DE102006003603A1

DE102006003603A1 - Vernetzbare multifunktionelle Träger für (niedermolekulare) Liganden und deren Anwendung in der Analytik sowie Verfahren zu deren Herstellung und Vernetzung

Info

Publication number: DE102006003603A1
Application number: DE200610003603
Authority: DE
Inventors: Heiko Andresen
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2006-01-25
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2026-01-26
Also published as: WO2007085403A2; WO2007085403A3; DE102006003603B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft vernetzbare multifunktionelle Träger für insbesondere niedermolekulare Liganden und deren Anwendung in der Analytik sowie Verfahren zu deren Herstellung und Vernetzung. Die erfindungsgemäßen Träger weisen mindestens zwei verschiedene, zueinander nicht komplementäre selektive Kopplungsfunktionen auf, die nicht mit dem gleichen Kopplungspartner reagieren können, wobei eine Kopplungsfunktion zur Kopplung an einen Liganden, vorzugsweise einen niedermolekularen Liganden, vorgesehen ist und mindestens eine weitere, davon verschiedene Kopplungsfunktion zur Bindung an eine immobilisierende Oberfläche und/oder zur Vernetzung der Träger untereinander vorgesehen ist. Die Erfindung betrifft auch die durch Vernetzung dieser Träger hergestellten dreidimensionalen Strukturen. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist zumindest ein Teil der vernetzbaren bzw. vernetzten Träger auch an eine immobilisierende Oberfläche gebunden.

Description

Hintergrund der Erfindung
Biochemisch aktive Substanzen, insbesondere niedermolekulare Substanzen, haben während der letzten Jahre zunehmende Bedeutung als analytische Spezies bekommen. Kurze Peptidsequenzen, die immundominante, lineare Epitope von Proteinantigenen substituieren, finden Anwendung als immobilisierte Sonden in miniaturisierten und parallelisierten immunologischen Analysetechniken. In vergleichbaren Formaten werden immobilisierte Peptide für die hochparallele Identifizierung von Enzymsubstraten und Inhibitoren sowie für die Ermittlung potentieller Proteinliganden in der Wirkstoffforschung verwendet. Der Einsatz von DNA- und RNA-Sonden in verschiedensten Anwendungen gewinnt ebenfalls zunehmend an Bedeutung. Kohlenhydrate werden in immobilisierter Form für Studien kohlenhydratvermittelter molekularer Abläufe verwendet, niedermolekulare organische Substanzen aus kombinatorischen Chemiebibliotheken werden in Mikroarray-Formaten für die Selektion von Proteinliganden und pharmazeutischen Wirkstoffen eingesetzt.

In vielen Anwendungen können diese Moleküle, z.B. Peptide und Kohlenhydrate, aus Makromolekülen abgeleitet werden und die biochemische Funktion ihres Herkunftsmoleküls ersetzen. Besondere Vorteile niedermolekularer Substanzen für den Einsatz in der Bioanalytik ergeben sich aus den folgenden Umständen: (i) Anders als Makromoleküle, z.B. Proteine, lassen sich viele dieser Substanzen mit etablierten Verfahren synthetisch und besonders wirtschaftlich herstellen. (ii) Niedermolekulare Substanzen erweisen sich häufig als chemisch und physikalisch besonders resistent gegenüber äußeren Einflüssen. (iii) Durch die synthetische Herstellung lassen sich die Moleküle definiert mit ungewöhnlichen oder nicht natürlichen Resten versehen, die im weiteren Verlauf bestimmte Funktionen, z.B. bei der gerichteten Kopplung oder der biochemischen Aktivität, übernehmen.

In vielen Anwendungen solcher niedermolekularen Substanzen ist deren Kopplung als Liganden an makromolekulare Strukturen, z.B. an Trägerproteine oder immobilisierende Oberflächen, vorteilhaft. Die Kopplung der Liganden an Trägermoleküle führt zu einer räumlichen Struktur und folglich zu einer Vergrößerung der Oberfläche, auf der die Liganden präsentiert werden können. Darüber hinaus können die Trägermoleküle als Vermittler oder Verstärker der biologischen Funktion des Liganden eine Rolle spielen. Eine solches Beispiel ist die Kopplung von niedermolekularen Antigenen, sog. Haptenen, an Trägermoleküle zur Erhöhung der Antigenität aus dem Bereich der molekularen Immunologie. Die Immobilisierung von niedermolekularen Molekülen, z.B. Analyten oder spezifischen Bindungspartnern dafür, an Oberflächen bietet z.B. Vorteile bei der Abtrennung von nicht umgesetzten Reaktanden, Verunreinigungen oder Lösungsmitteln.

