DE60123480T2

DE60123480T2 - Behandlung von hydrophoben oder hydrophilen oberflächen mit polymeren

Info

Publication number: DE60123480T2
Application number: DE60123480T
Authority: DE
Inventors: Jan Sudor
Original assignee: Serono Genetics Institute SA
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: AU2002211894B2; CY1106244T1; EP1362240B1; IL155179A; ES2267828T3; JP2004526939A; PT1362240E; EP1362240A2; IL155179A0; DK1362240T3; AU1189402A; US20040115833A1; WO2002030571A3; US20020103352A1; DE60123480D1; ATE341000T1; CA2424947A1; US6709692B2; WO2002030571A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Vermindern der Adsorption von organischen Materialien (z.B. Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren und Zellen) auf hydrophoben oder hydrophilen Oberflächen (z.B. Polymeroberflächen). Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen, Behälter und Geräte (z.B. Mikrotiterplatten, Mikrofluidkanäle und Kits), welche durch solche Verfahren behandelt worden sind, sowie Verfahren zum Durchführen von Fluidprozeßschritten darin.
HINTERGRUND
Biologische Materialien wie beispielsweise Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen werden oft in Vorrichtungen und Geräten wie beispielsweise Multiwell-Platten, Mikrozentrifugenröhrchen und Pipetten, die aus Kunststoff oder anderen unpolaren Materialien hergestellt sind, aufbewahrt, übertragen oder umgesetzt. Es ist eine allgemeine Beobachtung, dass biologische Verbindungen an Oberflächen solcher Vorrichtungen adsorbieren/binden. Dies gilt auch für organische Materialien, welche in einer wässrigen Lösung ein gewisses Maß an Hydrophobie aufweisen, z.B. Acridinverbindungen, PCBs etc.
Für viele Anwendungen ist eine solche Bindung unerwünscht. Zum Beispiel führt die Bindung zum Verlust von wertvollen Materialien, wie beispielsweise Enzymen und Antikörpern, und kann zu Schwanken beim Verteilen von organischen Materialien führen, insbesondere wenn kleine Volumina betroffen sind. Die Bindung von Proteinen, Zellen und Plättchen an hydrophobe Oberflächen ist auch bei einer Vielzahl von Methoden zum Behandeln von Blut von Interesse.
Als Ergebnis dieser Überlegungen sind umfangreiche Bemühungen unternommen worden, um Verfahren zum Vermindern der Bindung von Proteinen und anderen organischen Verbindungen an verschiedene Oberflächen bereitzustellen. Beispiele der Ansätze, welche berücksichtigt worden sind, können in Caldwell et al., US-Pat. Nr. 5,516,703; Ding et al., Internationale Anmeldung Veröffentlichung WO 94/03544; Amiji et al., Biomaterials, 13: 682–692, 1992; J. Andrade, „Principles of Protein Adsorption" in Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, J. Andrada, Herausgeber, Band 2, Plenum Press, New York, 1–80, 1985; Lee et al., Polymeric Mater. Sci Eng., 57: 613–617, 1987; Lee et al., Journal of Biomedical Materials Research, 23: 351–368, 1989; Lee et al., Biomaterials, 11: 455–464, 1990; Lee et al., Prog. Polym. Sci., 20: 1043–1079, 1995; Merrill et al., ASAIO Journal, 6: 60–64, 1983; Okano et al., Journal of Biomedical Materials Research, 20: 1035–1047, 1986; Okkema et al., J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 1: 43–62, 1989; Owens et al., Journal of Cell Science, 87: 667–675, 1987; Rabinow et al., J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 6: 91–109, 1994; Schroen et al., Journal of Membrane Science, 80: 265–274, 1993; Sheu et al., J. Adhesion Sci. Technol., 6: 995–1009, 1992; Shimada et al., Polymer Journal, 15: 649–656, 1983; und Thurow et al., Diabetologia, 27: 212–218, 1984, gefunden werden.
Von besonderem Interesse ist die Behandlung von Reaktionsgefäßen mit kleinem Volumen, die Mehrfachreaktionen unter vielfältigen Bedingungen ermöglichen. Solche Fortschritte sind in der Mikrofluid- und Mikrotiterplattentechnologie gemacht worden. Es besteht daher ein Bedarf nach Verfahren zum Behandeln dieser Vorrichtungen, um Kontamination zu vermindern, Reaktionsausbeuten zu erhöhen und wertvolle Reagenzien zu sparen.
Mikrofluide bringen die Verwendung von Mikrokanälen anstelle von Teströhrchen oder Mikroplatten mit sich, um Analysen und Reaktionen durchzuführen. Diese Mikrokanäle oder Mikroschaltungen sind in Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff geätzt. Die Größe dieser Kanäle liegt im Mikrometerbereich, während die Reaktionsvolumina im Nanoliter- oder Mikroliterbereich liegen. Das Prinzip besteht darin, die Reaktionsmedien, welche Reagenzien und Proben enthalten, über Bereiche zu führen, welche den verschiedenen Protokollschritten entsprechen. Das Einbringen von Reaktionskammern, Chromatographiesäulen, Kapillarelektrophoresesystemen und Miniaturnachweissystemen in diese Mikrofluidsysteme ermöglicht die Automatisierung komplizierter Protokolle, indem man sie in einer einzigen Plattform integriert. Diese „Laboratorien auf Chips" haben es ermöglicht, Ergebnisse zu erhalten, welche im Hinblick auf die Reaktionsgeschwindigkeit, im Hinblick auf Produkteinsparung und im Hinblick auf Miniaturisierung, welche die Entwicklung von tragbaren Vorrichtungen ermöglicht, effizient sind. Bemerkenswerte Ergebnisse sind auch für das Integrieren und Automatisieren komplizierter Protokolle erreicht worden, wie beispielsweise biochemischer oder molekularbiologischer Protokolle, welche oft zahlreiche Handhabungen erfordern. Diese Handhabungen umfassen insbesondere die Mischung von Reagenzien und Proben, das Kontrollieren der Reaktionstemperatur, das Ausführen von zyklischem Temperaturwechsel und den Nachweis. Wolley et al. (Anal. Chem., 68, 4081–4086, 1996) beschrieb zum Beispiel das Integrieren einer PCR-Mikroreaktionskammer, eines Kapillarelektrophoresesystems und einer Anzeigevorrichtung in einer einzigen Vorrichtung. Eine Vorrichtung auf einem Chip, welche die Integration von einem Schritt für das Mischen der Reagenzien und eine enzymatische Reaktion ermöglicht, ist von Hadd et al. (Anal. Chem., 69, 3407–3412, 1997) beschrieben worden. Diese Vorrichtung stellt eine Mikroschaltung von Kanälen und Vorratsgefäßen bereit, die in einen Glasträger geätzt sind, und das Bewegen und Mischen der Flüssigkeiten findet durch Elektrokinetik statt. Zahlreiche Mikrofluidsysteme zur Integration von Protokollen und Analysen sind insbesondere in der Internationalen Patentanmeldung WO 98/45481 beschrieben worden.
Eine der großen Schwierigkeiten beim Umsetzen dieser Vorrichtungen liegt weiterhin in der hohen Adsorption der Proben und Reagenzien an der Kanaloberfläche während des Bewegens der Flüssigkeiten durch den Kanal. Im Allgemeinen enthalten Mikrofluidvorrichtungen Kanäle im Größenbereich von Mikrometern, die große Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse aufweisen (~10–100-mal größer als ein Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis in herkömmlichen Mikrotiterplatten). Dies führt zu einer erhöhten Bedeutung der Oberflächeneigenschaften/Qualität/Chemie in Mikrofluidvorrichtungen. Gleichzeitig sind biologische Proben (z.B. Proteinproben oder Reaktionsgemische wie beispielsweise ein PCR-Gemisch, LCR-Gemisch, Microsequenzier (MIS)-Gemisch etc.) komplexe Gemische von großen und kleinen Molekülen von unterschiedlichen Polaritäten (z.B. DNA- und Proteinmoleküle, dNTPs, ddNTPs, Fluoreszenzmarkierungen etc.), die eine starke Affinität zu festen Trägern sowie für Flüssig-/Flüssig- und Flüssig-/Luft-Grenzflächen haben können. Insbesondere sind Proteine dafür bekannt, dass sie stark an Siliciumdioxidmaterialien adsorbieren (Righetti, P. G., Ausgabe, 1996, Capillary Electrophoresis in Analytical Biotechnology, CRC-Reihe in Analytical Biotechnology, CRC Press, Boca Raton). Daher werden Oberflächen in Mikrofluidvorrichtungen vor dem Durchführen biologischer Reaktionen in solchen Mikrostrukturen inaktiviert. Die Inaktivierung einer Oberfläche vermindert die Adsorption von organischen Materialien an die Oberfläche. Ohne Inaktivierung von Oberflächen können biologische Reaktionen im Allgemeinen in Silicium (Siliciumdioxid)-Mikrokanälen nicht durchgeführt werden [Shoffner, M. A. et al., Nucleic Acids Res. 24: 375–379 (1996) und Cheng, J. et al., Nucleic Acids Res. 24: 380–385 (1996)].
Es sind verschiedene Möglichkeiten zur Oberflächeninaktivierung gezeigt worden. Im Allgemeinen hängt die Inaktivierungsstrategie von dem Material ab, aus welchem eine Mikrofluidvorrichtung hergestellt ist. Zum Beispiel können Siliciumdioxidoberflächen (Siliciumchips) chemisch funktionalisiert werden, z.B. durch Silanisierungsreaktionen (Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Introduction to modern chromatography, Wiley-Interscience, 1979, New York; Shoffner, M. A. et al., Nucleic Acids Res 24: 375–379 (1996); und Kopp, M. et al., Science, 280: 1046–1048 (1998)). Die silanisierten Chips können unmittelbar für biologische Reaktionen verwendet werden oder können weiter durch Herstellung einer Polymerschicht auf der Oberfläche modifiziert werden.
Die Oberflächeninaktivierung unter Verwendung von Beschichtungen umfasst zwei Ansätze: Kovalente und nicht-kovalente Beschichtungen. Die Stabilität von kovalenten Beschichtungen, von denen einige als Polymerbürsten bezeichnet werden und von adsorbierten Polymerschichten hängt von drei Faktoren ab: (a) die chemische Stabilität der Oberfläche, (b) die Stabilität der Polymer-Oberflächen-Wechselwirkung, und (c) die chemische Stabilität des Polymers, das für eine Oberflächenmodifizierung verwendet wird. Im Allgemeinen ist im Hinblick auf die Stabilität einer einzelnen Polymer/Oberflächenwechselwirkung in adsorbierten Polymerschichten (a) eine kovalente Bindung (kovalente Beschichtungen) stabiler als eine nicht-kovalente Polymer/Oberflächenwechselwirkung (ein Teil einer k_BT-Einheit, wobei k_B die Boltzmann-Konstante und T die Temperatur ist). Aufgrund einer großen Anzahl an Segmenten (manchmal mehr als 10% der Gesamtanzahl an Segmenten/Monomeren in einem Polymer), die mit einer Oberfläche in adsorbierten Polymerschichten wechselwirken, kann die Gesamtadsorptionsenergie pro einem einzelnen Polymermolekül jedoch sehr groß sein, wobei sie mehrere k_BT-Einheiten erreichen kann und daher die Polymeradsorption eigentlich irreversibel macht.
Kovalente Beschichtungen haben sowohl das Wachstum einer Polymerkette aus einer funktionalisierten Siliciumdioxidoberfläche [Hjerten, S., J. Chromatogr., 347, 191–198 (1985); und Cobb, K. A. et al., Anal. Chem., 62: 2478–2483 (1990)] als auch das Propfen einer Polymerkette auf eine Siliciumdioxidoberfläche [Herren, B. J. et al., J. Colloid Interface Sci., 115: 46 (1987); und Balachander, N. et al., Langmuir 6: 1621 (1990), Burns, N. L. et al., Langmuir 11: 2768 (1995)] mit sich gebracht. Die Oberflächeninaktivierung durch chemische Reaktionen bringt die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen funktionellen Gruppen auf einer Oberfläche (-OH) und einem reaktiven Silan oder einem funktionalisierten Polymermolekül [z.B. einem silanisierten Polyethylenglykol (PEG)] mit sich. Diese chemische Modifizierung von Oberflächen, welche oft in organischen Lösungsmitteln ausgeführt wird, ist zeitintensiv und erfordert vor dem Fertigstellen einige Syntheseschritte. Daher ist die Strategie der Oberflächeninaktivierung im Allgemeinen teuer und für die Modifizierung großer Mengen an Chips auf einfache Art und Weise nicht gut geeignet. Die kovalenten chemischen Bindungen (insbesondere „-Si-O-X"-Bindungen) sind anfällig gegenüber Hydrolyse (z.B. bei einem alkalischen pH-Wert), wodurch die kovalenten Beschichtungen mit der Zeit abgebaut werden [Cobb, K. A. et al., Anal. Chem., 62, 2478–2483 (1990)]. Da diese Beschichtungen nicht einfach regeneriert werden können, ist die Lebensdauer solcher Oberflächen und folglich der gesamten Vorrichtung begrenzt, und die laufende Reproduzierbarkeit der Qualität einer Oberfläche in chemisch modifizierten Mikrofluidvorrichtungen ist gering. Darüber hinaus ist es aufgrund von z.B. Oberflächenverunreinigungen und/oder der Kontrolle des Wassergehaltes der verwendeten organischen Lösungsmittel schwierig, eine gute Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge beizubehalten.
