AT502126A1 - Enzym array - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Proteinanordnung, die eine Lipase oder eine Esterase umfasst, sowie auf Verwendungen dieser Anordnung.

Das aufstrebende Gebiet der Protein-Mikroanordnungs-Techno-logie hat für den Nachweis von DNA-Protein-, Protein-Protein-und Kleinmolekül-Protein-Interaktionen mehrere Lösungen geliefert [1-3]. Insbesondere der Nachweis von Protein-Protein- (sowie von Peptid-Protein-) und Kleinmolekül-Protein-Interaktionen wird immer wichtiger, hauptsächlich deshalb, weil eine große Notwendigkeit besteht, neuartige therapeutische Substanzen zu identifizieren. Die Mikroanordnungs-Technologie kann die Technologie der Wahl sein, um dieses Ziel zu erreichen, da sie es ermöglicht, zahlreiche Interaktionen zwischen einer Vielzahl von Molekülen und einer Vielzahl von Proteinen schnell und genau nachzuweisen (insbesondere bei der Verwendung in Screenings mit hohem Durchsatz). Ein weiterer Vorteil dieser Technologie besteht darin, dass nur geringe Mengen Protein und Moleküle verwendet werden müssen. Dies ist für jene Untersuchungen wichtig, wo die Bindungspartner nicht in großen Mengen zur Verfügung stehen. Besonders interessant ist der Nachweis von Interaktionen zwischen kleinen Molekülen und Enzymen, da viele bekannte Enzyme an entscheidenden biochemischen Abläufen beteiligt sind und von ihnen bekannt ist, dass sie bei verschiedenen Erkrankungen eine Schlüsselrolle spielen.

Da zahlreiche interessante Proteine enzymatische Aktivität aufweisen, ist man immer mehr bemüht, auf der Aktivität basierende Interaktionen von Proteinen und ihren Substraten, Pseudosubstraten und Inhibitoren auf Mikroanordnungs-Chips nachzuweisen. Im Prinzip gibt es zwei Hauptstrategien, um diese Interaktionen nachzuweisen: 1. Die Proteine/Enzyme werden auf einer Mikroanordnung immobilisiert, und die Anordnung wird einer Reihe von verschiedenen Molekülen ausgesetzt; 2. die Moleküle werden auf einer Anordnung immobilisiert, und diese Anordnung wird Pro-teinen/Enzymen ausgesetzt. Es ist jedoch zu beachten, dass die Zugänglichkeit der aktiven Stelle für potentielle Bindungspartner sowie die katalytische Aktivität des Proteins/Enzyms nicht beeinflusst werden, wenn die Proteine/Enzyme auf einem festen Träger immobilisiert werden. Weiters muss man bei der Immobili-

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Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Immobilisierung von Proteinen auf festen Trägern nicht so einfach ist, da viele Immobilisierungsverfahren zu inaktiven immobilisierten Proteinen führen, die in der Folge nicht für Bindungsstudien verwendet werden können. Dieses Problem ist insbesondere für Lipasen und Esterasen bekannt [6].

Ein Screening lipolytischer Enzyme auf Chip-Basis wäre nützlich, da diese Proteine eine Schlüsselrolle im Lipidstoffwechsel und der Energie-Homöostase spielen. Sie sind auch wichtige Biokatalysatoren in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Ein funktionelles Screening und eine Charakterisierung sind daher für ein besseres Verständnis dieser potentiellen Medikamen-ten-Ziele, die mit Lipid-assoziierten Erkrankungen wie Fettleibigkeit, Atherosklerose oder Schlaganfall in Zusammenhang stehen, von wesentlicher Bedeutung.

Die Bedeutung von Lipasen und Esterasen bei zahlreichen Erkrankungen zeigt die Notwendigkeit auf, auf diesem Gebiet Bio-chips/Mikroanordnungen zu haben, an die diese Enzyme gebunden sind. Solche Chips würden es zum Beispiel einem Fachmann ermöglichen, nach Inhibitoren oder anderen Bindungspartnern für diese Enzyme zu screenen. Bis heute ist jedoch im Stand der Technik kein Mikroanordnungs-Chip erhältlich, der eine Lipase oder Esterase umfasst. Chen et al. berichteten zum Beispiel, dass hydrolytische Enzyme auf Epoxid-aktivierten Südes in aktiver Form gehalten werden können. Der von dieser Arbeitsgruppe gewählte Ansatz war jedoch nur dann erfolgreich, wenn es sich bei den Enzymen um Proteasen handelte, funktionierte aber nicht mit Lipasen [6].

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Protein-Anordnung zur Verfügung zu stellen, die katalytisch aktive Lipasen/Esterasen umfasst, welche zum Nachweis der Interaktionen zwischen diesen Enzymen und Kleinmolekülen verwendet werden kann.

Dieses Ziel wird von einer Protein-Anordnung erreicht, die zumindest ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nachgerbcht - 3 -

Lipase und Esterase, auf einem festen Träger umfasst, wobei die Enzyme auf diesem festen Träger zumindest teilweise mit einer Hydrogel-Matrix bedeckt sind. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass eine Hydrogel-Matrix erfolgreich eingesetzt werden kann, um eine Anordnung von an einen festen Träger gebundenen Lipasen und Esterasen zu bedecken, ohne deren katalytische Aktivität zu beeinträchtigen.

Mit der vorliegenden Erfindung können alle bekannten Lipasen und Esterasen katalytisch aktiv an einem eine Hydrogel-Matrix umfassenden festen Träger immobilisiert werden. Die Lipasen und Esterasen können aus natürlichen Quellen isoliert oder rekombi-nant hergestellt sein. Weiters ist es ebenfalls möglich, Fusionsproteine (z.B. ein Lipase/Esterase-Teil und ein oder mehrere andere Protein/Peptid-Teile, wie Streptavidin, Fc-Regionen von Antikörpern) oder chemisch modifizierte Proteine zu verwenden.

Die Enzyme können direkt über funktionelle Gruppen oder indirekt über an Linker, die an diese Oberfläche gebunden sind, gebundene funktionelle Gruppen auf der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert sein. Weiters können die Enzyme auch an dem auf dem festen Träger vorhandenen Hydrogel immobilisiert sein.

Obwohl die vorliegende Erfindung für alle Esterasen und Lipasen verwendet werden kann, sind die in einer erfindungsgemäßen Anordnung vorzugsweise verwendeten Enzyme jene Lipasen und Esterasen, die in industriellem Maßstab verwendet werden oder die für medizinische Diagnosen von Interesse sind, insbesondere z.B. Adipose-Triglycerid-Lipase (ATGL), Hormon-sensitive Lipase (HSL), Monoglycerid-Lipase (MGL), hepatische Lipase (HL), Lipoproteinlipase (LPL), Endothel-Lipase (EL), Pankreas-Lipase (PALI) und Cholesterin-Esterase (CE).

Gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Ausdrücke „Anordnung" bzw. „Array" und „Mikroanordnung" bzw. „Mikroarray" auf eine Anordnung von Elementen, insbesondere von Proteinen/En-zymen wie Lipasen und Esterasen, die auf einem festen Träger vorhanden ist. Wenn es sich bei den Elementen einer Anordnung um Proteine handelt, wird eine solche Anordnung als „Protein-Anordnung" bezeichnet. Auf einem festen Träger vorhandene Anordnungen oder Mikroanordnungen können auch als „Chip" oder „Biochip" bezeichnet werden. Eine Anordnung von Proteinen/Enzymen kann auf NACHGEREICHT ! ........—1

·· ·· ···· - 4 - einem solchen Biochip in geringer Dichte (z.B. 2 bis 50 Spots pro cm2) oder in hoher Dichte (z.B. 50 bis 500 und sogar mehr Spots pro cm2) angelegt sein. Der erfindungsgemäße Biochip hat typischerweise eine geometrisch regelmäßige Form, was eine erleichterte Herstellung, Handhabung, Platzierung, Reagenseinführung, Nachweis und Lagerung ermöglicht. Natürlich kann er auch unregelmäßig geformt sein. Eine Anordnung ist vorzugsweise in Form von Reihen und Spalten konfiguriert, mit einem definierten Abstand zwischen den einzelnen Anordnungs-Elementen. Eine derartige Anordnung ermöglicht eine leichtere Handhabung, besonders in Anwendungen mit hohem Durchsatz, insbesondere wenn die Abgabe, die Maskierung oder die Probennahme der Reagenzien durch einen Roboter erfolgt. Weiters kann eine gut konfigurierte Anordnung auch den Nachweis oder die Quantifizierung erleichtern, z.B. durch Scannen mittels Laser-Beleuchtung, Erfassung von konfokalem oder abgelenktem Licht, CCD-Nachweis und chemischer Lumineszenz.

Der Ausdruck „fester Träger", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jeglichen festen Träger, der für die Erfindung verwendet werden kann, und umfasst oder besteht aus z.B. Glas, Siliziumdioxid, modifiziertem Silizium, Keramik, Plastik, Zr02, Gold oder jeder Art von geeignetem Polymer, wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinyli-dendifluorid und Polyacrylamid, sowie Copolymeren und Pfropfprodukten davon. Ein bevorzugter fester erfindungsgemäßer Träger ist Glas. Der feste Träger kann jegliche Form oder Größe haben und kann als separate Einheit oder als integrativer Bestandteil jeglicher Apparatur (z.B. Kügelchen, Küvette, Platte, Gefäß u. ä.) vorliegen. Weiters wird angenommen, dass eine geeignete Behandlung des festen Trägers (z.B. Glas) vorgenommen wird, um eine Haftung von Polyacrylamid am Glas zu gewährleisten, z.B. mit gamma-Methacryl-oxypropyl-trimethoxysilan („Bind Silane", Pharmacia) oder anderen geeigneten Mitteln in Fällen, wo das Hydrogel auf einem festen Träger vorhanden ist. Insbesondere kann eine kovalente Bindung des Polyacrylamid-Hydrogels am festen Träger vorgenommen werden, wie in EP 0 226 470 beschrieben ist. Der feste Träger umfasst oder besteht vorzugsweise aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nylon,

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Polystyrol, Glas, Latex, aktivierter Zellulose, Glas, Silizium-dioxid, modifiziertem Silizium, Keramik, Plastik, Zr02, Gold, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinylidendifluorid, Polyacrylamid und Kombinationen davon. Weiters ist der feste Träger vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Kügelchen, Membran, Mikrovertiefung, Zentrifugenröhre, Slide und Sensorspitze. Vorzugsweise kann der feste Träger mit einem Haftvermittler behandelt werden, um zum Beispiel Amingruppen an seine Oberfläche zu heften, und die auf dem festen Träger vorhandene reaktive Stelle wird durch die Amingruppen an den festen Träger angelagert. Weiters kann die Oberfläche des festen Trägers funktionalisiert werden, um die Immobilisierung jeglicher chemischer Substanzen, besonders von Biomolekülen, insbesondere Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Nukleinsäuren und Ähnlichen, entweder direkt oder indirekt zu ermöglichen.