Die Kopplung niedermolekularer Substanzen an Träger oder immobilisierende Oberflächen, insbesondere für deren Einsatz als biologische Sonden, geschieht vorzugsweise selektiv und gerichtet. Im Fall von niedermolekularen Liganden mit biologischer Aktivität, z.B. Peptiden und Kohlenhydraten, trägt in der Regel ein hoher Anteil der funktionellen Gruppen des Liganden zu dessen biologischer Aktivität bei. Aus diesem Grund führt die ungerichtete Kopplung solcher Moleküle häufig zu einer Modifikation der funktionellen Gruppen und zwangsläufig zu einer Beeinflussung bis hin zum Verlust der biologischen Aktivität. Die gerichtete Kopplung über selektive Rektionsmechanismen vermeidet dieses Problem: Ligand und Trägermatrix besitzen wechselseitig reaktive, bioorthogonale Linkerfunktionen oder werden synthetisch mit diesen ausgestattet, die im nächsten Schritt selektiv miteinander reagieren können und zu stabilen Konjugaten oder Komplexen führen. Als bioorthogonal werden solche Funktionen bezeichnet, die sich unreaktiv gegenüber den übrigen Funktionen der (bio)chemischen Umgebung verhalten. Die nativen funktionellen Gruppen der biologischen Moleküle bleiben daher bei einer solchen Reaktion unbeeinflusst.

Die im Stand der Technik bekannten Analyseverfahren, bei denen niedermolekulare Analyten als Liganden an Trägermoleküle gekoppelt oder auf Oberflächen immobilisiert werden, weisen trotz der oben genannten Vorteile dieser Kopplungstechniken immer noch gewisse Nachteile auf. Beispielsweise ist die Bindungskapazität der Trägermatrices oft nicht sehr hoch und damit die Sensitivität des jeweiligen Analyseverfahrens nicht befriedigend. Ferner ist die direkte Kopplung von niedermolekularen Liganden auf planaren Oberflächen häufig mit einer sterischen Behinderung, d.h. einer eingeschränkten Zugänglichkeit der Liganden für die Moleküle in der zu analysierenden Flüssigphase verbunden. Resultat sind niedrigere Sensitivitäten, bzw. es wird eine Verlängerung der Analysedauer notwendig, die unter bestimmten Umständen die sterische Hinderung kompensieren kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, neue verbesserte Träger für den breiten Einsatz in der Analytik, insbesondere Bioanalytik, bereitzustellen, mit denen die Handhabung, Kosteneffizienz und Analysesensitivität von solchen herkömmlichen Verfahren und Assays zur Analyse von chemischen Substanzen, insbesondere von niedermolekularen Substanzen mit biochemischer Aktivität, erleichtert bzw. erhöht werden kann. Eine damit verbundene Aufgabe ist die Bereitstellung eines besonders vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung solcher Träger.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung der vernetzbaren bzw. vernetzten multifunktionellen Träger mit den Merkmalen der Ansprüche 1–12, deren Verwendung in der Analytik nach den Ansprüchen 13–21 und die Verfahren zur Herstellung dieser Träger nach den Ansprüchen 22–26.

Beschreibung der Erfindung

Ein erfindungsgemäßer Träger besitzt mindesten zwei verschiedene, zu einander nicht komplementäre selektive Kopplungs- oder Linkerfunktionen, die nicht mit dem gleichen Kopplungspartner reagieren können, wobei eine erste Kopplungsfunktion zur Kopplung an einen Liganden, vorzugsweise einen niedermolekularen Liganden, vorgesehen ist und mindestens eine weitere, davon verschiedene Kopplungsfunktion zur Bindung an eine immobilisierende Oberfläche und/oder zur Vernetzung der Träger untereinander vorgesehen ist.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Träger bietet folgende Vorteile:
Sobald ein Träger mit den benötigten Linkerfunktionen vorliegt, sind im weiteren Verlauf der Kopplungsreaktionen weder sequentielle Aktivierungsschritte noch Reinigungsschritte notwendig, da aufgrund der Selektivität und Orthogonalität der Linkerfunktionen alle Reaktanden neben einander vorliegen können. Trotz der Multivalenz des Trägers besteht keine Gefahr einer unkontrollierten Polymerisationsreaktion. Die Kopplung von Trägern und Liganden erfolgt gerichtet über wechselseitig reaktionsspezifische (komplementäre) Linkergruppen, so dass keine der nativen funktionellen Gruppen des Liganden durch die Bindung beeinflusst wird. Nach der Kopplung von Träger und Ligand ist keine Reinigung der Produkte von überschüssigen Liganden notwendig, da sich die Linkerfunktion des Liganden unreaktiv gegenüber der Linkerfunktion der immobilisierenden Oberfläche verhält. Die ungereinigte Produktlösung kann direkt auf die Oberfläche appliziert werden und gestaltet sich dadurch verlustfrei und effizient. Die Oberflächenbindung findet nur zwischen den Linkerfunktionen der Träger und der Oberfläche statt. In der Folge werden überschüssige Liganden bei weiteren Verfahrensschritten einfach weggewaschen.

