DE69839249T2

DE69839249T2 - Screens für medikamente, die auf hormonrezeptoren des zellkerns wirken

Info

Publication number: DE69839249T2
Application number: DE69839249T
Authority: DE
Inventors: Kevin South San Francisco LUSTIG; Patrick South San Francisco BAEUERLE; Holger South San Francisco BECKMANN; Jin-Long South San Francisco CHEN; Bei South San Francisco SHAN
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2018-11-21
Also published as: WO1999027365A1; AU734875B2; CA2309879C; CA2309879A1; US7101681B1; ATE389180T1; DE69839249D1; EP1032834A4; JP2001524672A; JP3584211B2; AU1598999A; EP1032834B1; EP1032834A1

Description

EINLEITUNG
Gebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung sind Screens für Arzneimittel, welche eine Funktion eines nukleären Hormonrezeptors bewirken.
Hintergrund
Nukleare Hormonrezeptoren beinhalten eine große, gut definierte Familie von ligandaktivierten Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von Zielgenen durch das Binden an spezifische cis-wirkende Sequenzen modifizieren (Laudet et al., 1992, EMBO J, Bd. 1003–1013; Lopes da Silva et al., 1995, TINS 18, 542–548; Mangelsdorf et al., 1995, Cell 83, 835–839; Mangelsdorf et al., 1995, Cell 83, 841–850). Familienmitglieder umfassen sowohl verwaiste Rezeptoren als auch Rezeptoren für eine breite Vielfalt an klinisch bedeutsamen Liganden, die Steroide, Vitamin D, Schilddrüsenhormone, Retinolsäure, usw. umfassen. Es wird angenommen, dass Ligandenbindung eine konformative Änderung der Rezeptoren induziert und ihre Assoziation mit transkriptionalen Koaktivatoren fördert, die eine mannigfaltige Gruppe von großen nukleären Proteinen sind (Glass et al., 1997, Curr Opn Cell Biol 9, 222–232), die möglicherweise ein Signatursequenzmotiv teilen (Heery et al., 1997, Nature 733–736). Der resultierende Komplex bindet dann Stellen mit hoher Affinität in Chromatin und moduliert Gentranskription.
Der klassische Ansatz, Agonisten und Antagonisten nuklearer Hormonrezeptoren zu identifizieren, ist das Ligandenaustauschverfahren, wo der Austausch von einem radioaktiv markierten Liganden durch Wirkstoffkandidaten erkannt wird. Ein alternativer Ansatz ist ein zellbasierter Transkriptionsassay zur Expression eines Reporters von Aktivierung eines nuklearen Hormonrezeptors (z. B. Evans et al. (1991) US Patent Nr. 5,071,773 ). Vor Kurzem wurde ein von einem gelbasierten Koaktivator abhängiger Rezeptorligandassay (Krey et al., 1997, Mol Endocrinol 11, 779–791) verwendet, um Liganden von Peroxisom-Proliferatoraktivierten Rezeptoren (PPAR) zu identifizieren, die nukleäre Hormonrezeptoren sind, die durch eine Vielfalt von Verbindungen, einschließlich hypolipidemischen Arzneimitteln, aktiviert werden. Unglücklicherweise leiden diese verschiedenen Assays unter einer Anzahl an Einschränkungen, die einen erforderlichen bekannten Liganden und Zeit bzw. arbeits- und ressourcenaufwendige zeltbasierte und gelbasierte Verfahren umfassen.
Torchia et al., Nature Bd. 387, Nr. 6634, S. 677–684 berichten, dass der transkriptionale Koaktivator p/CIP CBP bindet und Nuklearrezeptorfunktion vermittelt.
Heery et al., Nature, Bd. 387, 12. Juni 1997, S. 733–736 berichten, dass ein Signaturmotiv bei transkriptionalen Koaktivatoren Bindung an nukleäre Rezeptoren vermittelt.
Krey et al., Molecular Endocrinology 11(6), Juni 1997, S. 799–791 berichten von Fettsäuren, Eikosanoiden und hypolipidemischen Wirkstoffen, die durch einen koaktivatorabhängigen Rezeptorligandassay als Liganden von Peroxisom-Proliferator aktivierten Rezeptoren identifiziert werden.
WO 94/19024 beschreibt Technetium/99m-markierte Peptide für diagnostische Bildgebung. WO 97/30074 beschreibt die Isolation und Verwendung von SH3-bindenden Peptiden. WO 97/10337 beschreibt Steroidrezeptorkoaktivatorzusammensetzungen und Verwendungsverfahren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt mit der Verwendung von zell- oder gelbasierten Schritten Verfahren für effizientes Screening von Modulatoren einer Funktion eines nukleären Hormonrezeptors bereit. Die Verfahren eignen sich zum automatisierten, kosteneffektiven Screening mit hohem Durchsatz von chemischen Bibliotheken für bioaktive Verbindungen.
Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Assayverfahren in vitro zum Charakterisieren eines Wirkstoffs als einen Modulator eines nukleären Hormonrezeptors bereit, das die folgenden Schritte beinhaltet:
Bilden einer Mischung in vitro, die einen ersten, gereinigten nukleären Hormonrezeptor, einen Sensor und einen Wirkstoffkandidaten, aber kein natürliches Koaktivatorprotein des Rezeptors beinhaltet, wobei der Sensor aus einem Peptid besteht, das die Sequenz L₁X₁X₂L₂L₃ (SEQ-ID-NR.: 18), die kovalent an eine direkt erkennbare fluoreszierende Markierung gekuppelt ist, beinhaltet, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden und X₁–X₂ unabhängig aus allen beliebigen Aminosäuren ausgewählt werden, und wobei das Peptid eine direkte, ligandenabhängige Bindung in vitro an den Rezeptor bereitstellt und seine Länge 24 oder weniger Reste beträgt, wobei die Konzentration des Sensors weniger als etwa 100 nM beträgt;
Messen einer Assayfluoreszenzpolarisation des Sensors als ein Anzeichen der Sensorbindung an den Rezeptor in Gegenwart des Wirkstoffs;
