DE60125783T2 - Verfahren zum nachweis von acetylase oder deacetylase-aktivität in einem immunoassay - Google Patents

Verfahren zum nachweis von acetylase oder deacetylase-aktivität in einem immunoassay Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Acetyltransferase- oder Deacetylase-Aktivität in einem Immunoassay.
  • In eukaryotischen Zellen finden zahlreiche post-translationale Modifizierungen von Proteinen statt, welche nach Ende der Proteinsynthese eingeführt werden. Bei der post-translationalen Modifizierung von Proteinen ist die Wirkung entsprechender Modifizierungsenzyme erforderlich. Es sind eine große Anzahl post-translationaler Modifizierungen bekannt, welche nach Ende der Proteinsynthese eingeführt werden.
  • Beispielsweise können spezielle chemische Gruppen an Aminosäuren in einem Protein addiert werden. Repräsentative Beispiele sind die Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Acylierung und Carboxylierung. Auch können spezielle chemische Gruppen von einem Protein durch Prozesse wie z.B. Deglykosylierung, Dephosphorylierung, Deacetylierung, Deacylierung und Decarboxylierung entfernt werden.
  • Ein Beispiel der Bedeutung enzymatischer Modifizierungen soll bezüglich Acetyltransferasen und Deacetylasen gegeben werden. Die Chromatinstruktur hat einen Einfluss auf zelluläre Schlüsselprozesse wie DNA-Replikation, Transkription, DNA-Reparatur und Differenzierung. Die Chromatinstruktur und die Bindung regulatorischer Proteine an DNA kann durch reversible Acetylierung der tertiären Aminogruppen konservierter Lysinreste an den N-terminalen Enden von Kern-Histonen modifiziert werden. Diese enzymatische Modifizierung wird durch Histon-Acetyltransferasen und Histon-Deacetylasen kontrolliert. Es mehren sich Beweisanzeichen, dass Inhibitoren der Histon-Deacetylase ein großes Potential bei der Krebstherapie aufweisen könnten (Nakayama, J., et al., Science, Bd. 292, 110–113, 2001; Darkin-Rattray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 93, 13142–13147, 1996; Kölle et al., Methods: A companion to methods in enzymology, Bd. 15, 323–331, 1998). Inhibitoren der Histon-Deacetylase haben aufgrund ihres Vermögens, die transkriptionale Regulation zu beeinflussen und Apoptose oder Differenzierung in Krebszellen zu induzieren, ein großes Potential als neue Arzneiwirkstoffe.
  • Bisher existieren keine Assay-Formate, um die Aktivität von Histon-Deacetylasen und potentiellen Modulatoren (d.h. Inhibitoren oder Aktivatoren) dieser Enzymaktivität zu messen, welche mit den Anforderungen an ein Hochdurchsatz-Screening, wie z.B. ein homogenes (d.h. "Mischen, Inkubieren und Ablesen") Assay-Format, hohe Sensitivität und kurze Messzeit, vereinbar sind.
  • A. L. Clayton et al. (The EMBO Journal, Bd. 19, 2000, S. 3714–3726) beschreiben die Phosphoacetylierung von Histon H3 auf c-fos- und c-jun-assoziierten Nukleosomen nach Genaktivierung. Die Anwendung von Hochdurchsatz-Screeningverfahren mit Fluoreszenzmessung wird insbesondere beschrieben von R. Seethala et al. (Analytical Biochemistry, Bd. 255, 1998, Seiten 257–262) und J. J. Wu (Journal of Biomolecular Screening, Bd. 5, 2000, Seiten 23–30) sowie in WO 99/29894.
  • Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich sein, dass es einen anhaltenden Bedarf für die Entwicklung von kosteneffektiven, leichten und sensitiven enzymatischen Assays für sowohl das Hochdurchsatz-Screening (HTS) potentieller Arzneiwirkstoffe als auch für sekundäre Assays gibt.
  • Somit bestand eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung in der Etablierung eines Assay-Verfahrens zum Nachweis der Aktivität von Acetyltransferasen und Deacetylasen. Die Assay-Verfahren sollten hoch verlässlich und einfach durchzuführen sein.
