DE60220893T2 - Verfahren und gelzusammensetzungen zum einkapseln lebender zellen und organischer moleküle - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Ser. Nr. 60/281,268 , eingereicht am 3. April 20001, deren Offenbarung durch Referenz hier aufgenommen wird.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Systeme und Verfahren zur Bildung von Polyurethanhydrogelen, die zur Einkapselung von Biopräparaten, zum Beispiel lebenden Zellen, Proteinen, Enzymen, Antikörpern und kleinen organischen Molekülen, einsetzbar sind, und auf die Zusammensetzungen, die daraus resultieren. Spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Formulierung und die Verwendung eines Polymerisationsverfahrens, das biokompatible Polymere und biokompatible Polymerisationsbedingungen verwendet, zum Beispiel neutralen pH, worunter die Aufrechterhaltung einer wäßrigen Umgebung und die Konservierung von physiologisch relevanter Osmolarität durch das Polymerisationsverfahren sind, wie auch auf Bioassays, die solche verbesserten resultierenden Produkte verwenden. Diese Erfindung stellt eine signifikante Entwicklung auf dem Fachgebiet der Einkapselung bestimmter Materialien und unter bestimmten Gesichtspunkten eine signifikante Weiterentwicklung des Verfahrens, das im US-Patent Nr. 6,174,683 , das dem Rechtsnachfolger dieser Anmeldung übertragen wurde, beschrieben ist, dar.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Verwendung von Enzymen, Antikörpern, Peptiden oder anderen bioaktiven Molekülen, z.B. Aptameren, hat als Werkzeuge zum Screening auf den Gebieten der Bioassays und Proteomics steigende Aufmerksamkeit erfahren. Als Teil dieser Entwicklung hat auch die Verwendung von Hydrogelträgern für diese bioaktiven Materialien an Bedeutung gewonnen. Hydrogele werden als Wasser-enthaltende polymere Matrices definiert. Hydrogele stellen insbesondere einen Träger für Biomaterialen bereit, der der nativen, wäßrigen, zellulären Umgebung stärker ähnelt, im Gegensatz zu einer stärker denaturierenden Umgebung, die resultiert, wenn Proteine oder andere Materialien direkt an eine feste Trägeroberfläche gebunden werden, wobei andere Verknüpfungen im molekularen Maßstab, zum Beispiel Beschichtungen, verwendet werden.
  • Bestimmte Hydrogele wurden bereits früher als Matrixträger für Biomoleküle und/oder lebende Zellen beschrieben, und diese umfassen Alginate, Alginate, die modifiziert werden, um eine Vernetzung zu ermöglichen, Hydrogele auf Acrylamid-Basis und Hydrogele auf Polyethylenoxid-Basis. Allerdings gibt es im allgemeinen häufig Schwierigkeiten bei der Abstimmung der Gelpolymerisations- und Einkapselungserfordernisse mit den milden Bedingungen, die Voraussetzung zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit oder Aktivität von lebenden Zellen oder bestimmten aktiven Proteinen sind. Außerdem fehlen vielen der Materialien, die für diese milden Bedingungen geeignet sind, z.B. Polymeren auf Alginatbasis, die strukturellen Erfordernisse und/oder die Biostabilität, die für breite Anwendungen notwendig ist.
  • Alginatgele werden in großem Umfang zur Immobilisierung von eukaryotischen Zellen und Proteinen verwendet. Diese Hydrogelform ist im allgemeinen vorteilhaft und während des Einkapselungsverfahrens biokompatibel; allerdings leidet sie an einem Mangel an struktureller Stabilität. Alginate werden so manchmal mit mehrwertigen Kationen kombiniert, um stabilere, ionisch vernetzte Gele zu bilden. Bei Exposition gegenüber physiologisch relevanten Puffern und Umgebungen tendieren zweiwertige Kationen jedoch dazu, mit einwertigen Spezies auszutauschen, und das Polymer verliert oft seine strukturelle Integrität. Das Resultat ist, daß Alginate etwas unerwünschte Hydrogele zur Einkapselung von Biomolekülen und lebenden Zellen sind. Darüber hinaus ist die gesamte Herstellbarkeit von Alginatgelen schwierig, was den Wunsch nach einem solchem Gelsystem und seiner Anwendbarkeit weiter verringert.
  • Polyacrylamidhydrogelsysteme haben auch als Matrices zur Befestigung von Biomolekülen und Einkapselungsvehikeln beträchtliche Aufmerksamkeit erfahren. Beispielsweise beschreiben Arenkov et al. (Anal. Biochem. 278, 123-131 (2000)) Gelpad-Arrays bzw. Gelpad-Anordnungen, die durch photoinitiierte Polymerisation von Acrylamid/Bisacrylamid-Mischungen unter Verwendung von Methylenblau als Photokatalysator gebildet wurden. Proteine werden dann nach Anwendung auf die Mikromatrix kovalent an jedes Gelpad gebunden, und zwar entweder durch Vernetzung durch Glutaraldehyd oder durch chemische Modifikation von Kohlenhydratgruppierungen, die an ausgewählten Proteinen vorliegen, um einen anschließende chemische Verknüpfung mit dem Gelträger zu ermöglichen. Allerdings kann ein derartige Verknüpfungsverfahren potentiell für die Integrität und/oder Aktivität des Proteins sehr schädigend sein und es kann auch das Vorliegen von Zuckerresten erfordern, die nicht an allen Proteinen reichlich gefunden werden.
  • Alternativ zu der Verwendung von Hydrogelen auf Polyacrylamid-Basis ist die Verwendung von solchen, die in erster Linie aus Polyethylenoxid (PEO)-Polymerisationseinheiten bestehen. Diese Polymere können eine Reihe von verschiedenen Vorteilen auf den Gebieten der Biokompatibilität, Diffusion von kleinen Molekülen und Herstellungsverfahrenkontrolle bieten. Beispielsweise reduziert das Pfropfen von PEO auf Serumalbumin die Immunogenität des nativen Albumins signifikant (Abuchowski et al., 1977). Hubbell et al. ( US-Patent Nr. 5,573,934 und verwandte Patente) lehren die Verwendung von Polyethylenglykol-Polymeren zur Einkapselung von Zellen unter Verwendung eines Farbstoff-basierten photoinitiierten Radikal-basierten Polymerisationsverfahren.
  • In den vorher genannten Polyacrylamid- oder PEG-Polymergelen erfordert eine Initiation der Polymerisation den Zusatz eines getrennten, photoaktivierbaren Katalysators und/oder die Zugabe von Radikale erzeugenden Polymerisationsbeschleunigern, getrennt und unterschiedlich von/zu den Polymerkomponenten oder Untereinheiten. Chudzik und Anderson ( US-Patent Nr. 6,156,345 ) lehren die Verwendung von Polymerinitiatorgruppen, die von den polymerisierbaren Gruppen vorstehen und somit die gesamte Zugabe von Initiatorkomponenten vermeiden.
  • Es wurden auch gemischte Polymer/Alginat-Systeme entwickelt, um Beschränkungen zu überwinden, die in jedem System allein inhärent sind. Beispielsweise verwenden Desai et al. ( US-Patent Nr. 5,334,640 ) Mischungen einer ionisch vernetzten biokompatiblen Komponente mit einer kovalent gebundenen Komponente. Allerdings bleibt das gesamte Verfahren von einer photoinitiierten, Radikal-basierten Polymerisation abhängig.
