CN101551389A - 一种游离甲状腺素的磁微粒化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒及利用该试剂盒进行检测游离甲状腺素的方法。所述的试剂盒包括游离甲状腺素标准品、辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素抗原、抗体、磁珠分离剂、发光底物液和洗液。检测游离甲状腺素的方法是在试管中加入游离甲状腺素标准品及待测标本，加入游离甲状腺素辣根过氧化物酶标记物及抗体，混匀后37℃温育1小时，再加入磁珠分离剂静置5分钟，分离，得免疫磁性微球，弃上清液，沉积物用洗液洗两遍；加入发光底物液，测量分析得到待测标本的游离甲状腺素浓度。本发明提供的游离甲状腺素定量检测试剂盒及检测方法具有较高稳定性，灵敏度和准确性的优点，属于免疫诊断技术领域。
Description
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种游离甲状腺素fT4定量检测试剂盒，本发明还涉及利用上述试剂盒进行检测游离甲状腺素的方法。
背景技术
甲状腺素是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素，甲状腺生成的甲状腺素T4运送到血液循环中后，大部分与蛋白质结合，结合部分的甲状腺素T4没有生物活性，其高低不能反映甲状腺的功能状态，仅约0.03％的甲状腺素T4呈游离状态存在于血液中，游离甲状腺素fT4是循环血中甲状腺激素的活性部分，具有生物活性，与甲状腺素T4在血液中保持相对恒定，维持其正常的生理功能，因此游离甲状腺素fT4高低能较准确地反应甲状腺功能状态，它不受血中甲状腺球蛋白TBG和含碘杂质的影响，游离甲状腺素fT4进入靶细胞发挥作用，它是反映甲状腺功能最确切的指标之一。测定血清中游离甲状腺素fT4含量，是评价甲状腺功能最灵敏的指标之一。临床上甲亢时游离T4、游离T3均升高并比TT4、TT3灵敏。甲亢早期和复发前兆的甲亢，血清游离甲状腺素fT4正常，而游离碘甲状腺原氨酸fT3可明显升高。在甲低的诊断上，游离甲状腺素fT4较fT3灵敏。对妊娠妇女或危重的非甲状腺疾病如肝硬化、肾功能衰竭患者的甲状腺功能判断很有价值。尤其在中枢神经甲状腺功能低下时，游离甲状腺素fT4含量测定更有价值。近年来已广泛应用于临床，其敏感性和特异性均明显超过总甲状腺素T4(TT4)。
长期以来，临床一般采用酶免疫分析或放射免疫分析来检测患者游离甲状腺素fT4的含量，但这两种方法都有其缺点：如放免分析操作复杂，时间长，存在放射性污染问题；酶免疫分析灵敏度低，监测范围窄。而化学发光免疫分析在酶免疫分析的基础上结合了化学发光技术使得检测灵敏度和检测范围得到提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒，其具有较高稳定性，灵敏度和准确性的优点。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒进行检测游离甲状腺素(fT4)的方法。
为实现上述发明目的，本发明的发明人在现有技术的基础上进行了大量的研究和创造性的劳动，研制出了一种游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒，包括游离甲状腺素(fT4)标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原、抗体、磁珠分离剂、发光底物液和洗液。
所述的抗体为羊抗甲状腺素(T4)的多抗。
所述的洗液含有0.05M磷酸盐缓冲液PBS，1wt‰吐温20和2wt‰硫柳汞。
一种利用所述的试剂盒检测游离甲状腺素(fT4)的方法，包括下述步骤：
a.将实验管按照校准品的浓度及标本编号，分别加入游离甲状腺素(fT4)标准品及待测标本100ul；
b.每管各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原及抗体各100ul，充分混匀后37℃温育1小时；
c.每管各加入100ul磁珠分离剂，静置5分钟，放在磁珠分离器上静置5分钟；
d.弃上清液，沉积物用洗液洗两遍；
e.每管各加入发光底物液100ul；
f.在管式半自动/全自动化学发光仪上测量分析得到待测标本的游离甲状腺素(fT4)浓度。
所述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素fT4抗原是通过以下方法制备的：采用过碘酸钠标记技术，游离甲状腺素fT4抗原与HRP通过氧化还原反应偶联在一起，制备成有生物活性的酶标记物。辣根过氧化物酶(HRP)标记的fT4抗原的制备方法：将5mgfT4溶于1.0ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml 10mg/ml辣根过氧化物酶(HRP)水溶液和1.3mg碳化二甲胺(EDC)，随后将1.0ml 20mg/ml EDC分3次加入，间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜。然后对0.05mol/L PH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)透析，过1.5cm×15cm Sephadex G-50柱，加入NaCl 185.g/L，加入牛血清白蛋白(BSA)10g/L，4℃储存备用。
所述游离甲状腺素(fT4)标准品是用PH 7.35-7.45的磷酸盐缓冲液作为标准品的基质，标定后高浓度的游离甲状腺素fT4抗原倍比稀释后而配制成系列浓度，配制的系列浓度为0pmol/L、1pmol/L、2.5pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、85pmol/L
