DE69929059T2

DE69929059T2 - Verfahren zum bestimmen von physiologisch aktiven komponenten

Info

Publication number: DE69929059T2
Application number: DE69929059T
Authority: DE
Inventors: Makoto Inashiki-gun TAKADA
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: DE69929059D1; US6607891B1; EP1103814A1; EP1103814B1; WO2000007021A1; EP1103814A4

Description

Fachgebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer bioaktiven Komponente in einer biologischen Probe durch eine Untersuchung mit Hilfe eines Antikörpers, eines Bindeproteins oder eines Rezeptors.
Stand der Technik
Viele bioaktive Komponenten wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Vitamine und Medikamente sind an Bindeproteine gebunden, so dass deren Effekte und metabolische Geschwindigkeiten in vivo gesteuert werden. Im Falle der Untersuchung bioaktiver Komponenten durch Untersuchung mit Hilfe von Antikörpern, Bindeproteinen oder Rezeptoren beeinflussen diese ebenfalls vorkommenden Bindeproteine häufig die Untersuchungsergebnisse.
Im Falle der Koexistenz einer zu untersuchende Substanz in einer biologischen Probe mit einem Bindeprotein war es üblich, verschiedene Vorbehandlungen durchzuführen, um die Effekte des Bindeproteins auf die Untersuchung zu eliminieren. Zum Beispiel im Falle des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-I) kann das „Säure-Ethanol Verfahren" als das derzeit am häufigsten verwendete Verfahren zitiert werden (Daughaday, W. H. (1980), Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism Bd. 51: S. 781–788). Dieses Verfahren macht Gebrauch von dem Phänomen, dass, wenn eine biologische Probe mit einer Mischung aus Salzsäure und Ethanol behandelt wird, Bindeproteine, die bei sauren Bedingungen IGF-I freisetzen, in der Ethanolatmosphäre unlöslich werden und daher leicht durch Zentrifugation aus der Probe entfernt werden können.
Falls die Zentrifugation im Säure-Ethanol-Verfahren weggelassen wird, wird jedoch die Bindungsaktivität des Bindeproteins gegenüber IGF-I am Neutralisationspunkt wieder hergestellt und beeinflusst so die Untersuchungsergebnisse. Um dieses Problem zu überwinden, beschreibt JP-A-8-145998 ein Verfahren, bei dem ein Wiederbindungsinhibitor einem Neutralisationspuffer, der nach der Säurebehandlung verwendet werden soll, zugegeben wird (der Begriff „JP-A", wie hier verwendet, meint eine „ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung"). Da angenommen wird, dass bei diesem Verfahren das gesamte IGF-I in der neutralisierten biologischen Probenlösung in der freien Form vorkommt, werden die Untersuchungsergebnisse durch die ebenfalls vorkommenden Bindeproteine nicht beeinflusst. Als Wiederbindungsinhibitor wird 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäuresalz (ANS) und dergleichen verwendet.
ANS, das lange Zeit verwendet wurde, um Schilddrüsenhormon von Bindeproteinen freizusetzen, ist mit einigen Problemen wie Instabilität gegenüber Licht und atmosphärischer Oxidation behaftet und weist starke Toxizität auf. Außerdem wird darauf hingewiesen, dass ANS manchmal Immunreaktionen beeinflusst, was die Verwendung von ANS bei der Untersuchung biologischer Proben einschränkt.
Als Verfahren zur Elimination der Wirkungen von Bindeproteinen, die in Proben enthalten sind, schlägt die Japanische Patentanmeldung Nr. 1,940,596 ein Verfahren vor, bei dem bei der Analyse von Vitamin B₁₂ eine Thiolgruppe in Bindeproteine eingebracht wird, um die Bindungsaktivität gegenüber Vitamin B₁₂ zu inaktivieren, während das Japanische Patent Nr. 2,023,927 ein Verfahren vorschlägt, bei dem Bindeproteine durch Verwendung von Peroxysäure denaturiert werden. Allerdings sollten denaturierende Mittel bei diesen bekannten Verfahren im Überschuss zugegeben werden und es ist daher notwendig, die überschüssigen denaturierenden Mittel nach Abschluss der Denaturierung der Bindeproteine zu inaktivieren.
