WO2023124154A1 - 磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒 - Google Patents

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Definitions

  • the principle of immunodetection and immunodiagnosis of the chemiluminescence platform is that antigens or antibodies are bound to the surface of nano magnetic beads through physical adsorption or chemical cross-linking, and maintain their immunological activity. or antibody) to immunoreact with the antigen or antibody on the surface of the magnetic beads according to different steps, and then form a complex with the antigen or antibody labeled with a tracer (such as acridinium ester), so as to conduct quantitative or qualitative research according to the luminescent signal.
  • a tracer such as acridinium ester
  • a preparation method of a magnetic bead coating comprising the following steps:
  • the preparation method of the above-mentioned magnetic bead coating is to prepare the magnetic bead coating by making bovine serum albumin into cationic bovine serum albumin and then coupling the active substance and magnetic beads, so that bovine serum albumin has more amino groups, etc.
  • the electric point increases from 4.9 to 5.4 to 9.5 to 11, which makes it easier to couple bovine serum albumin and active substances, more couples, and fewer by-products of coupling, thereby improving the magnetic bead coating.
  • the signal-to-noise ratio makes the detection kit containing the above-mentioned magnetic bead coating have higher sensitivity and better detection rate.
  • the diamine is at least one selected from ethylenediamine, 1-3 diaminopropane, diaminodipropylamine and hexamethylenediamine.
  • the ratio of the complex to the nano magnetic beads is (40 ⁇ g-80 ⁇ g): 1 mg.
  • Fig. 1 is the reaction formula that adopts diamine to modify BSA to prepare cBSA of an embodiment
  • the polyamines include diamines and/or PEG-modified diamines.
  • PEG-modified diamine refers to a diamine compound containing polyethylene glycol with a hydrophilic chain.
  • the formation of amide bond eliminates the negative potential of carboxylate, while the terminal amine increases the potential of positive charge, so that the isoelectric point of modified BSA (cBSA) increases (pI from the previous The 4.9 ⁇ 5.4 of 9.5 ⁇ 11).
  • the diamine is at least one selected from ethylenediamine, 1-3 diaminopropane, diaminodipropylamine and hexamethylenediamine. Please refer to FIG. 1 , in one embodiment, the diamine is ethylenediamine. It can be understood that the polyamine is not limited to the above, and the diamine is not limited to the above, and other substances that can provide amino groups can also be used.
  • the active substance is thyroxine (T4)
  • the activator is EDC and sulfo-NHS
  • the solvent for dissolving the activator is ultrapure water
  • the solvent for dissolving the active substance is DMSO. It can be understood that the solvent for dissolving the activator and the active substance can be selected according to specific conditions.
  • a step of purifying the complex in the reaction product is also included.
  • the way to purify the complex in the reaction product includes but not limited to at least one of desalting, ultrafiltration and dialysis.
  • ultrafiltration is used to purify the complex in the reaction product.
  • the above detection kit further includes a labeled antibody.
  • the labeled antibody includes an antibody that can specifically bind to the substance to be tested and a signal substance labeled on the antibody. The amount of the substance to be detected in the sample to be tested is reflected by detecting the signal substance of the labeled antibody.
  • a signal substance refers to a substance that can provide a signal to be detected. The signal substance is generally reactively labeled to an antibody that can specifically bind to the substance to be tested.
  • the reaction formula of the coupling of BSA and ethylenediamine is shown in Figure 1.
  • the coupling of BSA and diethylamine includes but not limited to the following steps:
  • Magnetic separation discard the supernatant, wash the magnetic beads, add 1mL of 0.1M pH6 MES buffer, then add 0.4mg of T4-cBSA complex, and mix well.
  • the magnetic beads were placed in a 25°C incubator, and mixed for 3 hours.