Eine weitere Möglichkeit zum Inaktivieren einer Mikrofluidoberfläche mit einer nicht-kovalenten Beschichtung ist die Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) auf einer Oberfläche. BSA ist erfolgreich für Oberflächeninaktivierungen bei PCR-Chips eingesetzt worden [Northrup, M. A., Anal. Chem., 70: 918–922 (1998); Waters, L. C. et al., Anal. Chem.; 70: 158–162 (1998); und Waters, L. C. et al., Anal. Chem., 70: 5172–5176 (1998)]. BSA adsorbiert auf Siliciumdioxid, sättigt Oberflächenadsorptionsstellen und ermöglicht es, biologische Reaktionen in Vorrichtungen mit hohen Oberflächen-zu-Volumenverhältnissen durchzuführen. BSA denaturiert jedoch bei Temperaturen über 55–65°C und kann folglich koagulieren und große Aggregate bilden (abhängig von der BSA-Konzentration) [Wetzel, R. et al., Eur. J. Biochem. 104: 469–478 (1980); und Oakes, J., J. Chem. Soc. Faraday, 172: 228–237 (1976)]. Diese Koagulation (Denaturierung) von BSA bei hoher Temperatur ist irreversibel, d.h. das BSA löst sich bei verminderter Temperatur in wässrigen Lösungen nicht wieder auf. Beim Durchführen biologischer Reaktionen in statischem Modus (kein Flüssigkeitsfluss), z.B. in Mikrowells, ist die Oberflächeninaktivierung durch BSA unempfindlich und funktioniert gut [Northrup, M. A., Anal. Chem. 70: 918–922 (1998), Waters, L. C., Anal. Chem., 70: 158–162 (1998); und Waters, L. C., Anal. Chem, 70: 5172–5176 (1998)]. Beim Ausführen biologischer Reaktionen in Bewegung (d.h. an der Fest-/Flüssig-Grenzfläche liegt eine von Null verschiedene Scher-Spannung vor) und in kleinen Kanälen können große BSA-Aggregate jedoch in einer Lösung stromabwärts transportiert werden und schließlich einen Mikrokanal oder eine Kapillare blockieren. Daher liegt der Nachteil bei der Verwendung von BSA für Oberflächeninaktivierungen in Mikrofluidvorrichtungen, in welchen Reagenzien durch einen Flüssigkeitsfluss von einer Stelle zur anderen transportiert werden, in der Änderung der Löslichkeit von BSA in einem Temperaturbereich, der üblicherweise für biologische Reaktionen verwendet wird (PCR, LCR, MIS, etc.). Shoffner et al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, Nr. 2, S. 375–379 beschreibt die Oberflächenpassivierung von mikrohergestellten Silicium-Glaschips für die PCR. Das Passivieren des PCR-Chips unter Verwendung eines silanisierenden Mittels und einer anschließenden Polymerbehandlung (mit Poly-alpha-Alanin; Poly-L-Asparaginsäure, Polyglycin, Poly-L-Leucin, Poly-DL-Phenylalanin, Poly-DL-Tryptophan, Poly-L-Lysin, Polyvinylpyrrolidon, Polyadenylsäure, oder Polymaleimid) führte offensichtlich zu guter, aber uneinheitlicher Amplifikation. Keines der PCR-Gemische (siehe Seite 376) umfasst jedoch irgendein Polymer. Tatsächlich werden die Vorrichtungen mit dem Polymer vor dem Stattfinden der PCR-Reaktion beschichtet – siehe zum Beispiel das Kapitel mit der Überschrift „Surface Treatments of Silicon Powder", welches die Seiten 375 und 376 umfasst. Das Polymer wird nicht direkt zu der Fluidprobe, die die Reagenzien umfasst, hinzugefügt. Stattdessen wird die Vorrichtung, in welcher die Reaktion stattfindet, vor dem Ausführen der Reaktion mit dem Polymer behandelt und/oder beschichtet.
EP-A-1 016 864 (Affymetrix Inc) beschreibt Verfahren zur Mikroherstellung von vollständig integrierten PCR-CE-Vorrichtungen mit kleinem Volumen, die aus Glas oder ähnlichen Materialien hergestellt sind. In Gebrauch verwenden die Vorrichtungen eine lineare Polyacrylamidoberflächenbeschichtung, die mit der Zugabe von BSA zu dem Amplifikationspuffer gekoppelt ist. Siehe Absatz [0011] auf Seite 2. Obwohl die Vorrichtung (ein PCR-Chip) mit dem Polymer beschichtet ist, wird das Polyacrylamid nicht direkt zu dem Amplifikationspuffer hinzugefügt. In dem Amplifikationspuffer ist nur BSA vorhanden. Das Polymer wird nicht direkt zu der Fluidprobe, die die Reagenzien umfasst, hinzugefügt. Stattdessen wird die Vorrichtung, in welcher die Reaktion stattfindet, vor dem Durchführen der Reaktion mit dem Polymer behandelt und/oder beschichtet.
Amiji et al., Biomaterials, 1992, Bd. 13, Nr. 10, S. 682–692 beschreibt die Verwendung von kurzkettigem Polydimethylacrylamid (PDMA), um eine dynamische Beschichtung auf der inneren Oberfläche von Kapillaren zu bilden, die für die Elektrophorese verwendet werden, um elektroosmotischen Fluss und DNA-Kapillarwand-Wechselwirkungen zu unterdrücken. Insbesondere wird die Oberfläche einer Kapillare unter Verwendung einer PDMA-Lösung als Siebboden beschichtet (siehe z.B. Seite 188, linke Spalte, Zeilen 25–35). Die Kapillaren werden zunächst mit der PDMA-Lösung gespült, und anschließend werden die Proben in die Kapillaren injiziert (siehe Seite 191, linke Spalte, Zeilen 8–17). Zwischen den Arbeitsgängen werden die Kapillaren mit Wasser und anschließend mit PDMA gespült. Das Polymer wird nicht direkt zu der Fluidprobe, die die Reagenzien umfasst, hinzugefügt. Stattdessen werden die Kapillaren, in welchen die Reaktion stattfindet, vor dem Ausführen der Reaktion mit dem Polymer behandelt und/oder beschichtet. Darüber hinaus ist in diesem Dokument nirgends irgendein Verfahren beschrieben, in welchem die Proben und/oder die Trennbereiche das Polymer (PDMA) umfassen; stattdessen lehrt dieses Dokument lediglich Verfahren, in welchen ein Mikrokanal mit PDMA vor dem Injizieren der Trennbereiche und/oder der Fluidprobenbereiche beschichtet wird.
Ren et al., Analytical Biochemistry, 1999, Bd. 276, Nr. 2, S. 188–194 beschreibt das Vermeiden von Proteinadsorption und Plättchenadhesion an Oberflächen durch PEO/PPO/PEO-Dreiblockcopolymere (Pluronics^® Polymere). Die Oberflächen (DDS-Glasdeckplättchen oder LDPE-Film) werden mit Pluronics^® Polymer behandelt, stehen gelassen und anschließend vor dem Ausbreiten der Plättchen auf den Pluronics^®- behandelten Oberflächen gespült. Das Polymer wird nicht direkt zu der Fluidprobe, die die Plättchen umfasst, hinzugefügt. Stattdessen werden die Oberflächen vor dem Hinzufügen der Plättchen mit dem Polymer behandelt und/oder beschichtet.
Obwohl die Verwendung der Polymere zum Vermeiden der Adsorption von Proben und Reagenzien an Mikrofluidoberflächen soweit erörtert worden ist, können dieselben Methoden auch auf andere Oberflächen, wie beispielsweise Oberflächen, die aus Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff (Polymer) hergestellt sind, und auf andere Grenzflächen (d.h. Flüssig-/Flüssig- und Flüssig-/Luft-Grenzflächen) angewendet werden. Diese Oberflächen können Oberflächen von Geräten, die für das Aufbewahren, Verteilen oder Umsetzen von Fluidproben verwendet werden, wie beispielsweise Teströhrchen, Multiwell-Platten, Pipetten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktionswells oder Mikrozentrifugenröhrchen umfassen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Solche Behandlungsmethoden finden besondere Anwendung bei Mikrotiterplatten, da sie für biologische Reaktionen verwendet werden, die häufig in demselben Reaktionswell mit kleinen Volumina aufeinander folgende Schritte erfordern. Zum Beispiel erfordert der Genotypisierungsvorgang mittels Einzelbasen-Extensionsverfahren drei aufeinander folgende biologische Reaktionen (d.h. Polymerasekettenreaktion (PCR), enzymatische Reinigung und Mikrosequenzieren (MIS)). Daher ist es effizient und wirtschaftlich, zwei oder mehr aufeinanderfolgende Reaktionen in demselben Well einer einzigen Mikrotiterplatte durchzuführen. In solchen Fällen sollte sichergestellt werden, dass keine Kontamination zwischen den Reaktionen stattfindet, und dass Biomoleküle aus vorhergehenden Reaktion nachfolgende Reaktionen nicht kontaminieren. Dies kann sich jedoch aufgrund der hohen Adsorption verbleibender Biomoleküle auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte oder aufgrund der hohen Konzentration solcher Moleküle in Flüssig-/Flüssig- oder Flüssig-/Luft-Grenzflächen schwierig gestalten.
Viele Geräte, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, sind nicht polar, während Biomoleküle (z.B. Proteinproben, oder Reaktionsgemische wie beispielsweise PCR-Reagenzien und MIS-Reagenzien) komplexe Gemische von großen und kleinen Molekülen verschiedener Polaritäten (z.B. DNA- und Proteinmoleküle, dNTPs, ddNTPs, Fluoreszenzmarkierungen, etc.), sind, die oftmals starke Affinitäten zu festen Trägern aufweisen. Die Adsorption der Biomoleküle auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte macht diese Biomoleküle gegenüber Enzymen während biologischer Reaktionen nicht zugänglich oder weniger zugänglich.
Ein Problem, auf das man im Allgemeinen stößt, liegt in der Adsorption von Deoxynukleotiden (dNTPs) auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten, insbesondere während Genotypisierungsvorgängen. Die Adsorption von dNTPs, die während des ersten Schrittes einer Genotypisierungsmethode (d.h. PCR) auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte hinzugefügt werden, macht sie während der nachfolgenden Schritte (d.h. Enzymreinigung) weniger zugänglich gegenüber der alkalischen Phosphatase aus Garnelen (SAP), und die adsorbierten dNTPs werden nicht dephosphoryliert. Da dNTPs bei hoher Temperatur von der Oberfläche der Mikrotiterplatte freigesetzt werden (z.B. während der Denaturierung von EXO- und SAP-Enzymen oder während des zyklischen Temperaturwechsels der MIS-Reaktionen), können sie den dritten Schritt des Genotypisierungsvorgangs (d.h. MIS) erheblich kontaminieren. Als Ergebnis kann das MIS-Oligonukleotidprodukt durch mehr als eine Base (dNTPs) verlängert sein; daher können die SNP-spezifischen fluoreszenzmarkierten ddNTPs falsch in das Oligonukleotidprodukt mehrerer Basen stromabwärts der SNP-Stelle von Interesse eingebaut sein. Folglich kann dies zu Fehlern beim Genotypisieren führen (z.B. kann eine homozygote Probe kann als eine heterozygote Probe erscheinen), wenn eine Nachweismethode eingesetzt wird, die nicht in der Lage ist, anhand von Größe zu unterscheiden. Eine zusätzliche Verlängerung eines MIS-Oligonukleotids durch dNTPs, die von einer PCR übrig geblieben sind, verursacht jedoch eine Verminderung eines spezifischen Signals, was für jede beliebige eingesetzte Nachweismethode nachteilig ist.
Ein weiterer Nachteil, der mit der Adsorption von Biomolekülen auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte zusammenhängt, ist eine verminderte Ausbeute der biologischen Reaktionen. Die Adsorption wertvoller Biomoleküle führt zu verminderten Ausbeuten des gewünschten Produkts. Bei dem Versuch, den Verlust an Reagenzien durch Adsorption auszugleichen, werden Konzentrationen von Reagenzien oft erhöht, um die Adsorptionsstellen auf den Plattenoberflächen zu sättigen. Dies stellt jedoch keine rationelle Lösung zum Vermeiden von Adsorption dar.
Eine Möglichkeit zum Vermeiden von Kontamination besteht darin, die Proben zwischen den aufeinanderfolgenden Reaktionen in eine neue Mikrotiterplatte zu übertragen. Im Fall eines Genotypisierungsvorgangs wird die PCR in einer Mikrotiterplatte durchgeführt und die enzymatische Reinigung und anschließendes MIS wird auf einer anderen Mikrotiterplatte durchgeführt. Dieses Verfahren zum Vermeiden von Kontamination ist jedoch nicht vollständig effektiv, da etwa 10% der MIS-Reaktionen immer noch durch übrig gebliebene dNTPs aus PCR-Reaktionen kontaminiert sind (Daten von Genset, Analyse Genomique Department). Diese Kontamination wird deutlicher, wenn die Reaktionen in sehr kleinen Volumina (z.B. Platten mit hoher Dichte) durchgeführt werden, da die Anzahl an Wechselwirkungen der Moleküle aus der Stammlösung mit den Oberflächen bei Abnahme des Reaktionsvolumens rasch zunimmt. Darüber hinaus ist es technisch bequemer und günstiger, ein Verfahren zu verwenden, das nicht die Übertragung von Proben auf eine neue Mikrotiterplatte erfordert.
Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren zur Inaktivierung von Oberflächen, welches eine gute laufende Reproduzierbarkeit der Qualität einer Oberfläche in demselben Chip, in derselben Mikrotiterplatte oder anderen Oberflächen bereitstellt, welches eine stabile Oberfläche bei den entsprechenden Temperaturen für biologische Anwendungen bereitstellt, und welches nicht komplizierte und kostenintensive Syntheseverfahren mit sich bringt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung von Polymeren für die kompetitive Adsorption an eine Oberfläche bereit, um die Adsorption von organischen Materialien (z.B. Biomolekülen) in Fluid- (z.B. wässrigen) Proben auf den Oberflächen zu vermindern. Alternativ stellt die Erfindung Verfahren zur Verwendung von Polymeren bereit, um die Adsorption von organischen Materialien auf Flüssig-/Luft- oder Flüssig-/Flüssig-Grenzflächen zu vermindern. Die Oberflächen können aus Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff, wie z.B. Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymeren, Polyamiden, Polydimethylsiloxanen, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen und Elastomeren hergestellt sein. Diese Oberflächen können die Oberflächen von Geräten wie beispielsweise Vorrichtungen oder Gefäßen, die zum Aufbewahren, Austeilen oder Umsetzen von Fluidproben verwendet werden umfassen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Solche Geräte umfassen Teströhrchen, Multi-Well-Platten, Pipetten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktionswells, Mikrokanäle, Mikrofluidgeräte, Kapillaren und Mikrozentrifugenröhrchen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zum Durchführen von Fluidprozeßschritten auf den Oberflächen, so dass die Adsorption von organischen Materialien in einer Fluidprobe durch das Einbringen von oberflächenadsorbierenden Polymeren minimiert wird. Fluidprozeßschritte umfassen Reaktionen, Inkubationen, Verdünnungen, Titrationen, Reinigungen, Nachweise, Mischen, Bindungsuntersuchungen, Arzneimittel-Screeninguntersuchungen und Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik), sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Fluidprozeßschritte, die ein Enzym umfassen, sind ebenso bevorzugt. Fluidproben umfassen Reaktionsgemische, wie beispielsweise PCR-Gemische, LCR-Gemische, Primerextensions-Reaktionsgemische und Genotypisierungs-Reaktionsgemische (z.B. Mikrosequenziergemisch), sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Bevorzugte Fluidproben sind wässrige Fluidproben. Organische Materialien umfassen Biomoleküle, wie beispielsweise Nukleinsäuren (z.B. DNA, RNA, Polynukleotide, Oligonukleotide, Nukleotide, dNTPs wie beispielsweise dATP, dTTP, dCTP, dGTP, und ddNTPs wie beispielsweise ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), Aminosäuren (z.B. Proteine, Polypeptide, Peptide, Aminosäuren wie beispielsweise Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin, Histidin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, Prolin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Glycin, Cystein und Tyrosin), Lipide, chemische Verbindungen (z.B. Fluoreszenzmarkierungen) und insbesondere Rezeptoren oder Antikörper und deren Liganden, Zellen und Wachstumsfaktoren, Wachstumsinhibitoren, Enzyme und Substrate. Bevorzugt können Biomoleküle komplexe Gemische großer und kleiner Moleküle verschiedener Polaritäten umfassen, wie beispielsweise die oben aufgelisteten Moleküle, die eine starke Affinität zu verschiedenen Oberflächen haben können. Jede Gattung oder jede Art von Oberflächen, Geräten, Fluidprozeßschritten oder organischen Materialien, die oben aufgelistet sind, können in die Ausführungsformen dieser Erfindung spezifisch eingeschlossen oder von ihnen ausgeschlossen sein.