Erfindungsgemäß wird der feste Träger mit den Enzymen Lipa-se/Esterase zum Teil („zumindest teilweise") oder ganz von einer Hydrogel-Matrix bedeckt. Eine teilweise Bedeckung des festen Trägers ermöglicht die Schaffung von Zonen mit verschiedenen Eigenschaften auf diesem Träger. Zum Beispiel kann ein Biochip Zonen mit einer Hydrogel-Matrix und Zonen mit anderen Oberflächeneigenschaften haben, was die Immobilisierung anderer Moleküle auf dem selben Chip ermöglicht. Die teilweise Bedeckung des festen Trägers kann zur Bildung von zweidimensionalen oder dreidimensionalen Strukturen aus dem auf einem festen Träger vorhandenen Hydrogel (wie Polyacrylamid) führen. Diese „Hydrogelstrukturen" können aus jeglicher Variation von Polymer bestehen (z.B. Polyacrylamid oder ein anderes Polymer, das mit einem geeigneten Teil funktionalisiert, aktiviert, modifiziert oder anders kombiniert ist), wie im Stand der Technik bekannt ist. Daher kann der feste Träger eine „Hydrogel-Anordnung" sein, die eine Kombination von mindestens zwei dieser Strukturen aufweist. Vorzugsweise besteht eine Anordnung aus Hydrogel-Strukturen in adressierbaren Reihen und Spalten. Auch die Dicke und die Abmessungen der erfindungsgemäß hergestellten Polymer-Hydrogel- und/oder Hydrogel-Anordnungen können je nach den besonderen Bedürfnissen des Benutzers variieren. Die Hydrogel-Strukturen können jedoch eine NACHGEREICHT [ ·« ♦ ·· ·· ···· · • · ♦· · ·· · · ·· ······· · · • · ·#··· · · - 6 -

Dicke von weniger als ca. 50 μιη haben. Weiters kann jede Hydrogel-Struktur in einer Anordnung eine Größe von ca. 5 bis ca. 1000 μπι haben.

Der Ausdruck „Hydrogel-Matrix" bezieht sich auf alle Hydrogel-Matrices, die im Stand der Technik für ähnliche Zwecke (Immobilisierung von Proteinen) üblicherweise verwendet werden und einem Fachmann bekannt sind. Hydrogele werden allgemein als polymere Materialien definiert, die in Wasser und anderen Flüssigkeiten quellen, wobei sie die Flüssigkeit im Polymernetz absorbieren, ohne sich aufzulösen. Hydrophile Hydrogele weisen einen großen Wassergehalt im Gleichgewicht und eine gute Biokompatibilität auf. Weiters können Hydrogele auf bestimmte Ana-lyten, wie Proteine, Nukleinsäuren und Ähnliches, sensibilisiert werden. Hydrogele werden passenderweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet, weil sie eine adäquate Porengröße und einen hohen Wassergehalt haben, um die Diffusion von Molekülen in die und aus der Matrix zu ermöglichen, an die Oberfläche eines Substrates wie Glas binden können, in ihrem vollständig polymerisierten Zustand ausreichend transparent sind, um optische Interferenzen mit fluoreszierenden Tags zu reduzieren, und eine ausreichende strukturelle Integrität aufweisen, wenn sie vollständig polymerisiert sind, um den bei der Verwendung wirkenden Kräften zu widerstehen. Außerdem ist das gewählte Gel vorzugsweise leicht herzustellen und zu verwenden.

Vorzugsweise ist ein „Hydrogel" zur Verwendung in der Erfindung als Hydrogel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyamid, Polyacrylamid, Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polymethylacrylat, Polystyrol und Copolymeren von Polystyrol, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyethylenoxid, Polyurethan und Polyvinylpyrrolidon. Vorzugsweise ist das Polymer Polyacrylamid. Die Herstellung einer Hydrogel-Anordnung (z.B. einer Poly-acrylamid-Hydrogel-Anordnung) umfasst vorzugsweise zusätzliche Schritte, gegebenenfalls die Entwicklung des Musters in der Anordnung, und weiters optimal die selektive Entfernung von nicht-vernetztem Polymer in wässeriger Lösung (z.B. Wasser), um die Hydrogel-Anordnung, vorzugsweise die Polyacrylamid-Hydrogel-An-ordnung, herzustellen. Es ist wünschenswert, dass die Musterentwicklung durch Belichtung des reaktiven Präpolymers (z.B. eines

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Polyacrylamid-reaktiven Präpolymers) durch eine Photomaske erfolgt. Die bei der vorliegenden Erfindung vorzugsweise verwendeten Hydrogel-Matrices haben im Gleichgewicht einen Wassergehalt zwischen 85% und 99%, vorzugsweise zwischen 90% und 98%, insbesondere zwischen 95% und 97%. Eine weitere wichtige Eigenschaft von Hydrogelen ist die Quellfähigkeit, da sie den maximalen Wassergehalt widerspiegelt. Je höher der Wassergehalt des polymerisierten Gels ist, desto schneller ist im Allgemeinen die Diffusion von Molekülen in das und aus dem Gel. Die Hybridisierungsreaktionen von DNA-Molekülen in einem Hydrogel sind zum Beispiel umso effizienter, je mehr Wassermoleküle in diesem Hydrogel vorhanden sind (Davis B. K., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21:3120, 1974) .

Die zur Bedeckung eines festen Trägers vorzugsweise verwendeten Hydrogele sind Gelatine-Hydrogele (z.B. US 6,815,078), Dextran-Hydrogel (z.B. US 5,242,828), Polyacrylamid (z.B. WO 03/014392, US 6,664,061) und Polyurethan (z.B. US 6,174,683).

In der WO 98/29736 ist eine Antikörper-Mikroanordnung geof-fenbart, wobei der Antikörper auf einem mit N-Hydroxysuccinimi-dylester modifizierten Glassubstrat immobilisiert ist.

In der US 5,981,734 und der WO 95/04594 wird eine Hydrogel-Substrat-Technologie auf Polyacrylamid-Basis zur Herstellung von DNA-Mikroanordnungen beschrieben. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass diese Hydrogel-Technologie weiters auch als Substrat für die Immobilisierung von Proteinen bei der Herstellung von Protein-Mikroanordnungen nützlich ist (Arenkov P. et al., Anal. Biochem. (2000), 278:123-131).

Daher umfasst die Hydrogel-Matrix vorzugsweise Dextran, Gelatine, Polyurethan, Polyacrylamid, Polyamid, Polyacrylamid, Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polymethylacrylat, Polystyrol und Copolymere von Polystyrol, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyethylenoxid, Polyvinylpyrrolidon oder Kombinationen davon.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Hydrogel-Matrix eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccin-imid, Streptavidin, Biotin, Antikörpern, Oligonukleotiden, Oli-godesoxynukleotiden und Kombinationen davon.

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Einer der Schlüsselpunkte bei der Protein-Mikroanordnung ist die Fähigkeit, Proteine in ihrer nativen Konformation auf einem festen Träger zu immobilisieren und dabei ihre Aktivitäten für funktionelle Studien zu erhalten. Es sind mehrere Ansätze entwickelt worden, um Proteine sowie auch andere Biomoleküle unter Verwendung von entweder kovalenten Bindungen oder nicht-kovalenter Affinitätsbindungschemie zu immobilisieren (Protein Microar-ray Technology, Ed. Dev Kambhampati, Wiley-VCH, Weinheim, 2004).

Um Moleküle an der Hydrogel-Matrix zu immobilisieren, kann diese Matrix daher funktionelle Gruppen (Modifikationen) umfassen. Diese funktionellen Gruppen sind für die Bindung der Enzyme an das Hydrogel und in der Folge an den festen Träger verantwortlich. Zum Beispiel kann Biotin verwendet werden, um Enzyme zu immobilisieren, die einen Streptavidin-Teil umfassen, was zu einer nicht-kovalenten Bindung führt. Im Gegensatz dazu kann N-Hydroxysuccinimid verwendet werden, um ein Enzym kovalent an das Hydrogel zu binden. Ein Antikörper, der mit dem Hydrogel konjugiert ist, um das zumindest eine Enzym zu immobilisieren, ist vorzugsweise gegen das Enzym selbst (vorzugsweise nicht auf die aktive Stelle des Enzyms) oder gegen einen Enzymteil gerichtet, der mit diesem Enzym konjugiert oder rekombinant fusioniert ist.

Das zumindest eine Enzym ist vorzugsweise mit Streptavidin, Biotin, Antikörpern, Oligonukleotiden, Oligodesoxynukleotiden oder Kombinationen davon konjugiert.