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Abstract

一种磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒。磁珠包被物的制备方法包括以下步骤：采用多胺修饰牛血清白蛋白制备阳离子牛血清白蛋白，及将纳米磁珠与活性物质通过阳离子牛血清白蛋白偶联制备磁珠包被物。采用磁珠包被物的制备方法制备磁珠包被物，能够提高磁珠包被物的特异性和包被在磁珠上的活性物质的免疫原性，从而提高磁珠包被物在检测时的特异性、信噪比、灵敏度和检出率。

Description

磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒 技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种磁珠包被物及其制备方法和检测试剂盒。
背景技术
化学发光平台的免疫检测和免疫诊断的原理是：抗原或抗体通过物理吸附或者化学交联的方式结合到纳米磁珠表面，并保持其免疫学活性，在测定时受检标本(测定其中的抗原或者抗体)按不同的步骤与磁珠表面的抗原或者抗体进行免疫反应，再与标记了示踪物(例如吖啶酯)的抗原或抗体形成复合物，从而根据发光信号进行定量或者定性研究。
将抗原或者抗体包被于纳米磁珠表面的纳米磁珠包被物是发光免疫试剂的重要成分。为了抗原或抗体能稳定结合在磁微粒表面，一般会选择以化学交联的方式对抗原或抗体进行偶联。小分子多肽和半抗原分子因为其分子量过小，直接包被容易导致包被效率较低，包被物生物活性较差，因此常常会先修饰一个亲水性蛋白增加其分子量后，再与磁珠进行偶联反应。常用的修饰蛋白是牛血清蛋白(BSA)，因为其理化性质稳定、廉价易得、较大的溶解度、在水相和有机相(吡啶、DMF)都可以进行偶联反应、操作简单等优点被广泛在各种小分子多肽和半抗原分子的修饰中。
然而，BSA修饰后的小分子多肽和半抗原分子与纳米磁珠的连接效率较低，反应副产物较多，容易使得纳米磁珠包被物的特异性较低，而且传统的BSA修饰的小分子多肽和半抗原分子的免疫原性往往较弱，容易使得发光免疫试剂的 信噪比较低，无法满足试剂性能要求。
发明内容
基于此，有必要针对提供一种磁珠包被物的制备方法，该制备方法能够改善磁珠包被物的特异性较低和经BSA修饰后小分子多肽和半抗原分子的免疫原性较弱的问题。
此外，还有必要提供一种特异性较好和免疫原性高的磁珠包被物和包括该磁珠包被物的检测试剂盒。
一种磁珠包被物的制备方法，包括以下步骤：
采用多胺修饰牛血清白蛋白，制备阳离子牛血清白蛋白；及
将纳米磁珠与活性物质通过所述阳离子牛血清白蛋白偶联，制备磁珠包被物。
上述磁珠包被物的制备方法通过将牛血清白蛋白制成阳离子牛血清白蛋白后再与活性物质和磁珠偶联制备磁珠包被物，使得牛血清蛋白具有更多的氨基，等电点从4.9～5.4增加到9.5～11，从而使得牛血清蛋白与活性物质更容易偶联，更多偶联，偶联的副产物更少，进而提高了制得的磁珠包被物的特异性，并且由于牛血清白蛋白的等电点从4.9～5.4增加到9.5～11，这大大提高了活性物质的免疫原性，增强了活性物质结合抗体的能力，从而提高了免疫检测时的信噪比，使得含有上述磁珠包被物的检测试剂盒的灵敏度更高，检出率更好。
在其中一个实施例中，所述将纳米磁珠与活性物质通过所述阳离子牛血清白蛋白偶联制备磁珠包被物的步骤包括：
将所述阳离子牛血清白蛋白与活性物质偶联，制备复合物；及
将所述复合物与纳米磁珠偶联，制备所述磁珠包被物。
在其中一个实施例中，所述多胺为二元胺和/或PEG修饰的二元胺。
在其中一个实施例中，所述二元胺选自乙二胺、1-3二胺基丙烷、二氨基二丙胺和己二胺中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述采用多胺修饰牛血清白蛋白制备阳离子牛血清白蛋白的步骤包括：
将所述多胺、所述牛血清白蛋白和活化剂混合进行脱水缩合反应，制备所述阳离子牛血清白蛋白。
在其中一个实施例中，所述牛血清白蛋白与所述多胺的摩尔比为1：(5～20)。
在其中一个实施例中，所述活化剂包括sulfo-NHS和NHS中的至少一种和EDC。
在其中一个实施例中，所述复合物与所述纳米磁珠的比例为(40μg～80μg)：1mg。