Die Verfahren der Erfindung betreffen auch Ausführungsformen, die die dynamische Regeneration von Oberflächen ermöglichen, wobei Fluidproben in einem Gerät wie beispielsweise einer Vorrichtung oder einem Gefäß (z.B. Mikrokanal) nacheinander bearbeitet werden. Darüberhinaus beziehen sich die erfindungsgemäßen Verfahren auf Ausführungsformen, die es ermöglichen, dass nachfolgende Fluidprozeßschritte nacheinander auf derselben Oberfläche durchgeführt werden, so dass Kontamination minimiert wird und die Reaktionsausbeuten maximiert werden.
Das Einbringen von oberflächenadsorbierenden Polymeren, die nicht-kovalent an eine Oberfläche binden, vermeidet die unerwünschte Adsorption von organischen Materialien auf der Oberfläche, so dass Kontamination vermindert und Reaktionsausbeuten erhöht werden. Bevorzugt weist die Oberfläche eine kleinere Polarität auf als die Polarität einer wässrigen Fluidprobe. Solche nicht-kovalenten Beschichtungen weisen verschiedene wichtige Vorteile gegenüber chemischen (kovalenten) Beschichtungen auf, die in Fluidprozeßschritten verwendet werden: nicht-kovalente Inaktivierungsverfahren bringen keine komplizierte und zeitaufwendige chemische Synthese mit sich und sind daher kostengünstig und gut geeignet, um große Mengen von Geräten zum Aufbewahren, Verteilen oder Umsetzen von Fluidproben auf einfache Art und Weise zu modifizieren.
In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Vermindern der Adsorption eines organischen Materials auf einer Oberfläche, umfassend: a) Hinzufügen einer Fluidprobe, die das organische Material und ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, zu der Oberfläche. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche aus Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymeren, Polyamiden, Polydimethylsiloxanen, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen und Elastomeren) hergestellt. Darüber hinaus stellt das organische Material ein komplexes Gemisch aus kleinen und großen Molekülen unterschiedlicher Polaritäten wie beispielsweise der oben aufgelisteten Biomoleküle dar, die eine starke Affinität zur Oberfläche des Gerätes haben können. Eine Fluidprobe kann ein Reaktionsgemisch, wie beispielsweise ein PCR-Reaktionsgemisch, ein LCR-Gemisch, ein Primerextensions-Reaktionsgemisch oder ein Genotypisierungs-Reaktionsgemisch (z.B. Mikrosequenzier (MIS)-Gemisch) umfassen. Das oberflächenadsorbierende Polymer ist ein Block-Copolymer, das Polypropylenoxide und Polyethylenoxide umfasst.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Vermindern der Adsorption eines organischen Materials auf einer Oberfläche, umfassend: (a) Erhalten einer Fluidprobe, die ein organisches Material umfasst; (b) Hinzufügen einer wirksamen Menge eines oberflächenadsorbierenden Polymers zu der Fluidprobe; (c) Inkontaktbringen der Fluidprobe, die das organische Material und das oberflächenadsorbierende Polymer umfasst, mit einer Oberfläche; und (d) Durchführen einer oder mehrerer Fluidprozeßschritte. Bevorzugte Fluidproben umfassen üblicherweise vor dem Durchführen eines Fluidprozeßschrittes kein oberflächenadsorbierendes Polymer der vorliegenden Erfindung. Alternativ können die Fluidproben üblicherweise vor dem Durchführen eines der Verfahren der Erfindung ein oberflächenadsorbierendes Polymer der vorliegenden Erfindung umfassen. Bevorzugte Fluidprozeßschritte sind Fluidprozeßschritte, die üblicherweise kein beliebiges oberflächenadsorbierendes Polymer der vorliegenden Erfindung umfassen. Weitere bevorzugte Fluidprozeßschritte sind Reaktionen, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer keiner der Reaktionspartner ist oder wobei das oberflächenadsorbierende Polymer keine aktivierende oder hemmende Wirkung auf die Reaktionspartner aufweist. Noch weiter bevorzugte Fluidprozeßschritte sind Reaktionen, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer nicht für das Stattfinden der Reaktion notwendig ist. Alternativ kann das oberflächenadsorbierende Polymer eines der Reaktionspartner des Fluidprozeßschrittes sein. Alternativ kann das oberflächenadsorbierende Polymer entweder bezüglich der Masse oder der Molarität im Überschuss hinzugefügt werden im Vergleich zu dem, was zum Durchführen eines Fluidprozeßschrittes benötigt oder üblicherweise verwendet wird. Bevorzugt liegt das oberflächenadsorbierende Polymer in einem mindestens 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000- oder 10000-fachen Überschuss gegenüber dem vor, was zum Durchführen der Reaktion benötigt wird, wenn das oberflächenadsorbierende Polymer ein Reaktionsmittel ist oder gegenüber der Menge, die üblicherweise verwendet wird, wenn das oberflächenadsorbierende Polymer kein Reaktionsmittel ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche Teil eines Gerätes, das zum Aufbewahren, Verteilen oder Umsetzen von Fluidproben verwendet wird, und kann einen Mikrokanal, ein Teströhrchen, eine Multi-Well-Platte, eine Pipette, eine Pipettenspitze, eine Mikrotiterplatte, ein Reaktionswell, einen Mikrokanal oder ein Mikrozentrifugenröhrchen umfassen, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt.
In noch einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Vermindern der Adsorption eines organischen Materials auf der Oberfläche eines Gerätes, umfassend: (a) Bereitstellen eines Gerätes, das im Wesentlichen eine Oberfläche umfasst oder im Wesentlichen aus einer Oberfläche besteht; (b) Hinzufügen einer Fluidprobe, die das organische Material und ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, zu dem Gerät, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer in der Lage ist, nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden; und (c) Durchführen einer oder mehrerer Fluidprozeßschritte in demselben Gerät.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Auswählen der Menge eines oberflächenadsorbierenden Polymers, das zu einem Fluidprozeßschritt hinzugefügt wird, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Gerätes, das im Wesentlichen aus einer Oberfläche besteht; (b) Hinzufügen einer Fluidprobe, die ein organisches Material und ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, zu dem Gerät, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer in der Lage ist, nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden; (c) Durchführen eines oder mehrerer Fluidprozeßschritte in demselben Gerät; (d) Auswählen der optimalen Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers, welche in der Lage ist, die höchste Ausbeute zu erhalten. Bevorzugt ist die Oberfläche von geringerer Polarität als die Oberfläche der Fluidprobe. Bevorzugt ist der Fluidprozeßschritt eine PCR.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Auswählen der Menge eines oberflächenadsorbierenden Polymers, die zu einem Fluidprozeßschritt hinzugefügt wird, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Gerätes, das im Wesentlichen eine Oberfläche umfasst oder im Wesentlichen aus einer Oberfläche besteht; (b) Hinzufügen einer Fluidprobe, die ein organisches Material und ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, zu dem Gerät, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer in der Lage ist, nicht-kovalent an die Oberfläche zu binden; (c) Durchführen eines oder mehrerer Fluidprozeßschritte in demselben Gerät; (d) Auswählen der optimalen Menge an oberflächenadsorbierendem Polymer, um die Adsorption oder Kontamination möglichst weit herabzusenken. Gegebenenfalls ist die Kontamination nachfolgender Fluidprozeßschritte auf die Anwesenheit unerwünschter dNTPs aufgrund der Adsorption an eine Oberfläche zurückzuführen. Bevorzugt weist die Oberfläche eine geringere Polarität auf als die Polarität der Fluidprobe. Bevorzugt ist der Fluidprozeßschritt Mikrosequenzieren und die Kontamination oder Adsorption durch das Vorliegen von Sequenzierungsartefakten nachweisbar.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung einen Kit, umfassend: (a) eine Fluidprobe zum Durchführen eines Fluidprozeßschrittes; (b) ein oberflächenadsorbierendes Polymer in einer wässrigen Lösung; (c) eine Anzeige, die die Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers vorschlägt, die zu der Fluidprobe hinzugefügt werden soll. Gegebenenfalls umfasst der Kit auch ein Gerät, welches im Wesentlichen aus einer Oberfläche besteht. Gegebenenfalls ist das oberflächenadsorbierende Polymer in einem Reaktionsgemisch beinhaltet. Bevorzugt ist die empfohlene Menge an oberflächenadsorbierendem Polymer, die zu der Fluidprobe hinzugefügt werden sollte, unter Verwendung eines der Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt. Bevorzugt ist der Kit ein Genotypisierungskit.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Reaktionsgemisch zum Durchführen von Fluidprozeßschritten, wobei das Reaktionsgemisch ein oberflächenadsorbierendes Polymer der vorliegenden Erfindung umfasst, und wobei die Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers, die in dem Reaktionsgemisch beinhaltet ist, unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde. Bevorzugt ist das Reaktionsgemisch ein PCR-Reaktionsgemisch, ein LCR-Gemisch, ein Primerextensions-Reaktionsgemisch oder ein Genotypisierungs-Reaktionsgemisch (z.B. Mikrosequenzier (MIS)-Gemisch).
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein Verfahren zum dynamischen Aufrechterhalten oder Regenerieren der Polymerbeschichtung, die auf der Oberfläche eines Mikrokanals adsorbiert ist, umfassend: (a) Bereitstellen eines Kanals, der in einem Träger angeordnet ist; (b) Einbringen von mindestens zwei Fluidprobenbereichen in den Kanal, wobei jede der mindestens zwei Fluidprobenbereiche eine Fluidprobe von Interesse umfasst; (c) Bereitstellen mindestens eines Fluidtrennbereiches, der zwischen zwei Fluidprobenbereichen positioniert ist, wobei der mindestens eine Fluidtrennbereich oder der mindestens eine Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, das in der Lage ist, nicht-kovalent an eine Oberfläche des Kanals zu binden. Gegebenenfalls umfasst mindestens ein Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls umfasst mindestens ein Fluidtrennbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls sind mindestens zwei Fluidprobenbereiche im Wesentlichen frei von oberflächenadsorbierendem Polymer. Gegebenenfalls umfasst mindestens ein Fluidtrennbereich und mindestens ein Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls umfasst jeder der Fluidprobenbereiche ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls umfasst jeder Fluidtrennbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls umfasst jeder Fluidtrennbereich und jeder Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer. Gegebenenfalls werden Fluidprobenbereichen mit mindestens einer ganzen Zahl zwischen 1 und 100 in einem Kanal bereitgestellt, wobei jede ganze Zahl spezifisch in die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen oder von diesen ausgeschlossen sein kann. Gegebenenfalls fließt mindestens ein Fluidprobenbereich und mindestens ein Fluidtrennbereich in den Kanal.
In weiteren Aspekten umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln der Oberfläche eines Mikrokanals, umfassend: (a) Bereitstellen eines Kanals, der in einem Träger angeordnet ist; (b) Einbringen eines ersten Fluidbereiches in den Kanal, wobei der erste Fluidbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, das in der Lage ist, nicht-kovalent an die Oberfläche des Kanals zu binden; (c) Einbringen eines zweiten Fluidbereichs, der eine Fluidprobe von Interesse umfasst, im Anschluß an den Kanal, wobei der zweite Fluidbereich beim Einbringen in den Kanal im Wesentlichen frei von dem oberflächenadsorbierenden Polymer ist. Die Oberfläche bezieht sich auf die Grenzfläche zwischen dem Mikrokanal und dem Fluidbereich.
In noch weiteren Aspekten umfasst die Erfindung ein Verfahren zum dynamischen Aufrechterhalten oder Regenerieren der Polymerbeschichtung, die auf der Oberfläche eines Mikrokanals adsorbiert ist, umfassend: (a) Bereitstellen eines Kanals, der in einem Träger angeordnet ist; (b) Einbringen von mindestens zwei Fluidprobenbereichen in den Kanal, wobei jeder der mindestens zwei Fluidprobenbereiche eine Fluidprobe von Interesse umfasst, und wobei jeder der mindestens zwei Fluidprobenbereiche ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, das in der Lage ist, nicht-kovalent an die Oberfläche des Kanals zu binden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden mindestens zwei Fluidbereiche oder Fluidprobenbereiche in einem einzelnen Kanal bereitgestellt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind Fluidbereiche oder Fluidprobenbereiche mit mindestens einer beliebigen ganzen Zahl zwischen 5 und 100 in einem einzelnen Kanal bereitgestellt. Bevorzugt sind die aneinander grenzenden Fluidbereiche oder Fluidprobenbereiche durch mindestens einen Fluidtrennbereich getrennt.
Bei gemeinsamer Bereitstellung von Fluidproben und oberflächenadsorbierendem Polymer können Fluidproben und Polymerlösungen in ein erfindungsgemäßes Gerät entweder als Gemisch oder getrennt eingebracht werden; getrennt eingebrachte Proben und Polymere können in dem Gerät gemischt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen fließt die Polymerlösung durch den Kanal. Bevorzugt wird die Polymerlösung, wie im Folgenden beschrieben, in einem kontinuierlichen Fluss durch den Kanal bewegt. In weiteren bevorzugten Verfahren wird die Bewegung eines Fluids wie beispielsweise einer Lösung, eines Fluidprobenbereichs oder eines Fluidtrennbereichs in einem Kanal durch einen Druckgradienten bewirkt. Gegebenenfalls wird die Bewegung der Lösung durch ein elektroosmotisches, elektrokinetisches, elektrohydrodynamisches oder durch ein Temperaturgradientensystem bewirkt.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen eines Fluidprozeßschrittes in einem Gerät, umfassend: (a) Einbringen einer Lösung, die ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, in ein Gerät, so dass das Polymer nicht-kovalent auf der Oberfläche des Gerätes adsorbiert; (b) Einbringen einer Fluidprobe in das Gerät; (c) Durchführen eines Fluidprozeßschrittes in dem Gerät. Bevorzugt ist das Gerät eine Mikrotiterplatte oder ein Mikrofluidgerät.
Die Erfindung umfasst auch Mikrokanäle und Mikrofluidvorrichtungen, die gemäß den Verfahren der Erfindung behandelte Kanäle umfassen. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Kanal oder eine Mikrofluidvorrichtung, die einen Träger und mindestens einen Kanal umfasst, der in dem Träger angeordnet ist, wobei ein erfindungsgemäßes oberflächenadsorbierendes Polymer auf dem Kanal nicht-kovalent adsorbiert ist. Bevorzugt weist der Kanal eine Breite von zwischen etwa 1 μm und etwa 3 mm auf. Bevorzugt besteht das Substrat im Wesentlichen aus Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff wie z.B. Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymeren, Polyamiden, Polymethylsiloxanen, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen und Elastomeren.