Die Bindung der Lipase/Esterase an das Hydrogel kann durch eine chemische Reaktion oder durch Konjugation eines Hydrogelspezifischen Liganden oder Bindungspartners mit diesen Enzymen erreicht werden. Spezifische Bindungspartner oder Liganden können vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid, Streptavidin, Biotin, Antikörper, Oligonukleotide und Oligodesoxynukleotide sein. Die Konjugation dieser Moleküle mit den Enzymen kann chemisch oder durch rekombinante Technologien erreicht werden. Rekombinante Technologien werden vorteilhafterweise verwendet, da es derartige Techniken ermöglichen, einen Ligandpartner in Bezug auf das Enzym exakt zu positionieren, wodurch vermieden wird, dass die katalytische Aktivität des Enzyms negativ beeinflusst wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung, umfassend zumindest eine an eine Oberfläche 1 NACHGEREICHT \ «· · ·· ·· ···· · ········ ··· ······· · · • · ····· · · • · ······· · ·· ··· ·· ·· ·« ··· - 9 - eines festen Trägers gebundende Verbindung, die zumindest ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase inhibiert oder potentiell inhibiert, wobei die Verbindung ein Ester ist, vorzugsweise ein p-Nitrophenylphosphonsäureester.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können nicht nur Lipasen und Esterasen an einen festen Träger gebunden sein, sondern auch Verbindungen, die an diese Enzyme binden oder potentiell an diese binden und diese daher inhibieren. Diese Verbindungen sind vorzugsweise mit Biotin konjugiert (gekoppelt), so dass die Bindung an einen geeigneten festen Träger ermöglicht wird. Da fluoreszierend markierte p-Nitrophenylphosphonsäureester hervorragende Aktivitätserkennungssonden („activity recognition probes", ARPs) für die qualitative und quantitative Bestimmung von Lipasen und Esterasen sind, sind die zu testenden Verbindungen vorzugsweise p-Nitrophenylphosphonsäureester (siehe A 1273/2004). Daher ist es auch möglich, diese Festträger-Hydrogel-Matrices zur Unterscheidung und Analyse von Esterase- und/oder Lipase-Aktivitäten sowie auch für die Identifizierung und/oder Charakterisierung vo\i Esterase- oder Lipasepräparaten, Proteinmischungen und Extrakten und komplexen proteinhältigen Proben, insbesondere komplexen Proteomproben, zu verwenden.

Die meisten Lipasen und Esterasen gehören zur Familie der Serin-Hydrolasen, die Carbonsäureester durch einen Mechanismus spalten, an dem eine hoch konservierte katalytische Triade und ein nukleophiler Serinrest beteiligt sind. Das nukleophile Serin ist an dem ersten Reaktionsschritt beteiligt, der zu einem te-traedrischen Zwischenstadium der zu spaltenden Fettsäurecarbo-nylgruppe führt. Dieses Zwischenstadium wird in einem kovalenten und stabilen Lipid-Protein-Komplex nachgeahmt, der durch Reaktion von Serin-Hydrolasen mit Phosphonsäureester-Inhibitoren stöchiometrisch gebildet wird [8]. Fluoreszenz-markierte p-Ni-trophenylphosphonsäureester sind hervorragende Aktivitätserkennungssonden (ARPs) für die qualitative und quantitative Bestimmung von Serin-Hydrolasen [9]. Diese ARPs finden für die Identifizierung und Charakterisierung von isolierten Enzymen und neuartigen Enzymen in komplexen Proteomen bereits verbreitet Verwendung [10-15]. Außerdem kann eine rasche Unterscheidung von Lipase- und Esterase-Aktivitäten erreicht werden, wenn eine [nachgereicht - 10 - - 10 - ·· 9 ·· ·· ···· 9 9 · 9 · 99 • • · · · · • · ·· · 99 9 • · • • · · · · 9

Bibliothek von strukturell verschiedenen ARP-Verbindungen verwendet wird. Die jeweiligen Verbindungen sind auch hervorragende Enzymsonden in der Chip-Technologie.

Derartige Verbindungen werden auch als Suizid-Inhibitoren bezeichnet. Die Enzym-Inhibitor-Interaktion auf Aktivitätsbasis auf einem Chip wurde zum Beispiel bereits unter Verwendung fluoreszierender Suizid-Inhibitoren für Caspasen, Phosphatasen, Cystein- und Serin-Hydrolasen untersucht [4-7].

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen aus den Verbindungen gemäß 1 bis 23, wie sie in Fig. 2A, 2B und 2C angeführt sind, ausgewählt.

Es stellte sich heraus, dass insbesondere diese Verbindungen an Lipasen und Esterasen binden und mit diesen reagieren. Eine Anordnung, die diese Verbindungen daran gebunden umfasst, kann zum Beispiel in Konkurrenztests verwendet werden, um die Bindungsaffinität der Enzyme an diese Verbindungen/Liganden zu bestimmen (siehe z.B. D. Leung et al., Nature Biotechnology 21 (6), 687-691 (2003); Eppinger et al., Angew. Chemie Intl. Ed. 43 (29), 3806-3810 (2004)).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Bindung einer Verbindung an ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase, umfassend die Schritte: a) Zur-Verfügung-Stellung I) einer Protein-Anordnung, die dieses Enzym umfasst, oder II) einer Anordnung, die zumindest eine Verbindung umfasst, die dieses an einen festen Träger gebundene Enzym inhibiert oder potentiell inhibiert, b) In-Kontakt-Bringen der Anordnung I) mit zumindest einer Verbindung, die dieses Enzym inhibiert oder potentiell inhibiert, oder In-Kontakt-Bringen der Anordnung II) mit dem Enzym, wobei sich ein Inhibitor/Enzym-Komplex bildet, und c) Nachweis der Bindung der zumindest einen Verbindung an dieses Enzym.

Um die Bindung eines Moleküls an eine Lipase/Esterase zu bestimmen, wird eine eine Lipase oder eine Esterase umfassende

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Protein-Anordnung oder eine potentielle Bindungspartner (wie Inhibitoren) umfassende Anordnung mit einer einen potentiellen Bindungspartner umfassenden Probe oder einer katalytisch aktive Lipase bzw. Esterase umfassenden Probe in Kontakt gebracht. Wenn beide Bindungspartner eine Affinität zueinander aufweisen, wird ein Molekül (Inhibitor)/Enyzm-Komplex gebildet. Dieser Komplex kann mit Antikörpern nachgewiesen werden, die auf die Lipase oder Esterase oder auf die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung gerichtet sind. Um eine derartige Bindung zu erleichtern, können die Enzyme oder Verbindungen eine funktionelle Gruppe umfassen. Weiters ist es auch möglich, diesen Komplex nachzuweisen, wenn im Laufe der Interaktion die Verbindung einen Verbindungsteil (durch eine Spaltungsreaktion) freisetzt, der zum Beispiel mit einem Fluorometer oder einem Photometer nachweisbar ist.

Die Proteinanordnung I) und Anordnung II) sind vorzugsweise Anordnungen gemäß der vorliegenden Erfindung.

Gemäß einer bevorzugen Ausführungsform ist die zumindest eine Verbindung ein Ester, vorzugsweise ein p-Nitrophenylphos-phonsäureester, und ist vorzugsweise ausgewählt aus den Verbindungen gemäß 1 bis 23, wie in Fig. 2A, 2B und 2C angeführt.

Die zumindest eine Verbindung ist vorzugsweise biotinyliert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bindung der zumindest einen Verbindung an die Lipase und/oder Esterase nachgewiesen, indem die Anordnung mit einem ersten Antikörper, der auf die Lipase, die Esterase oder die zumindest eine Verbindung gerichtet ist, und gegebenenfalls mit einem zweiten Antikörper, der auf den ersten Antikörper gerichtet ist, in Kontakt gebracht wird, wobei der erste oder zweite Antikörper mit einem Enzym, einem Fluorophor, einem Biotin, einem Enzymsubstrat und jeglichem anderen Affinitäts-Tag markiert ist.

Das Enzym, das an den ersten oder zweiten Antikörper gekoppelt ist, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase und Luciferase.

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Der Fluorophor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von Cyaninen, Merocyaninen, Boradiazaindacen, Rhodaminen, Anthracenen, Nitrobenzoxadiazolen und Kombinationen davon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Set zum Nachweis der Bindung einer Verbindung an ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase, umfassend: - eine Anordnung, bedeckt mit einem Hydrogel, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, - eine Lipase und/oder eine Esterase und - gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der Bindung der Verbindung an das Enzym.

Das erfindungsgemäße Set kann zum Beispiel in einem Verfahren verwendet werden, wie es oben beschrieben ist.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Zeichnungen und Beispiele weiter dargestellt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Fig. 1: Mikroanordnungen für das Lipase- und Esterase-Profi-ling auf Aktivitätsbasis. A: Auf einem Chip immobilisierte Enzyme können mit einer gegebenen fluoreszierenden Aktivitäts-Erkennungssonde (ARP) in Lösung gescreent werden. B: Auf einem Chip immobilisierte ARPs werden mit einem gegebenen Enzym in Lösung untersucht.

Fig. 2 (2A bis 2C): Fluoreszierende Aktivitäts-Erkennungssonden (ARP) (gemäß A1273/2004 und A440/2003).

Fig. 3: Wirkung der Inhibitorkonzentration auf die auf Aktivität basierende Fluoreszenzmarkierung von MME auf einem Chip. 400 pg/ml MME (für das Spotten verwendete Konzentration) wurde auf einen Chip gespottet (entspricht ca. 36 pg Protein pro Spot) und mit 100 μΐ (1 - 1000 nM) ARP 30 min. lang umgesetzt. ARPs: NBD-HE-HP 1 (); NBD-Cl2-Biotin 2 (·) (chemische Strukturen siehe Fig. 2A bis 2C).

Fig. 4: Wirkung der Proteinkonzentration auf die Reaktion von immobilisierter MME mit ARPs. 5 - 500 pg/ml MME (für das Spotten verwendete Konzentration, entspricht ca. 4,5 bis 450 pg Protein / Spot) wurde auf den Chip gespottet und mit 100 μΐ von 100 nM auf Aktivität basierender Sonde 30 min. lang umgesetzt. Inhibitoren: A: NBD-HE-HP 1 (); B: NBD-C12-Biotin 2 (·).