Die niedermolekularen Liganden werden an einen makromolekularen Träger gekoppelt, wodurch (i) die präsentierende Oberfläche vergrößert wird, (ii) die präsentierende Oberfläche eine räumliche Struktur erhält und (iii) sich die biochemische Aktivität der Liganden verstärken kann. Diese Kopplung kann frei in Lösung und mit einem Überschuss des Liganden durchgeführt werden, da die weiteren Linkerfunktionen des Trägers unreaktiv gegenüber der Linkerfunktion des Liganden sind (siehe oben). Die Kopplung in Lösung läuft in der Regel schneller und effizienter als auf der Oberfläche ab und ist daher gegenüber der ebenfalls möglichen Verfahrensvariante einer Oberflächenreaktion bevorzugt.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Träger beruht auf ihrer Vernetzbarkeit zu dreidimensionalen räumlichen Strukturen. Diese Vernetzung kann typischerweise durch die Zugabe von bifunktionellen oder multifunktionellen Vernetzungsreagenzien oder durch die Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Trägerspezies mit komplementären Kopplungsfunktionen initiiert werden. Durch die Vernetzung kommt es zu einer Stabilisierung der gekoppelten Träger und zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerkes mit einem sehr hohen Anteil an Ligandenmolekülen. In einer speziellen Ausführungsform sind an der Vernetzung auch oberflächengebundene Träger beteiligt. Auch hier kommt es zu einer Stabilisierung von oberflächengebundenen Trägern und zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerks durch Konjugation von Trägern in der Flüssigphase mit denen auf der Oberfläche. In beiden Fällen ist die Folge eine erhöhte Stabilität und eine erhöhte Bindungskapazität der Matrices, welche Effekte wiederum die Analysesensitivität der Assays erhöhen, in denen diese Träger und Matrices eingesetzt werden. Der Begriff „Matrix" wird hier im Sinne einer dreidimensionalen Struktur mit der Kapazität zur biologischen bzw. biochemischen Wechselwirkung mit Molekülen verwendet. Die Oberflächenbindung einer solchen Matrix ist ein weniger häufiger Fall, aber z.B. in der Chiptechnologie erforderlich. Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „Oberfläche", an den die erfindungsgemäßen Träger gebunden werden können, eine Oberfläche, welche den daran gebundenen Träger immobilisiert, d.h. zu einem Bestandteil einer festen Phase macht. Die erfindungsgemäßen makromolekularen Träger selbst, auch in Form von Partikeln oder Beads, die solubilisiert oder dispergiert/suspendiert in einer Flüssigphase vorliegen, stellen keine Oberfläche in diesem Sinne dar.

Aufgrund des Verzichts auf Reinigung und Aktivierung gestaltet sich die Reaktion äußerst sparsam und effizient. Besondere Attraktivität erhält die Methode aus der Möglichkeit, dass Oberflächenbindung und Vernetzung in situ durchgeführt werden können (z.B. im Mikrovolumen). Diese Verfahrenführung verspricht höchste Effizienz bei minimalen Verbrauchsmengen.

Die erfindungsgemäßen selektiven Kopplungen zwischen Ligand und Träger, Oberfläche und Träger oder zwischen zwei Trägermolekülen können sowohl kovalenter als auch affiner Natur sein.

Bei einer Affinitätskopplung oder Affinitätsbindung entsteht eine nicht-kovalente Bindung zwischen zwei Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares. Einige typische nicht-beschränkende Beispiele hierfür sind Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, Antikörper/Antigen, Rezeptor/Ligand, Lektin/Saccharid, DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA etc. Weitere geeignete Beispiele sind dem Fachmann bekannt oder unschwer in der Literatur zu finden. Ein bevorzugtes und etabliertes System für die affine Kopplung ist die Biotin-Avidin-Affinität. Avidin und seine bakteriellen Analoga (z.B. Streptavidin) binden hochspezifisch Biotin über Wasserstoffbrücken. Die Stabilität der Bindung kommt der einer kovalenten Kopplung sehr nahe.

Alternativ kann die Kopplung auf einer kovalenten Bindung zwischen einer spezifischen reaktiven Gruppe auf dem Träger und einer damit reaktionsfähigen komplementären Gruppe auf dem Liganden oder der Oberfläche oder einem anderen Träger oder einem Vernetzungsreagenz beruhen.