Mikrofluidvorrichtungen der Erfindung können weiter Mittel zum Erzeugen eines Druckgradienten über den Kanal umfassen, wodurch die Bewegung des Fluids in dem Kanal bewirkt wird, und/oder ein Mittel zur Temperatureinstellung zum Kontrollieren der Temperatur des Fluids in dem Kanal.
Die Verfahren der Erfindung umfassen weiter das Durchführen mindestens eines Fluidprozeßschrittes in dem Kanal und/oder der Vorrichtung. Die Verfahren der Erfindung sind insbesondere zum Durchführen aufeinanderfolgender Fluidprozeßschritte geeignet. Die Verfahren der Erfindung können das Durchführen von Fluidprozeßschritten in einem Kanal oder einem Gerät mit mindestens einer beliebigen ganzen Zahl zwischen 2 und 1000 umfassen.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung die Verwendung eines oberflächenadsorbierenden Polymers in einer Fluidprobe zum Durchführen eines Fluidprozeßschrittes in einem Gerät. Gegebenenfalls umfasst der Schritt des Durchführens eines Fluidprozeßschrittes das Durchführen eines Fluidprozeßschrittes, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Reaktion, einer Inkubation, einer Verdünnung, einer Titration, einer Reinigung, einem Nachweis und einer Arzneimittelscreening-Untersuchung, Bindungsuntersuchungen und Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik).
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren, Systeme und Geräte der Erfindung umfasst eine Fluidprobe oder eine Fluidprobe von Interesse einen Testanalyten oder ein Reagenz. Stärker bevorzugt umfasst eine Fluidprobe ein organisches Material. Bevorzugt ist das organische Material ein Biomolekül, wobei das Biomolekül ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus: Nukleinsäuren (z.B. DNA, RNA, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Nukleotiden, dNTPs wie beispielsweise dATP, dTTP, dCTP, dGTP und ddNTPs wie beispielsweise ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), Aminosäuren (z.B. Polypeptiden, Peptiden, Aminosäuren wie beispielsweise Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin, Histidin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, Prolin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Glycin, Cystein und Tyrosin), Lipiden, chemischen Verbindungen und insbesondere Rezeptoren oder Antikörpern und deren Liganden, Zellen und Wachstumsfaktoren und Wachstumsinhibitoren sowie Enzymen und Substraten. Das Biomolekül kann komplexe Gemische großer und kleiner Moleküle von unterschiedlichen Polaritäten umfassen (z.B. Nukleinsäuren und Proteinmoleküle, dNTPs, ddNTPs, Fluoreszenzmarkierungen etc.), die eine starke Affinität zu festen Trägern haben können. Jede beliebige Anzahl von Biomolekülen kann als eine einzelne Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein. In weiteren Aspekten kann eine Fluidprobe ein Reaktionsgemisch, wie beispielsweise ein PCR-Reaktionsgemisch, ein LCR-Gemisch, ein Primerextensions-Reaktionsgemisch oder ein Genotypisierungs-Reaktionsgemisch (z.B. Mikrosequenzier (MIS)-Gemisch) umfassen, wobei jedes davon als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann.
Die Verfahren, Systeme und Geräte der Erfindung können vorteilhafterweise in Übereinstimmung mit einer großen Auswahl an Fluidprozeßschritten verwendet werden, von welchen einige hierin im Folgenden beschrieben werden. In einigen Aspekten kann der Schritt des Durchführens eines Fluidprozeßschrittes das Durchführen eines Fluidprozeßschrittes umfassen, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Reaktion, einer Inkubation, einer Verdünnung, einer Titration, einer Reinigung, eines Nachweises, aus Mischen und einer Arzneimittel-Screeninguntersuchung, welche als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein können. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Fluidprozeßschritt das Durchführen einer biochemischen Reaktion. Insbesondere kann eine biochemische Reaktion eine Primerextensionsreaktion, zyklischen Temperaturwechsel, eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion oder Enzymreinigung umfassen, von welchen jede beliebige biochemische Reaktion als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann. Besonders bevorzugte Reaktionen mit zyklischem Temperaturwechsel umfassen PCR- oder MSI-Reaktionen. Jede beliebige Anzahl oder Kombination an Fluidprozeßschritten kann gemäß den Verfahren der Erfindung durchgeführt werden. In einem Aspekt wird ein Gerät für einen einzelnen Fluidprozeßschritt verwendet, wobei in weiteren Aspekten mindestens zwei aufeinanderfolgende Fluidprozeßschritte in einem Kanal oder Gerät der Erfindung durchgeführt werden. Bevorzugt werden die aufeinanderfolgenden Fluidprozeßschritte in demselben Kanal oder Gerät der Erfindung durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auf Fluidprozeßschritte in Volumina von weniger als einer ganzen Zahl zwischen 20 und 0,1 μl gerichtet. Jede beliebige ganze Zahl kann insbesondere in die Ausführungsformen der Erfindung eingeschlossen sein oder von diesen ausgeschlossen sein.
Bevorzugte Oberflächen, die das Gerät der Erfindung bilden, sind im Wesentlichen aus Glas, Quarz, Silicium, Metallen oder Kunststoffen hergestellt oder bestehen aus diesen, von welchen jede beliebige Oberfläche als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann. Bevorzugt ist der Kunststoff ein Polymer, und weiter bevorzugt ist das Polymer ein Polymer mit verschiedenen Polaritäten. Die Oberfläche kann polar, nicht-polar, hydrophil oder hydrophob sein. Bevorzugte Oberflächen sind polare hydrophobe Oberflächen, nicht-polare hydrophobe Oberflächen, polare hydrophile Oberflächen und nicht-polare hydrophile Oberflächen, von denen jede als Ausführungsform der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann. Noch weiter bevorzugt ist das Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymeren, Polyamiden, Polydimethylsiloxanen, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen und Elastomeren, von denen jedes Polymer als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung Träger auf eine strukturelle Oberfläche unterhalb eines Überzugs oder einer Beschichtung (z.B. Polymerbeschichtung). In der vorliegenden Erfindung können Mikrokanäle in einem Träger angeordnet sein, oder Geräte können aus einem Träger hergestellt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bezeichnung Gerät hierin austauschbar mit Vorrichtung oder Gefäß verwendet. Geräte der Erfindung werden zum Aufbewahren, Verteilen oder Umsetzen von Fluidproben verwendet. Das Gerät umfasst sowohl Vorrichtungen als auch Gefäße wie beispielsweise Kanäle, die in einem Substrat angeordnet sind, oder Teströhrchen, Multi-Well-Platten, Pipetten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktionswells, Mikrokanäle, Mikrofluidgeräte, Kapillaren und Mikrozentrifugenteströhrchen, Multi-Well-Platten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktionswells, Mikrozentrifugenröhrchen, Mikrokanäle und dergleichen, die die Oberfläche umfassen, von denen jede beliebige Vorrichtung oder jedes beliebige Gefäß als Art der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein kann. Bevorzugt ist der Kanal ein Mikrokanal. Mikrokanäle der Erfindung einschließlich die Mikrokanäle, die in den Mikrofluidvorrichtungen der Erfindung angeordnet sind, weisen bevorzugt eine Breite von zwischen etwa 1 μm und etwa 3 mm auf.
In bestimmten Aspekten ist die Oberfläche der Vorrichtungen, Gefäße oder des Gerätes eine unbehandelte Oberfläche; bevorzugt ist sie bei Verwendung eines Siliciumträgers eine nicht silanisierte Oberfläche. Die Oberfläche kann hydrophob oder hydrophil sein. In weiteren Aspekten kann die Oberfläche vor der Behandlung mit einem Polymer gemäß der Erfindung vorbehandelt werden.
Die Erfindung betrifft auch Mikrofluidvorrichtungen, die Reaktionswells umfassen, sowie Fluidprozeßschritte, die in einem Reaktionswell durchgeführt werden. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung das Bewegen einer Fluidprobe durch oder das Durchführen eines Fluidprozeßschrittes in einem Kanal, der gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde, sowie das Durchführen einer biochemischen Reaktion in einem Reaktionswell, das gemäß den Verfahren der Erfindung behandelt wurde. Bevorzugt ist das Reaktionswell eine Mikrotiterplatte. Stärker bevorzugt ist die Mikrotiterplatte eine Polypropylenmikrotiterplatte. Mikrotiterplatten der Erfindung sind bevorzugt Mikrotiterplatten mit hoher Dichte, wie beispielsweise Mikrotiterplatten mit 96, 384, 1536 oder mehr Wells.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das oberflächenadsorbierende Polymer ein wasserlösliches Polymer oder ein nicht-polares flüssiges lösliches Polymer; in weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das oberflächenadsorbierende Polymer ein ungeladenes Polymer. Bevorzugt ist das Polymer ein Siliciumdioxid-adsorbierendes Polymer. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist das Polymer ein Molekulargewicht von mindestens 1 × 10³, 5 × 10³, 1 × 10⁴, 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶ oder 5 × 10⁶ Dalton auf. Am meisten bevorzugt weist das Polymer ein Molekulargewicht von mindestens 1 × 10⁶ Dalton auf. Das Polymer kann in wässriger oder nicht-wässriger Lösung vorliegen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das oberflächenadsorbierende Polymer eine größere Affinität zu der Oberfläche auf, als die Biomoleküle der Fluidprobe. Am meisten bevorzugt erreicht die Gesamtadsorptionsenergie pro einzelnem Polymermolekül mindestens ein oder mehrere k_BT-Einheiten.
Zusätzlich zu den Verfahren und dem Gerät der Erfindung umfasst die Erfindung auch Zusammensetzungen, die die oberflächenadsorbierenden Polymere der Erfindung umfassen. Umfasst sind zum Beispiel, wie im Folgenden hierin beschrieben, Zusammensetzungen, die ein oberflächenadsorbierendes Polymer gemäß der Erfindung und eine Fluidprobe von Interesse umfassen, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer keiner der Reaktionspartner ist. Diese Zusammensetzungen können zum Beispiel als ein Gemisch für ein Gerät der Erfindung hergestellt und anschließend bereitgestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verwendungen eines oberflächenadsorbierenden Polymers, insbesondere zum Durchführen eines Fluidprozeßschrittes in einem Mikrokanal oder einem Kunststoffgerät, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer keines der Reagenzien des Fluidprozeßschrittes darstellt, oder wobei das oberflächenadsorbierende Polymer keine aktivierende oder hemmende Wirkung auf die Reaktionspartner aufweist, oder wobei das oberflächenadsorbierende Polymer für das Stattfinden der Reaktion nicht notwendig ist. Das oberflächenadsorbierende Polymer kann als Zusatzmittel in einem Gemisch verwendet werden, das eine Probe umfasst, z.B. bezüglich derer ein Fluidprozeßschritt durchgeführt wird. Bevorzugt ist der Fluidprozeßschritt ein Prozeßschritt, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Mischungschritt, einer Reaktion, einer Inkubation, einer Verdünnung, einer Titration, einem Nachweis, einer Arzneimittel-Screeninguntersuchung, einer Bindungsuntersuchung und einer Messuntersuchung (z.B. Messung von Kinetik). Am meisten bevorzugt ist der Fluidprozeßschritt eine biochemische Reaktion; stärker bevorzugt umfasst die biochemische Reaktion zyklischen Temperaturwechsel.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Darstellung der Wechselwirkung der Polymerketten in zwei unterschiedlichen Systemen als Funktion der Polymerkonzentration, wobei eine Überlappung zwischen ihnen stattfindet.
2 zeigt ein oberflächenadsorbierendes Homopolymer, welches auf einem festen Träger in einer Tail-Loop-Train-Konformation adsorbiert ist.
3 zeigt die Konformation eines adsorbierten Homopolymers, das auf einer Kanaloberfläche adsorbiert ist.
4 zeigt die Polymerkonzentration (c) als eine Funktion des Abstandes des Polymers (x) von der Oberfläche, auf welcher es adsorbiert ist. Die adsorbierten Polymere bilden eine Schicht, die aus einem proximalen, einem zentralen und einem distalen Bereiche gebildet ist und unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber den Details der Polymer-Oberflächen-Wechselwirkungen aufweisen.
5 zeigt die Wirkung einer Copolymeranlagerung auf die Stärke des spezifischen Signals, das nach einem Genotypisierungsverfahren, welches wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wird, erhalten wird.
6 zeigt die Wirkung einer Copolymeranlagerung auf die Spezifität des Signals, welches nach einem Genotypisierungsverfahren, welches wie in Beispiel 1 durchgeführt wird, erhalten wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Fluidprozeßschritte, insbesondere biologische Reaktionen, erfordern oftmals aufeinanderfolgende Schritte mit kleinen Volumina in demselben Gerät, um die Effizienz zu maximieren und die Kosten zu minimieren. Zum Beispiel erfordert Genotypisieren durch Einzelbasenextension drei aufeinanderfolgende biologische Reaktionen [d.h. Polymerasekettenreaktion (PCR), enzymatische Reinigung und Mikrosequenzieren (MIS)]. Daher ist es effizient und wirtschaftlich, zwei oder mehr aufeinanderfolgende Reaktionen in demselben Gerät durchzuführen. In solchen Fällen sollte sichergestellt werden, dass zwischen den Reaktionen keine Kontamination aufgrund von Adsorption auftritt, und dass Biomoleküle aus vorhergehenden Reaktionen nicht aufgrund unerwünschter Adsorption nachfolgende Reaktionen kontaminieren. Dies kann sich jedoch aufgrund der hohen Adsorption verbleibender Biomoleküle auf den Oberflächen von Geräten schwierig gestalten.
Daher stellt die Erfindung Verfahren zum Vermindern der Adsorption von organischen Materialien auf verschiedenen Oberflächen unter Verwendung oberflächenadsorbierender Polymere bereit. Insbesondere bringen Verfahren zum Durchführen von Fluidprozeßschritten das Hinzufügen von oberflächenadsorbierenden Polymeren mit sich, die nicht-kovalent an eine Oberfläche binden und somit die unerwünschte Adsorption von organischen Molekülen auf der Oberfläche vermeiden. Die Erfindung stellt auch Geräte und Systeme (z.B. Kits) bereit, die oberflächenadsorbierende Polymere umfassen. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln der Oberfläche eines Mikrofluidkanals bereit, wobei die Mikrofluidoberfläche zur Inaktivierung beschichtet wird, und wobei diese Beschichtung leicht regeneriert werden kann. Die oberflächenadsorbierenden Polymere der Erfindung sind bei Temperaturen und Bedingungen, die für biochemische Reaktionen erforderlich sind, stabil, insbesondere bei Anwendungen, die zyklischen Temperaturwechsel oder Polymerisation von Polynukleotiden oder Polypeptiden mit sich bringen.
