CN110308283B - 一种层粘连蛋白校准品及质控品 - Google Patents

一种层粘连蛋白校准品及质控品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种层粘连蛋白校准品及质控品，所述层粘连蛋白校准品包括抗原、缓冲液、防腐剂和尿素；所述尿素的浓度为0.05‑0.2mol/L；所述层粘连蛋白质控品，包括抗原、血清、防腐剂和尿素；所述尿素的浓度为0.05‑0.2mol/L。本发明提供的层粘连蛋白校准品及质控品，通过添加尿素后，尿素对层粘连蛋白稳定性起到一定保护作用，使校准品和质控品的稳定性均得到改善。本发明填补了层粘连蛋白校准品及质控品领域的空白，且本发明也对尿素用于其他相似校准品、质控品的开发起到指导作用。

Description

一种层粘连蛋白校准品及质控品
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种添加尿素作为蛋白保护剂制备的稳定、均一的层粘连蛋白校准品及质控品。
背景技术
肝纤维化是一个病理生理过程，是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。
目前诊断肝纤维化的方法有肝组织病理学检查、肝脏超声波测试和血清学方法，虽然病理学检查作为肝纤维化诊断的金标准，但是存在一定的缺陷，有创伤且有潜在并发症，不易为患者接受，且此方法无法监测肝纤维化的病情发展和疗效。肝脏超声波测试虽然解决病理学检查方法的缺陷，但是对于超重和肥胖病人此方法不易成功，该方法还受到肝脏内大血管、胆汁淤积、腹水等指标影响。体外诊断血清学方法很好的解决了以上2种检测方法的局限性，快速、准确、实时，是未来肝纤维化诊断方法发展的方向。血清学检测肝纤维化的项目一般有4项，Ⅲ型前胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和透明质酸。目前商品化试剂盒较少，相关文献报道也校少，该领域较新且商业前景乐观，有很高的医学研究和商业价值。
层粘连蛋白是1979年发现的，由α、β、γ3条多肽链构成的异三聚体，是一种大分子糖蛋白。这些α、β、γ链可组装成“十”或“T”字形的十余种不同的层粘连蛋白，进而这些肽链盘绕成α-螺旋结构，使层粘连蛋白结构上出现杆状部分和球状部分，这些结构多数靠氢键维持构象，但在水溶液中层粘连蛋白结构易受到其他因素的影响，导致蛋白结构被破坏。
尿素是一种重要生物功能的极性分子，是最常用的蛋白质变性剂之一。在尿素-水混合溶剂中，尿素分子取代水分子而积聚在蛋白质分子表面，尿素分子与蛋白质分子之间的直接相互作用对蛋白质的构象具有复杂的影响，高浓度的尿素-水混合溶剂破坏蛋白质的构象，而低浓度的混合溶剂则有利于蛋白质形成更紧密的构象。
虽然尿素是一种变性剂，在免疫诊断领域目前暂时无相关应用，本公司在研发过程中，将该物质应用到磁珠包被或发光底物标记时，未得到很好的效果，可能是尿素物质本身极性作用，导致包被或标记过程，蛋白与磁珠或发光底物结合不稳定。但是根据尿素对蛋白质构象的影响，尝试将尿素应用到不需要连接或其他处理的物质上，例如在蛋白保护液中加入尿素，以此来保护该蛋白。
因此，考虑将尿素应用到层粘连蛋白校准品、质控品中，调节合适的尿素浓度，研究尿素在水溶液中对层粘连蛋白的保护作用，继而可以得到稳定的校准品、质控品，且能对提高其他相似蛋白稳定性起到指引和借鉴作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种添加尿素作为蛋白保护剂制备的稳定、均一的层粘连蛋白校准品及质控品。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种层粘连蛋白校准品，包括抗原、缓冲液和防腐剂；
还包括尿素；
所述尿素的浓度为0.05-0.2mol/L。
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白校准品还包括盐类物质、多糖类物质和纯化水。
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白校准品的组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000031
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白校准品的pH为6.5-7.5。
在上述技术方案中，所述缓冲液为PB或MPOSO，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠。
本发明还提供一种层粘连蛋白质控品，包括抗原、血清和防腐剂；
还包括尿素；
所述尿素的浓度为0.05-0.2mol/L。
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白质控品还包括盐类物质和多糖类物质。
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白质控品的组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000032
Figure BDA0002111254300000041
在上述技术方案中，所述层粘连蛋白质控品的pH为6.5-7.5。
在上述技术方案中，所述血清为动物血清、人血清或类血清，优选牛血清，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠。
本发明的有益效果是：
本发明提供的层粘连蛋白校准品及质控品，通过添加尿素后，尿素对层粘连蛋白稳定性起到一定保护作用，使校准品和质控品的稳定性均得到改善。本发明填补了层粘连蛋白校准品及质控品领域的空白，且本发明也对尿素用于其他相似校准品、质控品的开发起到指导作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明提供的层粘连蛋白校准品及质控品开封稳定性曲线图。
图2为本发明提供的层粘连蛋白校准品及质控品实时稳定性曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种层粘连蛋白校准品，包括抗原、缓冲液和防腐剂；还包括尿素；所述尿素的浓度为0.05-0.2mol/L。
优选所述层粘连蛋白校准品还包括盐类物质、多糖类物质和纯化水。
进一步优选所述层粘连蛋白校准品的组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000042
Figure BDA0002111254300000051
所述层粘连蛋白校准品的pH为6.5-7.5。
优选所述缓冲液为PB或MPOSO，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠。
本发明还提供一种层粘连蛋白质控品，包括抗原、血清和防腐剂；还包括尿素；所述尿素的浓度为0.05-0.2mol/L。
优选所述层粘连蛋白质控品还包括盐类物质和多糖类物质。
进一步优选所述层粘连蛋白质控品的组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000052
所述层粘连蛋白质控品的pH为6.5-7.5。
优选所述血清为动物血清、人血清或类血清，进一步优选为牛血清，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、详细的描述。
以下实施例及对比例所用设备明细为10万级电子天平、pH计和配套定标缓冲液、1000mL量筒和专用滤器。
实施例1