  • Die oben genannte Hauptaufgabe wurde mit dem Assay-Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Acetylierung oder Deacetylierung eines Substrats mittels Acetylase- bzw. Deacetylase-Enzymaktivität in einem Immunoassay, welches die folgenden Schritte umfasst
    • a) Bereitstellung eines Proteins, Peptids oder Derivats davon, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = eine Aminosäure, die von dem jeweiligen Enzym acetyliert oder deacetyliert werden soll, X = eine Sequenz von Aminosäuren, vorzugsweise von 0 bis 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = ein Unterscheidungs-Enhancer für die Bindung an einen Antikörper, wobei der Unterscheidungs-Enhancer eine phosphorylierte Aminosäure umfasst, als Substrat für das Enzym;
    • b) Inkubation des Proteins, Peptids oder Derivats davon mit dem Enzym, um ein Protein, Peptid oder Derivat davon zu bilden, welches an der Z-Position acetyliert bzw. deacetyliert ist;
    • c) Zugabe eines Antikörpers, welcher die modifizierte Z-Position von der unmodifizierten Z-Position des Proteins, Peptids oder Derivats davon unterscheidet, wobei die Unterscheidung durch die Anwesenheit des Enhancers vermittelt wird; und
    • d) Nachweis der Enzymaktivität unter Anwendung eines homogenen Fluoreszenzbindungsimmunoassays.
  • Bei dem Assay zum Nachweis von Acetylase/Deacetylase-Aktivität umfasst der Unterscheidungs-Enhancer eine phosphorylierte Aminosäure.
  • Manchmal werden die Begriffe "Unterscheidungs-Enhancer" oder "Enhancer" synonym für den Begriff "Affinitäts-Enhancer" verwendet werden.
  • Die weiteren Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • In einer Ausführungsform könnte das Substrat mit dem Enzym vor der Zugabe des Antikörpers kombiniert werden. Jedoch könnten alle Assay-Komponenten auch gleichzeitig kombiniert werden.
  • In dem Sequenzmotiv kann jede Aminosäure oder Sequenz von Aminosäuren (X) zwischen Z und Y inseriert sein. Die Anzahl der Aminosäuren liegt im Bereich von 0 bis 10 Aminosäuren. Ein Bereich von 0 bis 10 ist bevorzugt, um sowohl lineare Antikörperepitope als auch Konformations-Antikörperepitope einzuschließen. X ist insbesondere mindestens eine Aminosäure, irgendwelche anderen kurzen Aminosäuresequenzen mit mindestens zwei Aminosäuren, wie z.B. Oligopeptide, sind ebenfalls eingeschlossen.
  • Der verwendete Antikörper ist gewöhnlich ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Der zu verwendende Antikörper unterscheidet die modifizierte Z-Position von der unmodifizierten Z-Position des Substrats.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Unterscheidungsvermögen vermittelt durch die Anwesenheit eines Unterscheidungs-Enhancers in der Aminosäuresequenz des Substrats. Der Unterscheidungs-Enhancer Y, der in dem Sequenzmotiv enthalten ist, hat die Funktion, die Bindung eines Antikörpers, der im Schritt c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zugegeben wird, zu fördern und/oder zu intensivieren. Der Enhancer Y kann mindestens eine Aminosäure umfassen, welche durch ein Phosphat modifiziert oder substituiert ist.
  • In Abhängigkeit von der Enzymmodifizierungsreaktion, wie z.B. der enzymatischen Addition oder Eliminierung von Gruppen zu oder von dem Protein, Peptid oder Derivat davon, kann das Enzym derart sein, dass entweder die Addition oder die Eliminierung der chemischen Gruppe von dem Enzym Acetylase oder Deacetylase gefördert wird.
  • In dem Falle, dass das Protein, Peptid oder Derivat davon durch Addition von chemischen Gruppen an die Z-Position in dem Sequenzmotiv enzymmodifiziert ist, wird ein entsprechendes Co-Substrat in Schritt b) verwendet. Geeignete Co-Substrate umfassen eine Acetylgruppe.
  • Der Immunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung kann als direkter Immunoassay, vorzugsweise als homogener direkter Immunoassay durchgeführt werden.
  • Jeder homogene Assay basiert auf einem Prinzip von Mischen und Messen. Dies ist sehr vorteilhaft gegenüber den herkömmlichen Assays mit direkter Bindung, die immer komplizierte Trennungsschritte der Assaykomponenten vor dem Nachweis erfordern.
  • Bei dem Immunoassay mit direkter Bindung wird typischerweise entweder ein nachweisbares Peptid/Protein/Derivat davon oder ein nachweisbarer Antikörper verwendet. Gewöhnlich findet der Nachweis durch optische Verfahren statt und irgendeine vorherige Markierung des Peptids etc. oder des Antikörpers kann nach herkömmlichen Standardverfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise werden das Peptid/Protein/Derivat davon und/oder der Antikörper durch Verwendung einer Lumineszenzmarkierung oder durch Verwendung spezifischer Markierungsmoleküle, wie z.B. ein Reporter-Enzym oder ein Affinitätsligand, markiert.