  • Die Verwendung von Methologien, die freie Radikale als essentielle Elemente in ein solches Verfahren einarbeiten, ist ein im allgemeinen unerwünschtes Merkmal vieler der Einkapselungs/Polymerisationstechniken, die derzeit in Verwendung sind. Beispielsweise erfolgt bei der Zelleinkapselung mit Acrylamidgelen "Polymerisation von Acrylamid erzeugt Hitze und freie Radikale, was einen Verlust bei der chemiosmetischen Integrität und der enzymatischen Aktivität der immobilisierten Zellen verursacht" (siehe Poncelet De Smet, et al. in "Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization", Mattheus F.A. Goosen, Herausgeber, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993, S. 301). Es ist daher wünschenswert, ein Polymerisationsverfahren bereitzustellen, das keine freien Radikale verwendet, um eine Polymerisation zu initiieren, wodurch eine potentielle Gefahr für eingekapselte Zellen und Biomoleküle vermieden wird. Es ist auch wünschenswert, Polymere zu verwenden, die sowohl strukturelle als auch mechanische Haltbarkeit in biologischen Situationen und Verwendungen haben, insbesondere solche, die wirklich biokompatibel sind, d.h. für das eingekapselte Biomolekül oder die eingekapselte Zelle und für die umgebenden Medien oder den Wirt nicht toxisch sind.
  • Wood et al. lehren die Verwendung von verschiedenen Vernetzungspolymersystemen, die ein Polyurethan-basiertes Hydrogel, gebildet aus Isocyanat-funktionellen Präpolymeren, umfassen, um ein vernetztes Polymer zu bilden, um mikrobielle Zellen einzukapseln ( US-Patente Nrn. 4,436,813 und 4,732,851 ). Auch beschrieben werden Verfahren, die Polyazetidin-Präpolymere und Carboxymethylcellulose, die mit polyvanten Ionen vernetzt werden können, verwenden. Ein direkter Kontakt von Isocyanaten mit den mikrobiellen Zellen, der bei der Einkapselung in ein solches Polyurethan-basiertes Hydrogel erfolgt, und eine Exposition gegenüber anderen potentiell toxischen Bedingungen kann für die Einkapselung von bestimmten empfindlichen biologischen Materialien nicht geeignet sein.
  • Im '683-Patent wird ein Polyurethan-basiertes Hydrogel-Präpolymer verwendet, um gleichzeitig Biomoleküle, zum Beispiel Nukleinsäuresonden, in seiner Struktur während einer Polymerisation zu derivatisieren. Ein derartiges Polymerisationsverfahren kann PEG-basierte Präpolymere verwenden und ist wegen seiner Vermeidung von freien Radikalen oder anderen Mitteln als Resultat seiner Verwendung von Wasser, um eine Polymerisation zu initiieren, vorteilhaft. Da bei der Präpolymerbildung, Derivatisierung und/oder Solubilisierung allerdings oft organische Lösungsmittel verwendet werden, ist das Verfahren für bestimmte sensitive biologische Materialien, zum Beispiel lebende Säugerzellen, noch toxisch.
  • EP-A-1 025 860 beschreibt ein dehydratisiertes Hydrogel, das als Verband für chronische Wunden oder Verbrennungen verwendbar ist, das PEG-Isocyanate durch Harnstoffbindungen an Proteine, Enzyme oder dgl. gebunden verwendet.
  • WO 02/059372 (Stand der Technik für die vorliegende Erfindung gemäß Artikel 54(3) EPC soweit dieselben Vertragsstaaten bezeichnet sind) zeigt Biochips, die mit optisch klaren Polyurethanhydrogelzellen gebildet sind, welche Proteine oder andere Biomoleküle, gebunden an Isocyanat-Gruppen an dem Polymer durch direkte Bindungen oder durch Metallchelate oder dgl., umfassen.
  • Kurz ausgedrückt, es bleibt ein bestimmter Bedarf für wirklich gutartige, nicht-toxische, biokompatible und mechanisch robuste Hydrogel-Polymere und assoziierte Polymerisationsmethodologie, um bestimmte Biopräparate, zum Beispiel empfindliche Proteine, Enzyme, Antikörper und lebende Zellen, in nützlicher und wirtschaftlich machbarer Art einzukapseln, welche Produkte liefern kann, die für Assays und andere Anwendungen gut geeignet sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur biokompatiblen Polymerisation von Isocyanat-modifizierten biokompatiblen Makromeren, um entweder direkt oder indirekt Biopräparate, z.B. lebende Zellen, Protein, Nukleinsäuren und andere bioaktive Materialien und Verbindungen, einschließlich kleiner organischer Moleküle, einzukapseln oder zu überziehen. Das Polymerisationsverfahren ist wirklich biokompatibel, da es keine organische Lösungsmittel verwendet. Dieses neue Verfahren verwendet Vernetzer auf Thiol-Basis, was die Vernetzung von Biomaterialien innerhalb des Hydrogels reduziert, wodurch das Verfahren fähig wird, solches biologisches Material in Formen, die für diagnostische und therapeutische Verwendung besonders geeignet sind, zum Beispiel Mikroarrays bzw. Mikroanordnungen von Proteinen oder Zellen oder anderen organischen Verbindungen für ein Testen mit hohem Durchsatz, einzukapseln oder zu binden.
  • Das Polymerisationsverfahren verwendet Thiol-haltige Vernetzer und selektive Reaktionsbedingungen, spezifisch neutralen pH und wäßrige Puffer, um vorzugsweise die Reaktion von Sulfhydryl-Gruppen im Gegensatz zu Aminen als das bevorzugte Konjugationsnukleophil zu begünstigen, wenn Wasser während der Polymerisation vorliegt; dies stellt milde, Nicht-Radikal-Reaktionsbedingungen bereit, die eine milde Einkapselung ermöglichen, was für Biomoleküle und lebende Zellen von besonderer Bedeutung ist. Die Porosität des Einkapselungspolymers kann vorteilhafterweise variiert werden, und das Einkapselungsverfahren erlaubt eine Abscheidung auf Glasobjektträgern oder anderen Oberflächen von diskreten Hydrogeltröpfchen in Punkten oder Schichten, die Zellen, Proteine oder andere organische Moleküle einkapseln, entweder direkt oder indirekt durch Bindemittel oder alternativ durch Bildung von Tröpfchen oder Kügelchen, die getrennt solche Biopräparate einkapseln. Darüber hinaus umfaßt das gesamte Einkapselungs/Polymerisationsverfahren weniger Schritte als vergleichbare Methodologien, was eine Verfahrensentwicklung vereinfacht und erleichtert. Da die resultierenden Polymere Antikörper-Arrays oder enzymatische Arrays und eine Einkapselung von lebensfähigen Zellen bereitstellen können, wird die potentielle Verwendung von solchen Materialien in Bioreaktoren, Biosensoren, Biochips und künstlichen Organen erleichtert. Es wird erwartet, daß solche eingekapselten Zellen als logische Erweiterung der Bioassay-Entwicklung für ein Screening komplexer biologischer Wege dienen, und eingekapselte Zellen werden nützliche Werkzeuge in Bioreaktoren für die wirtschaftliche Erzeugung komplizierter therapeutischer Mittel und Materialien sein. Außerdem können eingekapselte lebende Zellen potentiell als künstliche Organe oder Biosensoren in Reaktion auf einen Bedarf bei veränderten oder toxischen Umgebungen dienen. Es wird erwartet, daß Mikroarrays von eingekapselten Zellen oder anderen derartigen biologischen Präparaten bei biologischen Untersuchungen mit hohem Durchsatz nützlich sind.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung, die einen Mechanismus der Vernetzung von Präpolymeren zeigt.