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Pig. 5: Zeitabhängiges Markieren von MME auf einem Chip durch fluoreszierende ARPs. Direkter Nachweis der ARP-Fluores-zenz auf dem Chip: NBD-HE-HP 1 (, Feld A) NBD-Cl2-Biotin 2 (·, Feld B), Indirekter Nachweis von NBD-C12-Biotin 2 durch Avidin-ALEXA 555 Konjugat ist in Feld C dargestellt (o). Die Inhibitorkonzentration in den Inkubationslösungen betrug 50 nM.

Pig. 6: Deaktivierung von immobilisierter MME. MME-Anordnun-gen wurden hintereinander folgendermaßen mit den angegebenen Reagenzien inkubiert: 1. Inkubation mit 7 M Harnstoff / 2 M Thioharnstoff; 2. Sondieren der Enzyme mit den Inhibitoren; 3. Nachweis des biotinylierten Inhibitors 2 unter Verwendung von Avidin-ALEXA 555 Konjugat (Verdünnung: 1 : 500); 4. Inkubation mit 7 M Harnstoff / 2 M Thioharnstoff. Die ARP-Konzentrationen in den Inkubationslösungen betrugen: 1000 nM (a) und 100 nM (b). Zu den chemischen Strukturen von NBD-HE-HP 1 und NBD-C12-Biotin 2 siehe Fig. 2. Fluoreszenznachweis: NBD: (lex: 480 nm; lern: 530 nm), Avidin-ALEXA 555 Konjugat (lex: 532 nm; lern: 595 nm). Inkubationsvolumen: 100 μΐ ARP-Lösungen. Inkubationszeit für die Denaturierung: 15 min.

Pig. 7: Reaktion von mit ALEXA 647 markierter Mucor miehei-Esterase mit verschiedenen Konzentrationen von immobilisierten ARP 2 auf einem Chip. Mit Streptavidin beschichtete Südes wurden mit ARP 2 in Konzentrationen im Bereich von 50 μΜ (-1,7 auf der x-Achse) bis hinunter zu 100 fM (7 auf der x-Achse) inkubiert. Schließlich wurden die Südes mit 100 μΐ markiertem Enzym (14 μg/ml) inkubiert, gefolgt von Waschen und Fluoreszenz-Scannen (A, lex: 480 nm; lern: 530 nm, Fluoreszenz von ARP und B, lex: 635 nm; lern: 685 nm, Fluoreszenz von markiertem Enzym) .

Fig. 8: Bindung von mit ALEXA 647 markierter MME und MGL an ARPs 2 und 20-23 (Fig. 2), immobilisiert auf mit Streptavidin beschichteten Südes. MME: Südes wurden mit 100 μΐ markierter MME (14 pg/ml) bei 37°C 30 min lang inkubiert, gefolgt von Waschen und Scannen der Fluoreszenz-Intensitäten (falsch rot gefärbt: lex: 635 nm; lern: 685 nm). Zur Messung der Blind-Fluores-zenz wurde vor der Inkubation mit MME auf die Bindung von ARP an Streptavidin verzichtet. MGL: Die Südes wurden 60 min lang mit 100 μΐ rohem Zytoplasmalysat (1,11 mg/ml, Gesamtprotein) von COS-7-Zellen inkubiert, die transient murine MGL exprimierten. I nachgereicht ' ·· · · · ·· ···· > ········· • · · · · ·· · - 14 -

Gebundenes MGL wurde immunologisch an die enzymatische Hydrolyse von ELF-97 Phosphat gekoppelt identifizert, was einen fluoreszierenden Niederschlag ergab, der bei lex: 360 nm; lern: 530 nm gescannt wurde (falsch grün gefärbt). Die BÜnd-Fluoreszenzin-tensität wurde nach der Inkubation von Zytoplasmaextrakten (1,14 mg/ml, Gesamtprotein) von COS-7-Zellen, die mit LacZ im selben Vektor (pcDNA4/HisMax-Invitrogen) transfiziert waren, unter den oben beschriebenen Bedingungen erhalten.

Fig. 9: Zusammenstellung der Anordnung: Die Anordnungen bestehen aus 6 Unteranordnungen, die die 6 zu untersuchenden Enzyme repräsentieren, wobei jede 6-fach in 9 verschiedenen Konzentrationen gespottet wird. BEISPIELE:

Beispiel 1: Immobilisierung von Lipasen/Esterasen auf einem festen Träger

Proteine wurden in Druckpuffer (300 mM Phosphatpuffer pH = 8,50, 0,005% CHAPS und 1% Trehalose) bei 25ÖC und 45% relativer Feuchtigkeit unter Verwendung von SMP 3B Stealth Pins (Telechem, USA) in Kombination mit einem QArraymini Robot (Genetix, UK) und Qsoft Microarray Software auf Schott Nexterion Slide H Mikroanordnungs-Slides (Schott Nexterion Slide H Microarray Südes, Schott Nexterion, USA) gespottet. Beim Spotten wurde die Ausgangsmikrotiterplatte bei 6°C gehalten, um die Verdampfung des Wassers zu verringern und die Enzymaktivität zu erhalten. Jedes Enzym wurde 6-fach zu 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10 und 5 pg/ml gespottet (entspricht ca. 450, 360, 270, 180, 90, 45, 22,5, 9 und 4,5 pg/Spot), um eine 18 x 18 Anordnung mit einem Abstand von 300 μπι von Spot zu Spot zu erzeugen. Zur Herstellung der Streptavidin-Mikroanordnungen wurden 500 pg/ml Streptavidin in Druckpuffer auf Nexterion Slide H Südes gespottet, um 18 x 18 Anordnungen zu erhalten. Zwölf dieser Anordnungen wurden auf ein Slide in einem Muster von 6x2 gedruckt, was mit den Inkubationskammern mit 16 Einlagen des FAST FRAME-Sys-tems (Schleicher & Schuell, Deutschland) kompatibel war. Um eine gute Proteinbindung sicherzustellen, wurden die bedruckten Südes bei 75% relativer Luftfeuchtigkeit und 25°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Südes wurden sofort verwendet oder bei 4°C höchstens 2 Tage lang gelagert.

NACHGEREICHT 15 ·· · ·· ·· · · · · ········ ·· • · · · · ·· ·

Nach dem Spotten und der Inkubation bei 75% Feuchtigkeit wurde die verbleibende aktive Oberfläche der Slides mit 50 mM Ethanolamin in 50 mM Boratpuffer pH = 8,0 bei 25°C 1 Stunde lang blockiert, bevor mit den ARPs in Lösung inkubiert wurde. Der Blockierungsschritt wurde direkt vor der Inkubation der Slides mit ARPs durchgeführt, um die Proteine vor dem Austrocknen zu schützen.

Beispiel 2: Enzym-Inhibitor-Studien unter Verwendung einer Mucor miehei-Esterase-Anordnung

Enzyme in aktiver Form wurden auf mit N-Hydroxysuccinimin-säure (NHS) aktivierten Hydrogel-Slides (Nexterion Slide H,

Schott Nexterion, USA) immobilisiert. Die für das Sondieren der Enzyme auf dem Chip verwendeten ARPs waren die gleichen, die für den Nachweis von Lipase und Esterase in homogenen Systemen verwendet wurden.

In einem ersten Ansatz wurden identische Konzentrationen von im Handel erhältlicher Mucor miehei-Esterase (MME, Fluka, Deutschland) mit unterschiedlichen Konzentrationen der Inhibitoren 1 und 2 (Strukturen siehe Fig. 2A bis 2C) im Bereich von 1 -1000 nM (siehe Fig. 3) gespottet und sondiert.

Im Prinzip können zwei Systeme vorgesehen werden, um die Interaktion von Enzymen und Inhibitoren auf Aktivitätsbasis zu untersuchen, nämlich die Protein-Mikroanordnung und die Kleinmolekül-Mikroanordnung. Die Aktivität eines einzelnen Inhibitors auf eine Gruppe von verschiedenen Enzymen wird unter Verwendung einer Mikroanordnung festgestellt, die verschiedene immobilisierte Enzyme enthält, die mit einer einzigen ARP in Lösung sondiert werden (Fig. 1 Feld A). Die Präferenz eines bestimmten Enzyms für verschiedene ARPs kann untersucht werden, indem die immobilisierten ARPs mit dem Enzym in Lösung sondiert werden (Fig. 1, Feld B).

Immobilisierte MME wurde in einer Konzentrations-abhängigen Weise von beiden ARPs inhibiert. Die Fluoreszenzintensitäten (relative Fluoreszenzeinheiten, „relative fluorescence units", RFU) wurden bei 25 nM (ARP 1) und 500 nM (ARP 2) flacher. Die Nachweisgrenze betrug für beide Inhibitoren 1 nM. Umgekehrt wurden verschiedene Enzymkonzentrationen von MME ( 5 - 500 pg/ml) gespottet und mit 100 nM ARP in Lösung inkubiert. Bei ARP 1 wur- I nachqerboht \ 16 16

de eine Konzentrations-abhängige Interaktion von MME mit den einzelnen Sonden beobachtet. Die Bindung von Inhibitor 2 erreichte erst bei 100 pg/ml eine Sättigung. Die Minimalmenge MME, die von ARPs auf Mikroanordnungen nachweisbar war, betrug 50 pg/ml in der Spot-Lösung. Diese Menge entspricht etwa 45 pg Enzym pro Spot unter der Annahme eines Spot-Abgabevolumens von 0,9 nl pro Spot und einer vollständigen Probenbindung auf der Oberfläche des Südes (Fig. 4) [17] . Ein Fluoreszenzintensitäts-3D-

Plot der Spots zeigte, dass die Höhen der Spots nicht linear anstiegen. Daher wurden die geplotteten RFüs vom Hintergrundkorrigierten Spotvolumen berechnet, das nicht mit der Höhe der Spots korrelierte.