所述磁珠分离剂是以四氧化三铁作为固相载体，将含有抗抗体的包被液包被在四氧化三铁表面，并用PH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，于4℃条件下过夜后封闭即得；所述的包被液为PH 7.4磷酸盐缓冲液PBS，所述得抗抗体为羊抗兔的IgG抗体。
所述发光底物液包括A液和B液，其中A液：2％Na2CO3.H2O，0.95％NaHCO3，0.4％NaOH，0.4％EDTA加少量双蒸水于烧杯中55℃水浴溶解，然后加入鲁米诺(luminol)溶解，用重量百分比浓度为30％NaOH和固体NaHCO3调节PH至11.00左右，混合均匀；
B液：30％H2O23ml，尿素1克于烧杯中溶解，混合均匀；
使用时将A液与B液按1∶1的比例混合。
所述抗体为羊抗甲状腺素T4的多抗，是用浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液与羊抗甲状腺素T4多抗按照效价比1∶100000的比例稀释而成。
本发明提供的游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒由于采用具有超顺磁性的磁珠做为免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，更容易进行固液分离，使得检测的灵敏度较一般化学发光免疫分析又有了很大提高；同时，以辣根过氧化物酶作为示踪酶的检测方法，在保证具有较高稳定性，灵敏度和准确性的同时，使得试剂盒的生产成本得到大幅度的降低。利用本发明提供的方法，使用辣根过氧化物酶HRP标记的游离甲状腺素fT4抗原和待测标本一起与定量的抗体进行竟争性结合，酶标抗原与抗体反应形成结合相和游离相，反应达到平衡后，采用羊抗兔IgG抗抗体包被免疫磁珠做为固相分离剂，使标记的抗原抗体复合物与游离的部分分离，结合部分与磁珠被磁架吸附于管底，用洗液反复清洗两遍后，加入发光底物液，测量其光子数量，分析仪分析得出待测标本中fT4的浓度。
附图说明
图1为本发明中游离甲状腺素浓度与发光强度的标准曲线，以标准品相对发光单位RLU的百分数值的对数(LogB/B0％)为纵坐标，标准品浓度的对数(LogX)为横坐标。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明提供的游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒及其检测方法做进一步的说明。
(一)材料与仪器
1、标准品浓度分别为0pmol/L、1pmol/L、2.5pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、85pmol/L，各0.6ml
2、磁珠分离剂(3ug/ml)10ml
3、洗液100ml
4、发光底物溶液A，B液各6ml
5、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原10ml
6、抗体10ml
7、待测标本
8、半自动管式化学发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司BHP9507型化学发光免疫分析仪)
9、水浴箱(用于37℃温育)
(二)试剂制备
所述游离甲状腺素(fT4)标准品是用PH 7.35-7.45的磷酸盐缓冲液作为校准品的基质，标定后高浓度的游离甲状腺素fT4抗原倍比稀释后而配制成系列浓度，配制的系列浓度为0pmol/L、1pmol/L、2.5pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、25pmol/L、85pmol/L。
磁珠分离剂是以四氧化三铁作为固相载体，将含有抗抗体的包被液包被在四氧化三铁表面，并用PH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，于4℃条件下过夜后封闭即得；所述的包被液为PH 7.4磷酸盐缓冲液PBS，所述的抗抗体为羊抗兔的IgG抗体。
洗液含有0.05M磷酸盐缓冲液PBS，1wt‰吐温20和2wt‰硫柳汞。
发光底物液包括A液和B液，其中A液：2％Na2CO3.H2O，0.95％NaHCO3，0.4％NaOH，0.4％EDTA加少量双蒸水于烧杯中55℃水浴溶解，然后加入鲁米诺(luminol)溶解，用重量百分比浓度为30％NaOH和固体NaHCO 3调节PH至11.00左右，混合均匀；B液：30％H2O23ml，尿素1克于烧杯中溶解，混合均匀；使用时将A液与B液按1∶1的比例混合。
辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素fT4抗原是通过以下方法制备的：采用过碘酸钠标记技术，游离甲状腺素fT4抗原与HRP通过氧化还原反应偶联在一起，制备成有生物活性的酶标志物。辣根过氧化物酶(HRP)标记的fT4抗原的制备方法：将5mgfT4溶于1.0mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml10mg/mlHRP水溶液和1.3mg碳化二甲胺(EDC)，随后将1.0ml 20mg/mlEDC分3次加入，间隔1小时，混合物不断搅拌，4℃过夜。然后对0.05mol/L PH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)透析，过1.5cm×15cm Sephadex G-50柱，加入NaCl185.g/L，加入BSA 10g/L，4℃储存备用。