Das Oberflächeninaktivierungsverfahren der Erfindung stellt auch ein Mittel zum dynamischen Beschichten einer Oberfläche mit einem oberflächenadsorbierenden Polymer bereit. Bevorzugt ist die Oberfläche nicht vorbehandelt worden, um Adsorption von organischen Materialien auf der Oberfläche zu vermindern. Das dynamische Beschichtungsverfahren ermöglicht so oft wie erforderlich die Regenerierung einer Oberfläche, wobei die Lebensdauer eines Gerätes, welches die Oberfläche umfasst, erhöht wird, und wobei die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge einer beliebigen Oberfläche der Erfindung erhöht wird. Dieses Verfahren vermeidet auch das Erfordernis einer speziellen Vorbehandlung der Oberfläche.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung Träger auf eine strukturelle Oberfläche unter einem Überzug oder einer Beschichtung (z.B. Polymerbeschichtung). Ein Substrat kann Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymere, Polyamide, Polydimethylsiloxane, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen und Elastomere) sein. Bevorzugt umfasst ein Kunststoffträger Polystyrol. In der vorliegenden Erfindung können Mikrokanäle in einem Träger angeordnet sein oder Vorrichtungen können aus einem Träger hergestellt sein. Bevorzugt ist der Träger ein Kunststoff von geringerer Polarität als die Polarität einer wässrigen Fluidprobe.
Wie hierin verwendet, umfasst die Bezeichnung Gerät die Bezeichnungen Vorrichtung und Gefäß, welche in der gesamten Anmeldung austauschbar mit Gerät verwendet werden. Ein Gerät bezieht sich auf ein beliebiges Element, ein beliebiges Arbeitsgerät oder einen beliebigen Bestandteil, welcher (welches) für eine spezielle Verwendung oder einen speziellen Zweck entwickelt wurde. Die Verwendungen umfassen das Aufbewahren, Verteilen oder Umsetzen von Proben, bevorzugt von Fluidproben. Beispiele eines Gerätes umfassen Mikrokanäle, Mikrofluidgeräte, Kapillaren, Teströhrchen, Multi-Well-Platten, Pipetten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktionswells und Mikrozentrifugenröhrchen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung Mikrotiterplatte auf eine Multiwell-Platte, die zum Aufbewahren und/oder Umsetzen von Fluidproben oder zum Durchführen von Fluidprozeßschritten verwendet wird. Üblicherweise sind die Platten aus Trägern wie beispielsweise Silicium, Quarz, Glas, Keramik oder Kunststoff hergestellt, und enthalten 96, 384, 1536 oder mehr Wells. Dieselben Mikrotiterplatten können verwendet werden, um aufeinander folgende Fluidprozeßschritte durchzuführen. Bevorzugt sind die Fluidprozeßschritte biochemische Reaktionen, wie beispielsweise zyklischer Temperaturwechsel (z.B. PCR), Enzymreinigung, Primer-Extensionsreaktionen (z.B. MIS).
Wie hierin verwendet, umfasst die Bezeichnung Kanal die Bezeichnung Mikrokanal. Wie ebenso hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung ein Mikrofluidträger auf einen festen Träger, in welchem ein Mikrokanal angeordnet ist. Eine Mikrofluidvorrichtung umfasst einen Mikrofluidträger, welcher üblicherweise mehr als einen Mikrokanal umfasst, und welcher gegebenenfalls weitere Bestandteile oder Eigenschaften umfasst, die sich auf das Durchführen eines Fluidprozeßschrittes beziehen, wie beispielsweise Vorratsgefäße, Einlass-/Auslassöffnungen sowie ein Nachweisgerät, die Aufbewahrung von Reagenzien und Verteilungsmittel, Mittel zur Temperatureinstellung, etc.
Die Erfindung stellt auf Grundlage des neuen Inaktivierungsverfahrens auch Verfahren zum Durchführen von Fluidprozeßschritten bereit, insbesondere chemische und biochemische Reaktionen, und insbesondere Fluidprozeßschritte, die Handhabungen von Flüssigkeiten, die Biomoleküle enthalten, umfassen.
Ein Fluidprozeßschritt wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede beliebige Handhabung von Fluiden einschließlich der Bewegung von Fluiden oder des Durchführens einer Aufgabe in einer Fluidphase. Fluidprozeßschritte umfassen Reaktionen, Inkubationen, Trennungen, Verdünnungen, Titrationen, Mischen, Reinigungen, Nachweise, Arzneimittel-Screeninguntersuchungen, Bindungsuntersuchungen, Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik) sowie jeden beliebigen Prozeßschritt, der im Allgemeinen eine große Zahl aufeinanderfolgender Handhabungen umfasst sowie jede beliebige Handhabung, in welcher das Fluid einen Testanalyten, ein Reagenz oder ein Biomolekül umfasst, insbesondere wenn der Testanalyt oder das Reagenz ein Biomolekül ist, sind aber nicht auf diese eingeschränkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine chemische Reaktion oder biochemische Reaktion auf ein Verfahren, in welchem eine oder mehrere Substanzen chemisch oder biochemisch in eine oder mehrere verschiedene Substanzen umgewandelt werden (zum Beispiel: Reaktionspartner + Reaktionspartner – gegebenenfalls ein beliebiger (beliebige) Katalysator(en) -> Produkt(e). Eine biochemische Reaktion ist üblicherweise eine Reaktion, die entweder durch ein Biomolekül vermittelt wird oder ein Biomolekül umfasst.
Ein Reaktionsgemisch bezieht sich auf ein einzelnes Gemisch, das die Bestandteile enthält, die notwendig sind, damit eine chemische oder biochemische Reaktion stattfindet. Beispiele umfassen PCR-Gemisch und MIS-Gemisch, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Wie hierin verwendet, umfasst eine Fluidprobe oder Fluidprobe von Interesse jedes beliebige Molekül, für das ein Fluidprozeßschritt durchgeführt wird, der jedes beliebige Biomolekül oder chemische Molekül umfasst, ist jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Eine Fluidprobe oder eine Fluidprobe von Interesse umfasst einen Testanalyten oder ein Reagenz, ist jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Die Bezeichnung Testanalyt umfasst eine Substanz, die in einer analytischen Methode gemessen wird, welche Chemikalien sowie Biomoleküle umfassen kann. Ein Reagenz bezieht sich auf einen Reaktionspartner in einer chemischen oder biochemischen Reaktion.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Biomolekül auf ein organisches Molekül, das durch einen lebenden Organismus synthetisiert wird, sowie Derivate, Varianten und Fragmente davon. Bevorzugte Biomoleküle sind Makromoleküle. Weitere bevorzugte Biomoleküle umfassen Nukleinsäuren (z.B. DNA, RNA, Polynukleotide, Oligonukleotide, Nukleotide, dNTPs wie beispielsweise dATP, dTTP, dCTP, dGTP, und ddNTPs wie beispielsweise ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), Aminosäuren (z.B. Proteine, Polypeptide, Peptide, Aminosäuren wie beispielsweise Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin, Histidin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan, Prolin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Glycin, Cystein und Tyrosin) und Lipide, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Jede Gattung oder Art der Erfindung kann von den Ausführungsformen der Erfindung ein- oder ausgeschlossen sein.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein wasserlösliches ungeladenes oberflächenadsorbierendes Polymer für Oberflächenmodifizierungen von Teströhrchen, Multiwell-Platten, Pipetten, Pipettenspitzen, Mikrotiterplatten, Reaktions-Wells, Mikrokanälen, Mikrofluidgeräten, Kapillaren und Mikrozentrifugenröhrchen etc., inbesondere zur Verwendung in Mikrofluidvorrichtungen und Kunststoffvorrichtungen wie beispielsweise Mikrotiterplatten bereitgestellt. Bevorzugt verändert sich die Löslichkeit des Polymers im Gegensatz zu BSA nicht erheblich innerhalb des Temperaturbereichs, der für biologische Reaktionen relevant ist (d.h. 37–94°C). Die Oberflächenmodifizierung von Kanälen in Mikrofluidvorrichtungen machen solche Mikrovorrichtungen für chemische oder biochemische Reaktionen geeignet. Das Molekulargewicht der oberflächenadsorbierenden Polymere kann für die Stabilität der adsorbierten Polymerschicht von Bedeutung sein. Während Polymere mit jedem beliebigen Molekulargewicht ausgewählt sein können, sind Polymere mit einem Molekulargewicht von größer als 1 × 10⁶ Dalton bevorzugt, wodurch die Stabilität der adsorbierten Polymerschicht bei hohen Temperaturen verbessert wird. Polymere mit einem Molekulargewicht von etwa 1 × 10⁶ Dalton und mehr sind für biologische Anwendungen, insbesondere Reaktionen, die zyklischem Temperaturwechsel mit sich bringen, besonders geeignet. Polymere sind hierin im Folgenden beschrieben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung Polymer auf ein Molekül, das aus kleineren monomeren Untereinheiten zusammengesetzt ist, die kovalent miteinander verbunden sind. Die Bezeichnung Polymer umfasst die Bezeichnung Homopolymer, welche sich auf ein Polymer bezieht, das nur aus einer Monomerart hergestellt ist, sowie die Bezeichnung Copolymer, welche sich auf ein Polymer bezieht, das aus zwei oder mehr Monomerarten gebildet ist.
Das Polymer kann als eine Polymerlösung in eine Oberfläche eingebracht werden, bevorzugt als ein Zusatzmittel in einer Fluidprobe, z.B. Reaktionsgemisch. Das Polymer kann allein oder in Kombination mit zum Beispiel einem Biomolekül, einer Chemikalie oder einer Zelle in ein Lösungsmittel eingebracht werden. Die geeignete Konzentration eines Polymers für Oberflächenmodifizierungen liegt bevorzugt im Bereich zwischen etwa 0,001% bis etwa 5% (Gewicht/Volumen). Eine bevorzugte Konzentration ist etwa 0,1% (Gewicht/Volumen). Wie im Folgenden hierin in dem Abschnitt mit dem Titel "Polymere und Lösungen" beschrieben, erkennt man, dass die Polymerkonzentration, Polymerlänge und Viskosität der Lösung, die das Polymer enthält, an geeignete unterschiedliche Kanäle und Fluidprozeßschritte angepasst werden kann.
Die Polymere der Erfindung weisen verschiedene Vorteile gegenüber bisher verwendeten Oberflächeninaktivierungsverfahren auf, z.B. sind sie in einem Temperaturbereich, der für biologische Reaktionen relevant ist, wasserlöslich, während BSA denaturiert und bei hohen Temperaturen (> ~60°C) weniger polar (hydrophober) wird; sie sind ungeladen; und sie sind chemisch einfachere Moleküle als BSA, wodurch die Wahrscheinlichkeit für eine unspezifische Wechselwirkung der modifizierten Oberfläche mit Reagenzien vermindert wird.
Geräte, Vorrichtungen und Gefäße, insbesondere die Träger, aus denen sie hergestellt sind, können jede beliebige Form annehmen, von welchen Beispiele hierin im Folgenden beschrieben sind. Zum Beispiel können Kunststoffe verwendet werden, um röhrenartige Kanäle, wie beispielsweise in freistehenden Kapillaren herzustellen. Röhrenartige Kanäle oder Kanäle, die im Allgemeinen in einer dünnen Trägerschicht angeordnet sind, werden zum Beispiel in Vorrichtungen zum Aufbewahren von Flüssigkeiten oder zum Verteilen zur Verwendung mit Mikrofluidsystemen verwendet, wie beispielsweise Kapillarpipettierhilfen, Kapillaren, die zum Übertragen von Fluidproben zu einem Mikrokanal oder einer Mikrofluidvorrichtung verwendet werden, oder getrennte Aufbewahrungsvorrichtungen, die Aufbewahrungskanäle und/oder Fluidvorratsgefäße umfassen, einschließlich Vorrichtungen zum Einbringen von Fluidproben in einen Mikrokanal, wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 00/21666 beschrieben. Während die Mikrokanäle verwendet werden können, um eine breite Vielfalt an Fluidprozeßschritten auszuführen, erkennt man, dass die Polymere und Verfahren, die sich auf die Inaktivierung von Kanaloberflächen beziehen, besonders vorteilhaft für Fluidprozeßschritte sind, einschließlich zyklischem Temperaturwechsel, wie beispielsweise PCR und Einzelnukleotid-Primerextension sowie beispielsweise allgemeine Handhabung von Proteinen, insbesondere wenn die Proteine einer oder mehreren unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt sind. In bevorzugten Aspekten umfassen Mikrofluidvorrichtungen daher ein Mittel zur Temperatureinstellung, insbesondere ein Mittel für zyklischen Temperaturwechsel der Anteile eines Kanals. Bevorzugt weisen die Mikrofluidvorrichtungen ein Mittel zum Bewegen von Fluiden auf, das die Erzeugung eines Druckgradienten über einen oder mehrere Kanäle umfasst. Mikrofluidvorrichtungen, einschließlich damit zusammenhängende Mittel zur Temperatureinstellung, Mittel zum Bewegen von Fluiden sowie Fluidprozeßschritte, werden hierin im Folgenden beschrieben.
Es werden verschiedene unterschiedliche Verfahren zum Adsorbieren eines Polymers auf einer Oberfläche bereitgestellt. Eine weitere Beschreibung, die die Prinzipien der Polymeradsorption betrifft, wird hierin dargestellt. In einem Beispiel wird die Polymerlösung zu der Fluiodprobe vor dem Hinzufügen der Fluidprobe zu einer Vorrichtung der Erfindung hinzugefügt. In einem anderen Beispiel wird eine Polymerlösung entweder in An- oder Abwesenheit einer Fluidprobe, wie beispielsweise einer solchen, die einen Testanalyten oder ein Reagenz umfasst, durch einen Kanal bewegt, so dass das Polymer auf der Kanaloberfläche adsorbiert. Bevorzugt wird die Bewegung der Polymerlösung durch Erzeugen eines Druckgradienten bewirkt, der beispielsweise durch eine Spritze, eine Schlauchpumpe und/oder ein Druckgas bereitgestellt werden kann. Sobald der Kanal mit dem Polymer beschichtet ist, kann jede beliebige Anzahl an Fluidproben nacheinander durch den Kanal durchgeführt werden. Mittel zur Injektion der Polymerlösung, der Fluide, welche Fluidprozeßschritten unterzogen werden, sowie Mittel zum Bewegen von Fluiden werden im Folgenden hierin beschrieben. Die Mikrofluidvorrichtungen, die gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, werden ebenso hierin im Folgenden beschrieben. Man erkennt, dass eine breite Vielfalt an Kanalträgern, Kanalgeometrien und Bestandteile zum Aufbewahren, Handhaben, Injizieren und/oder Nachweisen von Fluidproben gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet werden können.