  • 2 ist eine schematische Darstellung ähnlich 1 einer alternativen Vernetzungsreaktion, die verschiedene Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Wasser wird oft eingesetzt, um die Vernetzung von Isocyanatfunktionellen Präpolymeren zu initiieren oder diese zu härten. Dies wird im Gegensatz zu Verfahren, wie eine auf freien Radikalen basierte Methodologie, verwendet, z.B. durch UV-induzierte Photopolymerisation, die verwendet wird, um reaktive Spezies zu erzeugen, die zur Bildung von kovalenten Bindungen zwischen Präpolymereinheiten geeignet ist.
  • Isocyanat-funktionelle Gruppen werden kovalent an ein Präpolymer der Wahl gebunden, und eine solche Zugabe von Wasser erzeugt ein aktives primäres Amin mit einer bestimmten Häufigkeit durch Umwandlung von einigen Isocyanat-Gruppierungen, basierend auf Temperatur und pH. Solche primären Amine reagieren anschließend mit anderen Isocyanaten, die an andere Präpolymereinheiten gebunden sind; dadurch werden die Präpolymereinheiten kovalent miteinander verknüpft, wie es in 1 dargestellt ist; dies ist für bestimmte Reaktionen, die im '683-Patent verwendet werden, im allgemeinen typisch. Dieses Verfahren führt zu der Bildung eines optisch transparenten, auf Harnstoff basierenden Hydrogels, solange die Reaktivität des Präpolymers und die Reaktionsbedingungen kontrolliert werden, so lange eine Gasblasenbildung und/oder eine Präzipitation des Polymers verhindert werden. Während eines solches Polymerisationsverfahrens können verschiedene biologische Einheiten oder kleine Moleküle, z.B. Biopräparate, vorliegen oder zugesetzt werden, um biologisch aktive Hydrogele zu produzieren. Der Ausdruck Biopräparate sollte zu Zwecken dieser Patentanmeldung so verstanden werden, daß er lebende Zellen, Proteine, z.B. Antikörper, andere bioaktive Materialien, sowohl natürliche als auch synthetische, und kleine organische Moleküle, die bioaktiv wirken, umfaßt. So kann gesehen werden, daß die Größe eine Biopräparats stark variieren kann, und daß, wie es im folgenden erläutert wird, Moleküle kleiner Größe wünschenswerterweise mit Verankerungsgruppierungen ausgestattet werden können.
  • Das '683-Patent beschreibt den Zusatz von mit primären Amin derivatisierten Oligonukleotiden zu Isocyanat-funktionellen Präpolymeren, um Oligonukleotid-Anordnungen zu produzieren, die an eine feste Trägeroberfläche gebunden sind. Ein vorteilhaftes Merkmal eines solchen Verfahrens besteht darin, daß die Oligonukleotide während der Vervollständigung der Polymerisationsreaktion zwischen Isocyanat- Präpolymereinheiten kovalent an die Polymermatrix gebunden werden. Allerdings kann ein solches Verfahren, das auf Amin-Konjugation basiert, für bestimmte sensitive Biopräparate, z.B. bestimmte Proteine und lebende Zellen, nicht geeignet sein. Da primäre Amine Komponenten aller Proteine, einschließlich jener, die an der Oberfläche von lebenden Zellen vorliegen, z.B. Ligandenrezeptorproteine, Ionenkanalproteine und Zell-zu-Zell-Adhäsionsproteine, sind, kann eine extensive Derivatisierung oder Konjugation von solchen Aminen direkt an das Isocyanat-funktionelle Präpolymer zu einer Inaktivierung, Denaturierung oder einer veränderten Funktionalität des Proteins führen. Es wurde nun festgestellt, daß diese Möglichkeit als Resultat der Verwendung eines neuen Vernetzungsansatzes, der in erster Linie auf Thiol-Gruppen anstelle von Aminen zu diesem Zweck basiert, minimiert wird.
  • Vernetzungsmittel auf Thiol-Basis dienen als Mediatoren der Vernetzungsreaktion zwischen Isocyanat-Gruppen an verschiedenen Präpolymeren anstelle der Verwendung von Aminfunktionalität. In einer wäßrigen Umgebung wird natürlich ein bestimmter Prozentsatz der Isocyanat-Gruppen einer Hydrolyse unterliegen; allerdings werden die als Resultat gebildeten primären Amine pKa-werte im Bereich von 9 bis 10 haben. Indem ein neutraler pH aufrechterhalten wird, wird die überwiegende Mehrheit dieser Amine protoniert werden und daher nicht am Polymerisationsverfahren teilnehmen. Als neutraler pH ist 6,5 bis 7,5 bevorzugt, 6,6 bis 7,1 ist bevorzugter und am bevorzugtesten ist ein pH von etwa 7,0. Das Vorliegen von solchen Thiol-haltigen Spezies wird nicht-umgesetzte Isocyanat-Gruppen vernetzen, so daß das Polymerisationsverfahren wirksam durchgeführt wird.
  • Ein vorteilhaftes Resultat einer solchen bevorzugten Verwendung von Thiol-Vernetzern ist die Minimierung von Reaktionen mit den Biopräparaten, die eingekapselt werden oder an Stellen am Molekül immobilisiert werden, wo eine Anheftung an die Matrix unerwünscht ist. Die Kontrolle des pHs der Polymerisationsreaktion, die eine Beschränkung auf die nukleophile Reaktivität der Amine, nicht aber der Thiol-Gruppen auferlegt, vermeidet eine Schaffung von übermäßigen Verbindungen zu Proteinen innerhalb der Matrix. Proteine bestehen natürlich aus einer Vielzahl von Aminosäuren, von denen einige primäre Amine als Seitenkette enthalten, die während des gesamten Polymerisationsverfahrens potentiell reaktiv sind. Allerdings kann eine Bindung an solche Amin-Funktionalitäten die natürliche Bewegung und Konformation der Proteine gut behindern und im Fall von lebenden Zellen wird sie wahrscheinlich das Muster und das Reaktionsvermögen von extrazellulären und Plasma-Membranproteinen verändern. Das vorliegende Verfahren vermeidet das Auftreten von solchen Bindungen oder begrenzt es wesentlich und somit die negativen Aspekte daraus.
  • Beispielsweise ist der pKa-Wert für die primäre Amin-Seitenkette der Aminosäure Lysin ziemlich basisch, etwa 10,5, und der für Arginin ist sogar noch basischer, d.h. über 12. Wenn der pH der Polymerisationsmischung etwa neutral gehalten wird, dann ist der Verhältnisanteil an freiem Amin, der für eine Beteiligung in einer nukleophilen Addition geeignet ist, zum Beispiel wie in 1 gezeigt, weniger als 1/1000stel der gesamten primären Amin-Gruppen, die durch Lysin-Seitenketten dargestellt werden. Im Gegensatz dazu bleiben Thiol-Gruppen bei neutralen pH-Werten nukleophil und sehr reaktiv. Obgleich Cystein-Reste in Proteinen eine Thiol-Seitenkette enthalten, ist die Häufigkeit von Cysteinen innerhalb von Proteinen im allgemeinen mehr als 3-mal niedriger als die von Lysin, und wenn Cysteine vorhanden sind, sind sie in nativen Proteinen häufig unter Bildung von intramolekularen Cystin-Bindungen oxidiert, wodurch die Anzahl an verfügbaren Sulfhydryl-Gruppen weiter gesenkt wird. Das Gesamtresultat ist eine sehr wesentliche Verringerung bei der Zahl von mehrfachen, potentiell denaturierenden Bindungen zwischen eingebetteten Proteinen oder Zellen und der Polymermatrix; demnach stellt eine solche Thiol-vermittelte Vernetzung von Hydrogel-Präpolymeren verbesserte Formulierungen zur Einkapselung von sensitiven biologischen Molekülen und lebenden Zellen bereit.