Es ist ein Verfahren zur Untersuchung von IGF-I durch Zugeben von IGF-II zu einer Probe im Überschuss bekannt. Da IGF-II alle Bindungsstellen von Bindeproteinen blockiert, wird IGF-I, das somit verdrängt und freigesetzt wird, bei diesem Verfahren immunologisch untersucht (Blum, W. F. (1988) Acta Endocrinologica Bd. 118: S. 374–380). Bei diesem Verfahren ist es notwendig, Antikörper zu verwenden, die keine Kreuzreaktivität mit IGF-II aufweisen. Da IGF-I strukturell sehr ähnlich mit IGF-II ist, ist es sehr schwierig, Antikörper zu erhalten, die nie durch die überschüssige Zugabe von IGF-II bei der Vorbehandlung beeinflusst werden. Obwohl JP-A-6-102275 ein ähnliches Verfahren zur Untersuchung eines Steroidhormons beschreibt, ist dieses Verfahren mit einigen Problemen behaftet, so dass ein hierfür verwendbares Untersuchungssystem beschränkt ist und sehr viel Geld kostet.
Um die Wirkungen von ebenfalls vorkommenden Bindeproteinen in biologischen Proben zu eliminieren, ist es normalerweise nötig, teure Reagenzien oder stark toxische Reagenzien zu Vorbehandlungsmitteln, Neutralisierungsmitteln oder Untersuchungspuffern zuzugeben oder schwierige Verfahren oder spezielle Instrumente zu verwenden, wie vorstehend beschrieben. Daher war es nötig, diese Probleme, auf die man bei den bestehenden Verfahren trifft, zu lösen.
Offenbahrung der Erfindung
Bei der Erfindung wurde herausgefunden, dass, wenn ein spezifisches Vorbehandlungsmittel in einer Menge, welche die Aktivität der zu untersuchenden Substanz nicht beeinflusst, einer Probe zugegeben wird, ausschließlich Bindeproteine inaktiviert werden und die so erhaltene Mischung direkt der Untersuchung unterzogen werden kann.
Das heißt, wenn eine biologische Probe einem grenzflächenaktiven Mittel und/oder einem Alkalimittel ausgesetzt wird, werden die Bindeproteine von einer zu untersuchenden Substanz freigesetzt und gleichzeitig irreversibel denaturiert. Die so vorbehandelte Probe kann neutralisiert oder verdünnt werden, so dass der pH-Wert einen für die Untersuchung geeigneten Wert erreicht, während weder die Neutralisierung einer funktionellen Gruppe eines Denaturierungsmittels noch die Zugabe irgendeines speziellen Materials, das die zu untersuchende Substanz vor erneuter Bindung an das Bindeprotein bewahrt, nötig sind.
Alternativ kann die vorbehandelte Probe der Untersuchung als solche unterzogen werden.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine Eichkurve der gebundenen Radioaktivität der in Beispiel 1 erhaltenen IGF-I-Standards.
2 zeigt eine Eichkurve der gebundenen Radioaktivität der in Beispiel 3 erhaltenen IGF-I-Standards.
Beste Methode zur Durchführung der Erfindung
Der Begriff „Bindeproteine", wie hier verwendet, meint ohne Einschränkung sämtliche Proteine, die in der Lage sind, an die zu untersuchende bioaktive Komponente zu binden. Beispiele der Bindeproteine schließen Insulin-ähnliche Wachstums-faktor-Bindeproteine, Wachstumshormon Bindeproteine, Insulinantikörper und Schilddrüsenhormon Bindeproteine ein.
Die Erfindung stellt ein Untersuchungssystem bereit womit Wachstumsfaktoren (insbesondere Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 2), Hormone, Vitamine, Medikamente, Aminosäuren, Aminosäuremetabolite, Peptide oder Proteine, die in biologischen Proben, verkörpert durch Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma oder Urin, enthalten sind, vorbehandelt werden können, ohne die Genauigkeit des Untersuchungssystems zu verschlechtern und ohne von irgendwelchen schwierigen Verfahren oder speziellen und hochgefährlichen Reagenzien Gebrauch zu machen.
In der Erfindung werden ein grenzflächenaktives Mittel und/oder ein Alkalimittel als Vorbehandlungsmittel verwendet. Das Vorbehandlungsmittel wird normalerweise als wässriges Medium eingesetzt. Falls zwei oder mehr Komponenten verwendet werden, können diese Komponenten entweder als getrennte Flüssigkeiten oder als Mischung eingesetzt werden, obwohl letzteres in der Praxis bevorzugt wird.
Als grenzflächenaktives Mittel kann ein anionisches grenzflächenaktives Mittel, ein kationisches grenzflächenaktives Mittel, ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel oder ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel verwendet werden. Es wird bevorzugt, ein anionisches grenzflächenaktives Mittel zu verwenden.