Vorzugsweise handelt es sich bei diesen kovalenten Kopplungsreaktionen um sogenannte chemoselektive Ligationen. Als chemoselektive Ligationen werden hochselektive, in vivo kompatible kovalente chemische Reaktionen bezeichnet. Bei diesem Reaktionstyp werden vorzugsweise Moleküle, z.B. Biomoleküle, über wechselseitig reaktive Linkerfunktionen konjugiert. Die Reaktivität der Gruppen verhält sich orthogonal zu der Reaktivität anderer funktioneller Gruppen in den koppelnden Molekülen oder von anderen Molekülen in der Umgebung. Die chemoselektive Ligation erlaubt daher auch die gerichtete kovalente Kopplung ungeschützter niedermolekularer Substanzen an Trägermatrices in wässrigen Lösungsmitteln und unter physiologischen Bedingungen. Einige nicht-beschränkende Beispiele für Reaktionstypen, die hier erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind die Reaktion zwischen einer Aminofunktion oder Sulfhydrylfunktion und einer, vorzugsweise aktivierten, Carboxyfunktion, die Reaktion von Hydraziden oder Hydrazinen mit elektrophilen Gruppen, z.B. Carbonylen oder Epoxiden (vgl. Mahal et al., 1997, Science, 276, 1125–1128), die Reaktion von elektrophilen Gruppen, z.B. Carbonylen, mit Aminooxygruppen, Thiosemicarbaziden oder Beta-Aminothiolen oder von Thiocarboxylaten mit Alpha-Halogen-Carbonylen, oder eine Staudinger-Ligation (Nilsson et al., 2000, Org Lett, 2, 1939–1941) oder eine 1,3-dipolare Cycloaddition von Aziden und Alkinen (Kolb et al., 2001, Angew Chem, 113, 2056–2075). Weitere geeignete Reaktionen können unschwer vom Fachmann ermittelt werden.

Als Kopplungsfunktionen können entweder natürliche Funktionen der vorgesehenen Kopplungspartner verwendet werden oder diese Kopplungspartner (Oberfläche, Träger, Liganden) werden in Standard-Konjugationsverfahren über Linker mit geeigneten Funktionen versehen (vgl. 2A und 2B). Solche Linker werden in der Regel bifunktionell sein, wobei eine funktionelle Gruppe des Linkers mit einer funktionellen Gruppe des zu modifizierenden Kopplungspartners reagieren kann und die zweite funktionelle Gruppe die gewünschte Kopplungsfunktion bereitstellt. In Abhängigkeit von den natürlichen funktionellen Gruppen der Kopplungspartner (bei Peptiden/Proteinen z.B. Amino-, Sulfhydryl-, Carboxyfunktionen der Aminosäureseitenketten), die eine damit reaktionsfähige Gruppe des Linkermoleküls erforderlich machen (z.B. eine aktivierte Carboxyfunktion zur Reaktion mit einer Amino- oder Sulfhydrylfunktion und umgekehrt), und der Art der gewünschten Kopplungsfunktionen, z.B. solche, die eine der oben speziell genannten kovalenten oder nicht-kovalenten Kopplungsreaktionen ermöglichen, ergibt sich somit ein sehr breites Spektrum an Variationsmöglichkeiten für solche Linker. Ein Vielzahl geeigneter Linkerfunktionen, sowohl für kovalente Kopplungen als auch Affinitätskopplungen, sind im Handel erhältlich oder können im Bedarfsfall unschwer mit chemischen Standardverfahren gewissermaßen maßgeschneidert hergestellt werden. Einige nicht-beschränkende Beispiele sind die Modifizierung eines Trägers oder Liganden mit einer Biotingruppe und die gerichtete Kopplung an einen Kopplungspartner mit einer Avidingruppierung und/oder die Einführung einer Hydrazidgruppierung zur Kopplung mit z.B. einer Aldehydgruppierung. Natürliche Kopplungsfunktionen können nur verwendet werden, wenn die erforderliche Selektivität, d.h. ausschließliche Reaktivität mit dem vorgesehenen Kopplungspartner, gegeben ist.

Niedermolekulare Liganden werden in der Regel nur eine Kopplungs- oder Linkerfunktion aufweisen, während die Träger mit einer Mehrzahl/Vielzahl jeder Linkerfunktion versehen sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Träger zu dreidimensionalen räumlichen Strukturen vernetzt. Diese Vernetzung kann durch die Zugabe von bifunktionellen oder multifunktionellen Vernetzungsreagenzien oder durch die Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Trägerspezies mit komplementären Kopplungsfunktionen initiiert werden. Durch die Vernetzung kommt es zu einer Stabilisierung der gekoppelten Träger und zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerkes mit einem sehr hohen Anteil an Ligandenmolekülen. In einer speziellen Ausführungsform sind an der Vernetzung auch oberflächengebundene Träger beteiligt. Auch hier kommt es zu einer Stabilisierung von oberflächengebundenen Trägern und zur Ausbildung eines dreidimensionalen Netzwerks durch Konjugation von Trägern in der Flüssigphase mit denen auf der Oberfläche.