Vergleichen der Assayfluoreszenzpolarisation mit einer entsprechenden Kontrollfluoreszenzpolarisation, wobei die Kontrollfluoreszenzpolarisation ein Anzeichen der Sensorbindung an den Rezeptor in Abwesenheit des Wirkstoffs bereitstellt, und wobei eine größere Assayfluoreszenzpolarisation als Kontrollfluoreszenzpolarisation anzeigt, dass der Wirkstoff ein Modulator des Rezeptors ist.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Assayverfahren in vitro zum Charakterisieren eines Wirkstoffs als einen Modulator eines nukleären Hormonrezeptors bereit, das die folgenden Schritte beinhaltet:
Bilden einer Mischung in vitro, die einen ersten, gereinigten nukleären Hormonrezeptor, einen Sensor und einen Wirkstoffkandidaten, aber kein natürliches Koaktivatorprotein des ersten Rezeptors beinhaltet, wobei der Sensor aus einem Peptid besteht, das die Sequenz L₁X₁X₂L₂L₃ (SEQ-ID-NR.: 18), die kovalent an eine erkennbare Markierung gekuppelt ist, beinhaltet, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden und X₁–X₂ unabhängig aus allen beliebigen Aminosäuren ausgewählt werden, und wobei das Peptid eine direkte, ligandenabhängige Bindung in vitro an den ersten Rezeptor bereitstellt und seine Länge 24 oder weniger Reste beträgt und unter Bedingungen, bei denen das Peptid des Sensors den ersten Rezeptor bindet, um einen Komplex aus dem ersten Rezeptor und dem Sensor zu bilden, und der Komplex auf eine feste Phase immobilisiert wird;
Messen einer Assaybindung des Sensors an den ersten Rezeptor mittels wahlweisen Erkennens von Komplexen aus dem immobilisierten ersten Rezeptor und dem Sensor; und
Vergleichen der Assaybindung mit einer entsprechenden Kontrollbindung, wobei die Kontrollbindung ein Anzeichen der Sensorbindung an den ersten Rezeptor in Abwesenheit des Wirkstoffs bereitstellt, und wobei eine größere Assaybindung als Kontrollbindung anzeigt, dass der Wirkstoff ein Modulator des ersten Rezeptors ist.
Bei bestimmten Ausführungsformen beinhaltet der Sensor eine Domäne einer amphipathischen Alpha-Helix, die mit nukleären Hormone wechselwirkt, die eine Motivsequenz eines transkriptionalen Koaktivators von nukleären Hormonen beinhaltet. Um Spezifität zu sichern und Bindung zu optimieren, ist der Sensor im Allgemeinen bei sub-mikromolarer Konzentration vorhanden, und die Bindungsreaktion tritt in Lösung auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der Sensor eine fluoreszierende Markierung, und der Messschritt beinhaltet das Erkennen von Fluoreszenzpolarisation der Markierung.
Reagenzien wie markierte Sensorpeptide und Reaktionsmischungen werden beschrieben, die im Wesentlichen aus einem nuklearen Hormonrezeptor, einem Peptid und einem Wirkstoffkandidanten bestehen, wobei das Peptid eine direkte ligandenabhängige Bindung in vitro an den Rezeptor bereitstellt, insbesondere wobei die Bindung in der Gegenwart des Wirkstoffs verbessert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Dosis-Wirkung der LXR-Aktivierung mit Oxysterolliganden in fluoreszierendem Polarisationsassay mit einem TUK-1391-Sensor.
2. Die Dosis-Wirkung, die einen 24-Ketocholesterin-Liganden (2 μM) zeigt, erhöht die LXR-Rezeptor-Affinität für den markierten Peptidsensor in einem fluoreszierenden Polarisationsassay.
3. Die Dosis-Wirkung, die einen 9-cis-Retinolsäure-Liganden (1 μM) zeigt, erhöht die RXR-Rezeptor-Affinität für den markierten Peptidsensor in einem fluoreszierenden Polarisationsassay.
4. NRH-Agonist-Assaybewertung mittels fluoreszierender Polarisation für einen LXR/24-Ketocholesterin-Liganden (2 μM), PPARγ/BRL49653 (1 μM) und einen RXR/9-cis-Retinolsäure-Liganden (1 μM) mit einem TUK-1391-Sensor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verfahren benutzen im Allgemeinen eine Mischung, die drei Komponenten beinhaltet: einen nuklearen Hormonrezeptor, einen Peptidsensor und einen Wirkstoffkandidaten, in Mengen, effektiv zum Messen der als Ziel gesetzten Wechselwirkungen. Viele natürliche nukleäre Hormonrezeptoren sind modulare Proteine mit diskret funktionalen Domänen, einschließlich einer ligandenbindenden Domäne; siehe Laudet et al.; Lopes da Silva et al.; Mangelsdorf et al. oben. Die Gegenstandsrezeptoren umfangen derartige Rezeptoren voller Länge sowie Abschnitte der Rezeptoren, die ausreichen, um unterschiedliche Sensorbindung in der Gegenwart und Abwesenheit eines entsprechenden Rezeptorliganden, Agonisten und/oder Antagonisten bereitzustellen. Derartige Abschnitte beinhalten im Allgemeinen mindestens die ligandenbindende Domäne des Rezeptors. Eine breite Vielfalt molekularer und biochemischer Verfahren steht zur biochemischen Synthese, molekularen Expression und Reinigung der Zusammensetzungen des Gegenstands zur Verfügung, siehe z. B. Molecular Cloning, A Laborstory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laborstory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, New York) oder solche, die anderweitig auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielhafte nukleäre Hormonrezeptoren und entsprechende therapeutische Zielanwendungen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1. Beispielhafte nukleäre Hormonrezeptoren, Form (M = monomer, D = heterodimer, H = homodimer), Gewebeexpression und therapeutische Zielapplikation.