Der zeitliche Verlauf der Reaktion von ARPs mit MME (Fig. 5) zeigte, dass die verschiedenen zeitabhängigen Reaktivitäten der Inhibitoren mit dem Protein auf dem Chip gut bestimmt werden konnten. Die Reaktion von MME mit ARP 1 erreichte nach 60 min die Vollständigkeit, während die Reaktion mit Inhibitor 2 nach zwei Stunden abflachte. Inhibitor 2 hat einen Biotinteil zusätzlich zu einem fluoreszierenden Tag (Fig. 2). Daher kann er entweder an Hand seines Fluoreszenzsignals oder, alternativ dazu, nach dem Zusatz von Fluoreszenz-markiertem Avidin nachgewiesen werden. Der indirekte Nachweis von Inhibitor 2 durch ein Avidin-ALEXA 555 Konjugat spiegelte jedoch das Fortschreiten der Reaktion im Vergleich zum direkten Fluoreszenznachweis nur schlecht wider (Feld C). Das optimale Zeitfenster für die kinetische Unterscheidung der Enzymreaktivität auf dem Chip durch ARP 1 und 2 lag zwischen 30 und 60 min. In diesem Bereich waren die Enzymmarkierung durch den Inhibitor und die Änderungen der Signale linear in Abhängigkeit von der Zeit. Daher wurden in allen diesen Beispielen alle Inkubationszeiten für das Chipscreening mit ARPs auf 30 min eingestellt, falls nicht anders angegeben.

Um zu bestätigen, dass die ARPs nur aktive Enzyme nachwei-sen, wurde MME auf dem Chip vor der Inkubation mit ARPs unter Verwendung einer Mischung von 7M Harnstoff / 2M Thioharnstoff bei 37°C 15 min lang denaturiert (Fig. 6). Nach der Denaturierung wurde keine Bindung der ARPs an die gespotteten Proteine mehr beobachtet, was zeigt, dass die ARPs nur aktive Enzyme binden. Der indirekte Nachweis der Bindung von Inhibitor 2 an MME

NACHGEREICHT 17 auf dem Chip durch das fluoreszierende Avidinkonjugat war im Vergleich zu der direkten Messung der NBD-Fluoreszenz dieser Enzymsonde weniger empfindlich. Die folgende Inkubation mit dem Denaturierungsmittel Harnstoff / Thioharnstoff verminderte den indirekten Nachweis durch das Avidin-ALEXA 555 Konjugat und reduzierte so die Bindung von Biotin an Avidin. Die Inkubation von MME auf einem Chip mit 100 nM ARP 2 war für den indirekten Nachweis von gebundener Sonde durch das Biotin Avidin-ALEXA 555 Konjugat-System nicht ausreichend, während die Fluoreszenz der NBD-Markierung sehr gut vom Hintergrund zu unterscheiden war. Die gleiche Beobachtung wurde auch gemacht, als fluoreszierende ARPs in Proteomprofiling-Experimenten mit biotinylierten Derivaten verglichen wurden [18]. Die Behandlung von MME auf einem Chip mit einem Probenpuffer für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektropho-rese bei 37°C 15 min lang hob die Enzymerkennung auf Aktivitätsbasis nicht auf. Statt dessen war es zur Enzym-Deaktivierung unbedingt erforderlich, die Südes mehrere Minuten lang auf 95°C zu erhitzen.

Beispiel 3: Enzyminhibitorstudien unter Verwendung einer Anordnung von 6 verschiedenen lipolytischen Enzymen Für die parallele Enzymaktivitäts-Profilierung auf einem Chip wurden 6 verschiedene lipolytische Enzyme (Tabelle 1, zur Herstellung der Enzyme siehe Beispiel 6) in 9 verschiedenen Konzentrationen zwischen 5 und 500 pg/ml (gespottetes Volumen ca. 0,9 nl, das entspricht ca. 4,5 - 450 pg Enzym pro Spot) gespottet. Ein Mikroanordnungs-Slide enthielt 6x2 identische Anordnungen, die aus 18 x 18 Features bestanden, wobei jede Enzymkonzentration sechsfach gespottet wurde. Es wurden Inkubationskammern mit 16 Einlagen in Kombination mit dem FAST FRAME-System (Schleicher & Schuell) verwendet. So konnten bis zu 12 unabhängige Experimente mit einem einzigen Mikroanordnungs-Slide durchgeführt werden (siehe Fig. 9) .

Die Fluoreszenz-markierten ARPs, die zum Nachweis von auf den Mikroanordnungen immobilisierten aktiven Lipasen und Esterasen verwendet wurden, sind in Fig. 2A bis 2C dargestellt.

Die immobilisierten Enzyme (4,5 - 450 pg/Spot) auf dem Chip wurden mit 100 μΐ einer 100 nM Lösung der ARPs in 10 mM Tris-HCl pH ** 7,40, 0,25 M Saccharose und 1 mM Triton X-100 bei 37°C 30

NACHGEREICHT - 18 - ♦ · · ·· ♦· ···· ········ · · • · · · ♦ ·♦ · • · ····· ♦ min lang sondiert. Nach der Inkubation wurden die Südes gewaschen, und die Fluoreszenz wurde bei 530 nm gescannt. Für einen Vergleich der Markierung durch die verschiedenen ARPs wurden die Ablesungen der Fluoreszenzintensität des Anordnungsscanners für jede einzelne ARP und Enzym als Bruchteile der Fluoreszenzintensität jener ARP ausgedrückt, die bei der Bindung an das gleiche Enzym die höchste Intensität (Reaktivität) aufwies.

Tabelle 1: Relative Fluoreszenzintensitäten von mit ARP markierten Enzymen. Die Werte sind als Prozentsatz der Fluoreszenzablesung einer Enzym-gebundenen ARP dividiert durch die Ablesung der durch das gleiche Enzym am besten gebundenen ARP ausgedrückt. Inhibitorkonzentration in der Inkubationsmischung: 100 nM. bCE: Bovine Cholesterin-Esterase; CAL B: Candida antarctica-Lipase B; CLE: Candida lipolytica-Esterase; ppL: porcine Pankreas-Lipase; MME: Mucor miehei-Esterase. A: Enzymreaktivität auf einem Chip; B: Enzymreaktivität in Lösung; n.b.: nicht bestimmt

NACHGEREICHT

Enzyme bCE CAL B CLE CVL ppL MME A B A A A A A | B ARP % relative Fluoreszenz NBD-HE-HP 1 100 52 10 45 40 85 73 69 NBD-C12-Biotin 2 39 n.b. 15 37 22 97 12 n.b. 3 0 73 0 0 16 0 1 7 4 0 78 0 0 0 0 3 46 5 0 24 0 0 25 0 0 69 6 74 69 19 44 100 100 50 72 7 59 41 19 77 6 54 81 100 8 60 36 27 100 7 72 94 86 9 54 43 4 67 14 40 83 n.b. 10 38 n.b. 5 53 20 66 72 100 11 67 54 100 51 30 31 100 70 12 40 n.b. 6 44 58 83 16 n.b. 13 0 n.b. 2 0 61 0 4 n.b. 14 0 69 9 17 4 13 1 1 15 0 19 1 14 4 15 1 1 19 ·· · ·· ·· ···· • · · · · ·· · t 16 0 92 32 19 4 15 1 0 17 0 100 3 25 4 14 1 0 18 26 52 1 15 5 16 1 6 19 0 n.b. 1 15 5 15 1 n.b.

Beispiel 4: Herstellung von Lösungen einer Aktivitätserkennungssonde (ARP) und ARP-Anordnungen

Die ARPs (gemäß A1273/2004 und A440/2003) wurden lösungsmittelfrei bei < -20°C gelagert. Aliquote von ARPs, gelöst in Chloroform : Methanol 2:1 (v/v), wurden in eine Eppendorf-Röhre transferiert, gefolgt von der Zugabe von 15 μΐ 10 mM Triton X-100 in Chloroform. Das organische Lösungsmittel wurde unter einem leichten Argonstrom entfernt, und der lösungsmittelfreie Rest wurde in 150 μΐ Assaypuffer (10 mm Tris/HCl pH = 7,40, 0,25 M Saccharose) durch 5 min. langes Vortexen gelöst. Für die Streptavidin-Anordnungen wurde die Endkonzentration der Inkubationslösung auf 10 mM Triton X-100 und 5 μΜ biotinylierte ARPs eingestellt. Danach wurden die vorbereiteten ARP-Lösungen auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Wells transferiert und auf einem Eppendorf-Schüttler bei 37°C und 550 üpm 5 min. lang inkubiert. 100 μΐ der einzelnen Proben wurden auf die Mikroanordnung unter Verwendung einer 8 Kanal-Transfer-Pipette geschichtet. Die ARPs wurden mit der Anordnung bei 37°C 30 min. lang inkubiert, sofern nicht anders angegeben. Nach extensivem Waschen mit TBST (20 mM Tris pH = 7,40, 150 mM NaCl, 1% Tween-20) und kurzem Spülen mit entionisiertem Wasser wurde die NBD-Fluoreszenz der gebundenen Inhibitoren mit einem ArrayWorxe Auto Microarray Scanner (Applied Precision, Issaquah, WA) gescannt (lex: 480 nm; lern: 530 nm; Belichtungszeit: 0,1 s) .

Der Biotinteil von ARP 2 wurde nach 30 min. Inkubation mit Avidin-ALEXA Konjugat (1:500 (v/v) in TBST (1% Tween-20)) bei Zimmertemperatur nachgewiesen. Die Markierungsfluoreszenz wurde nach extensivem Waschen der Chips mit TBST (1% Tween-20), gefolgt von einem kurzen Spülen mit entionisiertem Wasser gescannt (lex: 540 nm; lern: 595 nm; Belichtungszeit: 0,25 s).

