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Fachgebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung
einer rezeptorbindenden Substanz in einer wässrigen Probe (z.B. biologisches
Material, Meerwasser, Flusswasser, Grundwasser und dergleichen)
oder auf ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft
einer chemischen Substanz sowie auf ein Assayreagens zur Verwendung
bei diesem Verfahren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Neuere
Berichte haben ergeben, dass Substanzen verschiedene biochemische
Reaktionen induzieren, die in einem lebenden Körper vorkommen. Diese Substanzen
binden im Körper
an ihre Rezeptoren und verursachen die Freisetzung von Signaltransmittern,
die solche Reaktionen induzieren. Die Rezeptoren werden grob unterteilt
in solche, die auf der Zellmembran vorhanden sind, und solche, die
in einer Zelle oder einem Zellkern vorhanden sind.
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Die
Rezeptoren, die auf der Zellmembran vorhanden sind, sind Hormonrezeptoren,
wie adrenergischer Rezeptor, LH-Rezeptor und dergleichen. Viele
dieser Rezeptoren sind für
die intrazelluläre
Regulierung durch Signalübertragung
und -verstärkung über Tyrosin-Kinase,
Adenylat-Cyclase und dergleichen verantwortlich, die durch die Wechselwirkungen
der Rezeptoren und ihrer Liganden reguliert werden. Beispiele für diejenigen,
die in einer Zelle oder einem Zellkern vorhanden sind, sind der
Estrogenrezeptor, Retinoidrezeptor und dergleichen.
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Einige
Rezeptoren wirken als Trägersubstanzen
im Blut, wie Transferrin. Insbesondere wird davon ausgegangen, dass
der Wirkungsmechanismus eines Zellkernrezeptors Folgendes beinhaltet:
die Bindung zwischen einem Zellkernrezeptor und seinem Liganden,
welche einen nucleinsäurebindenden
Bereich des Rezeptors aktiviert, und dessen Bindung an die Nucleinsäure, die
die von der Nucleinsäure
ausgehende Transcription und Translation steuert, was schließlich zur
Steuerung verschiedener Reaktionen im Körper führt.
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Die
Bindung zwischen Substanz und Rezeptor wurde in Form von Modellen,
die verschiedene Reaktionen im Körper
darstellen, untersucht und studiert. "Rezeptor" bedeutet eine Substanz, die kein Antikörper ist
und die eine Bindungseigenschaft an ein Hormon, einen biochemischen
Botenstoff, ein Steroid, einen Wirkstoff, einen Wirkstoffmetaboliten,
ein Polypeptid, ein Protein, ein Vitamin, ein Alkaloid, ein Monosaccharid,
ein Disaccharid, ein Polysaccharid und dergleichen zeigt.
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Es
gibt einige Verfahren, um die Rezeptorbindungseigenschaft einer
Substanz in vitro zu beurteilen. Dazu gehören ein Verfahren, bei dem
ein Radioisotop verwendet wird (Obourn, J.D. et al., Biochemistry,
32, 6229–6236,
1993), ein Verfahren, bei dem Fluoreszenzdepolarisation verwendet
wird (Bolger, R. et al., Environ. Health Perspect., 106, 551–557, 1998),
ein Verfahren, bei dem Oberflächenplasmonresonanz
verwendet wird (Ward, L.D. et al., J. Biol. Chem., 269, 23286–23289,
1994), ein Verfahren, bei dem ein Mikrokalorimeter für einen
thermodynamischen Assay verwendet wird (Moore, J.L. et al., J. Biol.
Chem., 271, 21273–21278, 1996),
und dergleichen.
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Als
in-vivo-Verfahren wurden ein Verfahren, bei dem kultivierte Zellen
verwendet werden (Soto A.M. et al., Environ. Health Perspect., 103,
113–122,
1995), ein Verfahren, bei dem rekombinante Hefe verwendet wird (Arnold,
S.F. et al., Environ. Health Perspect., 104, 544–548, 1996), und dergleichen
beschrieben und in der Praxis durchgeführt.
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Das
von Bolger et al. beschriebene Verfahren, bei dem Fluoreszenzdepolarisation
verwendet wird, umfasst die kompetitive Umsetzung eines fluoreszenzmarkierten
Tracers mit einem Rezeptor und einer Assay-Zielsubstanz mit einem
Rezep tor und die Messung der Depolarisation der Fluoreszenz aufgrund
der Bindung des Tracers und des Rezeptors. Dieses Verfahren weist
den Mangel auf, dass die Verwendung des fluoreszenzmarkierten Tracers
eine geringere Reaktivität
bewirkt, und das Verfahren unterliegt einem Einfluss einer kontaminierenden
fluoreszierenden Substanz in der Probe und der Trübheit der
Probe.