  • Außerdem stellt dieses Einkapselungsverfahren, das von Thiol-Reaktionen abhängt, auch einen sehr wirksamen Weg zur Verankerung kleiner organischer Moleküle, zum Beispiel von organischen Molekülen mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 2000 und insbesondere von solchen mit einem Molekulargewicht von größer als etwa 500, in einer Weise bereit, daß sie ihre Wirksamkeit im Hydrogel vollständig beibehalten. Diese kleinen Moleküle werden derivatisiert, so daß eine Thiol-Gruppe an einer Stelle im Molekül plaziert wird, an der sie die sekundäre oder tertiäre Konfiguration des kleinen Moleküls nicht stören wird, zum Beispiel an einem Ende eines im allgemeinen linearen Moleküls. Obgleich das kleine Molekül eine solche Größe haben könnte, daß es nicht notwendigerweise in einer Einkapselungsmatrix dieses Typs zurückgehalten wird, wird das Vorliegen der Thiol-Gruppe in einer Verknüpfung mit einer Isocyanat-Gruppe an dem Polymer und somit in der Verankerung des kleinen organischen Moleküls innerhalb des Gels oder an dem Gel in einer Art, daß es seine normale aktive Konfiguration annehmen kann, resultieren. In dieser Weise kann das Einkapselungsverfahren verwendet werden, um sogenannte chemische Chips wie auch Protein-Chips, zelluläre Chips und dgl. zu produzieren.
  • Die Isocyanat-funktionellen Präpolymere werden oft aus Polyoxyalkylendiolen oder Polyolen mit relativ hohem Molekulargewicht hergestellt, die mit difunktionellen oder polyfunktionellen Isocyanat-Verbindungen umgesetzt werden. Bevorzugte Präpolymere sind solche, die aus Polyoxyalkylendiolen oder -polyolen hergestellt sind, die Homopolymere von Ethylenoxid-Einheiten oder Block- oder Raudom-Copolymere, die Mischungen aus Ethylenoxid-Einheiten und Propylenoxid- oder Butylenoxid-Einheiten enthalten, umfassen. Im Fall von solchen Block- oder Random-Copolymeren sind wenigstens 75 % der Einheiten vorzugsweise Ethylenoxid-Einheiten. Das Molekulargewicht von derartigem. Polyoxyalkylendiol oder -polylol ist vorzugsweise 2000 bis 30 000 und bevorzugter 5000 bis 30 000. Geeignete Präpolymere können durch Umsetzung von ausgewählten Polyoxyalkylendiolen oder -polyolen mit Polyisocyanat in einem Isocyanat-zu-Hydroxyl-Verhältnis von etwa 1,2 bis etwa 2,2 umgesetzt werden, so daß im wesentlichen alle Hydroxyl-Gruppen mit Polyisocyanat verkappt sind. Aliphatische Isocyanate sind gegenüber aromatischen bevorzugt, da sie eine einfach kontrollierte Polymerisation bereitstellen. Im allgemeinen sind Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol (PPG) oder Copolymere davon bevorzugt. Die Isocyanat-funktionellen Präpolymere, die vorzugsweise verwendet werden, enthalten aktive Isocyanate in einer Menge von etwa 0,1 mÄq/g bis 1 mÄg/g und bevorzugter etwa 0,2 mÄq/g bis 0,8 mÄq/g. Sollten Präpolymere mit relativ niedrigem Molekulargewicht, z.B. weniger als 2000, verwendet werden, enthalten sie vorzugsweise einen relativ hohen Isocyanat-Gehalt (etwa 1 mÄq/g oder sogar höher). Allerdings kann die Polymerisationsrate von solchen kleineren Präpolymeren eine genauere Kontrolle erfordern, um eine zu schnelle Polymerisation zu vermeiden, und wäre somit zur Herstellung von Mikroanordnungen und dgl. weniger bevorzugt. Darüber hinaus können Präpolymere mit einem ziemlich hohen Isocyanat-Gehalt einen relativ hohen Gehalt an freiem Aminen nach der Polymerisation haben, und die positiven Ladungen an solchen Amin-Funktionaltitäten bei neutralem pH können eine nicht-spezifische Bindung von negativ geladenen Biomolekülen mit dem Potential, daß höhere Level an unerwünschten Hintergrundsignalen resultieren, erhöhen. Demnach sind Präpolymere mit höherem Molekulargewicht, die einen relativ niedrigen Isocyanat-Gehalt enthalten, bevorzugt.
  • Um die Diffundierbarkeit von großen biologischen Molekülen zu verstärken, kann es wünschenswert sein, niedrige Verhältnisse an Präpolymer (3-5 %) bezüglich des Gesamtvolumens der letztendlichen Formulierung zu verwenden. Solche relativ niedrigen Prozentgehalte unterstützen die Herstellung von Hydrogelzusammensetzungen, die die gewünschte Porosität zur Verwendung in Assays, Bioreaktoren und dgl. haben. Wie oben erwähnt wurde, wird die Lebensfähigkeit von eingeschlossenen biologischen Molekülen durch Minimierung der Involvierung von Amin-Gruppen durch Verwendung von Vernetzern mit Thiol-Funktionen und Aufrechterhaltung eines physiologischen pHs von etwa 7,0 erhöht, wobei ein großer prozentualer Anteil an Aminen (pKa = ~10) als protonierte Spezies vorliegen wird, die nicht mit den Isocyanat-Funktionalitäten reagiert. Obgleich eine solche Anordnung in einigen Fällen potentiell in einer unvollständigen Härtung des Präpolymers resultieren könnte, wird die nukleophile Aktivität von Thiolen gegenüber Isocyanaten bei einem solchen pH nicht beeinträchtigt, so daß ein Härten vollständig erfolgen kann; das Gesamtresultat ist einer der signifikanten Fortschritte bei der Formulierung von Hydrogelen auf PEG-Basis und/oder PPG-Basis zur Einkapselung von Biomaterialien.