Rezeptor	Form	Gewebe-Expression	Therapeutische Zielapplikation
NURR1	M/D	Dopaminerge Neuronen	Parkinsonkrankheit
RZRβ	Gehirn	(Pituitaria), Muskel	Schlafstörungen
RORα	M	Kleinhirn, Purkinjezellen	Arthritis, Kleinhirnataxie
NOR-1	M	Gehirn, Muskel, Herz, Nebenniere, Thymus	ZNS-Störungen, Krebs
Rev-ErbAβ	H	Gehirn, Muskel, Milz	ZNS-Störungen
Tlx	H	Embryonales und erwachsenes Gehirn	ZNS-Störungen
NGFI-Bβ	M/D	Gehirn	ZNS-Störungen
HZF-2α	H	Hippokampus	ZNS-Störungen
COUP-TFα	H	Gehirn	ZNS-Störungen
COUP-TFβ	H	Gehirn	ZNS-Störungen
COUP-TFγ	H	Gehirn	ZNS-Störungen
Nur77	M/D	Gehirn, Thymus, Nebennieren	ZNS-Störungen
LXRα	D	Leber, Niere, Milz, Nebennieren	Hypercholesterinämie
COR	M	Leber, Bauchspeicheldrüse	Hypercholesterinämie
Rev-ErbAα	H	Muskel, Gehirn (ubiquitär)	Fettleibigkeit
HNF4α	H	Leber, Niere, Darm	Diabetes
TOR	M	Thymus, T-Zellen	Lymphom-Immunstörungen
MB67α	D	Leber	Stoffwechselstörungen
SHP	D	Leber, Herz, Bauchspeicheldrüse	Stoffwechselstörungen
FXR	D	Leber, Niere	Stoffwechselstörungen
SF-1	M	Keimdrüsen, Pituitaria	Stoffwechselstörungen
LXRβ	D	Niere (Ubiquitär)	Stoffwechselstörungen
GCNF	M/H	Hoden, Eierstock	Unfruchtbarkeit
TR2-11α,β	H	Hoden	Unfruchtbarkeit, Empfängnisverhütung
TR4	H	Hoden	Unfruchtbarkeit, Empfängnisverhütung
ERRα,β	M	Plazenta	Unfruchtbarkeit
DAX-1	M	Hoden, Nebennieren, Eierstock, Leber	Nebennierenhypoplasie, Hypogonadismus