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Das
Verfahren von Obourn et al., bei dem ein Radioisotop verwendet wird,
umfasst die kompetitive Umsetzung eines radioisotopmarkierten Tracers
mit einem Rezeptor und einer Assay-Zielsubstanz mit einem Rezeptor
und die quantitative Bestimmung des an den Rezeptor gebundenen Radioisotops.
Dieses Verfahren kann nur in einer speziellen Einrichtung verwendet
werden, da es ein Radioisotop verwendet, was die leichte Durchführbarkeit
und Verarbeitbarkeit beschränkt.
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Das
Verfahren von Ward et al., bei dem Oberflächenplasmonresonanz verwendet
wird, verwendet einen immobilisierten Rezeptor und analysiert die
direkte molekulare Wechselwirkung zwischen der Assay-Zielsubstanz
und dem Rezeptor. Mit diesem Verfahren lassen sich jedoch nicht
mehrere Proben gleichzeitig verarbeiten, und es erfordert einen
teuren Sensorchip und eine spezielle Apparatur.
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Das
Verfahren von Moore et al. für
den thermodynamischen Assay ist insofern überlegen, als es keine Immobilisierung
des Rezeptors oder Verwendung eines markierten Tracers erfordert.
Mit diesem Verfahren lassen sich jedoch auch nicht mehrere Proben
gleichzeitig verarbeiten, und es erfordert eine spezielle Apparatur.
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In
den letzten Jahren entstand ein Bedürfnis nach einer breiten Suche
(Screening) nach endokrin wirksamen Substanzen (EWS) (Toyama, C.,
Clinical Endocrinology, 46, 517–528,
1998), die die Untersuchung der Rezeptorbindungseigenschaft von
Zehntausenden bekannten oder neuen chemischen Substanzen erfordert. Mit
den oben genannten Verfahren lassen sich nicht mehrere Proben gleichzeitig
verarbeiten, und daher werden enorm viel Zeit und Arbeit benötigt.
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Es
besteht ein dringendes Bedürfnis
nach einem Assayverfahren für
die Wechselwirkung zwischen einem Rezeptor und einer chemischen
Substanz, das einen hohen Durchsatz erzielen kann.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, mit
dem sich mehrere Testproben gleichzeitig verarbeiten lassen, für die Rezeptorbindungseigenschaft
einer chemischen Substanz, das keine Immobilisierung des Rezeptors
oder eine spezielle Vorrichtung erfordert, und ein Reagens zur Verwendung
bei diesem Verfahren bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf dem Ergebnis, dass ein Ligand,
der nicht an einen Rezeptor gebunden ist, leicht allein bestimmt
werden kann durch die Schritte des kompetitiven Umsetzens eines
Liganden und einer Assay-Zielsubstanz mit dem Rezeptor in einer
Lösung
und, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden physikalisch zu
entfernen, des weiteren Zugebens eines Antikörpers gegen den Liganden und
eines markierten Liganden, so dass eine Reaktion ermöglicht wird.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:
- 1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft
einer Assay-Zielsubstanz,
das die folgenden Schritte umfasst:
- (a) kompetitive Umsetzung einer bekannten Konzentration eines
Liganden und der Assay-Zielsubstanz mit einer bekannten Konzentration
des Rezeptors in einer Lösung;
- (b) Messen der Menge des freien Liganden in der Lösung unter
Verwendung von einem oder mehreren Antikörpern gegen den Liganden, ohne
den an den Rezeptor gebundenen Liganden vor dem Assay physikalisch
zu entfernen; und
- (c) Bestimmen der Rezeptorbindungseigenschaft der Assay-Zielsubstanz
anhand der Menge des freien Liganden.
- 2. Das Verfahren gemäß dem obigen
Punkt 1, wobei der Schritt (b) die Zugabe von einem oder mehreren Antikörpern gegen
den Liganden und eines markierten Liganden zu dem in Schritt (a)
erhaltenen Reaktionsgemisch, so dass eine kompetitive Reaktion des
Antikörpers
und des freien oder markierten Liganden stattfinden kann, und das
Messen der Menge des an den Antikörper gebundenen oder nicht
gebundenen Markers umfasst.
- 3. Das Verfahren gemäß dem obigen
Punkt 1, wobei der Antikörper
in einem 1%igen organischen Lösungsmittel
seine Aktivität
zu 60% oder mehr beibehält.
- 4. Das Verfahren gemäß dem obigen
Punkt 1, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert
oder denaturiert ist.