Beispiel 5: Enzymbindungs-Assay an Kleinmolekül- (Bindungspartner, Inhibitoren) Mikroanordnungen

NACHGEREICHT 20

Die Kleinmolekül-Mikroanordnungen (ARPs immobilisiert auf Streptavidin-Slides, siehe z.B. Beispiel 7) wurden mit MME oder MGL bei 37°C 30 bzw. 60 min. lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikroanordnungen mit TBST (0,1% Tween-20) extensiv gewaschen. Südes, die gebundenes MME-ALEXA 647 Konjugat enthielten, wurden direkt abgebildet (lex: 635 nm; lern: 685 nm; Belichtungszeit: 3 s). Südes, die mit COS-7 Zelllysaten untersucht worden waren, wurden mit Anti-6 x HIS Antikörper (1:150 (v/v); Amersham Biosciences, gezüchtet in Mäusen) in TBST (0,1% Tween-20) bei Zimmertemperatur 30 min. lang inkubiert. Nach extensivem Waschen mit TBST (0,1% Tween-20) wurde Anti-Maus-Anti-körper-alkaüsche Phosphatase-Konjugat (1:150 (v/v); Sigma, gezüchtet in Ziegen) in TBST (0,1% Tween-20) 30 min. lang inkubiert. Die Südes wurden hintereinander mit TBST (0,1% Tween-20) und alkalischem Phosphatase-Reaktionspuffer (APRB; 10 mM Tris pH = 9,50; 10 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2, 0,05% Triton X-100) gewaschen. Schließlich wurden die Südes mit 250 nM ELF-97 Phosphat in APRB bei Zimmertemperatur 15 min. lang inkubiert. Die Reaktion auf dem Chip wurde durch extensives Waschen mit TBST (0,05% Triton X-100) beendet, gefolgt vom Fluoreszenz-Scannen des erhaltenen Niederschlags auf der Chipoberfläche (lex: 360 nm; lern: 530 nm; Belichtungszeit: 0,02 s).

Alle Experimente wurden doppelt ausgeführt, und die Mikroanordnungsdaten wurden unter Verwendung von Genepix Pro 5.1 Software (Axxon) analysiert.

Mikroanordnungen von Lipase- und Esteraseinhibitoren wurden als ein Mittel zum raschen Screenen der Enzympräferenz für verschiedene Substrat-analoge ARPs entwickelt. In einem ersten Versuch wurden NHS-aktivierte Vorläufer der in Fig. 2A, 2B und 2C angeführten ARPs direkt auf Amino-modifizierten Hydrogelsüdes immobilisiert. In einem anderen Experiment wurden Mikroanordnungen von biotinyüerten ARPs auf mit Streptavidin beschichteten Hydrogelsüdes erzeugt (Fig. 1, Feld B) . Anstelle eines Fluorophors enthielten diese Verbindungen eine Biotin-Markierung für die Reaktion mit einer mit Streptavidin beschichteten Chipoberfläche. Die ARPs in diesem Experiment binden ausschließlich an Streptavidin über ihren Biotinteil. In Kontrollexperimenten wurde keine kovalente Bindung des Phosphonsäureesters nachgewiesen.

NACHGEREICHT - 21 - «· » »· 4« 44*4 ········ · 4 • * 4 4 14« 4 Für den Nachweis der Enzymbindung an derartige Chips mussten die Proteine vor der Inkubation unter Bedingungen markiert werden, die die eigentliche Enzymfunktion nicht beeinträchtigten.

In einem typischen Experiment wurden 500 pg/ml (450 pg / Spot) Streptavidin in ünteranordnungen gespottet, die 18 x 18 Features enthielten. Nach dem Blockieren der verbleibenden aktiven NHS-Ester auf der Anordnungsoberfläche wurden die Slides mit den biotinylierten ARPs inkubiert. Ungebundene ARPs wurden weggewaschen, und die ARP-Mikroanordnung wurde mit Fluoreszenz-getagg-ter Lipase oder Esterase inkubiert. Für die Experimente wurden Chips verwendet, auf welchen verschiedene Konzentrationen von ARP 2 vor der Inkubation mit MME-ALEXA 647 Konjugat aufgespottet wurden. Die auf den mit Streptavidin beschichteten Slides immobilisierte Menge ARP 2 und die Bindung auf Aktivitätsbasis von MME an diese Mikroanordnungen wurden gleichzeitig durch die Messung der Lipid- (NBD) bzw. Protein- (ALEXA 647) -Fluoreszenz beobachtet (Fig. 7). Das Fluoreszenzsignal blieb über einen Konzentrationsbereich von 4,5 Größenordnungen konstant. Bei sehr geringen Mengen von ARP 2 (100 fM) war die Bindung von MME reduziert. Die relativen Mengen von gebundenem Enzym wurden an Hand des Verhältnisses der Fluoreszenzintensität bei 685 nm (MME-ALEXA 647) dividiert durch die Intensität bei 530 nm (NBD-ARP) ermittelt. Das Verhältnis stieg linear von 25 nM bis auf 1 pM und sank wieder bei 100 fM ARP. Unter diesen Bedingungen war die ARP-Fluoreszenzintensität im 685 nm Kanal bereits viel geringer als die Hintergrundintensität im 530 nm Kanal.

Die Aktivitäts-basierende Inhibition von markierter MME durch verschiedene, auf Streptavidinslides immobilisierte bioti-nylierte ARPs (Fig. 2A bis 2C) ist in Fig. 8 dargestellt. Die biotinylierte ARP 22 war die beste Sonde für MME. Abgesehen von der Markierung ist das fluoreszierende Derivat 11 (NBD-Markie-rung) strukturell ident mit ARP 22 (Biotin-Tag, Fig. 2B). Es war der beste untersuchte MME-Inhibitor, sowohl auf einem Chip als auch in Lösung. Die Triacylglycerin-analogen ARPs 20 und 21 in immobilisierter Form wurden ebenfalls von MME erkannt (Fig. 8).

Im Gegensatz dazu reagierten die Fluoreszenz-getaggten ARPs 3 und 4 nicht mit immobilisierter MME (Tabelle 1). Um die Fähigkeit der ARP-Mikroanordnungen zum Nachweis aktiver Proteine zu nachgereicht 22 zeigen, wurde die Bindung von muriner Monoacylglycerinlipase (MGL, tiberexprimiert in C0S-7-Zellen) mit N-terminalem 6 X His-Tag an die Kleinmoleküle auf einem Chip unter Verwendung unbearbeiteter Zytoplasmaextrakte von MGL-transfizierten C0S-7-Zellen untersucht. MGL war vorher als Target verschiedener Aktivitätserkennungssonden in zahlreichen Proteomen identifiziert worden [19]. Die unbearbeiteten Zytoplasmaextrakte (1,11 mg/ml Gesamtprotein) wurden mit ARP 2, 20-23 enthaltenden Kleinmolekül-Mikroanordnungen 1 Stunde lang inkubiert. Das His-Tag des gebundenen Enzyms wurde immunologisch durch Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugate nachgewiesen, gefolgt von der Hydrolyse von ELF-97 Phosphat (Molecular Probes, Leiden) und der Messung der Niederschlagsfluoreszenz auf dem Chip [20].

Beispiel 6: Enzympräparate zur Verwendung in Inhibitorstudien unter Verwendung von Lipase-/Esterase-Anordnungen

Bovine Cholesterinesterase (bCE, Sigma, C-3766, Lot 119H7405); Mucor miehei-Esterase (MME, Fluka, 46059 Lot: 10249/2); Candida lipolytica-Esterase (CLE, Fluka, 46056 Lot: 48839/1); Candida antarctica-Lipase B (CAL B, Novo, SP525, Lot: PPW 5328); Chromobacterium viscosum-Lipase (CVL, Biocatalysts, Lot: 3169/2484); porcine Pankreas-LipaSe (ppL, Sigma, L-0382, Lot: 031K7670); Streptavidin (Sigma, S-4762, Lot: 118H86605); Enzyme wurden in destilliertem Wasser gelöst, gefolgt von der Überführung auf Druckpuffer (300 mM Phosphatpuffer pH = 8,50, 0,005% CHAPS und 1% Trehalose) unter Verwendung von PD-10 Entsalzungskolonnen (Amersham Biosciences, Österreich). Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bio-Rad Proteinassay-Reagens auf Basis des Verfahrens von Bradford ermittelt. Die Protein-Endkonzentration wurde mit Hilfe von Druckpuffer auf 2 mg/ml eingestellt.

Lyophilisiertes Streptavidin wurde direkt in Druckpuffer zu 1 mg/ml aufgelöst. Enzym-Ausgangslösungen wurden bei -20°C gelagert. Die transiente Expression von Mäuse-Monoacylglycerin-Lipase (MGL) erfolgte wie beschrieben. MME und Avidin wurden mit ALEXA 647-NHS bzw. ALEXA 555-NHS (Molecular Probes, Niederlande) markiert. Die Proteinmarkierung und Reinigung des Konjugats erfolgte wie von Molecular Probes empfohlen.

NACHGEREICHT MGL wurde transient in C0S-7-Zellen exprimiert. Die Trans-fektion der C0S-7-Zellen erfolgte mit Metafectene“ (Biontex, Deutschland) gemäß den Vorschriften des Herstellers. Das scheinbare Molekulargewicht der MGL mit His-Tag betrug 33 kDa, wie mittels Western Blotting unter Verwendung von Anti-His monoklonalem Antikörper (6 x His, Amersham Biosciences) bei einer Verdünnung von 1 : 7000 bestätigt wurde. Transfizierte COS-7-Zellen wurden zwei Mal mit PBS gewaschen, in Lysepuffer (0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 1 mM Dithioerythrit, 20 pg/ml Leupeptin, 2 pg/ml Antipain, 1 pg/ml Pepstatin) geschabt und durch kurze Beschallung (Virsonic 475, 4 mm Beschallungsspitze) bei Maximalkraft auf Eis 10 s. lang lysiert. Zellkerne und ungebrochenes Material wurden durch 15 minütiges Zentrifugieren bei 1.000 g bei 4°C entfernt, um Zytoplasmaextrakte zu erhalten.