Die Mischung umfasst ebenfalls einen Peptidsensor, der einen direkten bedeutsamen Assay in vitro bereitstellt, der unter Assaybedingungen erkennbar an den Rezeptor bindend ist. Demgemäß umgeht der Sensor die Notwendigkeit, ein natürliches Koaktivatorprotein des Rezeptors in die Mischung einzuschließen. Der Sensor beinhaltet eine Rezeptorbindungssequenz, im Allgemeinen L₁X₁X₂L₂L₃, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden, vorzugsweise Leucin oder Isoleucin, noch besser Leucin; und X₁–X₂ unabhängig aus allen beliebigen Aminosäuren ausgewählt werden, vorzugsweise jede beliebige Aminosäure. Der Sensorbereich, der diese Sequenz beinhaltet, bildet im Allgemeinen eine amphipathische Alphahelix. Derartige Sequenzen können natürliche Koaktivatorproteinmotivsequenzen sein, die von Koaktivatormotivsequenzen oder Konsenssequenzen davon abgeleitet werden, z. B. durch schrittweise veränderliche Analyse und/oder aus Screens von rein oder teilweise synthetischen Sequenzen, z. B. Randomisieren von Resten und Auswählen für die Rezeptorbindung. Die Sensoren verfügen über eine Länge und Sequenz, die ausreicht, um die notwendige spezifische Bindung zu bewirken, im Allgemeinen eine Länge von 50 oder weniger, vorzugsweise 24 oder weniger, noch besser 12 oder weniger Resten. Demgemäß werden Platten von vorbestimmten oder randomisierten Kandidatensensoren zur Rezeptorbindung leicht ausgesiebt. Zum Beispiel werden bei dem Hochdurchsatz-Fluoreszenzpolarisationsassay (unten) Kandidatensensoren, die eine spezifische Bindung demonstrieren, in geeigneter Weise durch verbesserte fluoreszierende Polarisation identifiziert, im Allgemeinen eine Erhöhung von mindestens etwa 5, vorzugsweise mindestens etwa 10, noch besser mindestens etwa 20 Millipolarisationseinheiten unter optimierten Bindungsassaybedingungen.
Bei einer bestimmten Ausführungsform demonstrieren die Sensoren Ligand, Agonist und/oder ligandabhängige Bindung, d. h. der Sensor bindet den Rezeptor in der Gegenwart und Abwesenheit eines derartigen Liganden/Agonisten/Antagonisten unterschiedlich, im Allgemeinen Differentialbindung von mindestens 10/10%, vorzugsweise mindestens 100/50%, bzw. noch besser mindestens 1000/90%. Demgemäß sind Platten von vorbestimmten oder randomisierten Kandidatensensoren leicht auszusieben für Differentialbindung, wie in 2 und 3 für zwei beispielhafte Rezeptor/Ligand-Paare beispielhaft gezeigt. Differentialbindung wird analog in geeigneter Weise unter Verwendung bekannter Agonisten oder Antagonisten von vorherbestimmten Rezeptoren demonstriert. Für verwaiste Rezeptoren ist es oftmals zweckdienlich, bekannte Liganden nach Pseudoliganden oder Surrogaten vorauszusieben, die wahlweise die Ligandenbindungsdomäne binden. Alternativ dazu können Agonisten und/oder Antagonisten durch Screening von vorbestimmten oder randomisierten markierten Kandidatenpeptiden für Sensoren, die durch Assay erkennbare Rezeptorbindung demonstrieren, bzw. dann Screening für Wirkstoffe, die die Bindung des identifizierten Sensors an den Rezeptor, d. h. Agonisten/Antagonisten, erhöhen/vermindern, identifiziert werden.
Beispielhafte Sensoren und Bindungsdaten sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2. Sensorenaktivität: Fluoreszierender Polarisationsassay
Der Sensor beinhaltet ebenfalls eine erkennbare Markierung. Eine breite Vielfalt an Markierungen kann verwendet werden, einschließlich Markierungen, die direkte Erkennung, wie etwa Radioaktivität, Lumineszenz, optische oder Elektronendichte usw., oder indirekte Erkennung, wie etwa ein Epitop-Marker usw., berücksichtigen. Eine Vielfalt an Verfahren kann verwendet werden, um die Markierung zu erkennen, abhängig von der Beschaffenheit der Markierung und anderer Assaykomponmenten, z. B. durch optische oder Elektronendichte, Strahlungsaussendungen, nichtstrahlende Energieübertragungen usw., oder indirekt erkannt werden mit Antikörperkonjugaten usw. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Markierung unterschiedlich erkennbar gemäß der Rezeptorbindung, wobei die Notwendigkeit jeglichen Gebunden-gegen-ungebunden-Trennungsschritts umgangen wird. Bei einer spezifischeren Ausführungsform ist die Markierung eine fluoreszierende Markierung, die abhängig von der Rezeptorbindung unterschiedliche Fluoreszenzpolarisation bereitstellt. Derartige Markierungen umfassen beispielhafterweise Rhodamin und Fluorescein, was durch einen Verknüpfer, z. B. einen Aminosäureverknüpfer, direkt oder indirekt gekuppelt werden kann. Geeignete Markierungen und Verfahren für Peptidkonjugation/-inkorporation (z. B. während Peptidsynthese in der festen Phase) sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Der Sensor ist im Allgemeinen mit einer Konzentration von weniger als ungefähr 1 μM, vorzugsweise weniger als ungefähr 100 nM, noch besser weniger als ungefähr 10 nM und am besten weniger als ungefähr 1 nM vorhanden.
Die Assay-Mischung beinhaltet ebenfalls einen Wirkstoffkandidaten. Geeignete Wirkstoffkandidaten umschließen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen sind; vorzugsweise kleine organische Verbindungen, und werden aus einer breiten Vielfalt an Quellen, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen, erhalten. Bei einer bestimmten Ausführungsform beinhaltet die Assaymischung ebenfalls einen bekannten Liganden des Rezeptors. Diese Ausführungsform ist insbesondere zum Screening für Antagonisten des Rezeptors geeignet. Eine Vielfalt anderer Reagenzien kann in der Mischung ebenfalls eingeschlossen sein. Diese umfassen Reagenzien wie etwa Salze, Puffer, neutrale Proteine; z. B. Albumin, Detergenzien, Proteaseinhibitoren, usw. können verwendet werden.