- 5. Das Verfahren gemäß dem obigen
Punkt 1, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer
Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
- 6. Das Verfahren gemäß dem obigen
Punkt 1, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffmetaboliten,
Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen
und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.
- 7. Ein Reagens zur Bestimmung der Rezeptorbindungseigenschaft
einer Substanz, umfassend ein Reagens, das eine bekannte Konzentration
eines Rezeptors enthält,
ein Reagens, das eine bekannte Konzentration eines Liganden des
Rezeptors enthält
und ein Reagens zur Messung eines freien Liganden, das einen oder
mehrere Antikörper
gegen den Liganden enthält.
- 8. Das Reagens gemäß dem obigen
Punkt 7, das weiterhin ein Reagens umfasst, das den markierten Liganden
enthält.
- 9. Das Reagens gemäß dem obigen
Punkt 7, wobei der Antikörper
in einem 1%igen organischen Lösungsmittel
seine Aktivität
zu 60% oder mehr beibehält.
- 10. Das Reagens gemäß dem obigen
Punkt 7, wobei der Ligand nicht markiert, gebunden, prozessiert
oder denaturiert ist.
- 11. Das Reagens gemäß dem obigen
Punkt 7, wobei der Rezeptor in einer Menge verwendet wird, die zu einer
Bindung von 50% oder mehr des Liganden an den Rezeptor führt.
- 12. Das Reagens gemäß dem obigen
Punkt 7, wobei der Rezeptor aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Rezeptoren von Hormonen, Wirkstoffen, Wirkstoffmetaboliten,
Polypeptiden, Proteinen, Sacchariden, biochemischen Botenstoffen
und vitamin- und ligandbindenden Domänen davon besteht.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich, kurz gesagt, auf ein Verfahren
zur Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft einer natürlichen
Verbindung oder einer künstlich
synthetisierten Verbindung. Gemäß diesem
Verfahren werden die zu bewertende Substanz und ein unmarkierter
Ligand kompetitiv an einer Bindungsstelle auf dem Rezeptor umgesetzt,
und die Konzentration des freien Liganden wird direkt im Reaktionsgemisch
bestimmt, ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vom freien
Liganden abzutrennen. In der vorliegenden Erfindung umfasst der
Rezeptor ein Hormon, einen Wirkstoff, Wirkstoffmetaboliten, ein
Polypeptid, Protein, Saccharide, einen biochemischen Botenstoff,
ein Vitamin, ligandbindende Domänen
davon und dergleichen. Der Rezeptor umfasst Rezeptoren auf Biomembranen
(z.B. LH-Rezeptor (LH = luteinisierendes Hormon, FSH-Rezeptor (FSH
= follikelstimulierendes Hormon), Human-Choriogonadotropin-Rezeptor,
Thyreotropinrezeptor und dergleichen), Zellkern- und Cytoplasmarezeptoren
(z.B. Estrogenrezeptor, Androgenrezeptor, Progesteronrezeptor, PPAR-Rezeptor
(peroxisome proliferator activated receptor), Glucocorticoidrezeptor,
Retinsäurerezeptor,
Retinoid-X-Rezeptor, Thyroidhormonrezeptor, Ubichinonrezeptor, Vitamin-D-Rezeptor,
Mineralcorticoidrezeptor und dergleichen) sowie Rezeptoren um Serum
als Träger
(z.B. Thyroglobulin, Transferrin und dergleichen). Daher bedeutet
der "Ligand" in der vorliegenden
Erfindung luteinisierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon,
humanes Choriogonadotropin, Thyreotropin, Estrogen, Androgen, Progesteron,
Peroxisom, Glucocorticoid, Retinsäure, Retinoid X, Thyroidhormon,
Ubichinon, Vitamin D, Mineralcorticoid, Eisen und dergleichen, die
den oben genannten Rezeptoren entsprechen.
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Das
Bindungsverhältnis
der Assay-Zielsubstanz und des Liganden mit dem Rezeptor wird anhand
ihrer bestehenden Verhältnisse
und der jeweiligen Bindungskonstanten bestimmt. Wenn ein Rezeptor
und ein Ligand in gegebenen Konzentrationen vorhanden sind, wird
das Bindungsverhältnis
des Liganden mit dem Rezeptor konstant. Wenn eine Substanz mit Rezeptorbindungseigenschaft
vorhanden ist, nimmt die Menge des Liganden, der an den Rezeptor
bindet, jedoch in Abhängigkeit
von der Menge der Substanz und ihrer Bindungskonstante ab, und die
Menge an freiem Ligand nimmt zu. Durch Messung der Variation der
Konzentration des Liganden wird eine indirekte Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft
einer Substanz ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst höchst
charakteristischerweise die folgenden Schritte, um die Rezeptorbindungseigenschaft
zu bewerten:
- (a) Hinzufügen eines Liganden, von dem
bekannt ist, dass er an den Rezeptor bindet;
- (b) kompetitives Umsetzen einer Assay-Zielsubstanz und des Liganden
an einer Bindungsstelle des Rezeptors; und
- (c) Messen der Menge des freien Liganden im Reaktionsgemisch,
ohne den an den Rezeptor gebundenen Liganden vor dem Assay physikalisch
zu entfernen. Gemäß diesem
Verfahren und im Unterschied zu herkömmlichen Verfahren braucht
der Rezeptor oder Ligand nicht auf einem unlöslichen Träger immobilisiert zu werden.