一种磁珠包被物，由上述的磁珠包被物的制备方法制得。
一种检测试剂盒，包括上述的磁珠包被物。
附图说明
图1为一实施例的采用二元胺修饰BSA制备cBSA的反应式；
图2为活性物质与cBSA偶联的反应流程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文中，“BSA”为牛血清白蛋白的简称；“cBSA”是阳离子牛血清白蛋白的简称。
请参阅图1和图2，本申请一实施方式提供了一种磁珠包被物的制备方法，该制备方法包括步骤S100和步骤S200。
步骤S100：采用多胺修饰牛血清白蛋白(BSA)，制备阳离子牛血清白蛋白(cBSA)。
具体地，多胺是一类含有两个或更多氨基的化合物。多胺用于提供氨基，使得BSA的羧基经多胺修饰后转为氨基。
在一些实施例中，多胺包括二元胺和/或PEG修饰的二元胺。PEG修饰的二元胺是指含有亲水链聚乙二醇的二胺化合物。在二元胺修饰BSA的反应中，酰胺键的形成消除了羧酸盐的负电位，而末端胺增加了正电荷的电位，使得修饰后BSA(cBSA)的等电点升高(pI从之前的4.9～5.4提高到9.5～11)。
可选地，二元胺选自乙二胺、1-3二胺基丙烷、二氨基二丙胺和己二胺中的至少一种。请参阅图1，在其中一个实施例中，二元胺为乙二胺。可以理解的还是，多胺不限于上述，二元胺也不限于上述，还可以其他能提供氨基的物质。
在一些实施例中，多胺为二元胺，BSA与多胺的摩尔比为1：(5～20)。在一个可选地具体示例中，BSA与多胺的摩尔比为1：5、1：8、1：10、1：12、1：15、1：18或1：20。进一步地，BSA与多胺的摩尔比为1：(10～20)。将BSA与多胺的摩尔比设置为1：(10～20)，可以进一步提高BSA与多胺的偶联效率并减少副产物的产生，进而提高制得的磁珠包被物对活性物质抗体的特异性，进 一步提高检测的信噪比。更进一步地，BSA与多胺的摩尔比为1：(10～18)。
在一些实施例中，采用多胺修饰BSA的步骤包括：将多胺、BSA和活化剂混合，进行脱水缩合反应。
BSA具有羧基。在活化剂的作用下，多胺的氨基与BSA的羧基发生脱水缩合反应，形成具有酰胺键的cBSA。
在一些实施例中，活化剂包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的至少一种、和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳化二亚胺(CMC)。在其中一个实施例中，sulfo-NHS和NHS中的至少一种和EDC。可以理解的是，在其他实施例中，活化剂不限于上述，还可以是其他能促使BSA的羧基与多胺的氨基形成酰胺键的物质。
在一些实施例中，活化剂的使用浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。在一个可选地具体示例中，活化剂的使用浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL。需要说明的是，活化剂的使用浓度是指在向反应体系加入活化剂时活化剂的浓度。
在一个可选地具体示例中，活性物质为甲状腺素(T4)，活化剂为EDC和sulfo-NHS，溶解活化剂的溶剂为超纯水，溶解活性物质的溶剂为DMSO。可以理解的是，溶解活化剂和活性物质的溶剂均可以根据具体情况进行选择。
具体地，多胺的氨基与BSA的羧基发生的脱水缩合反应在缓冲液中进行。可选地，缓冲液为MES、HEPES、MOPS或PBS。可选地，缓冲液的浓度为50mM～100mM。
在一些实施例中，多胺的氨基与BSA的羧基发生的脱水缩合反应的体系的pH为5～7。在一个可选地具体示例中，多胺的氨基与BSA的羧基发生的脱水缩 合反应的体系的pH为6。
可以理解的是，在多胺的氨基与BSA的羧基发生的脱水缩合反应后，还包括对反应产物中的cBSA进行纯化的步骤。可选地，对cBSA进行纯化的方式包括但不限于脱盐、超滤和透析中的至少一种。在一个可选地具体示例中，采用超滤对反应产物中的cBSA进行纯化。
步骤S200：将纳米磁珠与活性物质通过阳离子牛血清白蛋白偶联，制备磁珠包被物。