Jede beliebige Oberfläche, die mit einem Polymer gemäß der Erfindung behandelt worden ist, kann mit einer frischen oberflächenadsorbierenden Polymerlösung regeneriert werden. Das oben beschriebene Beschichtungsverfahren kann jederzeit durch Bewegen einer Polymerlösung durch den Kanal wiederholt werden. Die Polymerlösung kann gleichzeitig mit (d.h. in Gegenwart von) einer Fluidprobe von Interesse durch den Kanal bewegt werden, oder sie kann vor dem Bearbeiten weiterer Proben durch den Kanal bewegt werden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Erfindung ein dynamisches Beschichtungsverfahren. Das dynamische Beschichtungsverfahren umfasst das Regenerieren der Kanaloberfläche in regelmäßigen Abständen, um eine einheitliche Oberflächenqualität beizubehalten, wenn ein Kanal wiederholt verwendet wird. Dies ist insbesondere für Mikrofluidanwendungen nützlich, wo viele Proben nacheinander in einem Kanal bearbeitet werden.
Wie hierin verwendet, bildet eine einzelne Fluidprobe, die in einen Kanal injiziert wird, einen sogenannten Fluidprobenbereich. Verschiedene Fluidprobenbereiche können zum Beispiel nacheinander injiziert werden. In bestimmten Ausführungsformen ist es bevorzugt, die Fluidprobenbereiche durch Bereitstellen eines Fluidtrennbereiches zwischen den Fluidprobenbereichen zu trennen, um zu verhindern, dass sich die Inhalte der Bereiche vermischen.
In einem ersten Beispiel der Verfahren der Erfindung werden eine, zwei oder mehr Fluidprobenbereiche nacheinander in einem Kanal bereitgestellt. In einer solchen Ausführungsform wird das oberflächenadsorbierende Polymer in dem Fluidprobenbereich bereitgestellt. Das oberflächenadsorbierende Polymer kann in jedem Fluidprobenbereich oder nur in bestimmten Fluidprobenbereichen oder in geeigneten Abständen bereitgestellt werden.
In weiteren Ausführungsformen ist das oberflächenadsorbierende Polymer in einem, oder in zwei oder mehr Fluidprobenbereichen, jedoch nicht in einem (in) Fluidtrennbereich(en) bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform ist das oberflächenadsorbierende Polymer in einen oder in zwei oder mehr Fluidtrennbereichen, aber nicht in einem (in) Fluidprobenbereich(en) bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer in mindestens einem Fluidtrennbereich bereitgestellt, es liegt jedoch im Wesentlichen von mindestens einem Fluidprobenbereich entfernt. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Polymer in mindestens einem Fluidtrennbereich und mindestens einem Fluidprobenbereich bereitgestellt.
Das oberflächenadsorbierende Polymer kann in einer Fluidprobe beinhaltet sein und in einen Kanal als ein Gemisch eingespeist werden. Alternativ kann eine Lösung eines oberflächenadsorbierenden Polymers und eine Fluidprobe durch getrennte Einlassöffnungen eingespeist werden, oder gleichzeitig durch eine gemeinsame Öffnung in einen gemeinsamen Kanal eingespeist werden. Die Fluidprobe kann zum Beispiel einen Testanalyten, ein Reagenz, ein Reaktionsgemisch oder ein Biomolekül umfassen. Das oberflächenadsorbierende Polymer kann daher als ein Zusatzmittel in einem Reaktionsgemisch verwendet werden. Nach der Injektion kann die Lösung anschließend, bevorzugt in einem kontinuierlichen Fließmodus, durch den Kanal bewegt werden, so dass die Lösung des oberflächenadsorbierenden Polymers die Kanaloberfläche regeneriert.
Die Konzentration des oberflächenadsorbierenden Polymers kann gemäß einem speziellen Fluidprozeßschritt oder bevorzugt einer speziellen biochemischen Reaktion optimiert werden. Im Allgemeinen sollte die Polymerkonzentration minimiert werden, so dass die Viskosität des Fluidmediums in dem Kanal nicht erheblich ansteigt, und dass die Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers nicht im Überschuss vorliegt. Um die optimale Polymerkonzentration auszuwählen, können biochemische Reaktionen in einer Mikrofluidvorrichtung mit unterschiedlichen Polymerkonzentrationen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine optimale Polymerkonzentration unter Verwendung eines wie in Beispiel 2 gezeigten Protokolls leicht durch Bestimmen von Polymerkonzentrationen ausgewählt werden, welche eine annehmbare Produktqualität oder -ausbeute bereitstellen.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Ausführen verschiedener Handhabungen von Fluiden in einem Kanal bereit, der mit einem oberflächenadsorbierenden Polymer der Erfindung beschichtet ist. In den dynamischen Beschichtungsverfahren, bringt das Durchführen von Fluidprozeßschritten, insbesondere von biochemischen Reaktionen, das Bereitstellen eines Fluids, das einen Testanalyten oder ein Reagenz, bevorzugt ein Biomolekül, ein Reaktionsgemisch oder ein Protein umfasst, für einen Kanal in Gegenwart eines oberflächenadsorbierenden Polymers mit sich. Wenn aufeinanderfolgende Fluidprozeßschritte in dem selben Kanal durchgeführt werden, muss das oberflächenadsorbierende Polymer nicht zu jedem Fluidprozeßschritt oder jeder Fluideinheit hinzugefügt werden, kann jedoch zum Beispiel nur zu jedem zweiten, dritten, vierten, fünften, zehnten, zwanzigsten Fluidprozeßschritt hinzugefügt werden.
Es kann daher eine breite Vielfalt an Fluidprozeßschritten ausgeführt werden. Verfahren zum Ausführen von Fluidprozeßschritten umfassen das Ausführen von Reaktionen, Inkubationen, Trennungen, Verdünnungen, Titrationen, Reinigungen, Nachweise, Arzneimittel-Screeninguntersuchungen, Mischen, Bindungsuntersuchungen, Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik) sowie jedes beliebige Verfahren, das im Allgemeinen eine große Zahl an aufeinanderfolgenden Handhabungen mit sich bringt, sowie jede beliebige Handhabung von Fluiden, bei der die Fluidprobe einen Testanalyten oder ein Reagenz umfasst, insbesondere wenn der Testanalyt oder das Reagenz ein Biomolekül ist, und stärker bevorzugt, wenn der Testanalyt oder das Reagenz eine Nukleinsäure oder eine Aminosäure ist.
1. Polymere & Lösungen
Die Erfindung stellt ein wasserunlösliches ungeladenes oberflächenadsorbierendes Polymer für Oberflächenmodifizierungen von Kanälen, wie beispielsweise freistehende Kapillarkanäle, sowie ein solches Polymer für Oberflächenmodifizierungen in Mikrofluidvorrichtungen bereit. Bevorzugt weist das Polymer eine Löslichkeit auf, die sich innerhalb eines Temperaturbereiches, der für biologische Reaktionen relevant ist, nicht erheblich ändert (z.B. zwischen etwa 20–100°C oder stärker bevorzugt zwischen etwa 37–94°C). Bevorzugt ist ein Siliciumdioxid-absorbierendes Polymer vorgegeben.
Die Synthese von Polymeren kann gemäß den im Fachbereich bekannten Verfahren ausgeführt werden. Beispiele geeigneter Polymersyntheseverfahren sind in Odian, Principles of Polymerization, Dritte Ausgabe (John Wiley, NY, 1991) beschrieben.
Block-Co-Polymere von PPG und PEG (PPG-PEG-PPG- und PEG-PPG-PEG-Block-Co-Polymere) oder EO und PO sind kommerziell erhältlich. SYNPERONIC, PLURONIC^® und PLURONIC^®R Block-Co-Polymere (EO-PO-EO und PO-EO-PO) sind zum Beispiel von BASF, Ludwigshafen Deutschland erhältlich.
Wie hierin erörtert, werden mehrere Verfahren zum Adsorbieren eines Polymers auf einer Oberfläche bereitgestellt. In einem Beispiel wird eine Polymerlösung entweder in An- oder Abwesenheit einer Fluidprobe durch einen Kanal bewegt, so dass das Polymer an der Kanaloberfläche adsorbiert. Die Polymerkonzentration wird üblicherweise minimiert, so dass die Viskosität des Fluidmediums in dem Kanal nicht erheblich ansteigt, und so dass die verwendete Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers nicht im Überschuss vorliegt. Für den Fall, dass die Polymerlösung einen Testanalyten oder ein Reagenz umfasst, erkennt man, dass der Einfluss der Viskosität der Polymerlösungen auf die Kinetik jeder beliebigen möglichen biologischen Reaktion zu berücksichtigen ist. Bevorzugt ist die Viskosität der Polymerlösung so ausgewählt, dass sie die biologische Reaktion nicht beeinflusst.
Polymereigenschaften
Ein Polymermolekül (wie beispielsweise PDMA, DNA, etc.) verhält sich wie ein statistisches Knäuel, wobei sein Trägheitsradius R_g proportional der Quadratwurzel der Länge des Umrisses L der Kette ist (oder der Zahl an Monomerem N): L = N·1 und R_g ~ L^1/2·1^1/2 oder R ~ N^1/2·1, wobei l die Länge eines Monomers ist. Folglich erscheint ein Polymermolekül in seiner Größe weitaus kleiner als wenn es vollständig gestreckt wäre.
Eine Polymerlösung kann im Allgemeinen bei einer vorgegebenen Temperatur und in einem vorgegebenen Lösungsmittel durch die Polymergewichtskonzentration C, seine durchschnittliche Molekülmasse M_w und durch die Viskosität der Polymerlösung η gekennzeichnet werden.
In Bezug auf die Konzentration der Polymerlösung kann man drei verschiedene Systeme erkennen: (a) verdünnt; (b) halb-verdünnt; und (c) konzentriert. In dem verdünnten System sind die Polymerketten in guten Lösungsmitteln, in denen Polymer/Lösungsmittel-Wechselwirkungen bevorzugt sind, voneinander isoliert. Wenn die Konzentration einer Polymerlösung über eine kritische Konzentration (C*) erhöht wird, werden die Polymerketten verwickelt. Die verdünnten (C < C*) und halb-verdünnten (C > C*) Systeme mit der Überlappung zwischen ihnen (C ~ C*) sind in 1 gezeigt. Die Grenze (kritische Konzentration) ist eindeutig nicht scharf, aber sie ist als ein Überschneidungsbereich zwischen den zwei Systemen festgelegt. Aus Skalierungsgesichtspunkten wird erwartet, dass C* mit der lokalen Konzentration innerhalb eines einzelnen Polymerknäuels vergleichbar ist.
In einem guten Lösungsmittel bedeutet dies: C* ~ NlRg 3 = a–3N1-3γ = a–3·N–4/5 (1)wobei N die Anzahl an Monomeren in einem Polymerknäuel ist, R_g ³ das Volumen eines Polymerknäuels ist und a die Grundlänge eines Polymers ist. Die Grundlänge eines Polymermoleküls definiert seine Biegsamkeit. Die physikalische Bedeutung der Grundlänge besteht darin, dass ein Erinnerungsvermögen einer Kettenrichtung nur bezüglich Skalenlängen beibehalten wird, die kürzer als l sind (das Erinnerungsvermögen einer Kettenrichtung geht bei Längenskalen, die größer als l sind, verloren). Praktischer ausgedrückt, ist die überlappende Grenzkonzentration auf die Grenzviskosität einer Polymerlösung, wie folgt bezogen: C* = 1,5/[η] (2)
Die Grenzviskosität einer Polymerlösung wird durch Extrapolieren einer verminderten Viskosität η_red = (η – η_s)η_s auf eine Polymerkonzentration von Null erhalten (Sun S. F., Physical Chemistry of Macromolecules, Wiley-Interscience, John Wiley and sons, Inc., New York, 1994). Die Grenzviskosität einer Polymerlösung ist durch die Mark-Houwink-Beziehung auch auf das Molekulargewicht des Polymers bezogen: [η] = KM_w ^a, wobei K und a die Mark-Houwink-Koeffizienten darstellen.
Für C < C* kann die Polymerlösung als ein verdünntes System von Polymerknäulen angesehen werden. Die Polymerknäuel verhalten sich wie harte Kugeln. Dies hat seine Ursache in der Tatsache, dass, wenn zwei Knäule gezwungen sind, in einem guten Lösungsmittel zu überlappen, jeder Polymer/Polymerkontakt eine Energie der Ordnung k_BT mit sich bringt (wobei k_B die Boltzmann-Konstante ist und T die Temperatur ist). Da viele Kontakte zwischen überlappenden Polymerknäulen auftreten müssen, beträgt die Gesamtüberlappungsenergie mehrere k_BT, wobei die Boltzmann-Exponentialzahl sehr klein wird und folglich die Polymerknäuel nicht miteinander überlappen.
In dem halb-verdünnten System (C > C*) überlappen die Polymerknäuel miteinander und die Polymerlösungen verhalten sich wie ein dynamisches Netzwerk. Alle thermodynamischen Eigenschaften (z.B. lokale Energien, Entropien, etc.) solcher Lösungen werden nur durch die Konzentration C der Lösung kontrolliert und nicht durch die Länge einer Polymerkette N. Die bedeutende Längenskala solcher dynamischer Netzwerke ist der durchschnittliche Abstand zwischen verschiedenen Polymerketten (eine durchschnittliche Maschengröße). Die dynamische Maschengröße S einer Polymerlösung kann für C ~ C* unter Skalierungsgesichtspunkten abgeleitet werden und ist umgekehrt proportional der Konzentration C^α der Polymerlösung (nur wenn C > C*): S ~ Rg(C*/C)3/4 (3)
Die Diffusionskoeffizienten der Moleküle stehen über die Einstein-Stokes-Beziehung mit ihrer Größe, der Viskosität eines Mediums, in welchem sie diffundieren, und der Temperatur in Zusammenhang: D = kBT/6πηR (4)wobei D ein Molekulardiffusionskoeffizient ist, η die Viskosität einer Polymerlösung ist und R der Molekülradius ist. Es ist offensichtlich, dass Diffusionskoeffizienten von biologischen Molekülen mit einer Zunahme der Viskosität der Lösung abnehmen. Die Viskosität der Polymerlösungen η hängt in dem verdünnten System (C < C*) linear von der Polymerkonzentration (η ~ C) ab, diese Abhängigkeit wird jedoch in halb-verdünnten Systemen (C > C*) nicht linear (d.h. η ~ C^α, wobei α > 1). Daher kann die Diffusion biologischer Reagenzien in halb-verdünnten Systemen (C > C*) durch eine kleine Änderung der Polymerkonzentration erheblich beeinflusst werden. D = kBT/6πCαR (5)
Polymeradsorption
Bevorzugt liegt die Stammkonzentration einer Polymerlösung, die zur Oberflächenmodifizierung verwendet wird und die ein Gemisch von Reagenzien umfasst, unterhalb der Überlappungsgrenzkonzentration C*. Die Überlappungsgrenzkonzentration nimmt mit zunehmender Polymergröße ab, wodurch nahegelegt wird, dass niedrig konzentrierte Polymerlösungen (C_bulk < 1%) eingesetzt werden sollten, wenn große Polymere (M_w > 10⁶) für Oberflächenmodifizierungen verwendet werden.
