄原胶的HRP标记鼠抗人肌钙蛋白I单克隆抗体。
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