具体地，活性物质是用于免疫检测中的物质，其能与待测样本中的待检物质特异性结合。在活性物质与待检物质特异性结合后，利用能与待检物质特异性结合的标记物(标记物与待检物质结合的表位可以与活性物质与待检物质结合的表位相同，也可以不同：在标记物与待检物质结合的表位与活性物质与待检物质结合的表位相同，利用的是竞争法的原理检测待测样本中待检物质的量；在标记物与待检物质结合的表位与活性物质与待检物质结合的表位不同时，利用的夹心法的原理检测待测样本中待检物质的量)，进而通过检测标记物质的量而计算待测样本中待检物质的量。在一些实施例中，活性物质为小分子多肽、半抗原、蛋白质或淄醇类化合物。可以理解的是，在其他实施例中，活性物质还可以是其他物质。
请参阅图2，在一些实施例中，将纳米磁珠与活性物质通过cBSA偶联制备磁珠包被物的步骤包括：将cBSA与活性物质偶联，制备复合物；及将复合物与纳米磁珠偶联，制备磁珠包被物。cBSA通过其氨基与活性物质的羧基发生缩合反应而偶联形成复合物。可以理解的是，在cBSA的氨基与活性物质的羧基发生缩合反应中，缩合反应在活化剂的作用下在缓冲液中进行。可选地，cBSA的氨基与活性物质的羧基发生缩合反应的活化剂和缓冲液，与多胺的氨基与BSA的 羧基发生的脱水缩合反应的活化剂和缓冲液有相同的选择。需要说明的是，在图2中，
Figure PCTCN2022115066-appb-000001
指具有羧基的活性物质，H 3N +-R′指cBSA，
Figure PCTCN2022115066-appb-000002
指cBSA与活性物质偶联所形成的复合物。
在一些实施例中，活性物质的羧基的数量为一个，活性物质与cBSA的摩尔比为(1～10)：1。在一个可选地具体示例中，活性物质与cBSA的摩尔比为1：1、5：1、8：1或10：1。可以理解的是，在活性物质的羧基数量为其他时，可以适应性地调整cBSA的量。
可以理解的是，在cBSA与活性物质缩合反应结束后，还包括对反应产物中的复合物进行纯化的步骤。可选地，对反应产物中的复合物进行纯化的方式包括但不限于脱盐、超滤和透析中的至少一种。在一个可选地具体示例中，采用超滤对反应产物中的复合物进行纯化。
在一些实施例中，纳米磁珠为羧基磁珠，复合物通过其氨基与纳米磁珠的羧基偶联。可以理解的是，在另一些实施例中，复合物还可以通过其他方式(例如复合物的羧基(BSA的羧基未完全氨基化或多胺上还有羧基基团))与纳米磁珠偶联。可以理解的是，纳米磁珠的类型不限于羧基磁珠，还可以是甲苯磺酰基磁珠或氨基磁珠。纳米磁珠的具体类型可以根据实际情况进行选择，只要能与复合物偶联即可。
在一些实施例中，复合物与纳米磁珠的比例为(40μg～80μg)：1mg。进一步地，复合物与纳米磁珠的比例为(50μg～80μg)：1mg。
当然，在复合物与纳米磁珠偶联后，还包括对未反应的活性位点进行封闭的步骤。通过对未反应的活性位点的封闭，使得待检物质不能与纳米磁珠上的除活性物质外的其他物质结合。在一些实施例中，采用封闭剂封闭活性位点。可选地，封闭剂为蛋白(例如BSA)、抗体或血清。在其中一个实施例中，封闭 剂为蛋白封闭剂。
上述磁珠包被物的制备方法至少具有如下优点：
(1)提高了磁珠包被物的特异性：通过将BSA中的羧基转化为氨基，大大增加了BSA分子中的氨基含量，使得单个cBSA更容易与活性物质(例如小分子多肽或半抗原分子)偶联，且偶联的活性物质更多；并且由于cBSA表面极其丰富的氨基基团和几乎不存在的羧基基团，这使得cBSA较BSA更能定向偶联活性物质的羧基，大大提高了偶联效率，减少了副产物的生成，提高了形成的活性物质与BSA的复合物的纯度，从而提高了磁珠包被物的特异性；此外，由于cBSA修饰了多胺(例如二元胺)，等电点从5.0左右增加到9.5～11左右，因此在反应的过程中带正电荷，而活性物质经过EDC和sulfo-NHS活化后的琥珀酰亚胺酯往往带负电荷，其反应静电荷吸引增大，也大大增加了反应效率。总之，上述磁珠包被采用通过cBSA偶联活性物质提高了磁珠包被物的特异性。经检测，将cBSA与活性物质形成的复合物后与磁珠偶联后得到磁珠包被物的特异性确实也大大提高。
(2)提高了检测的灵敏度、信噪比和检出率：多胺修饰后的BSA，由于等电点从原有的5.0左右增加到9.5～11左右，这大大提高了活性物质的免疫原性，使其结合抗体的能力大大增加，从而提高了试剂的信噪比。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种磁珠包被物，该磁珠包被物由上述任一实施例的磁珠包被物的制备方法制得。