  • Kurzkettige Dithiol-Vernetzer, zum Beispiel 1,4-Dithiothreitol (MG = 154), produzieren eine Polymerisation mit ziemlich hoher Geschwindigkeit, die verlangsamt werden muß und sorgfältig kontrolliert werden muß, um eine Präzipitation zu vermeiden. Längere Dithiol-Vernetzer ergeben Formulierungen zur Hydrogel-Polymerisation, die leichter kontrolliert werden. Vernetzer mit einer Hauptkomponente aus PEG- und/oder PPG-Einheiten sind eine Klasse von Dithiolen, die Biokompatibilität und strukturelle Vorzüge bereitstellen; solche Vernetzer mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 500 und 10 000 sind bevorzugt, wobei solche zwischen etwa 2000 und 6000 bevorzugter sind, und solche mit einem Molekulargewicht zwischen 3000 und 4000 am bevorzugtesten sind. Beispielsweise kann PEG-(Thiol)2 (Shearwater Polymers, Inc.) mit einem MG = 3400 und Thiol-Gruppen an den Enden der Ketten mit Hypol PreMa G-50 (Hampshire Chemical Corp., das einen Gehalt an aliphatischen Isocyanat von ungefähr 0,35 mÄq/g hat) verwendet werden; und es wurde festgestellt, daß durch Variation des Verhältnisses zwischen zwei solchen Ausgangsmaterialien die Polymerisationsbeständigkeit im allgemeinen wirksam bei pH 7,0 kontrolliert werden kann. Das Molverhältnis von Dithiol-Vernetzer zu Isocyanat (aus dem Präpolymer) ist vorzugsweise nicht höher als bei 0,3 Dithiol pro Isocyanat und bevorzugt nicht höher als etwa 0,2 Dithiol pro Isocyanat.
  • Formulierungen mit einem Verhältnis, das deutlich niedriger als 0,1 Dithiol pro Isocyanat ist, zum Beispiel 0,05 oder niedriger ist, können bei pH 7,0 ohne den Einschluß eines Hilfsvernetzers nicht sofort und/oder vollständig polymerisieren. Somit werden Formulierungen mit einem Verhältnis, das leicht niedriger als etwa 0,1 Dithiol pro Isocyanat ist, vorzugsweise mit einem zweizähnigen Hilfsvernetzer versetzt, der zwei unterschiedliche Isocyanatreaktive funktionelle Gruppen hat, von denen eine vorzugsweise Thiol ist, zum Beispiel Cystein, das eine Thiol-Seitenkettengruppe und eine weniger reaktive α-Amin-Gruppe hat, die natürlich unter diesen Bedingungen nukleophiler als das α-Carboxyl ist. Andere zweizähnige Vernetzer, die verwendet werden könnten, umfassen 2-Mercaptoethanol, 2-Aminoethanthiol, Homocystein, 2-Mercaptopropanol und andere kurzkettige Verbindungen, die eine Thiol-Gruppe und eine andere nukleophile Gruppe haben. Es wurde festgestellt, daß, selbst wenn eine adäquate Menge des Dithiol-Vernetzers bereitgestellt wird, die Bereitstellung eines zweizähnigen Hilfsvernetzers bei der Kontrolle der Polymerisationsreaktion zur Erreichung einer Vollendung innerhalb wünschenswerter Zeitgrenzen und beim Erhalt von Hydrogelzusammensetzungen, die stabil sind, einen hohen Wassergehalt und ausgezeichnete strukturelle Festigkeit haben, vorteilhaft sein kann. Dementsprechend ist die Verwendung der Kombination aus einem Dithiol-Vernetzer mit relativ hohen Molekulargewicht, zum Beispiel mit einem MG von etwa 2000 bis 6000, und einem zweizähnigen Vernetzer mit viel niedrigeren Molekulargewicht, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von unter etwa 300, bevorzugt. Es wurde festgestellt, daß dieser Zusatz eines moderierenden zweizähnigen Vernetzers, der zwei unterschiedliche reaktive Gruppen hat (z.B. Cystein), ein neues und wirksames Mittel bereitstellt, durch das eine Polymerisation wirksam kontrolliert werden kann; dies ist schematisch in 2 dargestellt, welche auch anzeigt, daß eine Vernetzung in dieser Art eine große Menge von CO2 eliminiert, die sonst bei einer normalen Vernetzung erzeugt werden würde. Wenn ein derartiger Hilfsvernetzer eingesetzt wird, wird er im allgemeinen in einer Molmenge von etwa der 1- bis 3-fachen Molmenge des Dithiols und vorzugsweise der etwa 1,5- bis etwa 2,5-fachen der Mole des Dithiol-Vernetzers eingesetzt, wobei festgestellt wurde, daß diese Menge diese Polymerisationsreaktion moderat macht und in einer zufriedenstellenden Härtung resultiert.
  • Der inhärente Reaktivität von Präpolymeren dieses allgemeinen Typs erlaubt es, daß die Verwendung von chemisch funktionellen Oberflächen eine kovalente Bindung des Polymers an ein Substrat während einer Polymerisation erreicht. Solche Oberflächen können an Substraten bereitgestellt werden, die die Handhabung und die instrumentierte Untersuchung des polymerisierten Hydrogels und des eingekapselten biologischen Materials erleichtern werden; zum Beispiel die Herstellung eines Mikroarrays bzw. einer Mikroanordnung, der/die unterschiedliches bioaktives Material eingekapselt in einzelne Punkte oder Regionen von polymerisiertem Hydrogel, das in einem bekannten Muster auf einem solchen Substrat plaziert ist, enthält.
  • Ein neutraler pH wird durch das Polymerisationsverfahren hindurch vorzugsweise durch die Verwendung von 50 mM Phosphatpuffer, supplementiert mit NaCl, typischerweise 10 mM bis 80 mM, aufrecht erhalten; ein osmotischer Druck wird vorzugsweise bei physiologischen Leveln, etwa 300 Milliosmol, gehalten. Es wird festgestellt, daß solche Formulierungen ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln hergestellt werden können, indem Isocyanat-derivatisierte Präpolymere rasch in Phosphatpuffer/NaCl gemischt werden, und dann schnell eine vorgemischte Lösung von Zellen oder Proteinen und Dithiol-Vernetzer in Phosphatpuffer/NaCl zugesetzt wird. Das Polymerisationsverfahren wird dann im allgemeinen innerhalb von 20 bis 60 Minuten, typischerweise in weniger als 30 Minuten, ablaufen, wobei während dieser Zeit die Zellen oder Proteine in einem hydratisierten und einem osmotisch ausgewogenen Zustand bei physiologischem pH bleiben. Vorzugsweise werden pH und Osmolalität zwischen 6,9 und 7,6 bzw. zwischen 250 und 400 mOsm/kg gehalten. Sobald sie gehärtet sind, werden die Polymerstellen, die die eingekapselten Biopräparate enthalten, leicht gewaschen und manipuliert.
  • Eine optische Untersuchung dieser Thiol-vernetzten Hydrogele zeigt optische Klarheit ohne Hintergrundfluoreszenz, die Gel-Formulierung zuzuschreiben wäre, und im allgemeinen ähnliche optische Eigenschaften wie Hydrogelformulierungen, die in dem '683-Patent beschrieben sind. In den '683-Verfahren war es jedoch oft sehr wichtig, sorgfältig die Rate der CO2-Entwicklung zu kontrollieren, um eine gewisse Opazität zu vermeiden. Das erfindungsgemäße Verfahren, welches Dithiol-Vernetzer in Kombination mit zweizähnigen Modifizierungsmitteln verwendet, minimiert inhärent eine CO2-Entwicklung, wie es bereits vorher in Verbindung mit 2 erwähnt wurde, und kann ein optisch transparentes Hydrogel im wesentlichen ohne Schwierigkeiten produzieren.