本发明提供的层粘连蛋白校准品，其组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000061
按照上述浓度比例：在干净的配制容器中加入全批量纯化水，然后向其中按顺序依次加入全批量的缓冲液、盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至7.0(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使校准品的浓度分别为低值：100ng/mL；高值：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，尿素的浓度分别为0、0.02、0.5、2mol/L。
实施例2
Figure BDA0002111254300000071
按照上述比例，在干净的配制容器中加入全批量的血清，然后向其中按顺序依次加入全批量的盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至7.0(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使质控品的浓度分别为水平1：100ng/mL；水平2：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
对比例2
与实施例2的不同之处在于，尿素的浓度分别为0、0.02、0.5、2mol/L。
将上述实施例和对比例配制完的校准品、质控品分别储存在2-8℃或37℃环境中14天，选取层粘连蛋白测定试剂盒(化学发光免疫分析法)，用CM-180全自动化学发光免疫分析仪测试不同浓度尿素对层粘连蛋白校准品、质控品稳定性的影响(表1，表2)。
表1 不同浓度尿素的层粘连蛋白校准品的14天加速稳定性
Figure BDA0002111254300000072
Figure BDA0002111254300000081
注：校准品浓度单位ng/mL。
表2 不同浓度尿素的层粘连蛋白质控品的14天加速稳定性
Figure BDA0002111254300000082
注：质控品浓度单位ng/mL。
由上表可知，在添加尿素后，层粘连蛋白校准品、质控品加速稳定性衰减率得到改善，且尿素浓度过大对层粘连蛋白起到破坏作用，尿素浓度过低未起到保护层粘连蛋白的作用，只有尿素浓度在0.05-0.2mol/L浓度范围内对层粘连蛋白起到保护作用。
确定尿素含量后，选取0.05mol/L尿素浓度的校准品、质控品进行开封稳定性(图1)、实时稳定性(图2)、均一性指标验证(表3)，因此确定该尿素能够提高层粘连蛋白校准品、质控品的稳定性，且性能稳定、均一，可应用于配套试剂作为试剂配套校准品和质控品。
表3 层粘连蛋白校准品、质控品均一性测试数据
Figure BDA0002111254300000091
注：校准品、质控品浓度单位ng/mL
将尿素添加到层粘连蛋白校准品、质控品中，只有合适的尿素浓度对层粘连蛋白起到保护作用。
实施例3
本发明提供的层粘连蛋白校准品，其组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000092
Figure BDA0002111254300000101
按照上述浓度比例：在干净的配制容器中加入全批量纯化水，然后向其中按顺序依次加入全批量的缓冲液、盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至6.5(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使校准品的浓度分别为低值：100ng/mL；高值：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
本实施例通过添加尿素作为蛋白保护剂制备得到了稳定、均一的层粘连蛋白校准品。
实施例4
本发明提供的层粘连蛋白校准品，其组成成分及各成分的浓度如下：
Figure BDA0002111254300000102
按照上述浓度比例：在干净的配制容器中加入全批量纯化水，然后向其中按顺序依次加入全批量的缓冲液、盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至7.5(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使校准品的浓度分别为低值：100ng/mL；高值：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
本实施例通过添加尿素作为蛋白保护剂制备得到了稳定、均一的层粘连蛋白校准品。
实施例5
Figure BDA0002111254300000111
按照上述比例，在干净的配制容器中加入全批量的血清，然后向其中按顺序依次加入全批量的盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至6.5(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使质控品的浓度分别为水平1：100ng/mL；水平2：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
本实施例通过添加尿素作为蛋白保护剂制备得到了稳定、均一的层粘连蛋白质控品。
实施例6
Figure BDA0002111254300000112
Figure BDA0002111254300000121
按照上述比例，在干净的配制容器中加入全批量的血清，然后向其中按顺序依次加入全批量的盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至7.5(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使质控品的浓度分别为水平1：100ng/mL；水平2：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
本实施例通过添加尿素作为蛋白保护剂制备得到了稳定、均一的层粘连蛋白质控品。
实施例7
Figure BDA0002111254300000122
按照上述比例，在干净的配制容器中加入全批量的血清，然后向其中按顺序依次加入全批量的盐类物质、多糖类物质、尿素、防腐剂，依次搅拌至完全溶解；使用0.22μm滤膜过滤一次。用浓HCl或40mmol/LNaOH调节pH值至7.0(25±1℃)，按浓度计算加入层粘连蛋白，使质控品的浓度分别为水平1：100ng/mL；水平2：500ng/mL。按照1mL/瓶的规格进行分装。
本实施例通过添加尿素作为蛋白保护剂制备得到了稳定、均一的层粘连蛋白质控品。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种层粘连蛋白校准品，其特征在于，其组成成分及各成分的浓度如下：
Figure FDA0003161600490000011
所述层粘连蛋白校准品的pH为6.5-7.5；
所述缓冲液为PB或MPOSO，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠；
2.一种层粘连蛋白质控品，其特征在于，其组成成分及各成分的浓度如下：
Figure FDA0003161600490000012
所述层粘连蛋白质控品的pH为6.5-7.5；
所述血清为动物血清、人血清或类血清，所述盐类物质为氯化钠，所述多糖类物质为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为P300或叠氮钠。
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