Da der kompetitiv mit einem Rezeptor umzusetzende Ligand außerdem nicht
markiert ist, nimmt die Reaktivität nicht ab. Außerdem kann
der Ligand ein beliebiger Ligand sein, solange er Rezeptorbindungseigenschaft
aufweist, und es kann einer verwendet werden, der ökonomisch
und effizient bestimmt werden kann. "Physikalisches Entfernen" bedeutet hier einen
Schritt zum Abtrennen eines an einen Rezeptor gebundenen Liganden
von einem freien Liganden, wobei es sich um ein herkömmliches
Verfahren handeln kann, wie Waschen, Filtrieren durch einen Filter,
Trennung durch Magnetismus und dergleichen. Die Trennung kann während der
Bestimmung des freien Liganden durchgeführt werden, zum Beispiel wenn
ein festphasengebundener Antikörper
verwendet wird und dergleichen.
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Nach
einem Assay zur Bestimmung einer endokrin wirksamen Substanz bestand
in letzter Zeit ein starkes Bedürfnis.
Die Kombination eines Rezeptors und eines Liganden zum Screening
nach einer solchen Substanz unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch
handelt es sich vorzugsweise um einen Estrogen-Rezeptor und Estradiol,
Estron oder Estriol, einen Thyroidhormonrezeptor und Thyroxin oder
Triiodthyronin und dergleichen. Das Assayverfahren der vorliegenden
Erfindung kann auch für
eine andere Kombination aus Rezeptor und Ligand als die oben genannten
verwendet werden.
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Der
oben genannte Ligand ist vorzugsweise nicht markiert, gebunden,
prozessiert oder denaturiert. Die hinzuzufügende Menge des Rezeptors ist
vorzugsweise so groß,
dass eine Bindung von nicht weniger. als 50% des daneben vorliegenden
Liganden ermöglicht
wird. Wenn die Konzentration kleiner als 50% ist, zeigt der Ligand
eine sehr geringe Variation der Konzentration, was wiederum die
Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft schwierig macht.
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Die
Konzentration an freiem Liganden wird nach einem bekannten Verfahren
gemessen. Vorzugsweise wird ein spektroskopisches Verfahren oder
ein Fluoreszenz/Lumineszenz-Assay angewendet. Wenn ein spektroskopisches
Verfahren verwendet wird, beinhaltet der Assay im Allgemeinen eine
kompetitive Reaktion des freien Liganden und eines enzymmarkierten
Liganden mit einem immobilisierten Anti-Ligand-Antikörper. Das
als Marker zu verwendende Enzym kann eine Peroxidase, Alkalische
Phosphatase, β-Galactosidase, Acetylcholin-Esterase
und dergleichen sein, wobei eine Peroxidase bevorzugt ist. Bei einem
Fluoreszenz/Lumineszenz-Assay werden anstelle eines Enzymmarkers
ein Fluoreszenzmarker, Lumineszenzmarker und dergleichen verwendet.
Beispiele für
den Fluoreszenzmarker sind Fluorescein, Rhodamin und dergleichen,
und Beispiele für
den Lumineszenzmarker sind Acridiniumester, Photoprotein (z.B. Aequorin)
und Enzyme (z.B. Luciferase).
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Der
in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Antikörper unterliegt
keiner besonderen Einschränkung
hinsichtlich seiner Herkunft, Eigenschaft und dergleichen, solange
er einen Liganden bestimmen kann. Der Antikörper kann ein monoklonaler
Antikörper
oder ein polyklonaler Antikörper
sein. Wenn in einer Probe eine gegenüber dem Antikörper reaktive
Substanz vorhanden ist, wird vorzugsweise ein Antikörper gegen
die Substanz zu dem Reagens gegeben, um einen Einfluss der Substanz
auf den Assay zu verhindern. Wenn ein Antikörper auf einem wasserunlöslichen
Träger
immobilisiert ist, kann alternativ dazu auch ein Antikörper (sekundärer Antikörper) gegen
den für
eine höhere
Orientierung zu verwendenden Antikörper zuvor an einen wasserunlöslichen
Träger
gebunden werden. Es ist auch möglich,
ein bekanntes Verfahren zur Bereitstellung einer festen Phase zu
verwenden, wie ein Verfahren, das das vorherige Immobilisieren von
Protein A oder Protein G und das Binden des Antikörpers oder
aber das Binden eines biotinylierten Antikörpers an einen wasserunlöslichen
Träger,
an dem zuvor Streptavidin oder Avidin immobilisiert wurde, umfasst.