  • Um zu zeigen, daß diese Polyurethanhydrogele zur Einkapselung eines weiten Bereichs von Biopräparaten geeignet sind, wurde zuerst eine Einkapselung von lebenden eukaryotischen Zellen untersucht. Ein Kriterium für den Erfolg einer Einkapselung von lebenden Zellen ist eine Bewertung der andauernden Zelllebensfähigkeit, und typischerweise ist Trypanblau-Ausschluß eine Technik, die häufig von Biologen begünstigt wird, um in einfacher Weise die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Da jedoch Hydrogel eine signifikante Menge des Trypanblau-Farbstoffs absorbiert, war die Bestimmung der Zellfarbe und die Intensität des intrazellulären Farbstoffs unter Verwendung dieses Verfahrens unzuverlässig. Als Alternative wurde AlamarBlueTM (Trek Diagnostic Systems, Inc.) verwendet. AlamarBlue ist ein Farbstoff, der bei Reduktion durch metabolische Prozesse fluoreszierend wirkt. Ziege-Lymphozyten, bei denen durch Trypanblau-Ausschluß festgestellt worden war, daß sowohl lebensfähige als auch tote Zellen im Zellgemisch vorlagen, wurden gewählt und das Präpolymer und Zellsuspension/Dithiol-Vernetzer/zweizähniger Vernetzer wurden gemischt. Die Lymphozyten wurden in dem Thiol-vernetzten Hydrogel eingekapselt, indem Tröpfchen der Mischung als Punkte (etwa 300-1000 μm im Durchmesser mit einer Höhe von 20 μm oder größer) auf Glasobjektträgern abgeschieden wurden und dann in einer Kammer mit hoher Feuchtigkeit bei Raumtemperatur gehärtet wurden; Mischen und Härtung nahmen genau weniger als 20 Minuten in Anspruch. Vorzugsweise ist die relative Feuchtigkeit (RH) wenigstens etwa 90 % und bevorzugt ist sie etwa 95 % oder höher. Mit den fest an den Glasobjektträger befestigten Punkten wurde der Objektträger für 3 Stunden bei 37°C mit RPM 1640 Medium inkubiert, darauf folgte eine Inkubation für 1,5 Stunden mit AlamarBlueTM-Farbstoff, der im Verhältnis 1:20 mit RPM1640-Medium gemischt worden war. Nachdem der Objektträger für 30 Minuten im Dunklen gelassen worden war, zeigte eine Visualisierung der Punkte (Spots) unter Verwendung eines Epifluoreszenz-Mikroskops leuchtend gefärbte einzelne Zellen gegenüber einem moderat fluoreszierenden Hydrogelhintergrund. Sichtbares Licht zeigte Zellen innerhalb des Gels, die nicht leuchtend gefärbt waren, welche wahrscheinlich die vorgenannten toten Zellen waren, die bereits in der Zellsuspension vorlagen. Punkte nur aus Hydrogel, die in analoger Art behandelt worden waren, hatten keine sichtbare Fluoreszenz. Demnach wird AlamarBlueTM als nützliches Werkzeug zur Detektion von Zelllebensfähigkeit innerhalb dieser Polyurethan-PEG-Hydrogele angesehen; und es wurde durch die Erhaltung von lebensfähigen Zellen gezeigt, daß das Hydrogel selbst unter Polymerisationsverfahren biokompatibel sind.
  • Einkapselung von Proteinen wurde auch untersucht, indem das Gel im wesentlichen wie eben beschrieben formuliert wurde. Eine Protein-Einkapselung wurde durch die Sequestrierung/Einkapselung an Anti-Transferrin-Antikörper in der Gelmatrix während der Polymerisation bewiesen. Ein Beweis für die Antikörper-Funktionalität wurde durch die spezifische Bindung von Fluoreszenzfarbstoff-markiertem Transferrin an solchen Stellen, die den Anti-Transferrin-Antikörper enthielten und nicht an anderen Stellen, die andere Antikörper oder keine Antikörper enthielten, bewiesen.
  • Als weitere Ausführungsformen könnten eingekapselte lebende Zellen und/oder Proteine innerhalb eines solchen Thiolvernetzten Hydrogels als Punkte oder Regionen auf Trägeroberflächen, zum Beispiel Glasobjektträger, oder in Mikrowells oder Mikrokammern, zum Beispiel wie sie in Standard-Mikrotiterplatten mit 96 Wells, 384 Wells oder 1536 Wells vorliegen, abgeschieden werden. Mit beiden Ansätzen sind charakteristische Vorzüge vorhanden. Bei der Abscheidung einer Reihe von getrennten Punkten bzw. Flecken auf einer einzelnen Oberfläche könnte jeder Punkt eine unterschiedliche Einheit enthalten, was eine einzige Inkubation, gefolgt von der Zufuhr von Waschlösungen, um mit allen Punkten gleichzeitig in Kontakt zu kommen, ermöglicht. Die Verwendung von einzelnen Mikrokammern würde eine Roboterbehandlung der Platten erlauben und die Verwendung von geringen Volumina einzelner Testlösungen bei jedem Well ermöglichen. Es können auch Kombinationen dieser zwei Ansätze verwendet werden, wodurch einzelne Kammern, die in einem Standard-Array oder einer Standardanordnung mit 96 Wells angeordnet sind, mit einem oder mit mehreren Hydrogelpunkten, die unterschiedliche Einheiten enthalten, beschickt werden.
  • Vorrichtungen, die solche Anordnungen bzw. Arrays verwenden, können als kombinatorische Chemikalien- oder Wirkstoff-Screening-Vorrichtungen, Antikörper-Arrays, Peptid-Arrays, Zell-Arrays, Arrays auf enzymatische Aktivität oder DNA oder andere Polynukleotid-Arrays verwendet werden, die für eine Bindung an verwandte Proteine oder andere Biomoleküle selektiv sein werden. Außerdem werden eingekapselte Zellen oder Biomoleküle, die auf die Wände von Mikrokapillarröhrchen aufgetragen sind, als Durchflußvorrichtungen mit einem einzelnen Kanal oder mehreren Kanälen fungieren, welche als Screening-Vorrichtungen oder als Biosensoren bei Systemen, zum Beispiel in Flüssig-Chromatographie-Vorrichtungen oder in "Lab-on-a-Chip"-Vorrichtungen, verwendet werden. Eine Signalablesung aus solchen Vorrichtungen kann über eine Bindung von fluoreszierenden Proteinen oder von Antigenen erfolgen, die durch anschließende Detektionsverfahren auf der Basis von Antikörpern (möglicherweise unter Verwendung zusätzlicher Anordnungen oder Arrays) oder über Reaktion mit endogenen Biowegen, die in der Bildung einer detektierbaren Spezies resultieren werden, zum Beispiel enzymatische Umwandlung eines Substrats in ein fluoreszierendes Farbstoffmolekül oder Änderung bei den elektrischen Eigenschaften, zum Beispiel Leitfähigkeit der Zelle und/oder der umgebenden Matrix, die aus der Exposition gegenüber dem spezifischen Agens resultiert, gemessen werden. Der Zusatz entweder eines Redoxmittels zu dem Gel oder der Zusatz eines elektrisch leitenden Polymers kann insbesondere eine Signaldetektion durch elektrische, nicht-photonische Mittel ermöglichen.
  • Die Arbeitsbeispiele, die folgen, umfassen den besten derzeit bekannten Modus zur Bereitstellung von Formulierungen und Einkapselungsverfahren, die besondere Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern; allerdings sollten sie nicht so verstanden werden, daß sie Beschränkungen für den Rahmen der Erfindung bilden, der selbstverständlich durch die nachfolgend angeführten Patentansprüche definiert wird.