  • In 1 ist eine schematische Zeichnung einer Ausführungsform des direkten Assays der vorliegenden Erfindung gezeigt. Ein markiertes modifiziertes Protein/Peptid-Substrat trägt zwei chemische Gruppen (CG) auf zwei Aminosäuren (AS) in der Z- und Y-Position. Durch die Wirkung eines Enzyms wird eine der chemischen Gruppen abgespalten. Folglich bindet das markierte modifizierte Substrat nicht länger an den spezifischen Antikörper.
  • Der Assay gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch als Konkurrenz-Immunoassay, vorzugsweise als ein homogener Assay mit indirekter Bindung, durchgeführt werden. Ein homogener indirekter Bindungsassay basiert ebenfalls auf dem Misch- und Mess-Prinzip. Bei diesem Assay mit indirekter Bindung wird ein nachweisbarer Ligand zugegeben, um entweder mit der modifizierten oder unmodifizierten Form des Peptids/Proteins/Derivats um die Bindung an einen Antikörper zu konkurrieren. Der Ligand wird vorzugsweise durch Verwendung einer Lumineszenzmarkierung oder durch Verwendung spezifischer Markie rungsmoleküle, wie z.B. ein Reporter-Enzym oder ein Affinitätsligand, optisch nachweisbar gemacht oder markiert.
  • 2 zeigt eine schematische Zeichnung einer Ausführungsform des indirekten Assays der Erfindung. In einem ersten Schritt wird ein modifiziertes Peptid/Protein/Substrat mit zwei chemischen Gruppen (CG) auf zwei Aminosäuren (AS) in der Z- und Y-Position der Wirkung eines Enzyms unterworfen, wodurch folglich eine der chemischen Gruppen verloren geht. Das Produkt der Reaktion konkurriert nicht länger mit dem Liganden um die Bindung an den spezifischen Antikörper.
  • Der Assay der vorliegenden Erfindung kann als Fluoreszenzimmunoassay durchgeführt werden. Insbesondere sind Fluoreszenzimmunoassays wie ein Fluoreszenzpolarisations (FP)-Immunoassay (FP), ein Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)-Assay, ein Fluoreszenzlebensdauer (FL)-Assay oder ein Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA)-Assay zu nennen.
  • Wie im Folgenden auch detaillierter ausgeführt werden wird, betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Acetylase- oder Deacetylase-Aktivität. Deshalb wird auch ein spezieller Kit zur Durchführung der entsprechenden Assays verwendet. Ein solcher Kit umfasst die folgenden Komponenten:
    • (i) ein Substrat, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = eine Aminosäure, die von dem jeweiligen Enzym acetyliert oder deacetyliert werden soll, X = eine Sequenz von Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 0 und 10 Aminosäuren, welche gleich oder verschieden sein können, Y = ein Unterscheidungs-Enhancer für die Bindung an einen Antikörper, wobei der Unterscheidungs-Enhancer eine phosphorylierte Aminosäure umfasst; und
    • (ii) einen Antikörper, der die modifizierte Z-Position von unmodifizierten Z-Position des Substrats unterscheidet, wobei die Unterscheidung durch die Anwesenheit des Unterscheidungs-Enhancers vermittelt wird.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sowie die Kits können zum Screening von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) hinsichtlich Enzymaktivität verwendet werden. Solche Modulatoren können eine Schlüsselrolle im Metabolismus von Tieren, einschließlich Menschen, spielen. Sie werden als äußerst nützlich für die Behandlung von Krankheiten, wie z.B. Stoffwechselstörungen und Krebs, betrachtet.
  • Die Begleitzeichnungen illustrieren die vorliegende Erfindung. In den Figuren ist folgendes gezeigt:
  • 1 ist eine schematische Zeichnung des Prinzips des direkten Assays der vorliegenden Erfindung.
  • 2 ist eine schematische Zeichnung des Prinzips des indirekten Assays der vorliegenden Erfindung.
  • 3 ist eine schematische Zeichnung, welche die Bindung eines ac(K9)-p(S10)-spezifischen Antikörpers von New England Biolabs (# 9711) an doppelt-modifiziertes ac(K9)p(s10)-H3-Peptid #10 zeigt; als Kontrolle wird nur niedrige Bindung für einfach-modifiziertes ac(K9)-H3-Peptid #12 und p(S10)-H3-Peptid #13 gemessen.
  • 4 ist eine schematische Zeichnung, welche die Bindung eines ac(K9)-p(S10)-spezifischen Antikörpers von New England Biolabs (# 9711) an doppelt-modifiziertes ac(K9)p(S10)-H3-Peptid #10 zeigt; als Kontrolle wird nur niedrige Bindung für das doppelt-modifizierte p(S10)ac(K14)-H3-Peptid #11 gemessen.