在一些实施例中，上述磁珠包被物包括纳米磁珠、牛血清白蛋白和活性物质，纳米磁珠和活性物质均与牛血清白蛋白偶联，其中，牛血清白蛋白的羧基经多胺修饰。在其中一个实施例中，纳米磁珠与牛血清白蛋白通过形成酰胺键偶联；牛血清白蛋白通过与活性物质形成酰胺键偶联。
上述磁珠包被物通过上述磁珠包被物的制备方法制得，经验证，应用于检测时特异性好，信噪比高，灵敏度高，检出率高。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述任一实施例的磁珠包被物。
在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括标记抗体。标记抗体包括能与待检物质特异结合的抗体和标记在该抗体上的信号物质。通过检测标记抗体的信号物质而反应待测样本中待检物质的量。信号物质指能够提供被检测的信号的物质。信号物质一般通过反应标记到能与待检物质特异性结合的抗体上。
在一些实施例中，信号物质选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金及可检测信号的酶中的至少一种。可选地，发色团选自荧光、量子点、荧光微球、发光化合物和染料中的至少一种。在一些实施例中，发色团为发光化合物。例如，吖啶酯及其衍生物、金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺等。可选地，吖啶酯及其衍生物选自吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺及吖啶酯三氟甲基磺酰胺中的至少一种。可选地，电子致密物质为放射性分子。例如32P，35S或125I。可选地，产生可检测信号的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中的一种。可以理解的是，标记抗体的抗体及信号物质没有特别限制，可以根据实际情况进行选择和调整。
在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括稀释用缓冲液、洗脱液、保护蛋白溶液、发光底物溶液和反应杯中的至少一种。可选地，保护蛋白溶液中的保护蛋白选自新生牛血清、卵清蛋白、牛血清白蛋白以及酪蛋白中的至少一种。保护蛋白可以提供良好稳定反应环境，使抗原/抗体保持天然构象。
在其中一个实施例中，上述检测试剂盒用于检测T4抗体，上述检测试剂盒 包括磁珠包被物，其中磁珠包被物中的活性物质为T4。
上述检测试剂盒包括上述磁珠包被物，与传统的含有直接将活性物质与牛血清白蛋白偶联的磁珠包被物的检测试剂盒相比，上述检测试剂盒具有更好的特异性，信噪比更高，灵敏度更好，检出率高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.T4(甲状腺素)和BSA偶联
(1)将T4(776.87g/moL)溶于DMSO中，制备浓度为5mg/mL的甲状腺激素T4溶液。
(2)将BSA(65KD)溶解在0.1M pH6的MES缓冲液中，制备BSA浓度为5mg/mL的BSA溶液。取7mL该BSA溶液，加入85μL甲状腺激素T4溶液，使其反应摩尔比大致为1:1，制备混合液。
(3)将EDC和sulfo-NHS分别用水溶解为10mg/mL，然后将EDC和sulfo-NHS 1:1等体积混合制备活化剂溶液。
(4)将0.7mL步骤(3)制得的活化剂加入步骤(2)制得的混合液(活化剂反应浓度大致为0.5mg/mL)，放置在25℃恒温箱中反应3h。
(5)将步骤(4)的反应后的溶液超滤纯化，保存固体在pH 7.4，20mM的磷酸盐缓冲液中，制备含偶联有T4的BSA的溶液(T4-BSA复合物溶液)。
2.T4磁珠包被的制备
(1)取10mg羧基磁珠，用0.1M pH6的MES缓冲液清洗3次后加入200μL MES缓冲液。
(2)将EDC和sulfo-NHS分别溶于MES缓冲液中，使各浓度均为10mg/mL，1:1混合后加200μL到(1)中的磁珠中，25℃恒温箱中反应30min待用。
(3)磁分离，弃去上清，加入1mL 0.1M pH6的MES缓冲液，再加入T4-BSA复合物0.4mg(通过紫外蛋白浓度仪测定T4-BSA复合物溶液的浓度，再依据该浓度×相应的体积＝质量而取T4-BSA复合物的量)，混匀，将磁珠置于25℃恒温箱中，混合反应3小时；