Diese Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, wobei, außer bei Anwesenheit des Wirkstoffkandidaten, der Sensor den Rezeptor mit einer Referenz-Bindungsaffinität bindet. Bei einer bestimmten Ausführungsform befinden sich alle Komponenten der Mischung, einschließlich des Rezeptors, des Peptids und des Wirkstoffs, in Lösung. Die Mischungskomponenten können in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden, die die erforderlichen Bindungen bereitstellt, und Inkubationen können bei jeder beliebigen Temperatur durchgeführt werden, die eine optimale Bindung ermöglicht. Inkubationsperioden werden gleichermaßen zur optimalen Bindung ausgewählt, aber auch minimiert, um ein schnelles Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen. Nach der Inkubation wird die wirkstoffbefangene Bindung zwischen dem Sensor und Rezeptor gemäß der Beschaffenheit der Markierung erkannt, wie oben beschrieben. Ein Unterschied der Bindung in der Gegenwart und Abwesenheit des Wirkstoffs zeigt an, dass der Wirkstoff eine Rezeptorbindungsfunktion moduliert. Ein Unterschied, wie hier verwendet, ist statistisch signifikant und stellt vorzugsweise einen Unterschied von mindestens 50% und besser einen Unterschied von mindestens 90% dar.
Eine breite Vielfalt an Verfahren kann verwendet werden, um Bindung zwischen dem Sensor und dem Rezeptor zu messen, abhängig von der Beschaffenheit des Sensors und nuklearen Hormonrezeptors, ob der Assay in Lösung oder teilweise oder komplett in fester Phase durchgeführt wird, ob lumineszierende, radioaktive oder fluoreszierende Aussendungen verwendet werden, ob der Sensor oder der Rezeptor von Komplexen aus dem immobilisierten Rezeptor und dem Sensor erkannt wird usw. Bei Ausführungsformen in fester Phase kann der Messschritt unter anderem das Immobilisieren des Rezeptors durch den Sensor oder des Sensors durch den Rezeptor involvieren. Zum Beispiel wird angenommen, dass der Sensor eine Markierung beinhaltet, wie etwa einen Marker, oder die Aminosäuren des Sensors selbst können eine Epitopmarkierung bereitstellen. Folglich kann der Rezeptor durch den Sensor immobilisiert und der Sensor durch die Markierung immobilisiert werden. Die Markierung kann durch herkömmliche kovalente und/oder nicht kovalente Verknüpfungen direkt an die feste Phase gekuppelt sein oder durch einen oder mehrere zweite Rezeptoren, spezifisch für die Markierung, wie etwa epitopspezifische Sensorantikörper, Avidin (wenn die Markierung Biotin ist), usw. indirekt gekuppelt sein. Wo der Sensor derart immobilisiert ist, beinhaltet der Messschritt im Allgemeinen das Erkennen des immobilisierten nukleären Hormonrezeptors, wie etwa mit einem rezeptorspezifischen Antikörper, wie bei einem herkömmlichen ELISA-Format. Bevorzugte ELISA-Format-Assays benutzen ein chemolumineszierendes oder zeitüberwindendes fluoreszierendes Substrat zur zweckdienlichen Ablesung, insbesondere bei Hochdurchsatzanwendungen.
Bei alternativen Ausführungsformen in fester Phase sind der Sensor und der Rezeptor umgekehrt, d. h. der Sensor wird durch den nukleären Hormonrezeptor immobilisiert. Auf ähnliche Art und Weise kann der Rezeptor direkt immobilisiert oder durch einen oder mehr rezeptorspezifische Rezeptoren gekuppelt werden, und der immobilisierte Sensor kann dann direkt oder indirekt, z. B. in einem ELISA-artigen Format, erkannt werden.
Die Assays in der festen Phase sind insbesondere nützlich, wenn erstrebt wird, eine Vielzahl von unterschiedlichen Sequenzsensoren simultan oder nebeneinander in Platten oder Mischungen auszusieben. Zum Beispiel werden mit verwaisten Rezeptoren schwach bindende Peptide in Phagenanzeigenbindungsassays identifiziert. Mischungen von schwach bindenden Peptiden werden verwendet, um Bibliotheken für Verbindungen auszusieben, die Peptidbindungen modulieren, und positive Mischungen werden dann getrennt und durch individuelle Peptide untersucht. Derartige aktive Peptide werden dann direkt markiert, z. B. mit einem fluoreszierenden Teil für Verwendung in z. B. Lösungsphasenassays mit extrem hohem Durchsatz, wie etwa dem unten beschriebenen fluoreszierenden Polarisationsassay. Platten derartiger Peptide können ebenfalls verwendet werden, um die Kandidatenmodulatoren bekannter Rezeptoren auszusieben, wobei eine Reihe von Bindungseffekten bereitgestellt wird, die einen virtuellen Fingerabdruck der Aktivität/Spezifität eines gegebenen Modulators konstituieren. Zusätzlich dazu können derartige Peptide verwendet werden, um bevorzugte Steuerungen für Lösungsphasenassays zu identifizieren, die ein direkt erkennbares Sensorpeptid erfordern.
Die Erfindung stellt ebenfalls Reagenzien zur Verwendung in den Gegenstandsverfahren bereit. Zum Beispiel stellt die Erfindung Sensoren bereit, die aus einem Peptid, das die Sequenz L₁X₁X₂L₂L₃ beinhaltet, die kovalent an eine erkennbare Markierung gekuppelt ist, bestehen oder hauptsächlich daraus bestehen, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden und X₁–X₂ unabhängig aus jeder beliebigen Aminosäure ausgewählt werden, und wobei das Peptid eine direkte ligandenabhängige Bindung in vitro an einen nukleären Hormonrezeptor bereitstellt. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Markierung eine fluoreszierende Markierung, die an den N-Terminus des Peptids gekuppelt ist, und das Peptid weist eine Länge von 24, vorzugsweise 18, noch besser 12, am besten 8 oder weniger Resten auf. Die Erfindung stellt ebenfalls Reagenzienmischungen bereit, wie etwa eine Mischung, die aus hauptsächlich einem nukleären Hormonrezeptor, einem Peptid und einem Wirkstoffkandidaten besteht, wobei das Peptid eine direkte ligandenabhängige Bindung in vitro an den Rezeptor bereitstellt, wobei vorzugsweise die Bindung in der Gegenwart des Wirkstoffs verbessert wird.
Das folgende Beispiel wird zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung geboten.
BEISPIELE
I. Hochdurchsatz-Fluoreszenzpolarisationsassay in vitro
Reagenzien:

Sensor:

Rhodaminmarkierte L₁X₁X₂L₂L₃-Peptide (Endkonz. = 1–5 nM)

Rezeptor:

Fusionsprotein der Ligandenbindungsdomäne der Glutathion-S-Transferase/des nukleären Hormonerezeptors (Endkonz. = 100–200 nM)

Puffer:

10 mM HEPES, 10 mM NaCl, 6 mM Magnesiumchlorid, pH-Wert 7,6

Protokoll:

1. Zugeben von 90 Mikrolitern der Peptid/NHR-Mischung in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen.
2. Zugeben von 10 Mikrolitern einer Testverbindung pro Vertiefung.
3. Schütteln für 5 Min und Bestimmen der Menge an Fluoreszenzpolarisation durch Verwendung eines Fluorolite-FPM-2-Fluoreszenzpolarisations-Mikrotitersystems (Dynatech Laborstories, Inc.) innerhalb von 5 Minuten.

II. Konformationssensor – ELISA-Format-Assay
Puffer und Lösungsvorbereitung:

1. 10X-Assay-Puffer: 100 ml von 1 M Hepes 300 ml von 5 M NaCl 20 ml von 1 M MgCl Zugeben von MQ H₂O für 1 l
2. Mastermix aus Ligand/Peptid/Protein Protein: Enkonz. = 100 nM Biotin-Peptid (MG: 1366,7387 g/mol): Endkonz. = 1 uM Zugeben von Assay-Puffer und H₂O, um zum Endvolumen zu bringen: Endpufferkonz. = 1 X
3. Antikörpermischung: Anti-GST, Kaninchen (Enkonz. = 1:10 000) Anti-Kaninchen-HRP (Enkonz. = 1:10 000) Zugeben von T-TBS, um zum Endvolumen zu bringen: Endpufferkonz. = 1 X

Verfahrensweise:

1. Herstellen von 50 ml Mastermix (siehe 2 oben) von passenden Peptid/Protein-Kombinationen (Verwenden von 50 ml-Polypropylenröhrchen). Inkubieren für 1 Std. bei RT
2. Zugeben von 95 uL Mastermix zu jeder Vertiefung einer Platte** mit 96 Vertiefungen ** Reacti-Bind-Streptavidin-beschichtete, weiße Styroporplatten (#15118B), die von dem Super-Blocking-Reagens von Pierce blockiert wurden.
3. Übertragen von 5 uL jeder Testverbindung (Bestand = 60 uM) zu jeder Vertiefung der Platte
4. Inkubieren der Platte für 1 Std. bei RT
5. Herstellen einer Mischung aus Kaninchen-Anti-GST-Antikörper und Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper während des Inkubierens (siehe 3 oben). Inkubieren auf Eis für 1 Std.
6. Sorgfältiges Waschen der 3x-Platten mit H₂O
7. Zugeben von 100 uL der Antikörpermischung in jede Vertiefung der Platte
8. Inkubieren für 1 Std. bei RT
9. Waschen von 3X mit H₂O
10. Verdünnen des SuperSignal-Substrats (vermischtes Luminol und Peroxid) in 1:2 H₂O und dann Zugeben von 100 uL in jede Vertiefung
11. Schütteln für 3–5 Min. Lesen der Chemolumineszenz.