Die Vernetzungsreagenzien können homofunktionell sein, wenn gleiche Linkerfunktionen miteinander verbunden werden sollen, oder heterofunktionell, wenn sich die Linkerfunktionen in ihrer Reaktivität unterscheiden. Geeignete Vernetzungsreagenzien sind im Stand der Technik bekannt und im Handel erhältlich. Einige nicht-beschränkende Beispiele hierfür sind Glutaraldehyd und andere Bis-Aldehyde, sowie Bis-Epoxide und Bis-NHS-Ester. Die Ermittlung weiterer geeigneter Reagenzien in Abhängigkeit von den gegebenen Kopplungsfunktionen liegt im Rahmen der Fähigkeiten und Kenntnisse eines Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet.

Zur Vernetzung der Träger untereinander kann die gleiche Kopplungsfunktion, die zur Bindung der Träger an eine immobilisierende Oberfläche verwendet wurde, oder eine weitere unabhängige Kopplungsfunktion eingesetzt werden. Auf jeden Fall sollte zur Vernetzung eine Kopplungsfunktion verwendet werden, welche von der für die Kopplung der Liganden verwendeten Kopplungsfunktion verschieden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform geschieht die Vernetzung in situ, d.h. zum Beispiel im Verlauf eines Verfahrens zur Untersuchung eines Analyten, z.B. einer niedermolekularen Substanz. Dies ist besonders vorteilhaft, da keine separaten Synthese- und Aufarbeitungsschritte nötig sind und die Vernetzungsreaktion besonders schnell und unter geringem Materialverbrauch, z.B. im Mikromaßstab, stattfinden kann.

Als erfindungsgemäße Träger kommen alle multifunktionellen und vorzugsweise vernetzbaren Moleküle in Frage, die groß genug sind, um als Träger zu fungieren. Typische nicht-beschränkende Beispiele hierfür sind Proteine, Polysaccharide oder andere organische oder anorganische Polymere. Geeignete Polymere sind beispielsweise Polyalkylenglycole, z.B. Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyalginat, Polyglycolsäure, Polyalkylenimine, z.B. Polyethylenimin, Poly-L-Lysin, Polysaccharide, z.B. Cellulose, Dextran, Polysilane, Polysiloxane, Polyphosphate, Latex, Poly(meth)acrylate, Polystyrol und andere Kunststoffe. Die Träger werden häufig in Form von Partikeln, insbesondere Nanopartikeln (z.B. aus Latex oder koagulierten Proteinen), oder Beads (z.B. aus Latex, Chitosan, Polystyrol oder einem anderen geeigneten Polymer) eingesetzt.

Grundsätzlich sind alle herkömmlicherweise verwendeten Trägermoleküle geeignet, die über die erfindungsgemäß erforderlichen Kopplungsfunktionen verfügen oder sich damit versehen lassen. Gewünschten- oder erforderlichenfalls können die Träger zusätzlich eine nachweisbare Gruppierung, beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, Enzymmarkierung oder radiaktive Markierung enthalten. Partikel oder Beads können z.B. einen magnetischen oder paramagnetischen Bestandteil enthalten. In der Regel wird das Trägermolekül mindestens etwa das vierfache Volumen des Liganden einnehmen, damit es zu einer deutlichen Vergrößerung der ligandenpräsentierenden Oberfläche kommt. Aufgrund der erfindungsgemäß möglichen Vernetzung der Träger kann die gewünschte Oberflächenvergrößerung jedoch auch indirekt durch die Vernetzung erfolgen, so dass auch geringere Größenverhältnisse möglich sind, bei denen der Träger im wesentlichen nur noch die Funktion eines verbindenden Bausteins im räumlichen Netzwerk übernimmt.

Als Liganden für die erfindungsgemäßen Träger kommen grundsätzlich Moleküle aller Stoffklassen in Frage, die über die erforderliche Kopplungsfunktion verfügen oder sich damit versehen lassen. Einige nicht-beschränkende Beispiele hierfür sind Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Steroide oder andere organische oder anorganische Substanzen.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um niedermolekulare Substanzen mit einem typischen Größenbereich zwischen 200 und 5000 Dalton, bevorzugter zwischen 500 und 2500 Dalton. Die niedermolekularen Substanzen können beispielsweise organische Substanzen aus einer kombinatorischen chemischen Bibliothek oder Peptide aus einer Peptidbibliothek sein.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Liganden um biologisch/biochemisch aktive Moleküle, die eine biologische und/oder biochemische Funktion in vivo oder in vitro ausüben können.