Die Polymeradsorption auf Oberflächen findet statt, wenn die Wechselwirkung zwischen dem Polymer und der Oberfläche günstiger ist als die des Lösungsmittels mit der Oberfläche. Daher können sogar Polymere, die in einem Lösungsmittel hochlöslich sind (z.B. in Wasser) auf einem festen Träger adsorbieren, wenn der feste Träger "bevorzugt" mit dem Polymer anstelle der Lösungsmittelmoleküle wechselwirkt. Eine einfache Art, vorherzusagen, ob ein Polymer, welches in einem vorgegebenen Lösungsmittel gelöst ist, auf eine Oberfläche adsorbiert, besteht darin, die Oberflächenspannung eines reinen Lösungsmittels γ_s (z.B. Wasser) und eines reinen Polymers γ_p zu messen. Wenn γ_s > γ_p ist, wird erwartet, dass das Polymer auf einer Oberfläche adsorbiert, wenn es in dem bestimmten Lösungsmittel gelöst wird. Es gibt zwei Hauptfaktoren, die die Polymeradsorption auf einer Oberfläche bestimmen. Ein erster Faktor ist eine Wechselwirkung zwischen festem Träger/Monomer (kleinster Teil eines Polymers) (eine Energie, die die Adsorption des Polymers begünstigt). Ein zweiter Faktor ist der Rückgang der Konformationszustände des Polymers am Träger (Abnahme der Entropie der Kette). Dies findet aufgrund der Undurchdringlichkeit des Trägers für Monomere statt und es ist die Energie, die versucht, das Polymer von einer Oberfläche entfernt zu halten. Darüber hinaus begünstigen abstoßende Monomer/Monomer-Wechselwirkungen in einem guten Lösungsmittel, dass das Polymer von einer Oberfläche weggedrängt wird (d.h. nicht zu berücksichtigende Volumenwechselwirkungen neigen dazu, die Dicke von adsorbierten Polymerschichten in guten Lösungsmitteln zu erhöhen). Die Stärke der Adsorption eines Polymers wird daher durch das Verhältnis von anziehenden und abstoßenden Kräften bestimmt.
Die adsorbierten Polymerschichten sind stabil, wenn sie aus langen Polymeren aufgebaut sind. Zum Beispiel sind Polymer/Oberflächen-Wechselwirkungen in adsorbierten Polymerschichten relativ schwach (ein Teil einer k_BT-Einheit). Aufgrund der großen Anzahl an Segmenten, die mit einer Oberfläche wechselwirken, welche mehr als 10% der Gesamtzahl an Segmenten/Monomeren in einem Polymer sein kann, kann die Gesamtadsorptionsenergie pro einem einzelnem Polymermolekül jedoch sehr groß sein, wobei sie mehrere k_BT-Einheiten erreicht und daher die Polymeradsorption eigentlich irreversibel macht, insbesondere wenn lange Polymere eingesetzt werden. Darüber hinaus weisen lange Polymere, die auf Oberflächen adsorbiert sind, einen höheren Freiheitsgrad auf als kurze Polymere, was zu stabileren Oberflächenbeschichtungen führt. Nichtsdestoweniger ist in Untersuchungen gezeigt worden (Thies, C., J. Phys. Chem. 70 (1976) 3783, und Cohen-Stuart, J. et al., J. Polymer Sci. (Phys.), 18 (1980) 559), dass Polymere, die auf Oberflächen adsorbiert sind, mit Polymeren in Stammlösung ausgetauscht werden können. Die erste Beobachtung zeigte, dass kurze Polymere, die auf einer Oberfläche adsorbiert sind, durch große Polymere ersetzt werden können, wenn diese in der Stammlösung vorhanden sind, und die Beobachtung legt auch nahe, dass adsorbierte Polymerschichten, die aus großen Polymeren hergestellt sind, stabiler sind als diejenigen, die aus kurzen Polymeren gebildet wurden. Folglich zeigte Phefferkorn, E., et al. (J. Polymer Sci. (Phys.), 23 (1985) 1997), dass der Austausch zwischen Polymerketten, die auf einer Oberfläche adsorbiert sind, und identischen Ketten in der Stammlösung durch eine Kinetik zweiter Ordnung gesteuert wird: (adsorbiertes Polymer)* + (freies Polymer) → (freies Polymer)* + (adsorbiertes Polymer) (6),wodurch nahegelegt wird, dass die Desorptionsrate zu der Konzentration der Polymerketten auf der Oberfläche C* und zur Stammlösung C proportional ist (–dC*/dt = kC*C, wobei k eine Konstante ist).
Eine wesentliche Eigenschaft einer adsorbierten Polymerschicht ist die stark abstoßende Wechselwirkung zwischen benachbarten Polymermolekülen. Dies bedeutet, dass die Anziehungsenergie zwischen einer Oberfläche (mit Polymeren) und des adsorbierenden Polymers abnimmt, wenn die Anzahl an Polymeren auf der Oberfläche ansteigt. Anders ausgedrückt wird die "Qualität" der Oberfläche durch die adsorbierenden Polymere geändert, so dass die Oberflächenqualität für das erste Polymer, das auf einer Oberfläche adsorbiert und für das n-te Polymermolekül nicht die gleiche ist. Daher besteht eine begrenzte (Gleichgewichts-) Deckfähigkeit (Konzentration, C_e) durch Polymerketten für eine Oberfläche. Wenn mehr Polymere auf einer Oberfläche adsorbieren, als durch die Gleichgewichtsdeckfähigkeit vorgegeben ist, wird die freie Energie dieser Moleküle höher als die freie Energie der Polymere in der Stammlösung und sie desorbieren schnell. Anders ausgedrückt, liegt eine wiederherstellende Kraft vor, die die Gleichgewichtsdeckfähigkeit konstant hält. Die Bedingung für nahezu konstante Gleichgewichtsdeckfähigkeit wird Sättigungsbedingung genannt. Die Sättigungsbedingung legt fest, dass Polymermoleküle aus einer adsorbierten Schicht nur austreten können, wenn Polymere aus einer Stammlösung sie sofort ersetzen, um C_e konstant zu halten.
Das einzelne Polymer, das auf einen festen Träger adsorbiert ist, ist im Hinblick auf Tail-Loop-Train-Konformation, wie in 2 dargestellt, beschrieben. Die Polymersegmente, die zu den Trains gehören, haften an einer Oberfläche, während die Segmente der Tails und Loops in Lösung vorliegen. Die Konformation eines adsorbierten Polymers liegt bei einer Länge in der Ordnung der Dicke (D) der adsorbierten Schicht ungestört vor. In weitaus größeren Längenskalen ist das Polymer in nicht in Wechselbeziehungen stehende Polymertropfen zerbrochen, wie in 3 gezeigt.
Die adsorbierten Polymere bilden eine Schicht, die aus drei Bereichen besteht: proximal (sehr empfindlich gegenüber den Details der Polymer-Feststoff-Wechselwirkungen), zentral (diese Schicht ist modellunabhängig, d.h. die Abhängigkeit Konzentration vs. Abstand (normal gegenüber der Oberfläche) wird durch ein Potenzgesetz gesteuert) und distal (durch wenige große Loops und Tails kontrolliert) wie in 4 gezeigt. Die Polymerschicht (4), die auf einer Oberfläche gebildet ist, verhindert durch eine sterische (entropische) Abstoßung Wechselwirkungen und folglich Adsorption biologischer Moleküle mit/an einer Oberfläche.
Der Leser wird erkennen, dass das durchschnittliche Molekulargewicht des Polymers in Abhängigkeit von den Anwendungen, die für den Mikrokanal vorgesehen sind, variiert. In bestimmten Ausführungsformen weisen Polymerlösungen ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens 1 × 10³, 5 × 10³, 1 × 10⁴, 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶ oder 5 × 10⁶ Dalton auf. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Molekulargewicht der oberflächenadsorbierenden Polymere höher als 1 × 10⁶ Dalton, so dass die Stabilität des adsorbierten Polymers aufgrund der Zunahme der Entropie der Kette (Zufälligkeit) auf der Oberfläche im Vergleich zu kurzen Polymermolekülen (< 1 × 10⁶ Dalton) verbessert wird. Die erhöhte Stabilität der adsorbierten Polymerschichten, die aus langen Polymeren aufgebaut sind, ist für Protokolle mit sich ändernder/zyklisch wechselnder Temperatur von Bedeutung (z.B. PCR- und MIS-Reaktionen). Im Allgemeinen können Polymere von einer Oberfläche desorbieren, wenn die Temperatur aufgrund einer erhöhten Wärme (zufälligen)-Energie des Systems erhöht ist.
Wie hierin im Folgenden beschrieben, kann das oberflächenadsorbierende Molekül, bevorzugt ein hierin aufgelistetes Polymer, zusammen mit einer Probe, einem Testanalyten oder bevorzugt mit einem Biomolekül und bevorzugt als Zusatzmittel zu einem Reaktionsgemisch bereitgestellt werden. In weiteren Ausführungsformen wird das oberflächenadsorbierende Molekül in einer Lösung im Wesentlichen in Abwesenheit einer bestimmten Probe, eines Testanalyten, eines Biomoleküls oder eines Reaktionsgemisches bereitgestellt, bevorzugt um eine Oberfläche zwischen Testanalyten in dem selben Mikrokanal zu regenerieren. Eine Polymerlösung umfasst im Allgemeinen auch einen geeigneten Puffer, aber dieser ist keine Notwendigkeit.
Bevorzugt liegt die Konzentration dieses Polymers in Lösung für Oberflächenmodifizierungen im Bereich von zwischen etwa 0,001% bis etwa 5% (Gewicht/Volumen).
Die oberflächenadsorbierende Qualität eines Polymers kann gemäß bekannten Mitteln bestimmt werden. Die Gesamtoberflächenabdeckung durch ein Polymer (Anzahl an Monomeren/cm² der Oberfläche) und die Dicke der adsorbierten Polymerschicht kann leicht durch hydrodynamische Messungen (de Gennes, P. G., Advances in Colloid and Interface Sci. 27: 189–209 (1987)) oder durch Elipsometrie (Azzam, R., Bashara, N., Ellipsometry and Polarized Light, North Holland, 1977; Charmet, J. C., de Gennes, P. G., J. Opt. Soc. Am. 73: 1777 (1983) untersucht werden.
In hydrodynamischen Untersuchungen stößt ein kolloidales Teilchen mit dem Radius R, das sich in der Polymerschicht- mit einer Geschwindigkeit V bewegt, auf eine Reibungskraft (6πη(R + e_H)V), wobei e_H die hydrodynamische Dicke der adsorbierten Polymerschicht ist. In ellipsometrischen Untersuchungen hängt die verbleibende Remission des auf gleicher Ebene im Brewster-Winkel polarisierten Lichtes von der Gesamtoberflächenbedeckung ab (d.h. der Remissionskoeffizient verschwindet, wenn kein Polymer auf einer Oberfläche adsorbiert wird). Mittels Ellipsometrie ist es möglich, die Dicke des Films im Bereich von 1–1000 Angström zu bestimmen. Aufwendigere Methoden zum Untersuchen von Polymerschichten auf Oberflächen verwenden z.B. verschwindende Wellen (Allain, C., et al., Phys. Rev. Lett., 49: 1694 (1982)) oder Neutronenstreuung (Barnett, K. et al., The effects of Polymers on Dispersion Stability, Tadros, J., Ausg., Academic Press, 1982). Darüber hinaus können die viskösen und elastischen Eigenschaften von Polymerschichten, die auf Oberflächen adsorbiert sind, durch ein Oberflächen-Kraft-Gerät (Surface Force Apparatus) (SFA) untersucht werden [Israelachvili, J. N. et al., Faraday Trans. I, 74: 975 (1978); Klein, J. et al., Nature 300: 429 (1982); Klein, J., et al., Nature 308: 836 (1984); und Dhinijwala, A., et al., Macromolecules 30: 1079–1085 (1997)].
2. Polymeradsorption in dynamischem Modus
In einer Ausführungsform wird ein Kanal vor dem Inkontaktbringen des Kanals mit einem Testanalyten oder einem Reagenz mit einer Polymerlösung in Kontakt gebracht. Zum Beispiel wird eine Polymerlösung so durch einen Kanal bewegt, dass das Polymer auf der Kanaloberfläche adsorbiert. Bevorzugt wird die Lösung durch Erzeugen eines Druckgradienten über den Kanal bewegt, wie es beispielsweise durch die Verwendung von Druck oder Vakuum auf Grundlage einer Injektionsspritze oder anderer geeigneter Fluidabgabemittel erzeugt werden kann. Alternativ kann ein Kanal, insbesondere ein Kanal wie beispielsweise in freistehenden Kapillaren, direkt in eine Polymerlösung eingebracht werden; die Polymerlösung wird anschließend durch Kapillarkräfte in den Kanal aufgesaugt oder kann durch einen Druckgradienten in den Kanal gesogen werden.
Sobald der Kanal mit dem Polymer beschichtet ist, kann eine Lösung, die eine Fluidprobe von Interesse umfasst, in den Kanal eingeführt werden, zum Beispiel als Teil jedes beliebigen gewünschten Fluidprozeßschrittes.
Jede beliebige geeignete Oberfläche, auf welcher eine Polymerbeschichtung adsorbiert worden ist, kann mit einer erfindungsgemäßen frischen oberflächenadsorbierenden Polymerbeschichtung regeneriert oder aufrechterhalten werden. Das oben beschriebene Beschichtungsverfahren kann zu einem gewünschten Zeitpunkt durch Bewegen der Polymerlösung durch den Kanal wiederholt werden. Daher umfasst die Erfindung in besonders bevorzugten Ausführungsformen ein dynamisches Beschichtungsverfahren. Unter Verwendung des dynamischen Beschichtungsverfahrens kann eine Kanaloberfläche während der Verwendung regeneriert oder aufrechterhalten werden, um eine einheitliche Oberflächenqualität bereitzustellen, wenn ein Kanal mehrfach verwendet wird, d.h. wenn aufeinanderfolgende Fluidprozeßschritte in einem Kanal durchgeführt werden, was auch als serienmäßiges Durchführen bezeichnet wird.
In einer Ausführungsform wird das oberflächenadsorbierende Polymer als ein Zusatzmittel zu einem Fluid verwendet, das eine Fluidprobe von Interesse umfasst. Ein oberflächenadsorbierendes Polymer wird zu jedem Fluidvolumen, das in den Kanal eingebracht wird, oder zu jedem 2., 3., 4., 5., 6., 8., 10., 20., 50. oder 100. Fluid hinzugefügt. Zum Beispiel wird das oberflächenadsorbierende Polymer in einem beispielhaften Verfahren der Erfindung zu einem PCR-Gemisch, einem Reinigungsgemisch aus einer Exonuklease/alkalischen Phosphatase aus Garnelen (EXO/SAP), und zu einem Mikrosequenzier (MIS)-Gemisch hinzugefügt. Dieses oberflächenadsorbierende Polymer adsorbiert auf einer Oberfläche und bildet an der Fest/Flüssig-Grenzfläche eine Polymerschicht. Die Konzentration des Polymers in der adsorbierten Schicht auf der Oberfläche erreicht einen Gleichgewichtswert. Die Konzentration des Polymers für Oberflächenmodifizierungen liegt üblicherweise im Bereich von etwa 0,001% bis etwa 5% (Gewicht/Volumen). Bevorzugt liegt die Polymerkonzentration in dem Bereich zwischen etwa 0,01% bis etwa 1% (Gewicht/Volumen). Man erkennt jedoch, dass die Gleichgewichtskonzentration des adsorbierten Polymers neben anderen Faktoren von der Temperatur und dem Oberflächenmaterial des Kanals abhängt und dass die Konzentration des Polymers in Lösung somit gemäß der bestimmten Anwendung weiter optimiert werden kann.