SEQUENCE LISTING

Claims

Ein Assayverfahren in vitro zum Charakterisieren eines Wirkstoffs als einen Modulator eines nukleären Hormonrezeptors, das die folgenden Schritte beinhaltet: Bilden einer Mischung in vitro, die einen ersten, gereinigten nukleären Hormonrezeptor, einen Sensor und einen Wirkstoffkandidaten, aber kein natürliches Koaktivatorprotein des Rezeptors beinhaltet, wobei der Sensor aus einem Peptid besteht, das die Sequenz L₁X₁X₂L₂L₃ (SEQ-ID-NR.: 18), die kovalent an eine direkt erkennbare fluoreszierende Markierung gekuppelt ist, beinhaltet, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden und X₁–X₂ unabhängig aus allen beliebigen Aminosäuren ausgewählt werden, und wobei das Peptid eine direkte, ligandenabhängige Bindung in vitro an den Rezeptor bereitstellt und seine Länge 24 oder weniger Reste beträgt, wobei die Konzentration des Sensors weniger als etwa 100 nM beträgt; Messen einer Assayfluoreszenzpolarisation des Sensors als ein Anzeichen der Sensorbindung an den Rezeptor in Gegenwart des Wirkstoffs; Vergleichen der Assayfluoreszenzpolarisation mit einer entsprechenden Kontrollfluoreszenzpolarisation, wobei die Kontrollfluoreszenzpolarisation ein Anzeichen der Sensorbindung an den Rezeptor in Abwesenheit des Wirkstoffs bereitstellt, und wobei eine größere Assayfluoreszenzpolarisation als Kontrollfluoreszenzpolarisation anzeigt, dass der Wirkstoff ein Modulator des Rezeptors ist.
Assayverfahren in vitro zum Charakterisieren eines Wirkstoffs als einen Modulator eines nukleären Hormonrezeptors, das die folgenden Schritte beinhaltet: Bilden einer Mischung in vitro, die einen ersten, gereinigten nukleären Hormonrezeptor, einen Sensor und einen Wirkstoffkandidaten, aber kein natürliches Koaktivatorprotein des ersten Rezeptors beinhaltet, wobei der Sensor aus einem Peptid besteht, das die Sequenz L₁X₁X₂L₂L₃ (SEQ-ID-NR.: 18), die kovalent an eine erkennbare Markierung gekuppelt ist, beinhaltet, wobei L₁–L₃ unabhängig aus hydrophoben Aminosäuren ausgewählt werden und X₁–X₂ unabhängig aus allen beliebigen Aminosäuren ausgewählt werden, und wobei das Peptid eine direkte, ligandenabhängige Bindung in vitro an den ersten Rezeptor bereitstellt und seine Länge 24 oder weniger Reste beträgt und unter Bedingungen, bei denen das Peptid des Sensors den ersten Rezeptor bindet, um einen Komplex aus dem ersten Rezeptor und dem Sensor zu bilden, und der Komplex auf eine feste Phase immobilisiert wird; Messen einer Assaybindung des Sensors an den ersten Rezeptor mittels wahlweisen Erkennens des Komplexes aus dem immobilisierten ersten Rezeptor und dem Sensor; und Vergleichen der Assaybindung mit einer entsprechenden Kontrollbindung, wobei die Kontrollbindung ein Anzeichen der Sensorbindung an den ersten Rezeptor in Abwesenheit des Wirkstoffs bereitstellt, und wobei eine größere Assaybindung als Kontrollbindung anzeigt, dass der Wirkstoff ein Modulator des ersten Rezeptors ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Messschritt das Erkennen des ersten Rezeptors der Komplexe aus dem immobilisierten ersten Rezeptor und dem Sensor beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung mittels eines zweiten, für die Markierung spezifischen Rezeptors immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung mittels eines zweiten, für die Markierung spezifischen Rezeptors immobilisiert wird, und wobei der Messschritt das Erkennen des immobilisierten ersten Rezeptors beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung mittels eines zweiten, für die Markierung spezifischen Rezeptors immobilisiert wird, und wobei der Messschritt das Erkennen des immobilisierten ersten Rezeptors mit einem dritten, für den ersten Rezeptor spezifischen Rezeptor beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Sensor eine Epitop-Markierung beinhaltet, und wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung mittels eines zweiten, für die Markierung spezifischen Rezeptors immobilisiert wird, der einen immobilisierten, für die Epitop-Markierung spezifischen Antikörperteil beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Sensor eine Biotin-Markierung beinhaltet, und wobei in dem Messschritt der erste Rezeptor durch den Sensor immobilisiert wird und der Sensor durch die Markierung mittels eines zweiten, für die Markierung spezifischen Rezeptors immobilisiert