Ein Haupteinsatzgebiet der erfindungsgemäßen Träger ist die Analytik, insbesondere Bioanalytik. Als Analyseverfahren in denen diese Träger Anwendung finden können, kommen beispielsweise alle Verfahren des Standes der Technik in Frage, bei denen untersuchte Analyten oder Sonden als Liganden an Träger gekoppelt oder an Oberflächen immobilisiert werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, in denen niedermolekulare Liganden eingesetzt werden. Der Begriff „Analyt", wie hier verwendet, bezeichnet das Zielmolekül des Analyseverfahrens, das Gegenstück dazu ist die Sonde. Die niedermolekularen Liganden können also als Sonden fungieren, wenn sie dazu dienen, bestimmte Zielmoleküle (z.B. Antikörper) in einer komplexen Analyselösung (z.B. Serum) nachzuweisen. Die Liganden können aber auch der Analyt selbst sein, wenn z.B. unter einer großen Anzahl immobilisierter Liganden einer gefunden werden soll, der an ein bestimmtes Protein binden soll (z.B. ein Rezeptor, Stichwort Wirkstoffscreening).

Einige nicht-beschränkende Beispiele geeigneter typischer Analyseverfahren sind Nukleinsäure-Assays, Protein-Assays, Immunoassays, enzymatische Assays, Rezeptorbindungs-Assays, ELISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretische und chromatographische Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetrische Assays, mikroskopische und spektroskopische Nachweismethoden, Assays unter Anwendung von Biochip- oder Mikroarray-Technologie oder Verwendung von Beads.

Figurenbeschreibung

1 demonstriert das Prinzip der gerichteten Kopplung von verschiedenen Kopplungspartnern über selektive Reaktionsmechanismen, jedoch ohne Vernetzung. Ligand und Kopplungspartner (hier eine Oberfläche) besitzen wechselseitig reaktive (komplementäre) Linkerfunktionen (A und B), die selektiv miteinander reagieren und zu stabilen Kopplungsprodukten führen.

2 ist eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Träger und deren Verwendung zur in situ-Herstellung eines dreidimensionalen Netzwerks aus niedermolekularen Liganden und Trägern, die teilweise auf einer Oberfläche immobilisiert sind.

2A Ein Träger wird mit zwei entgegengesetzt reaktiven, bioorthogonalen Linkerfunktionen (L-1A, L-2A) ausgestattet.

2B Ein zu koppelnder niedermolekularer Ligand wird mit einem Linker ausgestattet, der zu einer der Linkerfunktionen des Trägers den komplementären Reaktionspartner bildet (L-1B).

2C Die Liganden werden in einer Reaktion an die Träger gekoppelt, bei der die Kopplung selektiv über die komplementären Linkerfunktionen einer der bioorthogonalen Reaktionen abläuft (L-1A und L-1B).

2D Die Konjugate aus Träger und Ligand werden auf eine immobilisierende Oberfläche appliziert und die Konjugate über die zweite Linkerfunktion des Trägers (L-2A), zu der die Oberfläche den komplementären Reaktionspartner besitzt (L-2B), an die Oberfläche gebunden.

2E Anschließend werden freie Linkerfunktionen des zweiten Typs (L-2A) der Träger über geeignete bi- oder multifunktionale Vernetzungsreagenzien (durch ein X gekennzeichnet) konjugiert, so dass sich dreidimensionale Netzwerke zwischen oberflächengebundenen Trägern und Trägern in der darüber liegenden Flüssigphase (z.B. in einem Mikrospot) ausbilden.

3 Schematischer Ablauf der in Beispiel 1 beschriebenen Konzeptstudie. Streptavidin wird über EDC-Aktivierung mit Hydrazidfunktionen modifiziert, die neben der Biotin-Affinität die zweite selektive Kopplungsfunktion darstellen. Biotinylierte Peptidliganden werden in einer Flüssigphasenreaktion gerichtet an Streptavidin gekoppelt und die Reaktionsgemische direkt auf Aldehydoberflächen gedruckt. Unter chemoselektiven Reaktionsbedingungen werden die Peptid-Streptavidinkomplexe über die Hydrazidfunktionen definiert an die Oberfläche gebunden. In der Folge werden durch Zusatz des homobifunktionellen Vernetzers Glutaraldehyd dreidimensionale Konjugate aus oberflächengebundenem SAHz und SAHz in der Flüssigphase generiert.

