JPH01148962A - インスリン免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分１１Ｆ） 本発明は、−段階サンドイ、チ法を用いるインスリン免
疫測定法に関する。更に詳しくは、水不溶性担体に担持
されたインスリンに対するモノクローナル担体と該抗体
と競合しないインスリンの他のエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体の酵素標識物による一段階すンドイフ
チインスリン免疫測定法において、該反応系中に水溶性
合成ポリマーを共存させることＫより、検量線の直線性
を改善せしめ高感度、高精度かつ、簡易にインスリンを
測定する方法に関する。

（従来の技術） 抗原抗体反応を定量的に測定するため、従来から数多く
の方法が開発され、利用されている。なかでも抗原ある
いは抗体のいずれかを放射性同位元素又は酵素で標識す
る方法が代表的であり、これらを用いた測定法は各々、
ラジオイムノア、セイ（以下ＲＸＡと記す）、エンザイ
ムイムノアッセイ（以下Ｅ工Ａと記す）と呼ばれている
。

これらのうち、ＲＩＡ法は放射性同位元素を使うことに
起因する欠点、即ち、その半減期が短かく、標識物の安
定性が問題となり、しかも特定な測定機器や特別な施設
が必要であり、放射線被曝に対する安全対策を考慮しな
ければならない等が指摘されており、使用範囲が限定さ
れているのが現状である。

一方、ＫＩＡ法は上記ＲＩＡ法のような欠点がなく、同
法で用いる試薬がＲＩＡ法のものに比べて安価であり、
感度もＲＩＡ法と同等かそれ以上である点から、生物学
的、医学的分野に積極的に導入されている。このＥＩＡ
法にも種々の手法があり、その反応型式では抗原抗体反
応の結果生じた複合体と遊離型の部分とを物理的に分離
して測定する方法（以下Ｂ／Ｆ分離法と記す）と分離せ
ずに測定する方法（以下非Ｅ／７分離法と記す）及び主
に高分子物質を対象としたサントイ、チ法と主に低分子
物質を対象とした競合法とに大別することができる（放
置「酵素免疫測定法」医学書院第２版（１９８２））。

これらのうち、非競合法で、Ｂ　／　ＩＦ分＋！ＪＩＢ
ｌＡ法であるサントイ、チ法が汎用されており、この方
法は、試料抗原を酵素標識抗体と固相に結合させた抗体
ではさみこんだ後、固相に結合した標識酵素活性を測定
することにより、抗原を定量する方法であり、サンプル
中の抗原は、既知濃度の抗原を用いた検量線を基に求め
ることができる。この方法にも、固相化抗体と抗原を反
応させ、Ｂ／？分離後、酵素標識抗体と反応させる、又
は、逆に酵素標識抗体と抗原を反応させた後、固相化抗
体と反応させる二段階サントイ、チ法と、上記反応を一
度に行わせる一段階すンドイ、チ法とがある。このうち
、後者の一段階すンドイ、チ法がより簡便であり、短時
間で測定を行うことができる。この場合、抗体としてア
フィニティの高い２種類の認識するエピトープの大きく
異なるモノクローナル抗体を用いれば理論的には検量線
が直線となることが知られているが、実際にはそうなら
ない事があり、−段階インスリンサンドイッチイムノア
ッセイにおいても検量線が直線とならないものであった
。

（発明が解決しようとする問題点） 検量線が直線でない場合、検量線を得るためには５ない
し８種の濃度の抗原を含有する標準液を用いねばならず
、また、その検量線から検体の抗原濃度を求めるには、
検量線を実際に作製し、それから直接読み取るか、ある
いは、適当な回帰処理を行わなければならないなど、多
くの工程を要するものであった。本発明は検量線が直線
となるようなインスリン免疫測定法を提供することを目
的とするものである。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明者ら
は、特に抗原低濃度域で検量線が２次曲線様になるよう
なサントイ、チ法の測定系に検ｉ、ｍ直線化因子を共存
させることにより、検量線を直線とすることを目的とし
、種々検討した結果、ポリエチレングリコール（以下Ｐ
ＩＧと記す）とポリビニルアルコール（以下ＰＴＡと記
ス）に著しい増感効果のあることを見出し、特にこの効
果は、抗原低濃度域において顕著にあられれ、また、適
当な添加濃度を検討することにより、２次曲線様の検量
線の直線性が改善される事を見出し、本発明を完成する
に至った。