(4)反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，25℃恒温箱中混合封闭2小时。
(5)封闭反应完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，浓度为10mg/mL(以裸磁珠计，下同)，4℃保存待用。
实施例2
1.BSA和乙二胺的偶联制备cBSA
BSA和乙二胺的偶联的反应式如图1所示。BSA和二乙胺的偶联包括但不限于如下步骤：
(1)0.1M的MES缓冲液溶解BSA，制成浓度为5mg/mL的BSA溶液。
(2)将乙二胺溶于水中，再用高浓度的MES将其pH调整为6.0，制备浓度为5mg/mL的乙二胺溶液。
(3)取10mL步骤(1)制备的BSA溶液，将BSA溶液和92μL步骤(2)制备的乙二胺溶液混合，使其混合后反应摩尔比为BSA：乙二胺＝1：10。
(4)将EDC和sulfo-NHS溶解在水中，制成各浓度均为10mg/mL的溶液，然后1：1等体积混合后，制备成浓度为0.5mg/mL的活化剂。
(5)向步骤(3)的加入1mL步骤(4)制备的活化剂，常温25℃反应3h。
(6)反应结束后，超滤纯化，得到纯化后的阳离子牛血清白蛋白(cBSA)。保存在pH 7.4 20mM的磷酸盐缓冲液中待用。
2.T4和cBSA偶联
(1)将T4溶于DMSO中，制成浓度为5mg/mL的T4溶液。将cBSA稀释在0.1M pH6的MES缓冲液中，制成浓度为5mg/mL的cBSA溶液。
(2)将7mL步骤(1)制备的cBSA溶液与加入85μL步骤(1)制备的T4溶液混合，使cBSA与T4的反应摩尔比为1：1。
(3)将EDC和sulfo-NHS分别用水溶解，制成浓度均为10mg/mL的溶液，然后将EDC和sulfo-NHS按照等体积混合后，取0.7mL加入到步骤(2)的cBSA与T4的混合液中，放置在25℃恒温箱中反应3h。然后超滤纯化处理后，制备T4-cBSA复合物。
3.T4-cBSA磁珠包被的制备
(1)取10mg羧基磁珠，用0.1M pH6的MES缓冲液清洗3次后加入200μL MES缓冲液。
(2)将EDC和sulfo-NHS分别溶于MES缓冲液中，各浓度均为10mg/mL，1:1混合后加200μL到(1)中的磁珠中，25℃恒温箱中反应30min待用。
(3)磁分离，弃去上清，清洗磁珠后，加入1mL 0.1M pH6的MES缓冲液，然后加入T4-cBSA复合物0.4mg，混匀。将磁珠置于25℃恒温箱中，混合反应3小时。
(4)反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，25℃恒 温箱中混合封闭2小时。
(5)封闭反应完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，磁珠浓度为10mg/mL，4℃保存待用。
实施例3
本实施例的T4-cBSA磁珠包被物的制备大致与实施例2相同，其不同在于，在本实施例中，BSA和二乙胺的偶联时，BSA与乙二胺的摩尔比为1：5。
实施例4
本实施例的T4-cBSA磁珠包被物的制备大致与实施例2相同，其不同在于，在本实施例中，BSA和二乙胺的偶联时，BSA与乙二胺的摩尔比为1：20。
对比例1
(1)T4-BSA复合物为外购原料，用水溶解到5mg/mL。
(2)取10mg羧基磁珠，用0.1M pH6的MES缓冲液清洗3次后加入200μL MES缓冲液。
(3)将活化剂EDC和Sulfo-NHS分别溶于MES缓冲液中，使各浓度为10mg/mL，然后按1：1体积混合后加200μL到(1)中的磁珠中，25℃恒温箱中反应30min待用。
(4)磁分离，弃去上清，清洗磁珠后，加入1mL 0.1M pH6的MES缓冲液，在加入步骤(1)的T4-BSA复合物0.4mg，混匀，将磁珠置于25℃恒温箱中，混合反应3小时。
(5)反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，25℃恒 温箱中混合封闭2小时。
(6)封闭反应完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，磁珠浓度为10mg/mL，4℃保存待用。