  • Beispiel 1
  • Lösung A wurde hergestellt, indem 0,075 g Hypol PreMa G-50 (Hampshire Chemical Corp.) und 1,5 ml wäßriger 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 80 mM Natriumchlorid gemischt wurden. Lösung B wurde hergestellt, indem 30 mg PEG-(Thiol)2 (MG = 3400) und 2 mg freie Cysteinbase (Sigma Chemical Co.) (MG = 121) in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 60 mM Natriumchlorid gemischt wurden. Lösung C wurde hergestellt, indem 100 μl Lösung B mit 10 μl Ziege-Lymphozyten in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung gemischt wurden. Schließlich wurden 200 μl Lösung A mit 50 μl Lösung C gemischt und die resultierende Lösung wurde unter Verwendung von 5 μl Glaskapillarröhrchen auf Amin-behandeltes Glas (silanisierte Objektträger, Cell Associates, Inc.) im Mikromaßstab getüpfelt. Die Hydrogelpunkte bzw. die Hydrogelflecken wurden sorgfältig in einer Feuchtigkeitsbox bei etwa 65 % RH, um eine Dehydratisierung zu vermeiden, polymerisiert. Diese Formulierung polymerisierte innerhalb von 5 bis 10 Minuten. Nach der Polymerisation waren die Hydrogelpunkte physikalisch stabil und hafteten fest an dem Glasobjektträger; sie wurden unverzüglich mit Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferter Salzlösung behandelt und entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C für etwa 3 Stunden in RPM1640-Zellmedium inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Lymphozyten wurde mit Hilfe des vorher beschriebenen AlamarBlue-Färbeverfahrens untersucht. Sie wurden für 1,5 Stunden mit RPM1640-Medium plus dem Farbstoff inkubiert und dann mit einem Lichtmikroskop untersucht; es wurden lebensfähige eingekapselte Zellen beobachtet.
  • Beispiel 2
  • Lösung A wurde hergestellt, indem 0,1 g Hypol PreMa G-50 (Hampshire Chemical Corp.) und 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 80 mM Natriumchlorid gemischt wurden. Lösung B wurde durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt. Lösung C wurde hergestellt, indem 40 μl Lösung B mit 70 μl Ziege-Lymphozyten in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung gemischt wurden. Schließlich wurden 100 μl Lösung A mit 1 μl Lösung C gemischt und die resultierende Lösung wurde unter Anwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 im Mikromaßstab aufgetüpfelt. Die Formulierung polymerisierte in 5 Minuten und die Hydrogelpunkte wurden mit Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferter Salzlösung behandelt und bei 37°C für 1 Tag bis 3 Tage in RPM1640-Zellmedium inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Lymphozyten wurde mit einem Lichtmikroskop unter Verwendung von AlamarBlue untersucht, was lebensfähige eingekapselte Zellen zeigte.
  • Beispiel 3
  • Lösung A wurde hergestellt, indem 0,1 g Hypol PreMa G-50 (Hampshire Chemical Corp.) und 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 80 mM Natriumchlorid gemischt wurden. Lösung B wurde durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt. Lösung C wurde hergestellt, indem 40 μl Lösung B mit 70 μl E. coli in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung gemischt wurden. Schließlich wurden 100 μl Lösung A mit 100 μl Lösung C gemischt und die resultierende Lösung wurde in ein Einweg-Kulturröhrchen gegeben. Die Formulierung polymerisierte in 5 Minuten und das Hydrogel wurde mit Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferte Salzlösung behandelt und bei 37°C für 1 Tag in RPM1640-Zellmedium inkubiert. Lebensfähigkeit und Wachstum von E. coli wurden durch Betrachtung der Trübung in dem Hydrogel nach einem Tag bestätigt.
  • Beispiel 4
  • Lösung A wurde hergestellt, indem 0,1 g Hypol PreMa G-50 (Hampshire Chemical Corp.) und 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 80 mM Natriumchlorid gemischt wurden. Lösung B wurde hergestellt, indem 30 mg PEG-(Thiol)2 (MG = 3400) und 2 mg freies Cysteinbase in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 mit 60 mM Natriumchlorid gelöst wurden. 25 μl Lösung A, 10 μl Lösung B, 5 μl 50 % Trehalose in DI-Wasser und 10 μl Anti-Transferrin-Antikörper (Ziege-Anitikörper gegen humanes Transferrin, 5 mg/ml, Protein-G-gereinigt) (Calbiochem) wurden vermischt und die resultierende Lösung wurde im Mikromaßstab auf einen Amin-beandelten Glasobjektträger aufgetüpfelt, so daß Punkte mit 300 μm bis 1000 μm im Durchmesser und mit einer Höhe von wenigstens 20 μm gebildet wurden. Andere ähnliche Punkte wurden ohne den Zusatz des Anti-Transferrin-Antikörpers gebildet. Die Hydrogelpunkte wurden in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur und 95 % RH sorgfältig polymerisiert und nach der Polymerisation wurde festgestellt, daß die Hydrogelpunkte physikalisch stabil waren und gut am Glasobjektträger hafteten. Der Objektträger wurde mit PBS-Puffer, der 1 % Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co.) und 0,1 % Triton X-100 (Boehringer, Mannheim) enthielt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Anti-Transferrin in dem Hydrogel wurde für 1 Stunde mit Cy3-markiertem Transferrin (1 μg/ml in 1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Triton X-100 in Phosphatgepufferter Salzlösung) für 1 Stunde in Wechselwirkung gebracht und dann visualisiert; es wurde bewiesen, daß es eine spezifische Bindung von fluoreszierenden-Farbstoffmarkiertem Transferrin an Stellen, die den Anti-Transferrin-Antikörper enthielten, und nicht an anderen Stellen, die andere Antikörper oder keine Antikörper enthielten, gab.
  • Beispiel 5
  • Lösung A wurde hergestellt, indem 0,1 g Hypol PreMag G-50 (Hampshire Chemical Corp.) und 1 ml 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 gemischt wurden. Lösung B ohne Salze wurde durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt. Lösung C wurde durch Mischen von 40 μl Lösung B mit 70 μl 234 μm L-alpha-Cystein-N-[8-(1,2,3,4-tetrahydro-acridin-9-ylamino)octyl]-amid (MG = 428,26), einem Acetylcholinesteraseinhibitor, in 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,0 hergestellt. Schließlich wurden 100 μl Lösung A mit 100 μl Lösung C gemischt und die resultierende Lösung wurde durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 im Mikromaßstab aufgetüpfelt. Die Formulierung polymerisierte in 5 Minuten und die Hydrogelmikropunkte wurden mit cy-3-markierter Acetylcholinesterase behandelt. Diese Untersuchung bestätigte das Vorliegen und die Funktionalität von Acetylcholinesterase-Inhibitor in Hydrogel.