wird, der einen immobilisierten Avidinteil beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der Sensor durch den ersten Rezeptor immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der Sensor durch den ersten Rezeptor immobilisiert wird und der erste Rezeptor durch einen zweiten, für den ersten Rezeptor spezifischen Rezeptor immobilisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der Sensor durch den ersten Rezeptor immobilisiert wird und der erste Rezeptor durch einen zweiten, für den ersten Rezeptor spezifischen Rezeptor immobilisiert wird, und wobei der Messschritt das Erkennen des immobilisierten Sensors beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der Sensor durch den ersten Rezeptor immobilisiert wird und der erste Rezeptor durch einen zweiten, für den ersten Rezeptor spezifischen Rezeptor immobilisiert wird, und wobei der Messschritt das Erkennen des immobilisierten Sensors mit einem dritten, für die Markierung spezifischen Rezeptor beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei in dem Messschritt der Sensor durch den ersten Rezeptor immobilisiert wird und der erste Rezeptor durch einen zweiten, für den ersten Rezeptor spezifischen Rezeptor immobilisiert wird, der einen für den ersten Rezeptor spezifischen Antikörper beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der erste Rezeptor die Ligandenbindungsdomäne PPARγ, Cyp7PBP(LRH-1), NURR1, RZRβ, RORα, NOR-1, Rev-ErbAβ, Tlx, NGFI-Bβ, HZF2α, COUP-TFα,β,γ, Nur77, LXRα, COR, Rev-ErbAα, HNF4α, TOR, MB67α, SHP, FXR, SF-1, LXRβ, GCNF, TR2-11α,β, TR4, ERRα,β und DAX-1 beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid eine Sequenz beinhaltet, die aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht, ausgewählt wird: KLVQLLTTT (SEQ-ID-NR.: 1), ILHRLLQE (SEQ-ID-NR.: 2), LLRYLLDK (SEQ-ID-NR.: 3), LLRYLLD (SEQ-ID-NR.: 4), LRYLLD (SEQ-ID-NR.: 5), LLRYLL (SEQ-ID-NR.: 6), LRYLL (SEQ-ID-NR.: 7), LLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 8), QLLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 9), HQLLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 10), PQAQQKSLLQQLLT (SEQ-ID-NR.: 11), LLQQLLTE (SEQ-ID-NR.: 12), VTLLQLLLG (SEQ-ID-NR.: 13), ILRKLLQE (SEQ-ID-NR.: 14), ILKRLLQE (SEQ-ID-NR.: 15), ILRRLLQE (SEQ-ID-NR.: 16) und ILKKLLQE (SEQ-ID-NR.: 17).
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid aus einer Sequenz besteht, die aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht, ausgewählt wird: KLVQLLTTT (SEQ-ID-NR.: 1), ILHRLLQE (SEQ-ID-NR.: 2), LLRYLLDK (SEQ-ID-NR.: 3), LLRYLLD (SEQ-ID-NR.: 4), LRYLLD (SEQ-ID-NR.: 5), LLRYLL (SEQ-ID-NR.: 6), LRYLL (SEQ-ID-NR.: 7), LLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 8), QLLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 9), HQLLRYLLDKD (SEQ-ID-NR.: 10), PQAQQKSLLQQLLT (SEQ-ID-NR.: 11), LLQQLLTE (SEQ-ID-NR.: 12), VTLLQLLLG (SEQ-ID-NR.: 13), ILRKLLQE (SEQ-ID-NR.: 14), ILKRLLQE (SEQ-ID-NR.: 15), ILRRLLQE (SEQ-ID-NR.: 16) und ILKKLLQE (SEQ-ID-NR.: 17).
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Länge des Peptids 12 oder weniger Reste beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Markierung an den N-Terminus des Peptids gekuppelt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration des Sensors weniger als etwa 10 nM beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die indirekte Erkennung des Sensors gewährleistet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die indirekte Erkennung des Sensors gewährleistet, wobei die Markierung ein Epitop-Marker ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die direkte Erkennung des Sensors gewährleistet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die direkte Erkennung des Sensors gewährleistet, wobei die Markierung eine lumineszierende Markierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die direkte Erkennung des Sensors gewährleistet, wobei die Markierung eine lumineszierende Markierung ist, wobei die lumineszierende Markierung eine fluoreszierende Markierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Markierung die direkte Erkennung des Sensors gewährleistet, wobei die Markierung eine lumineszierende Markierung ist, wobei die lumineszierende Markierung eine fluoreszierende Markierung ist, wobei die fluoreszierende Markierung an den N-Terminus des Peptids gekuppelt ist.