测试
(1)将实施例1、实施例2和对比例1的3种T4磁珠包被物稀释至工作浓度0.10mg/mL，收集100例阴性样本和15例梯度样本进行测试，与样本反应后再与标记了T4抗体的吖啶酯形成复合物，测定其吖啶酯发光值，测试结果如表1和表2所示。
表1
项目 实施例1 实施例2 对比例1
特异性 92.0％ 98.0％ 91.0％
在表1中，特异性是指阴性检出率，实施例1的特异性为92％是指100例阴性样本中检出的阴性样本为92例，实施例2的特异性为98％是指100例阴性样本中检出的阴性样本为98例；对比例1的特异性为91％是指100例阴性样本中检出的阴性样本为91例。
表2
Figure PCTCN2022115066-appb-000003
Figure PCTCN2022115066-appb-000004
由表1和表2可以看出，实施例2的灵敏度(或称信噪比)及特异性明显好于实施例1和对比例1，说明将传统BSA改造为cBSA后再偶联的T4-cBSA作为抗原，其特异性和灵敏度明显好于直接偶联BSA的特异性和灵敏度。实施例1和对比例1相比，特异性和灵敏度差异不大，说明直接偶联BSA的抗原的特异性和灵敏度并非由于试验操作引起。
(2)将实施例2、实施例3和实施例4的3种T4磁珠包被物稀释至工作浓度0.10mg/mL，收集8例梯度样本进行测试，与样本反应后再与标记了T4抗体的吖啶酯形成复合物，测定其吖啶酯发光值，测试结果如表3所示。
表3
Figure PCTCN2022115066-appb-000005
由表3可以看出，与BSA和乙二胺的摩尔比为1：5相比，BSA与乙二胺的摩尔比为1：(10～20)时的信号值更高。由此可知，通过调整cBSA与乙二胺的摩尔比，可以调整BSA阳离子化的程度，进而更进一步可以提高最终测试的信噪比。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

  1. 一种磁珠包被物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
    采用多胺修饰牛血清白蛋白，制备阳离子牛血清白蛋白；及
    将纳米磁珠与活性物质通过所述阳离子牛血清白蛋白偶联，制备磁珠包被物。
  2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将纳米磁珠与活性物质通过所述阳离子牛血清白蛋白偶联制备磁珠包被物的步骤包括：
    将所述阳离子牛血清白蛋白与活性物质偶联，制备复合物；及
    将所述复合物与纳米磁珠偶联，制备所述磁珠包被物。
  3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多胺为二元胺和/或PEG修饰的二元胺。
  4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二元胺选自乙二胺、1-3二胺基丙烷、二氨基二丙胺和己二胺中的至少一种。
  5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述采用多胺修饰牛血清白蛋白制备阳离子牛血清白蛋白的步骤包括：
    将所述多胺、所述牛血清白蛋白和活化剂混合进行脱水缩合反应，制备所述阳离子牛血清白蛋白。
  6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白与所述多胺的摩尔比为1：(5～20)。
  7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂包括sulfo-NHS和NHS中的至少一种和EDC。
  8. 根据权利要求2～7任一所述的制备方法，其特征在于，所述复合物与所述纳米磁珠的比例为(40μg～80μg)：1mg。
  9. 一种磁珠包被物，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的磁珠包被物 的制备方法制得。
  10. 一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求9所述的磁珠包被物。
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