Beispiel 7: Bindung von biotinylierten ARPs an Streptavidin In biotinylierten ARPs verankert der Biotinrest die Molekülsonde am Streptavidin auf dem Chip, während der Phosphonsäure-ester-Teil spezifisch mit dem nukleophilen Serin in Serinhydro-laseenzymen reagiert. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass biotinylierte ARPs über den Phosphonatteil an Streptavidin binden (kovalente Bindung), wurde das folgende Kontrollexperiment durchgeführt. Aliquote von Proben, die 20 pg (0,29 nMol) Streptavidin enthielten (bindet 1,15 nMol Biotin), wurden mit 2 nMol ARP 2 bzw. 20-24 in 20 pl 10 mM Tris-HCl pH = 7,40, 10 mM Triton X-100 bei 25°C 1 Stunde lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 pl eines 5-fach konzentrierten ID SDS-PAGE-Probenpuffers zugesetzt, und die Proben wurden 5 min. lang bei 95°C inkubiert.

Die Proteine wurden mittels ID SDS-PAGE aufgetrennt, einem Elektroblotting auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher &

Schuell, Deutschland) unterworfen und mit 5% fettfreiem Milchpulver in TBST (1% Tween-20) blockiert. Die biotinylierten Proteine wurden unter Verwendung von Avidin ALEXA 555 Konjugat (Verdünnung von 1 : 2000 (v/v) in TBST (1% Tween-20)) nachgewiesen. Beispiel 8: Diskussion der Beispiele 1 bis 7 Die Immobilisierung und der Nachweis von Enzymen in aktiver Form ist ein Schlüsselschritt zu funktionellen Proteinmikroanordnungen. Es sind schon große Fortschritte bei der chemischen Oberflächenmodifizierung, insbesondere von Glassubstraten, ge-

NACHGERBCHT • * · • · ·· ·· ·· · ·· *·· · · ·· · + - 24 - macht worden, was die Basis für die Herstellung von Enzym-Mikroanordnungen ist. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass mit Hydrogel beschichtete Südes bei der Verwendung zur Immobilisierung von Enzymen, insbesondere Lipasen/Esterasen, in aktiver Form die besten Ergebnisse erzielt werden konnten. Diese Systeme waren besser als Enzymchips auf Basis von Epoxy-, Amino-oder Dendrimer-Oberflächen [7; 16; 21]. Chen et al. berichteten, dass hydrolytische Enzyme auf Epoxid-aktivierten Südes in aktiver Form erhalten werden können. Ihr Ansatz war erfolgreich, wenn es sich bei den Enzymen um Proteasen handelte, er funktionierte jedoch bei Lipasen nicht [6]. Laut den hier angeführten Versuchsdaten eröffnen mit Hydrogel beschichtete Südes nun die Möglichkeit eines funktionellen Screenings aktiver Lipasen und Esterasen auf einem Chip. Für die Enzymerkennung wurden Phos-phonsäureinhibitoren verwendet, die für das Screening von Lipase und Esterase in Lösung bereits erfolgreich eingesetzt wurden.

Die Inhibierung immobilisierter Enzyme durch diese Aktivitätserkennungssonden ist linear von der ARP-Konzentration (Fig. 3), der Konzentration des immobilisierten Enzyms (Fig. 4) und der Zeit (Fig. 5) abhängig. Die Markierung der gleichen Menge immobilisierten Enzyms (MME) mit ARP 1 und ARP 2 in Lösung erreichte bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen eine Sättigung (gleiche Fluoreszenzintensität). Bei ARP 1 wurde die Sättigung bei etwa 50 nM beobachtet, während die ARP 2-Bindung bei 500 nM abflachte. Die Sättigung der Lipid-Protein-Bindung bei höheren ARP-Konzentrationen in Verbindung mit der Resistenz der gebundenen Markierung gegen die Lösungsmittelextraktion kann als Beweis dafür angesehen werden, dass die Reaktion zwischen den Aktivitätserkennungssonden und den immobilisierten Proteinen kovalent und spezifisch war, und hatte nichts mit der reinen Oberflächenadsorption zu tun. Entsprechend den anfänglichen Steigungen der Bindungskurven, wie sie in Fig. 2 dargestellt sind, hat ARP 1 eine 25-fach höhere Affinität zu immobilisierter MME als ARP 2. Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration von immobilisierter MME und dem Ausmaß der Inhibitorbindung (100 nM ARP 1 und 2 in Lösung) und zeigt eine lineare Abhängigkeit im Konzentrationsbereich von 50 bis 500 pg/ml (45 - 450 pg Enzym pro Spot) für ARP 1 [17]. Ein zweifacher Anstieg der Fluoreszenzin-

NACHGEREICHT - 25 - tensität auf Grund der Bindung des markierten Lipids stand im Zusammenhang mit dem gleichen Anstieg der immobilisierten Enzymkonzentration auf dem Chip, was darauf hinweist, dass die gesamte gespottete Enzymmenge für die Reaktion mit dem Inhibitor zugänglich war. Im Gegensatz dazu war die Enzymmarkierung durch ARP 2 nur unter 100 pg/ml (90 pg Enzym pro Spot) eine lineare Funktion. Offensichtlich war nur ein eingeschränkter Teil des gespotteten Enzyms für diesen hydrophoberen Inhibitor zugänglich. Die Enzymmarkierung stieg jedoch linear an, als ansteigende Konzentrationen von ARP 2 in Lösung angewendet wurden. Dieser Effekt war insbesondere zu beobachten, wenn hydrophobe ARPs (2 -5; 12 und 13) als Sonden verwendet wurden. Die zeitabhängige Reaktion von ARP 1 und 2 mit immobilisierter MME spiegelt wiederum die höhere Affinität von ARP 1 im Vergleich zu ARP 2 wider. Die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit war 3 Mal höher und erreichte bei einer Inkubationszeit von 60 min mit ARP 1 die Sättigung, während die Sättigung mit ARP 2 zwei Stunden benötigte. Die beobachteten Unterschiede der MME-Reaktivität mit ARP 1 und 2 können durch die Tatsache erklärt werden, dass ARP 1 weniger hydrophob ist und daher ein bevorzugtes Substrat für die mikrobielle Esterase ist. Für das Enzymscreening auf Aktivitätsbasis ist es wichtig, dass die Inhibierungsreaktion zu dem Zeitpunkt, zu dem das Slide für das Ablesen der Fluoreszenz vorbereitet wird (Entfernung des Chips aus der Inkubationslösung), noch nicht vollständig abgelaufen ist. In früheren Experimenten wurde gezeigt, dass ARP 1 nicht spezifisch ist und eine hohe Affinität zu zahlreichen li-polytischen Enzymen aufweist. Daher wurden dieser Inhibitor und ARP 2 in Kombination mit MME für die Optimierung der Reaktionsbedingungen ausgewählt, die für die allgemeine Analyse der meisten bekannten lipolytischen Enzyme gelten sollten. Bei diesen Experimenten wurden Enzyme mikrobiellen und tierischen Ursprungs auf ihre Fähigkeit gescreent, mit ARP 1 und 2 zu reagieren, und alle waren unter dem optimierten Protokoll aktiv. Dieses Verfahren könnte daher auch für das Screenen von lipolytischen Aktivitäten in unbekannten gereinigten Proteinproben verwendet werden.

Tabelle 1 zeigt die relativen Reaktivitäten verschiedener Inhibitoren in Lösung für verschiedene Lipasen und Esterasen auf

NACHGEREICHT 4 4

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Hydrogelchips. Zusätzlich sind vergleichbare Daten für Inhibitorreaktivitäten gegenüber boviner Cholesterinesterase (bCE), porciner Pankreas-Lipase (ppL) und Mucor miehei-Esterase (MME) in einem Lösungsphasenassay angegeben. Im Allgemeinen weisen die offenkettigen ARPs 1-2 und 6-10 eine erhebliche Reaktivität für die Enzyme auf einem Chip auf, obwohl es signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Enzymen gibt. Die sperrigen hydrophoben ARPs 3-5 weisen eine extrem geringe oder gar keine Affinität auf. Die ARPs 14-19, die eher heterocyclische als li-pide Teile in enger Nachbarschaft zu den reaktiven Phosphonat-zentren aufweisen, sind mit Enzymen auf einem Chip auch nicht sehr reaktionsfreudig. Die relativen Reaktivitäten der immobilisierten Enzyme bCE, ppL und MME sind mit den für die Enzyme in Lösung erhaltenen Werten nicht völlig vergleichbar. Die Bindung der sehr hydrophoben Inhibitoren 3-5 an die immobilisierten Enzyme war in beiden Systemen bescheiden. Zusätzlich zu einer schlechten Enzymmarkierung war das Hintergrundsignal auf Grund unspezifischer Oberflächenverschmutzungen dominant, wenn die Inhibitoren 3-5 in 1 mM Triton X-100 solubilisiert wurden. Eine 10-fache Steigerung der Konzentration von Triton X-100 reduzierte das Hintergrundsignal nicht. Daher ist die offensichtliche Bindung von ARPs an die Enzyme auf einem Chip sowohl eine Funktion der Enzym-ARP-Affinität als auch der ARP-Solubilisierung im wässerigen Inkubationspuffer, was wiederum von der Hydrophobi-zität der ARP abhängig ist. Die MME-Affinitäten für ARPs waren auf einem Chip sehr ähnlich wie in Lösung, außer bei den sehr hydrophoben Inhibitoren 3-5. Die Inhibitoraffinitäten von bCE waren nur für die ARPs 6-11 vergleichbar, die die ziemlich polaren Verbindungen darstellen. Insgesamt entsprechen die beobachteten Enzymaktivitäten auf einem Chip nicht in allen Fällen ihren funktionellen Eigenschaften in Lösung. Trotzdem weisen die vorliegenden Daten darauf hin, dass die Mikroanordnungen von immobilisierten Lipasen und Esterasen gut definierte Systeme sind, die für das zumindest qualitative oder semi-quantitative Enzymscreening auf Aktivitätsbasis in einem Format mit hohem Durchsatz verwendet werden können. Während Enzym-Mikroanordnungen nützliche Werkzeuge für das Screenen der Proteinaktivität in Bezug auf einen gegebenen