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Da
die Assay-Zielsubstanz eine geringere Löslichkeit in Wasser haben kann,
wird ein organisches Lösungsmittel
verwendet, um die Probe aufzulösen.
Das zu verwendende organische Lösungsmittel
unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch werden Methanol,
Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Ethanol und dergleichen bevorzugt.
In diesem Fall muss der zu verwendende Antikörper beständig gegenüber dem zu verwendenden organischen
Lösungsmittel
sein. Wünschenswerterweise
behält
dieser Antikörper
seine Antikörperaktivität in einem
organischen Lösungsmittel
mit 1%iger Konzentration zu 60% oder mehr bei. "Antikörperaktivität" bedeutet hier die spezifische Affinität des Antikörpers zu
dem zu verwendenden Liganden.
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Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen ausführlicher
erläutert,
auf die die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.
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Beispiel 1: Bewertung
der Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft
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Zusammensetzung von Reagens
1
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- Estrogenrezeptor: 100 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM
NaCl; pH 7,2)
- 17β-Estradiol:
33 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)
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Zusammensetzung von Reagens
2
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Mikrotiterplatte
mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
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Probe
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Diethylstilbesterol
(0, 3,3, 10, 33, 100, 333, 1000 ng/ml)
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Assayverfahren
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Eine
Probe (30 μl)
und eine Estrogenrezeptor-Lösung
(20 μl)
wurden miteinander gemischt, und eine 17β-Estradiol-Lösung (30 μl) wurde hinzugefügt, und
anschließend
erfolgte eine Inkubation bei 37 °C
während 1
h. Die Lösung
(50 μl)
wurde in eine Mikrotiterplatte mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper gegeben,
und gleichzeitig wurde eine Lösung
von mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertem Estradiol (50 μl) zugegeben, und
danach wurde 1 h lang bei 37 °C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde entfernt, und die Platte wurde dreimal
mit 10 mM Phosphatpuffer gewaschen, der 0,15 M NaCl und 0,05% Tween
20 enthielt. Nach dem Waschen wurde eine Lösung von o-Phenylendiamin (OPD)
(50 μl)
hinzugefügt,
und das Gemisch wurde 20 min lang bei 37 °C inkubiert. 1 N Schwefelsäure (100 μl) wurde
hinzugefügt,
und die Extinktion bei 490 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 1 gezeigt.
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Die
Extinktion nahm mit zunehmenden Diethylstilbesterol-Konzentrationen
ab. Es wurde also bestätigt,
dass Diethylstilbesterol in der Lage ist, quantitativ eine Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft
zu zeigen.
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Beispiel 2: Bewertung
der Estrogen-Rezeptor-Bindungseigenschaft
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Zusammensetzung von Reagens
1
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Estrogenrezeptor:
100 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)
-
17β-Estradiol:
33 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2) Mikrotiterplatte
A mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
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Zusammensetzung von Reagens
2
-
- Estrogenrezeptor: 100 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM
NaCl; pH 7,2)
- 17β-Estradiol:
33 nM (in 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH 7,2)
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Mikrotiterplatte
B mit gebundenem Anti-Estradiol-Antikörper HRP-markiertes Estradiol
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Probe
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Diethylstilbesterol
(0, 1000 ng/ml; hergestellt mit PBS, hergestellt mit 1% DMSO-Lösung)
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Assayverfahren
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In
derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde der Assay durchgeführt.
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Wenn
PBS als Lösungsmittel
verwendet wurde, zeigten die beiden Arten von Antikörpern keinen
signifikanten Unterschied in den Assaywerten. Wenn jedoch ein organisches
Lösungsmittel
verwendet wurde, variierten die Assaywerte stark je nach den verwendeten
Antikörpern.
Das heißt,
wenn ein Antikörper
verwendet wird, der in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels
eine geringere Reaktivität
zeigt, wird die Bewertung der Rezeptorbindungseigenschaft einer
Assay-Zielsubstanz aufgrund der geringen Variation der Extinktion
schwierig.