4 Ergebnisse des Konzeptstudie. Die Fluoreszenzbilder zeigen einen beispielhaften Detailausschnitt des Peptid-Microarrays nach der Antikörperanalyse in Falschfarbendarstellung. Der Farbverlaufsbalken am rechten Bildrand gibt die Übertragung der Fluoreszenzintensität (von schwarz = keine Fluoreszenz nach weiß = Sättigung) in Farbstufen an. Das linke Bild zeigt die Fluoreszenzintensität im Cy3 Kanal (Laserpower 10%, Gain 400) und entspricht der gebundenen Proteinmenge auf der Oberfläche. Das rechte Bild zeigt die Fluoreszenzintensität im Cy5 Kanal (Laserpower 20%, Gain 400) und entspricht der Menge gebundener Antikörper aus der Analyselösung.

Das folgende Ausführungsbeispiel dient zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Das Konzept der vorliegenden Erfindung wird bei der Herstellung eines Peptid-Microarrays für die Antikörperdiagnostik erprobt. Bei dieser Technik dienen synthetische Peptide als Ersatz für Proteinantigene. Im vorliegenden Fall bildet Streptavidin das Trägermolekül für die Peptidliganden. Die Biotin-Avidin-Affinität bildet demnach die erste selektive Linkerfunktion, während die zweite Funktion, ein Hydrazid linker, durch eine chemische Modifizierung eingeführt wird. Der folgende Versuchsablauf ist schematisch in 3 zusammengefasst.
Fluoreszenzmarkiertes Streptavidin (2 mg/mL in 100 mM Phosphatpuffer pH 6,0 + 150 mM NaCl) wird über EDC-Aktivierung (32 mg/mL EDC) mit Adipinsäuredihydrazid (32 mg/mL) modifiziert (12 h Reaktionszeit bei +4°C). Streptavidin-Hydrazid (SAHz) und unmodifiziertes Streptavidin zur Kontrolle werden für die Kopplung von jeweils drei verschiedenen biotinylierten Peptidantigenen (Pol, Hel, Con, vgl. Tab. 1) verwendet.
Tab. 1: Peptidbezeichnung, Modifikation und Aminosäuresequenz
Die Kopplung findet in Lösung mit einem 10fachen molaren Überschuss der Peptide gegenüber der eingesetzten SAHz-Menge statt (12 h, +4°C). Die Protein-Peptid-Komplexe (0,2 mg/mL in MES Puffer pH 4,7) werden ohne weiteren Reinigungsschritt mit einem piezoelektrisch gesteuerten Dispensiersystem (sciFLEX Arrayer, Scienion AG, Berlin, Deutschland) ortsaufgelöst auf aldehyd-voraktivierte Glasobjektträger (Schott Nexterion Slide AL, Schott Nexterion AG, Jena, Deutschland) gedruckt. Nach einer kurzen Inkubationszeit (2 h) wird in jeden Mikrospot die Vernetzungsreagenz Glutaraldehydlösung dispensiert (350 pL, Endkonzentration 0,5% w/v). Die Objektträger werden über Nacht inkubiert und anschließend gewaschen und geblockt.
Für die Antikörperanalyse werden die monoklonalen Anti-Peptid-Antikörper (Pol-mAk, Hel-mAk und Con-mAk, je 1 μg/mL in PBS, pH 7,4) auf den bedruckten Flächen der Objektträger inkubiert (2 h, Raumtemperatur). Die Objektträger werden gewaschen und anschließend mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper inkubiert (Cy5-Antimaus-Ziegenantikörper, 10 μg/mL in PBS, pH 7,4, 1 h, Raumtemperatur). Nach erneutem Waschen werden die Objektträger getrocknet und im Fluoreszenzscanner (GenePix Professional 4200A, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA) ausgelesen.
Die Auswertung des Versuchs zeigt, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Träger zu deutlich besseren Ergebnissen führt. Es werden etwa 10-fach größere Mengen des hydrazidaktivierten Streptavidins im Vergleich zum unmodifizierten Streptavidin auf der Aldehydoberfläche gebunden (4). Die Antikörperanalyse macht deutlich, dass die höhere Streptavidinmenge gleichzeitig durch die größere Anzahl der Peptidliganden im Mikrospot zu höheren Bindungskapazitäten und Analysesensitivitäten führt und zeigt, dass die Peptidliganden von den Vernetzungsreaktionen unbeeinflusst bleiben und ihre biochemische Funktionalität behalten.