即ち、本発明はインスリンのエピトープを認識し、水不
溶性担体に結合させたモノクローナル抗体と、該抗体と
競合しない他のエピトープを認識し、酵素で標識された
モノクローナル抗体とのＭ合わせによって成る一段階イ
ンスリンサンドイ。

チイムノア、セイにおいて水溶性合成ポリマーを添加す
るユとを特徴とするイｙｘｖｙ免疫測定Ｐ以下、本発明
の詳細な説明する。

インスリン抗体な固相化するための水不溶性担体には特
に制限はなく、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リ塩化ビニル、ラテックス１．アガロース、セルロース
、メタアクリレート、カラス等のビーズやマイクロプレ
ート等が使用できる。

また、固相化する方法として、通常の吸着法、又は、化
学結合法などにより実施することができる。

抗体を標識すべき酵素としては、例えばパーオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアルカリ性フォスフ
ァターゼ等がある。この抗体、酵素標識法としては、通
常知られている方法によって行えばよい。

固相化用及び標識用抗体として抗インスリンモノクロー
ナル抗体を用い、これら２種がインスリンに対して競合
反応をしないものであることが必要である。なお、該モ
ノクローナル抗体の種類としては、工ｇＧ、工ｇＡ、Ｉ
ｇＭ等用いることが出来るが、非特異的吸着の観点から
、好ましくは、工ｇＭでない方が良い。更には、該抗体
をＩＦａｂ、　ＩＦａ’ｂ’、　ＩＰ（ａｂ’）。

等に消化したものを用いることもできる。

該固相化抗体及び酵素標識抗体を用いて、−段階サンド
イ、チ免疫反応を行わせるにあたり、添加する水溶性合
成ポリマーとしては、例えばＰＥＧ、Ｐ’７Ａ等が挙げ
られる。ＰＲｊＧの分子量は２，０００以上であればよ
く、またＰ’７Ａの分子量については特に制限はない。

添加濃度はｃＬ１％以上であれば、直線性の改善が認め
られる。反応液の粘度の上昇９反応液中の成分の不溶化
、また添加量の増加に伴う非特異吸着の上昇などを考慮
すれば、添加濃度の上限は５％である。直線性の改善及
び非特異吸着を考慮すれば、好ましくは添加濃度１．０
〜４０％である。更に、ＰＥＧとＰＴＡの混合物を用い
ることもでき、その場合はその比に制限はなく、添加濃
度は単独の場合と同様、α１〜５％、好ましくは１．０
〜４．０％である。

また、固相化抗体、酵素標識抗体、抗原であるインスリ
ン、水溶性合成ポリマーの反応系への添加順序は特に限
定はない。

（発明の効果） 本発明を用いたサントイ、チ法による測定法においては
、検量線が直線となるため、水溶性合成ポリマー無添加
系に比べて、抗原低濃度域での測定感度及び精度が高く
なり、しかも、標準試料を２濃度しか必要としない。こ
のため、簡単な一次式から検体濃度を算出する事ができ
る。また、抗原抗体反応が促進されるため、同じ反応時
間内で水溶性ポリマー無添加の系よりも、少ない標識抗
体量で同等の感度を得ることができる。

（実施例） 以下、実施例をもって本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例のみに限定されるものではな〜ゝ０ 実施例１ 化学修飾したグラスチックビーズ（直径的・１６５、）
に抗ヒトインスリンモノクロナール抗体を１個あたり１
５μり化学結合法により同相化し、抗ヒトインスリン抗
体結合ビーズとした。このビーズ６個忙該抗体と競合し
ない他のエピトープを認識する抗体を用いたアルカリ性
ホスファターゼ標識抗ヒトインスリンモノクローナル抗
体（以下コンジュゲートと記す）を４．４　ｍＡｂａ及
びＱ、１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと記す）含有
（ＬＩＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ＆２（以下コンジェゲー
ト液Ａと記す）またはコンジュゲートα８５　ｍＡｂＦ
ｌ。