Beispiele für das anionische grenzflächenaktive Mittel schließen Alkylbenzolsulfonate und Natriumdodecylsulfat (nachfolgend einfach als SDS bezeichnet) ein. Beispiele für das kationische grenzflächenaktive Mittel schließen Dodecyltrimethylammoniumchlorid und Didodecyldimethylammoniumchlorid ein. Beispiele für das nichtionische grenzflächenaktive Mittel schließen Alkylpolyoxyethylenether, Alkylpolyoxyethylenphenole und Polyoxyethylensorbitanalkylester (Tween) ein. Beispiele für das amphotere grenzflächenaktive Mittel schließen Alkyltrimethylammoniumsalze ein.
In der Erfindung wird bevorzugt, ein anionisches grenzflächenaktives Mittel zu verwenden, vorzugsweise SDS.
Die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels im Vorbehandlungsmittel reicht zum Beispiel von 0,01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 1 Gew.-%, obwohl es günstig ist, die optimale Konzentration, abhängig vom Untersuchungsgegenstand und dem eingesetzten grenzflächenaktiven Mittel, zu bestimmen.
Andererseits schließen Beispiele für das Alkalimittel Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniak ein. Natriumhydroxid wird besonders bevorzugt. Die Konzentration des Alkalimittels im Vorbehandlungsmittel reicht normalerweise von 0,001 bis 1 Gew-%.
Das Vorbehandlungsmittel kann außerdem verschiedene Komponenten enthalten (ein Denaturierungsmittel, ein Freisetzungsmittel etc.), zum Beispiel einen niederen aliphatischen Alkohol. Beispiele für diesen Alkohol schließen Methanol, Ethanol, Isopropanol und Butanol ein. Von allen ist Ethanol der günstigste. Es ist wünschenswert, dass der Alkohol in einer Menge von 25 bis 35 Gew.-% basierend auf dem gesamten Vorbehandlungsmittel eingesetzt wird.
Wie vorstehend beschrieben, können die Wirkungen von Bindeproteinen in einer biologischen Probe durch Mischen des Vorbehandlungsmittels mit der biologischen Probe kontrolliert werden. Bei dieser Vorbehandlung kann eine ausreichende Wirkung durch Rühren normalerweise bei etwa Zimmertemperatur (zum Beispiel von 10 bis 40°C) erreicht werden.
Bei dieser Mischbehandlung wird das grenzflächenaktive Mittel der biologischen Probe in einer Menge von normalerweise 0,01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 1 Gew.-%, basierend auf der biologischen Probe, zugegeben. Andererseits wird das Alkalimittel der biologischen Probe in einer Menge von normalerweise 0,001 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,01 bis 0,5 Gew.-% ausgehend von der biologischen Probe, zugegeben. Die Menge eines derartigen Alkalimittels kann passend gesteuert werden; das heißt, es kann im Falle der Verwendung zusammen mit dem grenzflächenaktiven Mittel in einer geringeren Menge verwendet werden und bei alleiniger Verwendung in einer größeren Menge.
In der Erfindung kann der unerwünschte Effekt der Bindeproteine in der biologischen Probe durch die vorstehend beschriebene Vorbehandlung eliminiert werden. Nachfolgend wird die flüssige Mischung der Untersuchung der bioaktiven Komponente durch Verwendung eines allseits bekannten Untersuchungsverfahrens zugeführt. Das Untersuchungsverfahren ist nicht besonders beschränkt, solange die zu untersuchende bioaktive Komponente dadurch untersucht werden kann. Beispiele für das Untersuchungsverfahren schließen das Kompetitionsverfahren und das Sandwich-Verfahren ein. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die vorstehend beschriebene flüssige Mischung nicht einigen speziellen Verfahren unterzogen (Fest/Flüssigseparation, Extraktion etc.), sondern bei der Untersuchung als solche verwendet.
Im Kompetitionsverfahren oder im Sandwich-Verfahren kann ein Antikörper, ein Bindeprotein oder ein Rezeptor verwendet werden. Beispiele dieser Verfahren schließen ein Immuntest-Verfahren unter Verwendung einer radioaktiven Substanz, eines Enzyms, einer fluoreszierenden Substanz oder eines chemischen lumineszierenden Substrats als Marker und ein Agglutionationstest-Verfahren mit Verwendung von Latex, magnetischem Latex oder einem fluoreszenzmarkierten Latex ein.
Die Erfindung schließt außerdem Untersuchungskits ein. Beispiele für diesen Kit ausmachende Reagenzien schließen mindestens die folgenden Komponenten ein. Zum Beispiel enthält ein Kit zur Untersuchung von Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF):
im Falle des Sandwich-Verfahrens, z.B.:

a) eine Vorbehandlungsflüssigkeit, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält;
b) einen markierten anti-IGF-Antikörper und
c) einen Festphasen-anti-IGF Antikörper;

a) eine Vorbehandlungsflüssigkeit, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält;
b) einen markierten IGF und
c) einen anti-IGF-Antikörper;

a) eine Vorbehandlungsflüssigkeit, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält;
b) einen Latex, an den IGF fixiert ist, und
c) einen anti-IGF-Antikörper und

a) eine Vorbehandlungsflüssigkeit, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält;
b) einen fluoreszenz-(Europium)-markierten Latex, an dem ein anti-IGF-Antikörper fixiert ist; und
c) einen magnetischen Latex; an dem ein anti-IGF-Antikörper fixiert ist.

Nun wird die Erfindung anhand der folgenden Beispiele beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass die Erfindung nicht als hierauf beschränkt ausgelegt ist.
Beispiel 1
(Untersuchung von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) unter Verwendung eines grenzflächenaktiven Mittels)
a) Herstellung der Vorbehandlungsflüssigkeit

(1) 0,15% SDS wurde hergestellt.
(2) Eine Säure-Ethanol Vergleichslösung, die 0,1 M HCl und 90% Ethanol enthielt, wurde hergestellt, was eine Vorbehandlungsflüssigkeit ergab.