抗体为羊抗甲状腺素T4的多抗，是用浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液与羊抗甲状腺素T4多抗按照效价比1∶100000的比例稀释而成。
(三)操作步骤
1、将实验管按照校准品的浓度及标本编号，分别加入游离甲状腺素fT4标准品及待测标本100ul；
b.每管各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原及抗体各100ul，充分混匀后37℃温育1小时；
c.每管各加入100ul磁珠分离剂，静置5分钟，放在磁珠分离器上静置5分钟；
d.弃上清液，沉淀物用洗液洗两遍；
e.每管各加入发光底物液100ul；
f.在管式半自动/全自动化学发光仪上测量分析得到待测标本的游离甲状腺素(fT4)浓度。
(四)结果计算
计算百分相对发光单位RLU值：依据下列公式分别计算各标准点和样品的百分RLU值(B/B0％)。
以标准品百分RLU值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准品曲线，见图1。
依据计算的样本百分发光度值，从标准曲线上读取所对应的浓度。
(五)游离甲状腺素fT4磁颗粒化学发光试剂盒性能指标实验
准确率
准确率实验是加入纯游离甲状腺素fT4至已知正常人混合血清的标本中，测定加入前后的游离甲状腺素fT4值，再计算所加入的游离甲状腺素fT4的回收率，实验结果如下。
2.精密度
选取两份不同浓度的样本进行检测，两份样本的浓度分别为正常值与异常值，分别对两份样本各检测20次并计算其平均偏差CV％值。
3.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：对20次零标准品的测定，求其2倍的平均偏差，其在标准品曲线上所对应的浓度即为灵敏度。该试剂盒的分析灵敏度为＜0.08pmol/L。
4.特异性
在1份已知游离甲状腺素fT4浓度的混合血清中加入不同浓度的游离碘甲状腺原氨酸(fT3)后，测得干扰率＜0.59，即交叉反应在生理学允许的浓度范围内。
5.健全性
用标准品零血清系列稀释高浓度定值血清，然后对稀释后所得混合血清进行方法学分析，用理论值和实际检测值做线性回归分析。
6.相关性
X＝ECLIA，Y＝RIA
Y＝4.6011+0.7276 X R＝0.9374。
Claims (9)
1、一种游离甲状腺素(fT4)定量检测试剂盒，包括游离甲状腺素(fT4)标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原、抗体、磁珠分离剂、发光底物液和洗液。
2、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的抗体为羊抗甲状腺素(T4)的多抗。
3、按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的洗液含有0.05M磷酸盐缓冲液PBS，1wt‰吐温20和2wt‰硫柳汞。
4、一种利用权利要求1所述的试剂盒检测游离甲状腺素(fT4)的方法，其特征在于包括下述步骤：
a.将实验管按照校准品的浓度及标本编号，分别加入游离甲状腺素(fT4)标准品及待测标本100ul；
b.每管各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素(fT4)抗原及抗体各100ul，充分混匀后37℃温育1小时；
c.每管各加入100ul磁珠分离剂，静置5分钟，放在磁珠分离器上静置5分钟；
d.弃上清液，沉积物用洗液洗两遍；
e.每管各加入发光底物液100ul；
f.在管式半自动/全自动化学发光仪上测量分析得到待测标本的游离甲状腺素(fT4)浓度。
5、按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述的辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离甲状腺素fT4抗原是通过以下方法制备的：采用过碘酸钠标记技术，游离甲状腺素fT4抗原与HRP通过氧化还原反应偶联在一起，制备成有生物活性的酶标记物。
6、按照权利要求4所述方法，其特征在于所述游离甲状腺素(fT4)标准品是用PH 7.35-7.45的磷酸盐缓冲液作为标准品的基质，标定后高浓度的游离甲状腺素fT4抗原倍比稀释后而配制成系列浓度。
7、按照权利要求4所述试剂盒，其特征在于所述磁珠分离剂是以四氧化三铁作为固相载体，将含有抗抗体的包被液包被在四氧化三铁表面，并用PH7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，于4℃条件下过夜后封闭即得；所述的包被液为PH 7.4磷酸盐缓冲液PBS，所述得抗抗体为羊抗兔的IgG抗体。
8、按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述发光底物液包括A液和B液，其中A液：2％Na2CO3.H2O，0.95％NaHCO3，0.4％NaOH，0.4％EDTA加少量双蒸水于烧杯中55℃水浴溶解，然后加入鲁米诺(luminol)溶解，用重量百分比浓度为30％NaOH和固体NaHCO3调节PH至11.00左右，混合均匀；
B液：30％H2O23ml，尿素1克于烧杯中溶解，混合均匀；
使用时将A液与B液按1∶1的比例混合。
9、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗体为羊抗甲状腺素T4的多抗，是用浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液与羊抗甲状腺素T4多抗按照效价比1∶100000的比例稀释而成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20091007 |