Claims

Träger mit mindesten zwei verschiedenen, zu einander nicht komplementären selektiven Kopplungsfunktionen, die nicht mit dem gleichen Kopplungspartner reagieren können, wobei eine erste Kopplungsfunktion zur Kopplung an einen Liganden, vorzugsweise einen niedermolekularen Liganden, vorgesehen ist und mindestens eine weitere, davon verschiedene Kopplungsfunktion zur Bindung an eine immobilisierende Oberfläche und/oder zur Vernetzung der Träger untereinander vorgesehen ist.
Träger mit mindesten zwei verschiedenen, zu einander nicht komplementären selektiven Kopplungsfunktionen, die nicht mit dem gleichen Kopplungspartner reagieren können, welcher über eine erste Kopplungsfunktion selektiv an einen Liganden gekoppelt ist und über eine davon verschiedene zweite Kopplungsfunktion an eine immobilisierende Oberfläche gebunden ist.
Träger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie über eine erste Kopplungsfunktion selektiv an einen Liganden gekoppelt sind und über eine davon verschiedene zweite oder weitere Kopplungsfunktion miteinander vernetzt sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung der Träger mit den Liganden und/oder der Oberfläche und/oder die Vernetzung der Träger auf einer nicht-kovalenten Bindung zwischen zwei Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares, z.B. Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, Antikörper/Antigen, Rezeptor/Ligand, Lektin/Saccharid, DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA, oder einer kovalenten Bindung zwischen einer spezifischen reaktiven Gruppe auf dem Träger und einer damit reaktionsfähigen komplementären Gruppe auf dem Liganden oder der Oberfläche oder einem anderen Träger oder einem Vernetzungsreagenz beruht.
Träger nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung das Ergebnis einer Reaktion zwischen einer Aminofunktion oder Sulfhydrylfunktion und einer, vorzugsweise aktivierten, Carboxyfunktion, der Reaktion von Hydraziden oder Hydrazinen mit elektrophilen Gruppen, z.B. Carbonylen oder Epoxiden, der Reaktion von elektrophilen Gruppen, z.B. Carbonylen, mit Aminooxygruppen, Thiosemicarbaziden oder Beta-Aminothiolen oder von Thiocarboxylaten mit Alpha-Halogen-Carbonylen, oder das Ergebnis einer Staudinger-Ligation oder einer 1,3-dipolaren Cycloaddition von Aziden und Alkinen ist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger Proteine oder organische oder anorganische Polymere umfassen.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger Partikel, insbesondere Nanopartikel, oder Beads sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Steroide oder andere organische oder anorganische, vorzugsweise niedermolekulare, Substanzen sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden eine biologische und/oder biochemische Funktion in vivo oder in vitro ausüben können.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden niedermolekulare Liganden sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden Analyten sind.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden spezifische Bindungspartner für Analyten (Sonden) sind.
Verwendung von Trägern nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Träger von Liganden für den Einsatz in der Analytik, insbesondere Bioanalytik.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kopplungsfunktion, welche von der für die Kopplung der Liganden verwendeten Kopplungsfunktion verschieden ist, für die dreidimensionale Vernetzung der Träger zur Herstellung räumlicher Strukturen verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vernetzung in situ erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die vernetzten Träger oberflächengebunden sind.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die vernetzten Träger nicht oberflächengebunden sind.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl oberflächengebundene als auch nicht oberflächengebundene vernetzte Träger vorliegen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr verschiedene Trägerspezies mit gleicher Ligandenspezifität über zueinander komplementäre Kopplungsfunktionen miteinander vernetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger in einem oder mehreren analytischen Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe aus Nukleinsäure-Assays, Protein-Assays, Immunoassays, enzymatischen Assays, Rezeptorbindungs-Assays, ELISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretischen und chromatographischen Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetrischen Assays, mikroskopischen und spektroskopischen Nachweismethoden, Assays unter Anwendung von Biochip- oder Mikroarraytechnologie oder Beads, eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger zum Arzneiwirkstoff-Screening eingesetzt werden.
Verfahren zur Herstellung vernetzter Träger nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger zuerst über eine erste Kopplungsfunktion an Liganden gekoppelt werden, die eine dazu komplementäre Kopplungsfunktion aufweisen, und dann die Träger über mindestens eine weitere Kopplungsfunktion, verschieden von der ersten, miteinander vernetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger vor oder nach der Vernetzung auch an eine immobilisierende Oberfläche gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zur Vernetzung die gleiche Kopplungsfunktion wie zur Bindung an die Oberfläche verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zur Vernetzung eine Kopplungsfunktion verwendet wird, die von der zur Bindung an die Oberfläche verwendeten Kopplungsfunktion verschieden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, das die Vernetzung in Gegenwart eines zusätzlichen Vernetzungsreagenzes erfolgt.