b) Herstellung von Antikörper-Kügelchen
Ein monoclonaler anti-IGF-I-Antikörper wurde unter alkalischen Bedingungen an Polystyrolkügelchen adsorbiert und der Untersuchung unterzogen.
c) Herstellung des Tracers
Anhand des Chloramin-T-Verfahrens wurde Jod¹²⁵ in einen monoclonalen Antikörper eingebaut, der in der Lage war, ein Sandwich gegen IFG-I zusammen mit dem Antikörper, wie vorstehend unter b) beschrieben, zu bilden. Der so erhaltene Tracer wurde mit dem nachstehend spezifizierten Phosphatpuffer, der Rinderserumalbumin etc. enthielt, verdünnt und der Untersuchung unterzogen:
0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4)
0,15 M Natriumchlorid,
10 mM Dinatriumedetat,
0,1% Rinderserumalbumin,
0,1% Tween 20 (grenzflächenaktives Mittel) und
0,02% Natriumazid.
d) Herstellung von IGF-I Standards
IGF-1, erhalten von Toyobo Co., Ltd, wurde mit dem gleichen Phosphatpuffer, der Rinderserumalbumin etc., wie vorstehend beschrieben, enthielt, verdünnt, um Konzentrationen von 0,3 bis 100 ng/ml zu erhalten.
e) Gewinnung menschlicher Serumproben
Gesunden Spendern wurden Blutproben entnommen. Nach der Separation wurden die Serumproben schnell eingefroren und bis zur Verwendung gelagert.
f) Vorbehandlung von Proben
25 μl einer menschlichen Serumprobe wurden in ein Teströhrchen überführt und hierzu wurden 500 μl der vorstehend unter (1) oder (2) beschriebenen Vorbehandlungsflüssigkeit gegeben. Im Falle der Vorbehandlungsflüssigkeit aus vorstehend (1) wurde die Probe gerührt und dann sofort der Untersuchung unterzogen. Im Falle des Säure-Ethanol Extraktes aus vorstehend (2) wurde die Probe gerührt und dann zentrifugiert und der Überstand wurde der Untersuchung unterzogen.
g) Immuntest
Portionen á 25 μl der IGF-I-Standards und der vorbehandelten Proben wurden jeweils in Teströhrchen überführt und es wurden je 300 μl Tracerlösung zugegeben. Nach dem Mischen wurde ein Antikörperkügelchen in jedes Teströhrchen gegeben. Nach Rühren bei Zimmertemperatur für 2 Stunden wurde das Kügelchen zweimal mit jeweils 3 ml gereinigtem Wasser gewaschen. Dann wurde die an das Antikörperkügelchen gebundene Radioaktivität mit einem γ-Zähler gemessen. Basierend auf den Mengen gebundener Radioaktivität von IGF-I-Standards in 7 Konzentrationen wurde eine Eichkurve erstellt (Tabelle 1 und 1). Tabelle 1
Gesamtradioaktivität (T): 182539 ZpM.
Im Falle jedes anderen Standards als NSB wird die Menge gebundener Radioaktivität (B) durch den Wert ausgedrückt, der durch Subtraktion der Menge gebundener Radioaktivität von NSB (236 ZpM).
Die IGF-I Konzentration in jeder vorbehandelten Probe wurde aus der Standardkurve bestimmt und die Menge gebundener Radioaktivität der vorbehandelten Probe und die IGF-I Konzentration in der unbehandelten Probe wurden durch Multiplikation der Konzentration der vorbehandelten Probe mit 21 bestimmt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 2
Beispiel 2
(Untersuchung von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) unter Verwendung eines grenzflächenaktiven Mittels)
Wie in Beispiel 1 wurden die IGF-I Konzentrationen in Proben gemessen und durch Verwendung von (1) einer Mischung aus 0,1 M HCl mit 90% Ethanol und (2) einer Mischung aus 0,18% SDS, 1 mM NaOH und 30% Ethanol als Vorbehandlungslösungen verglichen. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 3
Verglichen mit (1) (0,1 M HCl + 90% Ethanol) konnte (2) (1 mM NaOH + 0,18% SDS + 30% Ethanol) die Leistung verbessern.
Beispiel 3
(Untersuchung von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) unter Verwendung eines Alkalimittels)
a) Herstellung von Vorbehandlungslösung

(1) Eine wässrige 50 mM Natriumhydrochlorid-Lösung wurde hergestellt.
(2) Eine Säure-Ethanol Kontrolllösung wurde durch Zugabe von 9 Volumenanteilen Ethanol zu 1 Volumenanteil 1 N Salzsäure hergestellt, was eine Vorbehandlungsflüssigkeit ergab.

Nachfolgend wurde wie in Beispiel 1 b) die Präparation von Antikörperkügelchen, c) die Herstellung von Tracer, d) die Herstellung von IGF-I-Standards, e) die Gewinnung von menschlichen Serumproben und f) die Vorbehandlung der Proben durchgeführt.
g) Immuntest
Portionen á 25 μl des IGF-I-Standards und der vorbehandelten Proben wurden jeweils in Teströhrchen überführt und es wurden je 300 μl der Tracerlösung zugegeben. Nach dem Mischen wurde ein Antikörperkügelchen in jedes Teströhrchen gegeben. Nach Rühren bei Zimmertemperatur für 2 Stunden wurde das Kügelchen zweimal mit jeweils 3 ml gereinigtem Wasser gewaschen. Dann wurde die an das Antikörperkügelchen gebundene Radioaktivität mit einem γ-Zähler gemessen. Basierend auf den Mengen gebundener Radioaktivität von IGF-I-Standards in 7 Konzentrationen wurde eine Eichkurve erstellt (Tabelle 4 und 2). Tabelle 4
Gesamtradioaktivität (T): 193207 ZpM.
Im Falle jedes anderen Standards als NSB wird die Menge gebundener Radioaktivität (B) durch den Wert ausgedrückt, der durch Subtraktion der Menge gebundener Radioaktivität von NSB (270 ZpM) errechnet wird.
Die IGF-I Konzentration in jeder vorbehandelten Probe wurde aus der Standardkurve bestimmt und die Menge gebundener Radioaktivität der vorbehandelten Probe und die IGF-I-Konzentration in der unbehandelten Probe wurden durch Multiplikation der Konzentration der vorbehandelten Probe mit 21 bestimmt. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 5
Beispiel 4
(Untersuchung von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) unter Verwendung eines Alkalimittels und Ethanol)
Wie in Beispiel 3 wurden die IFG-I Konzentrationen in Proben durch Verwendung von (2) einer 50 mM NaOH-Lösung allein und (3) einer Mischung aus 5 mM NaOH mit 30% Ethanol und (1) einer Mischung aus 0,1 M HCl mit 90% Ethanol als Kontrolle als Vorbehandlungslösungen gemessen und verglichen. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 6
Verglichen mit der Verwendung von 50 mM NaOH allein wurde im Falle der kombinierten Verwendung die NaOH Konzentration auf 5 mM gesenkt. So kann die Lagerungsstabilität der Proben nach der Vorbehandlung verbessert werden und das Risiko, dass Arbeiter einer hochkonzentrierten Alkalilösung ausgesetzt sind, kann vermindert werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der Erfindung wird ein grenzflächenaktives Mittel bei der Vorbehandlung in einer solchen Konzentration verwendet, dass ebenfalls vorkommende Bindeproteine exklusiv inaktiviert werden, ohne dass die Aktivität einer zu untersuchenden Substanz zerstört wird. Daher kann die Konzentration der zu untersuchenden Substanz in einer biologischen Probe genau bestimmt werden, ohne dass auf teure Reagenzien, stark toxische Reagenzien, schwierige Verfahren oder spezielle Instrumente zurückgegriffen werden muss.