  • 5 ist eine schematische Zeichnung, welche die Bindung eines p(S10)-ac(K14)-spezifischen Antikörpers von Upstate Biotech (# 07-081) an doppelt-modifiziertes p(S10)ac(K14)-H3-Peptid #11 zeigt; als Kontrolle wird nur niedrige Bindung für doppelt-modifiziertes ac(K9)p(S10)-H3-Peptid #10 gemessen.
  • Die folgenden Experimente erläutern die vorliegende Erfindung näher.
  • BEISPIEL 1
  • Acetylierung von Lysinen in Proteinen
  • Der Histon-Deacetylase-Assay verwendet fluoreszenzmarkierte Peptide (TAMRA-Farbstoff als Markierung), die von der Histon-H3-Sequenz abgeleitet sind. Bei dem Assay werden zwei verschiedene polyklonale Antikörper verwendet, welche spezifisch an acetylierte Lysinreste (ac(K) an den Positionen ac(K9) oder ac(K10)) binden. Die Acetylierung eines einzigen Lysins führt zu einer relativ kleinen Änderung der Molekularstruktur der Aminosäureseitenkette. Die resultierende Veränderung in der Bindungsaffinität an Acetyl-spezifische Antikörper ist im Allgemeinen in einem homogenen Bindungsassay schwierig nachzuweisen. Erfindungsgemäß wurde deshalb eine zusätzliche Modifizierung (Phosphorylierung von Serin an Position (S10)) in der H3-Peptid-Sequenz eingeschlossen, um die Affinität der Peptide für die eingesetzten Antikörper zu erhöhen. Aus den Ergebnissen dreier unabhängiger Bindungsexperimente (3 bis 5) ist ersichtlich, dass doppelt-modifizierte Peptidkonjugate eine höhere Affinität für die eingesetzten Antikörper im Vergleich zu einfach-modifizierten Peptidkonjugaten verleihen. Dieses Charakteristikum ist von großem Wert zur Messung der unterschiedlichen Acetylierungszustände von Lysinresten unter Verwendung von Acetyl-spezifischen Antikörpern. Im Prinzip kann der beschriebene Bindungsassay für den Nachweis der Anwesenheit von sowohl Acetyltransferase- als auch Deacetylase-Aktivität, insbesondere Histon-Acetyltransferase/Deacetylase, eingesetzt werden.
  • Reagenzien und Puffer
  • Fluoreszierende TAMRA-Peptidkonjugate:
  • Alle fluoreszierenden Peptide wurden von Evotec Biosystems AG bezogen. Aminosäuren sind im einbuchstabigen Code angegeben. Ac bedeutet acetyliert, p bedeutet phosphoryliert.
    • ac(K9)p(S10)-H3-Peptid #10:
    • TAMRA-A-R-ac(K9)-p(S10)-T-T-G-K-A-P
    • p(S10)ac(K14)-H3-Peptid #11:
    • TAMRA-A-R-K-p(S10)-T-T-G-ac(K14)-A-P
    • ac(K9)-H3-Peptid #12:
    • TAMRA-A-R-ac(K9)-S-T-T-G-K-A
    • p(S10)-H3-Peptid #13:
    • TAMRA-A-R-K-p(S10)-T-T-G-K-A
  • Antikörper:
    • 1. Polyklonaler ac(K9)-p(S10)-spezifischer Antikörper von New England Biolabs, U.S.A. (# 9711)
    • 2. Polyklonaler p(S10)-ac(K14)-spezifischer Antikörper von Upstate Biotech, U.S.A. (# 07-081).
  • Assaypuffer
    • 10 × HEPES-Assay-Puffer, pH 7,5
    • 500 mM HEPES
    • 1 mM EGTA
    • 100 mM DTT
    • 62,5 mM NaCl
  • Auflösen von 770 mg DTT (FLUKA, Katalog Nr. 43815; MG 154,25 g/mol) [Endkonzentration 100 mM] in 30 ml Millipore-Wasser, Zugabe von 625 μl 5 M NaCl [Endkonzentration 62,5 mM], 19,02 mg EGTA (Merck Kat. Nr. 1.06404; MG 380,35 g/mol [Endkonzentration 1 mM] und 5,96 g HEPES (FLUKA Katalog Nr. 54457) [Endkonzentration 500 mM] und Einstellen des pH-Werts mit 1 M NaOH auf pH 7,5. Auffüllen auf 50 ml mit Millipore-Wasser. Der Puffer wird steril filtriert (0,22 μm) und auf 1,5 ml aliquotiert werden und sollte bei –20°C gelagert werden.