  • Obgleich die Erfindung bezüglich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte klar sein, daß Änderungen und Modifikationen, wie sie einem Fachmann offensichtlich sind, durchgeführt werden können, ohne den Rahmen der Erfindung, der in den beigefügten Ansprüchen dargelegt ist, zu verlassen. Der Einschluß von zusätzlichen Polymeren oder Modifikationen an dem oben beschriebenen Polymer könnte entweder eine Zellproliferation oder eine erhöhte Lebensfähigkeit von ausgewählten Zelltypen innerhalb der Matrix erlauben. Beispielsweise können Peptidbindungen innerhalb eines solchen Polymers spezifisch gepfropft werden, um bei Exposition gegenüber extrazellulären Matrixproteasen, die durch die eingekapselte Zelle erzeugt werden, gelöst zu werden, wodurch die Polymermatrix bei Bedarf gelöst wird, um Zellexpansion und -wachstum zu ermöglichen. Alternativ können andere Polymere oder Agentien, zum Beispiel Collagen, zu einer derartigen Polymermischung gegeben werden, um die Zelllebensfähigkeit durch Verwendung von spezifischen Adhäsionsfaktoren und/oder Bindungsmethoden zwischen eingekapselten Zellen und umgebenden Träger zu unterstützen. Im Gegensatz zum Auftüpfeln der Hydrogelzusammensetzungen auf eine feste Oberfläche können Hydrogelmikroperlen gebildet werden, welche Biopräparate einkapseln. Als ein Beispiel wird die Polymer/Zell (oder Protein)-Mischung nach Vermischen des Präpolymers mit den Vernetzer und den Biopräparaten zu einer nicht-mischbaren Flüssigkeit, zum Beispiel ein Öl, gegeben, während ein Härten erfolgt, so daß bewirkt wird, daß Mikroperlen verschiedener Abmessungen gebildet werden. Eine Abtrennung vom Öl oder einer anderen Suspendierflüssigkeit ergibt eine Aufschlämmung von Perlen, die zur Verwendung in Bioreaktoren, Assay-Vorrichtungen, künstlichen Organen, Biosensoren oder dgl. geeignet ist. Darüber hinaus können mehrere Schichten aus eingekapselten Zellen, Proteinen oder anderen bioaktiven Molekülen verwendet werden, um komplexe Materialien mit einzigartigen Gesamteigenschaften zu konstruieren. Alternativ können Farbstoff oder andere Mittel dem Einkapselungspolymer zugesetzt werden, um eine anschließende Identifikation des eingekapselten Zelltyps zu erleichtern, wenn heterogene Mischungen von Zellen zu verwenden sind. Ein derartiger Zell-Identifikationsmechanismus erlaubt kombiniert mit einer Chromophor-basierten oder Fluoreszenz-basierten Reaktion aus spezifischen Zellen in Reaktion auf zugesetzte Mittel, z.B. Expression von grün fluoreszierendem Protein als Reaktion auf eine Aktivierung eines spezifischen Zellsignal-Transduktionswegs durch einen Liganden oder einen Wirkstoff, das Screening von großen Populationen heterogener Zellen in schneller und einfacher Art.
  • Die Offenbarungen aller vorher genannten US-Patente werden hier durch Referenz auf genommen. Besondere Merkmale der Erfindung werden in den Ansprüchen, die folgen, ausgeführt.

Claims (12)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Hydrogelzusammensetzung mit einem darin eingekapselten Biopräparat, das die Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen eines Isocyanat-funktionalisierten Hydrogel-Präpolymers, eines Biopräparats und eines Vernetzers mit wenigstens zwei Thiolgruppen, die mit dem Isocyanat-funktionalisierten Hydrogel-Präpolymer reagieren können, (b) Mischen des Isocyanat-funktionalisierten Hydrogel-Präpolymers, des Biopräparats und des Vernetzers in einer wäßrigen Lösung bei neutralem pH-Wert, um eine Lösung bereitzustellen, die bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung 3 bis 5 % Präpolymer enthält, und (c) Halten der Mischung aus Schritt (b) bei neutralem pH-Wert, so daß das biologische Präparat innerhalb eines polymerisierten Hydrogels eingekapselt wird, wobei das biologische Präparat bioaktiv bleibt.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mischung bei einem pH-Wert zwischen ungefähr 6,5 und ungefähr 7,5 gehalten wird und die wäßrige Lösung ebenfalls einen wasserlöslichen zweizähnigen Vernetzer mit zwei unterschiedlichen Isocyanat-reaktiven nukleophilen Gruppen enthält.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Thiol-Vernetzungsmittel eine Hauptkette aus Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder einem Copolymer davon umfaßt und ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 2.000 und ungefähr 6.000 aufweist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das biologische Präparat eine lebende eukaryotische Zelle ist.
  5. Hydrogelzusammensetzung mit einem darin eingekapselten Biopräparat, das umfaßt: das Reaktionsprodukt eines Isocyanat-funktionalisierten Hydrogel-Präpolymers, ein Biopräparat und einen Vernetzer mit wenigstens zwei Thiolgruppen, wobei das Isocyanat-funktionalisierte Hydrogel-Präpolymer in Gegenwart des Biopräparats durch Reaktion mit dem Vernetzer in einer wäßrigen Lösung unter physiologischen Bedingungen vernetzt worden ist und das biologische Präparat als Resultat des Vernetzens in einem stabilen polymerisierbaren Hydrogel so eingekapselt ist, daß das biologische Präparat bioaktiv bleibt.
  6. Hydrogelzusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Präpolymer Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder ein Copolymer davon mit Isocyanat-Endgruppen enthält, wobei das biologische Präparat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Nukleinsäuren, lebenden Zellen und organischen Molekülen mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 2.000 und wobei das Thiol-funktionalisierte Vernetzungsmittel eine Hauptkette aus Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder einem Copolymer davon umfaßt und ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 2.000 und ungefähr 6.000 aufweist.
  7. Hydrogelzusammensetzung gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das stabilisierte Hydrogel optisch transparent ist.
  8. Hydrogelzusammensetzung gemäß Anspruch 5, 6 oder 7, wobei der Vernetzer ein Thiol-funktionalisiertes Vernetzungsmittel und ein zweizähniges Vernetzungsmittel mit einer Thiolgruppe und einer anderen unterschiedlichen Isocyanat-reaktiven Gruppe wie etwa Cystein oder Homocystein umfaßt.
  9. Mikroanordnung, die umfaßt: ein Substrat und eine Vielzahl diskreter Punkte einer Biopräparat-Hydrogel-Zusammensetzung, die an das Substrat angebracht sind, wobei die Biopräparat-Hydrogel-Zusammensetzung umfaßt: (a) das Reaktionsprodukt eines Präpolymers aus Polyethylenglycol, Polyproplenglycol oder einem Copolymer davon mit Isocyanat-Endgruppen und einem Thiol-funktionalisiertem Vernetzungsmittel, das Thiol-Urethan-Gruppen ergibt und ein stabilisiertes Hydrogel bereitstellt, und (b) ein Biopräparat, das innerhalb des stabilisierten Hydrogels eingekapselt ist und bioaktiv bleibt.
  10. Mikroanordnung gemäß Anspruch 9, wobei die Vielzahl der Punkte einige Umfaßt, die wenigstens zwei verschiedene Biopräparate an bekannten Stellen der Anordnung enthalten.
  11. Mikroanordnung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Thiol-funktionalisierte Vernetzungsmittel einen Dithiolfunktionalisierten Vernetzer und ein zweizähniges Vernetzungsmittel mit einer Thiolgruppe und einer anderen unterschiedlichen Isocyanat-reaktiven Gruppe in einer 1- bis 3-fachen Stoffmenge der Stoffmenge des Dithiol-Vernetzers umfaßt.
  12. Bioassay umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Mikroanordnung gemäß Anspruch 9, 10 oder 11, (b) Inkontaktbringen der Mikroanordnung mit einer Analytlösung und (c) Detektieren der Wechselwirkungen der Mikroanordnung mit der Analytlösung.
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