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer bioaktiven Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wachstumsfaktor, einem Hormon, einem Vitamin, einem Medikament, einer Aminosäure, einem Metabolit einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Protein, dadurch verkörpert, dass sie in einer Körperflüssigkeit enthalten ist, bestehend aus: (i) Hinzufügen mindestens eines Vorbehandlungsmittels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem grenzflächenaktiven Mittel und einem alkalischen Mittel und unter Umständen einem niederaliphatischen Alkohol zu einer biologischen Probe, wobei die Aktivität der bioaktiven Komponente in der biologischen Probe nicht negativ beeinflusst wird, jeder Komplex der bioaktiven Komponente und einem Bindeprotein in der biologischen Probe aufgelöst wird und das Bindeprotein in der biologischen Probe inaktiviert wird, um ein Gemisch der biologischen Probe und des Vorbehandlungsmittels zu erhalten; und (ii) dem Unterziehen des Gemischs aus der biologischen Probe und dem Vorbehandlungsmittel einer Untersuchung auf das Vorhandensein oder die Menge der bioaktiven Komponente.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 1, wobei das grenzflächenaktive Mittel ein anionisches grenzflächenaktives Mittel ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 2, wobei das grenzflächenaktive Mittel Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 1, wobei das Alkalimittel Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder ein wässriger Ammoniak ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das grenzflächenaktive Mittel in einer Menge von 0.01 bis 5 Gewichtsprozent eingesetzt wird.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Alkalimittel in einer Menge von 0.001 bis 1 Gewichtsprozent eingesetzt wird.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 1, wobei ein grenzflächenaktives Mittel und ein Alkalimittel in Kombination als das Vorbehandlungsmittel eingesetzt werden.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der niederaliphatische Alkohol Ethanol ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der niederaliphatische Alkohol in einer Menge von 25 bis 35 Gewichtsprozent eingesetzt wird.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die biologische Probe eine Körperflüssigkeit ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die zu untersuchende bioaktive Komponente insulin-like growth factor 1 oder insulin-like growth factor 2 ist.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die biologische Probe vermischt mit dem Vorbehandlungsmittel als solche der Untersuchung unterzogen wird.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches ein Untersuchungsverfahren ist, bei dem ein Antikörper, ein Bindeprotein oder ein Rezeptor eingesetzt wird, wobei eine radioaktive Substanz, ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz oder ein chemisches lumineszierendes Substrat als Marker eingesetzt wird; oder ein Untersuchungsverfahren, bei dem Latex, magnetischer Latex oder fluoreszenzmarkierter Latex eingesetzt wird.
Verfahren zur Untersuchung wie beansprucht nach Anspruch 13, wobei das Untersuchungsverfahren ein Kompetitionsverfahren oder Sandwichverfahren ist.