- 27 - (Substrat-analogen) Inhibitor sind, konnten ARP-Mikroanordnungen für die parallele Bestimmung der Präferenz eines gegebenen Enzyms für die einzelnen Kleinmoleküle auf einem Chip verwendet werden. Zusätzlich könnten ARP-Anordnungen helfen, ein allgemeines Problem im Zusammenhang mit der Proteinimmobilisierung auf Oberflächen zu umgehen. Die Immobilisierung von Enzymen auf festen Trägern ist ein kritischer Schritt und führt oft zu einem Sinken der Aktivität. Daher wurden die Kleinmolekülliganden immobilisiert, indem biotinylierte Aktivitätserkennungssonden auf mit Streptavidin beschichtete Glasslides gespottet wurden. Insbesondere wurde die Bindung von MME mit fluoreszierendem Tag an der biotinylierten ARP 2 auf einem Chip untersucht. Das Ausmaß der Lipid-Protein-Bindung war innerhalb eines ARP-Konzentrati-onsbereichs von 4,5 Größenordnungen gleich. Die kovalente Pro-tein-ARP-Bindung ist stöchiometrisch (1:1 Mol/Mol), und wenn ein Enzymmolekül einmal gebunden ist, sind aus sterischen Gründen viele in einem einzelnen Spot vorhandene ARPs nicht zugänglich. Daher ist die ARP-Dichte in einem Spot, die notwendig ist, um eine maximale Menge Enzym zu fangen, ziemlich gering. Kleinmolekül-Mikroanordnungen wurden hergestellt, indem 5 verschiedene biotinylierte Inhibitoren auf mit Streptavidin beschichtete Südes gespottet wurden, und wurden erfolgreich für das funktionelle Screening von MME mit ALEXA 647-Tag in Lösung eingesetzt. Die MME unterschied zwischen den einzelnen ARPs, wobei sie für den Inhibitor 22 die höchste Affinität zeigte. Außerdem korrelierte die Konzentration von MME in Lösung sehr gut mit den Fluoreszenzintensitäten auf dem Chip nach der Inkubation. Die Reduktion der Enzymkonzentration in der Inkubationslösungsphase um einen Faktor von 2 (von 14 auf 7 μg/ml) führte zu einem Sinken der abgelesenen Fluoreszenzintensität um den selben Faktor.

Markierte Enzyme werden für den Nachweis der Proteinbindung auf Kleinligandenanordnungen gebraucht, wenn Antikörper für derartige Enzyme nicht zur Verfügung stehen. Proteine können mit einer Minimalmenge Fluorophor gut markiert werden, wobei die funktionellen Eigenschaften des Enzyms erhalten bleiben. Heute werden zahlreiche Enzyme als rekombinante Proteine in geeigneten Wirtssystemen exprimiert. Um die Reinigung der Enzyme sowie die Identifizierung des überexprimierten Proteins im Wirt zu er-

NACHGEREICHT - 28 - leichtern, werden rekombinante Enzyme oft als Fusionsproteine mit einem Affinitäts-Tag exprimiert. Diese Tags können auch für die Identifizierung von Enzymen verwendet werden, falls diese an die Kleinmolekül-Mikroanordnung gebunden sind, z.B. auf Grund einer kovalenten Bindung durch die gespotteten Aktivitätserkennungssonden. Hier wird die Chipbindung von unbearbeiteten Zytoplasmaextrakten von C0S-7-Zellen beschrieben, die transient ex-primierte MGL mit 6 x His-Tag enthalten. Als zum Nachweis des primären Anti-6 x His-Antikörpers ein mit ALEXA-647 markierter Anti-Maus-Antikörper verwendet wurde, war die Empfindlichkeit zu gering, um die Bindung der assoziierten MGL zu messen. Die Bindung wurde jedoch beim Nachweis des His-Tags mit Hilfe eines Signalamplifizierungsverfahrens erfolgreich optisch dargestellt. Dazu wurde ein Anti-Maus-alkalische Phosphatase-Konjugat als sekundärer Antikörper verwendet, gefolgt von der Inkubation mit ELF 97-Phosphat. Die letztere Verbindung ist ein alkalisches Phosphatasesubstrat, das bei einer Enzym-vermittelten Hydrolyse einen fluoreszierenden Niederschlag bildet.

Dieses System wird für die Immunchemie, Western Blot-Analysen etc. in großem Umfang verwendet. Bei der vorliegenden Erfindung wird es zum ersten Mal als Mittel zum Nachweis in der Chip-Technologie beschrieben. Kurz gesagt wird ein starkes System auf Basis von Mikroanordnungen für das schnelle Screenen der ARP-Bindung an immobilisierte lipolytische Enzyme und umgekehrt der Proteinbindung an verschiedene auf einem Chip immobilisierte ARPs entwickelt. Dieses System könnte auch für andere biologisch relevante Wirkungen nützlich werden, einschließlich der Wirkung kompetitiver Inhibitoren, Substrate und Protein-Protein-Inter-aktionen. Es stellte sich heraus, dass Hydrogelslides die am besten geeignete Oberfläche für die Enzymchiptechnologie sind. Enzyme sowie ARPs konnten in funktioneller Form auf diese Systeme aufgetragen werden. Funktionelle ARP-Chips wurden alternativ dazu durch das Spotten von Derivaten mit Biotin-Tag auf mit Streptavidin gespotteten Slides hergestellt. Die Enzym-Ligand-Bindung wurde entweder durch die direkte Messung der Markierungsfluoreszenz oder, wenn die Enzyme aus der Lösung gefangen wurden, durch Amplifizieren der Fluoreszenzsignale nachgewiesen. Die obigen Techniken wurden auf die funktionelle Analyse von nachgereicht - 29 -

Lipasen und Esterasen unterschiedlichen Ursprungs (mikrobiell und tierisch) und unterschiedlicher Substratpräferenzen (Tri-acylglycerin-, Monoglycerin-, Cholesterinester- und Carbonsäu-reester-Hydrolasen) angewendet. Nun gibt es ständige Bemühungen, Routineanwendungen von Biochips für die Enzymanalyse in der Biotechnologie und Biomedizin zu optimieren.

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Claims (16)

1. 31 Patentansprüche: 1. Protein-Anordnung, umfassend zumindest ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase, auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme auf diesem festen Träger zumindest teilweise mit einer Hydrogel-Matrix bedeckt sind.
2. 2. Anordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrogel-Matrix Dextran, Gelatine, Polyurethan, Polyacrylamid, Polyamid, Polyacrylamid, Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polymethylacrylat, Polystyrol und Copolymere von Polystyrol, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyethylenoxid, Polyvi-nylpyrrolidon oder Kombinationen davon umfasst.
3. 3. Anordnung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nylon, Polystyrol, Glas, Latex, aktivierter Zellulose, Glas, Siliziumdioxid, modifiziertem Silizium, Keramik, Plastik, Zr02, Gold, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, (Poly) tetrafluorethylen, (Poly)vinylidendifluorid, Polyacrylamid und Kombinationen davon, umfasst.
4. 4. Anordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrogel-Matrix eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimid, Streptavidin, Biotin, Antikörpern, Oligonukleotiden, Oligodes-oxynukleotiden und Kombinationen davon, umfasst.
5. 5. Anordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zumindest eine Enzym mit Streptavidin, Biotin, Antikörpern, Oligonukleotiden, Oligodesoxynukleotiden oder Kombinationen davon konjugiert ist.
6. 6. Anordnung, umfassend zumindest eine Verbindung, die zumindest ein an eine Oberfläche eines festen Trägers gebundenes Enzym inhibiert oder potentiell inhibiert, dadurch gekennzeichnet, I nachgereicht 1 32 dass die Verbindung mit Biotin konjugiert ist oder ein Ester, vorzugsweise ein p-Nitrophenylphosphonsäureester, ist.
7. 7. Anordnung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Verbindung ausgewählt ist aus den Verbindungen mit den Formeln 1 bis 23, die in Fig. 2A, 2B und 2C angeführt sind.
8. 8. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Bindung einer Verbindung an ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase, umfassend die Schritte: a) Zur-Verfügung-Stellung I) einer Protein-Anordnung, die dieses Enzym umfasst, oder II) einer Anordnung, die zumindest eine Verbindung umfasst, die dieses an einen festen Träger gebundene Enzym inhibiert oder potentiell inhibiert, b) In-Kontakt-Bringen der Anordnung I) mit zumindest einer Verbindung, die dieses Enzym inhibiert oder potentiell inhibiert, oder In-Kontakt-Bringen der Anordnung II) mit einem Enzym, das einen Inhibitor/Enzym-Komplex bildet, und c) Nachweis der Bindung der zumindest einen Verbindung an dieses Enzym.
9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-Anordnung I) eine Anordnung ist, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist, und Anordnung II) eine Anordnung ist, wie sie in Anspruch 6 definiert ist.
10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Verbindung ein Ester ist, vorzugsweise ein p-Nitrophenylphosphonsäureester.
11. 11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Verbindung ausgewählt ist aus den Verbindungen mit den Formeln 1 bis 23, die in Fig. 2A, 2B und 2C angeführt sind. I NACHGEREICHT - 33 -
12. 12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis .11, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Verbindung biotinyliert ist.
13. 13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der zumindest einen Verbindung an das Enzym nachgewiesen wird, indem die Anordnung mit einem ersten Antikörper, der gegen das Enzym oder die zumindest eine Verbindung gerichtet ist, und gegebenenfalls mit einem zweiten Antikörper, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist, in Kontakt gebracht wird, wobei der erste oder zweite Antikörper mit einem Enzym, einem Fluorophor, einem Biotin, einem Enzymsubstrat oder irgendeinem anderen Affinitäts-Tag markiert ist.
14. 14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase und Luciferase.
15. 15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorophor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyaninen, Merocyaninen, Boradiazaindacen, Rhodaminen, Anthracenen, Nitrobenzoxadiazolen und Kombinationen davon.
16. 16. Set zum Nachweis der Bindung einer Verbindung an ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase und Esterase, umfassend: - eine Anordnung, bedeckt mit einem Hydrogel, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, - eine Lipase und/oder eine Esterase und - gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der Bindung der Verbindung an dieses Enzym. AP/Se j NACHGEREICHT