五７５％ｐｍｏ（分子量的６０００）及び（Ｌ１％ＢＳ
Ａ含有１１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐａａｚ（以下コンジェ
ゲート液Ｂと記す）またはコンジユゲートＩ１８３　ｍ
Ａｂｓ及びα１％Ｂ３Ａ含有α８リス塩酸緩衝液ｐＨａ
２（以下フンジェゲート液Ｏと記す）を１００μを加え
、抗原としてヒトインスリ：／ＱＩ　Ｑ、２０，４０，
８ｏ、１６（Ｌ３２０μＵ／ｄ含有ヒト血清を２５μを
加え、３７℃、４０分間反応させた６　Ｐ　Ｂ　Ｓ　−
Ｔｗｅａｎにて洗浄後、１ｍＭ４−メチルウンベリフェ
リルリン酸エステル含有１５Ｍ　　２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノ−ルー酢酸緩衝液１）Ｈｌ（ＬＯ（
以下基質液と記す）２００μｌを加え、３７℃で反応さ
せ、４−メチルウンベリフェロン（以下４ＭＵと記す）
の生成速度を励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０　ｍ
ｍにて蛍光測定することにより求めた。この結果を第１
図に示す。ここで横軸の値は、添加したインスリンの濃
度であり、縦軸は抗原抗体反応の結果、結合したコンジ
ユゲートの酵素活性値として生じた４ＭＵの生成速度な
ｎＭ／ｓｅａの単位で示しである。コンジュゲート液Ｂ
を用いた場合には、コンジュゲート液０と標識抗体含有
量が同じであるが、コンジュゲート液０を用いた場合よ
り、抗原抗体反応の結果結合したコンジユゲートの酵素
活性値が上昇し、また、コンジュゲート液Ａよりコンジ
ェゲート含有量がより少ないにもかかわらず、抗原抗体
反応の結果結合したコンジュゲートの酵素活性値がほぼ
同じである。更に、コンジュゲート液Ｂを使用した場合
、低濃度域まで極めて良好な直線性が得られており、こ
のことから検量線を作成するために漂準液としてインス
リン２０μＵ／−のヒト血清及び任意の濃度のインスリ
ン含有ヒト血清の２濃度を選択すれば良いことがわかる
。

また、低濃度域での測定誤差は、ＰＩＧが添加されてい
るコンジュゲート液Ｂを使用することにより改善される
ことがわかる。

実施例２ 実施例１で作製した抗ヒトインスリン抗体結合ビーズ６
個に、コンジェゲー）Ｎ３ｍＡｂｇ及びα１％ＢｓＡ含
有Ｑ、Ｉ　Ｍ）リス塩酸緩衝液ｐＨａ２（以下コンジュ
ゲート液りと記す）またはコンジュゲートα８５　ｍ　
Ａｔ）２１％　３％ＰＴＡ（分子量的ＩＱ、０００）及
び（１１％ＢＳＡ含有［１１Ｍ）リス塩酸緩衝液ｐＨａ
２（以下コンジュゲート液Σと記す）または実施例１で
使用したと同じコンジュゲート液ａを１００μを加え、
抗原としてヒトインスリン０．１へ２へ４へ８０，１６
０，３２０μＵ　／ｄ含有ヒト血清を２５μを加え、３
７℃、４０分間反応させた。Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ
にて洗浄後、基質液２００μを加え、３７℃で反応させ
、実施例１と同様にして４ＭＨの生成速度を測定した。

この結果を第２図に示す。ここで、横軸の値は添加した
インスリンの濃度であり、縦軸は抗原抗体反応の結果、
結合したコンジュゲートの酵素活性値としての生じた４
ＭＵの生成速度なｎＭ／’ａθＣの単位で示しである。

この図からも明らかなように、実施例１の場合に用いた
ＰＩＧと同様な効果が得られていることが分かる。即ち
、Ｐ’ＶＡを添加したことにより、抗原抗体反応が促進
され、しかも検量線の直線性が著しく改善される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において、第２図は実施例２において
、それぞれ各種濃度のインスリンを用いた場合の４ＭＵ
の生成速度を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）インスリンのエピトープを認識し、水不溶性担体
   に結合させたモノクローナル抗体と、該抗体と競合しな
   い他のエピトープを認識し、酵素で標識されたモノクロ
   ーナル抗体との組合わせによって成る一段階インスリン
   サンドイッチイムノアッセイにおいて水溶性合成ポリマ
   ーを添加することを特徴とするインスリン免疫測定法。
2. （２）水溶性合成ポリマーがポリエチレングリコール、
   ポリビニルアルコールまたはこれらの混合物である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。