  • 1M MgCl2:
  • Auflösen von 10,2 g MgCl2 × 6 H2O (FLUKA Katalog Nr. 63068) in 50 ml Millipore-Wasser. Der Puffer sollte filtriert werden (0,42 um) und kann bei 4°C mehrere Monate lang gelagert werden.
  • 1%iges (Gew./Vol.) Pluronic F-127
  • Auflösen von 0,5 g Pluronic (Sigma, Katalog Nr. P-2443) in 50 ml Millipore-Wasser. Vorsichtiges Rühren, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung sollte filtriert (0,42 μm) werden und kann bei 4°C mehrere Monate lang gelagert werden.
  • 1 × HEPES-Assay-Puffer/0,1 % Pluronic, pH 7, 5: (15 ml):
    • 50 mM HEPES
    • 0,1 mM EGTA
    • 10 mM DTT
    • 0,1 % Pluronic
  • Zugabe von 1,5 ml 1%igem (Gew./Vol.) Pluronic F-127 in Wasser und 1,5 ml 10 × HEPES-Assay-Puffer, pH 7,5, auf 12 ml Millipore-Wasser. Rühren der Mischung und Überprüfen des pH-Werts. Die Mischung konnte bei 4°C 1–2 Wochen lang gelagert werden.
  • 0,5 M EDTA (50 ml)
  • Auflösen von 9,309 g EDTA (Roche Molecular Biochemicals, Katalog Nr. 808288) in 40 ml Millipore-Wasser und Einstellen des pH-Werts auf 8–9 mit 10 M NaOH, um eine klare Lösung zu erhalten. Auffüllen auf 50 ml mit Millipore-Wasser. Der Puffer sollte filtriert (0,42 μm) werden und kann mehrere Monate lang bei 4°C gelagert werden.
  • 10 mM ATP (15 ml)
  • Auflösen von 9,1 mg ATP (Roche Molecular Biochemicals, Katalog Nr. 126888) in 1,5 ml 1 × HEPES-Assay-Puffer/0,1 % Pluronic, pH 7,5. Die Lösung sollte filtriert werden (0,42 μm) und kann 2 Wochen lang bei –20°C gelagert werden.
  • DMSO: 100%iges DMSO
  • Das Lösungsmittel wurde von SIGMA (Katalog Nr. P-2650) bezogen und steril filtriert.

Claims (10)

  1. Verfahren zum Nachweis von Acetylase- bzw. Deacetylase-Enzymaktivität, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Proteins, Peptids oder Derivats davon, umfassend das Sequenzmotiv -Z-X-Y- oder -Y-X-Z- worin Z = eine Aminosäure, die von dem jeweiligen Enzym acetyliert oder deacetyliert werden soll, X = eine Sequenz von Aminosäuren im Bereich von 0 bis 10 Aminosäuren, Y = ein Unterscheidungs-Enhancer für die Bindung an einen Antikörper, wobei der Unterscheidungs-Enhancer eine phosphorylierte Aminosäure umfasst, als Substrat für das Enzym; b) Inkubation des Proteins, Peptids oder Derivats davon mit dem Enzym, um ein Protein, Peptid oder Derivat davon zu bilden, welches an der Z-Position acetyliert bzw. deacetyliert ist; c) Zugabe eines Antikörpers, welcher die modifizierte Z-Position von der unmodifizierten Z-Position des Proteins, Peptids oder Derivats davon unterscheidet, wobei die Unterscheidung durch die Anwesenheit des Enhancers vermittelt wird; und d) Nachweis der Enzymaktivität unter Anwendung eines homogenen Fluoreszenzbindungsimmunoassays.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fluoreszenzimmunoassay ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay, ein Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Assay, ein Fluoreszenzlebensdauer-Assay, ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Assay oder ein Fluoreszenzintensitätsverteilungs-Assay ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei X = 1.
  4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Immunoassay als homogener Immunoassay mit direkter Bindung durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein nachweisbares Protein, Peptid oder Derivat davon verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein nachweisbarer Antikörper verwendet wird.
  7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Immunoassay als homogener Immunoassay mit indirekter Bindung durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein nachweisbarer Ligand zugegeben wird, um entweder mit dem modifizierten oder unmodifizierten Peptid, Protein oder Derivat davon um die Bindung an den Antikörper zu konkurrieren.
  9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Verfahrensschritte sequenziell oder mindestens teilweise gleichzeitig durchgeführt werden.
  10. Verwendung des Assayverfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Screenen hinsichtlich Modulatoren von Enzymaktivität.
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