Wie oben beschrieben, kann ein Fluidvolumen, das in einen Kanal eingebracht wird, als Fluidbereich bezeichnet werden, wie für den Fall, wenn es nacheinander in einen Kanal injiziert wird. Fluidbereiche können jedes beliebige geeignete Fluid umfassen oder aus diesem bestehen, einschließlich zum Beispiel Wasser oder einen Puffer, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Ein Fluidbereich kann auch eine Probe umfassen. Fluidbereiche, insbesondere Fluidbereiche, die Proben umfassen (Fluidprobenbereiche), können durch Fluidtrennbereiche getrennt werden, um die Diffusion der Proben zu vermindern, oder sie können einfach nacheinander eingebracht werden, so dass ein gewisses Maß an Diffusion auftritt. In bevorzugten Ausführungsformen werden Fluidprozeßschritte nacheinander in einem Kanal ausgeführt.
Bevorzugt sind mindestens 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 aufeinanderfolgende Fluidbereiche in einem Kanal bereitgestellt. Das oberflächenadsorbierende Polymer kann daher in mindestens einem Fluidbereich bereitgestellt werden, der eine Probe umfasst, oder in mindestens einem Fluidtrennbereich. Bevorzugt liegt das oberflächenadsorbierende Polymer in mindestens 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 Proben oder Fluidprobenbereichen, oder in mindestens 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 Fluidtrennbereichen vor. In weiteren Ausführungsformen wird das oberflächenadsorbierende Polymer in mindestens 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 Fluidtrennbereichen bereitgestellt und liegt entfernt von mindestens einem oder allen der Fluidprobenbereiche vor. Alternativ wird das oberflächenadsorbierende Polymer in sowohl einem Fluidprobenbereich als auch einem Fluidtrennbereich bereitgestellt. Bevorzugt liegt das oberflächenadsorbierende Polymer in mindestens 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 Fluidprobenbereichen und in mindestens 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 oder 1000 Fluidtrennbereichen vor. Bevorzugt liegt das oberflächenadsorbierende Polymer in allen Fluidtrennbereichen vor.
Man erkennt, dass ein Kanal mit einer Polymerlösung vorbehandelt werden kann (z.B. wird der Kanal vor dem Inkontaktbringen des Kanals mit einem Testanalyten oder mit einem Reagenz mit einer Polymerlösung in Kontakt gebracht). Abwechselnd können Fluidprozeßschritte, die Fuidproben umfassen, zu welchen ein Polymer hinzugefügt worden ist, ohne Vorbehandlung des Kanals mit einer Polymerlösung ausgeführt werden.
In einem Beispiel werden die Kanäle (im Größenbereich von wenigen Hundert μm) einer Mikrofluidvorrichtung aus Silicium mit einer Lösung von PDMA (~10 μl) einer optimierten Konzentration (z.B. derzeit 0,1%) gefüllt und für 10 Minuten äquilibriert. Anschließend werden abwechselnde Bereiche von Fluidproben, die PDMA (0,1 Gew.-%/Volumen) enthalten und nicht-polare Fluidtrennbereiche durch eine Vorrichtung geschoben. Jeder Fluidprobenbereich enthält biologische Bestandteile (d.h. Proteinprobe, PCR, EXO/SAP oder MIS-Reaktionsgemisch) und PDMA. Daher wird die Oberfläche einer Mikrofluidvorrichtung vor den Proben, die die biologischen Bestandteile, die in das System eintreten, vorbeschichtet, und anschließend wird PDMA in jeder Fluidprobe, die eine biologische Probe enthält, bereitgestellt, um die Kanaloberfläche für jede Reaktion zu regenerieren.
Man erkennt, dass das oberflächenadsorbierende Polymer durch jedes beliebige geeignete Mittel in den Kanal eingebracht werden kann. Das Polymer kann als ein Gemisch mit einer Probe oder getrennt durch eine gemeinsame oder getrennte Einlassöffnung eingebracht werden.
3. Mikrofluidvorrichtungen
Der Mikrofluidträger kann viele unterschiedliche Formen annehmen. Der Träger kann eine dünne Trägerschicht sein, die einen Kanal umgibt, wie es in röhrenartigen Trägern der Fall ist, wie beispielsweise bei zur Zeit erhältlichen Polymer- oder geschmolzenen Siliciumdioxidkapillaren. In weiteren Ausführungsformen liegen die Substrate in einem ebenen Träger vor, in welchem ein oder mehrere Kanäle angeordnet sind. Üblicherweise werden in dem ebenen Träger Rillen hergestellt, und mit einem Deckelement oder einem zweiten Träger verschlossen, der passende Rillen enthält. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Mikrofluidvorrichtungen solche integrierten Mikrokanalsysteme, in welchen mehrere Kanäle in einem einzelnen Mikrofluidträger angeordnet sind.
Die Träger können jedes beliebige geeignete Material sein. Bevorzugte Trägermaterialien sind Träger auf Grundlage von Siliciumdioxid wie beispielsweise Siliciumdioxid, Silicium, Glas, Quarz. Geeignete Trägermaterialien umfassen auch Metalle sowie Polymere wie beispielsweise Kunststoff, einschließlich Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymere, Polyamide, Polydimethylsiloxane, Polyurethan, Polysulfon, Polytetrafluorethylen (Teflon^TM), und zum Beispiel Elastomere. Weitere geeignete Träger sind im Fachbereich bekannt und können ebenso verwendet werden. Die Träger können nicht-modifizierte Oberflächen aufweisen, oder sie können so behandelt werden, dass sie die Eigenschaften der Oberfläche modifizieren; zum Beispiel kann ein Silanisierungsschritt auf Siliciumträgern vor der Verwendung in Fluidprozeßschritten ausgeführt werden.
Träger, in denen Mikrokanäle angeordnet sind, können in einer Vielzahl von Anwendungen, wie im Folgenden hierin beschrieben, verwendet werden. Zum Beispiel können Mikrokanäle für das Bewegen von Fluiden in einem Reaktionskanal, für das Bewegen von Fluiden zu einem Reaktionskanal oder einer Kammer in einer Mikrofluidvorrichtung, in einer Probe oder in einem Mittel zum Verteilen von Reagenzien (z.B. für das Bewegen von Fluiden zu oder aus einer Vorrichtung), oder für das Aufbewahren von Fluiden, die in einer Vorrichtung verwendet werden (z.B. einer Mikrofluidvorrichtung) verwendet werden.
Ein Beispiel einer Mikrofluidvorrichtung, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist in WO 0107159 gezeigt.
Die Kanäle können von jeder beliebigen geeigneten Geometrie sein und in einer Mikrofluidvorrichtung in jedem beliebigen geeigneten Format angeordnet sein. Die Kanäle können auch im Querschnitt eine Vielzahl von beliebigen unterschiedlichen Formen aufweisen, einschließlich röhrenartigen Kanälen, rechtwinkligen Kanälen, rautenförmigen Kanälen, hemispherischen Kanälen oder dergleichen, oder sogar willkürliche Formen annehmen, wie sich beispielsweise aus weniger präzisen Herstellungsmethoden, z.B. Laserabtragung, ergibt. Üblicherweise variiert die Form eines Kapillarkanals in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Trägers, und dem Herstellungsverfahren. Zum Beispiel ist der Kapillarkanal in üblichen geschmolzenen Siliciumdioxidkapillaren röhrenartig. In Systemen, die ebene Träger einsetzen, umfassen die Kanäle in Abhängigkeit von dem Trägermaterial und dem Herstellungsverfahren der Kanäle üblicherweise andererseits entweder eine rautenförmige, rechtwinklige oder eine hemispherische Querschnittsform.
Eine Vielzahl von Herstellungsmethoden sind zur Herstellung mikrohergestellter Kanalsysteme im Fachbereich bekannt. Zum Beispiel sind Herstellungsverfahren, die regelmäßig in denjenigen Industrien eingesetzt werden, in welchen diese Vorrichtungen Träger verwenden, die allgemein in der Halbleiterindustrie vorkommen, leicht anwendbar, z.B. Photolithographie, nasschemisches Ätzen, chemisches Aufdampfen, Sputtern, elektroerosive Metallbearbeitung, etc. In ähnlicher Weise sind Verfahren zur Herstellung solcher Vorrichtungen in Polymerträgern ebenso leicht erhältlich, einschließlich Spritzgießen, Prägen, Laserabtragung, LIGA-Methoden und dergleichen. Weitere geeignete Herstellungsmethoden umfassen Laminier- oder Überzugsmethoden, die verwendet werden, um dazwischen liegende Strukturen im Mikromaßstab bereitzustellen, um Elemente einer bestimmten Vorrichtung im Mikromaßstab festzulegen. Methoden sind auch in Sorab K. Ghandi, VLSI Principles: Silicon and Gallium Arsenide, NY, Wiley, beschrieben.
Üblicherweise weisen Kanäle ein inneres Querschnittsmaß, z.B. Breite, Tiefe oder Durchmesser von zwischen etwa 1 μm und etwa 3 mm auf, wobei die meisten solcher Kanäle ein Querschnittsmaß im Bereich von etwa 10 μm bis etwa 1000 μm aufweisen.
In besonders bevorzugten Aspekten werden ebene Mikrofluidträger verwendet, die mehrfach integrierte Kanäle einsetzen. Die ebenen Mikrofluidvorrichtungen setzen im Allgemeinen ein integriertes Kanalnetzwerk ein, das in die Oberfläche eines ebenen Trägers eingebaut ist. Ein zweiter Träger, in welchem komplementäre Kanäle gebildet oder nicht gebildet sein können, wird auf die Oberfläche des ersten gelegt, um die Kanäle zu bedecken und abzudichten, wodurch die Kanäle festgelegt werden.
Die Kanäle können so angeordnet sein, dass die Kanäle an einer oder mehreren Überschneidungen in Verbindung stehen, wie es in Ausführungsformen der Fall ist, bei welchen Fluidvorratsgefäße oder Zufuhrkanäle mit einem ersten Fluidprozeßschritt oder einer Reaktion oder einem Kanal, wie in US-Patent Nr. 5,858,195 beschrieben, miteinander in Verbindung stehen. Alternativ können die Kanäle so angeordnet sein, dass sie nicht miteinander in Verbindung stehen. Die Kanäle können im Wesentlichen geradlinig geformt sein, oder Krümmungen aufweisen, wie beispielsweise in schlangenlinienartigen Kanälen. In bestimmten Ausführungsformen ist eine große Anzahl an Kanälen parallel angeordnet, um eine große Anzahl an parallelen Untersuchungen gleichzeitig auszuführen.
Eine Mikrofluidvorrichtung kann auch Reaktionswells umfassen. Zum Beispiel kann eine Probe durch einen Kanal, der gemäß der Erfindung behandelt wurde, zu einem Reaktionswell bewegt werden, und die Reaktion wird anschließend in dem Reaktionswell ausgeführt. Das Fluid kann anschließend weiterbewegt werden, zum Beispiel zu einem Ausgang, einer weiteren Reaktionskammer, einem Aufbewahrungsgefäß, etc.
Wie hierin verwendet, ist ein Fuidbewegungssystem ein System zum Bewegen oder Fließen lassen von Fluiden durch einen Mikrokanal. Bekannte Fluidbewegungssysteme umfassen Systeme auf Grundlage von Druck oder Vakuum, elektrokinetische, elektroosmotische und elektrohydrodynamische Systeme (WO 98/45481 und US-Patent Nr. 6,046,056) sowie Bewegungsmittel aufgrund eines Wärmegradienten (US-Patent Nr. 6,057,149). In bevorzugten Ausführungsformen werden Mittel zum Bewegen von Fluiden auf Grundlage von Druck oder Vakuum verwendet, was durch einen breiten Bereich an Mechanismen, einschließlich der Verwendung von Mikropumpen, Mikroventilen und Spritzen bewirkt werden kann. Mittel zum Bewegen von Fluiden können eine oder verschiedene aufeinanderfolgende Bewegungen von Fluiden bewirken, oder können die Bewegung von Fluiden in kontinuierlichem Fluss durch einen Kanal bewirken.
Aufgrund der Stabilität der Polymerbeschichtung bei hohen Temperaturen und bei wechselnden Temperaturbedingungen wird die Erfindung vorteilhafterweise auch in einer Mikrofluidvorrichtung mit einem Mittel zur Temperatureinstellung ausgeführt, welches in der Lage ist, die Anteile eines Kanals zu erwärmen und/oder abzukühlen.
Gegebenenfalls kann die betreffende Vorrichtung auch eine große Auswahl an zusätzlichen Bestandteilen wie beispielsweise ein Grenzflächenmittel (z.B. Spritze) umfassen, um das Einbringen einer Fluidprobe in einen Kanal, in eine weitere Mikrofluidvorrichtung, in ein Reservoir, in einen Fluidvorratsbehälter, in eine Verteilungsvorrichtung, etc., zu unterstützen. Ein Beispiel eines Gerätes zum Einbringen von Fluidproben in einen Mikrokanal wird in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 00/21666 beschrieben. Die betreffenden Vorrichtungen können gegebenenfalls ein oder mehrere Vorratsgefäße zum Aufbewahren von Fluidbestandteilen wie beispielsweise Reagenzien, Testanalyten, etc. aufweisen. Die Vorrichtung kann einen Nachweisbereich umfassen, in welchem ein Signal aus einer Probe oder einer biochemischen Reaktion überwacht werden kann, und gegebenenfalls Nachweismittel zum Messen eines Signals.
4. Fluidprozeßschritte
Die Verfahren der Erfindung und die polymerbeschichteten Kanäle und Mikrofluidvorrichtungen, die die Kanäle umfassen, können vorteilhafterweise in einer großen Auswahl an Fluidprozeßschritten verwendet werden.
Fluidprozeßschritte umfassen neben anderen Verfahren Mischen, Ausführen von Reaktionen, Inkubationen, Trennungen, Verdünnungen, Titrationen, Reinigungen, Nachweise, Mischen, Bindungsuntersuchungen, Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik) und Arzneimittel-Screeninguntersuchungen. Fluidprozeßschritte umfassen im Allgemeinen das Unterziehen eines Fluids einer oder verschiedener unterschiedlicher Temperaturen. Fluidprozeßschritte umfassen auch Verfahren, die im Allgemeinen eine große Zahl an aufeinanderfolgenden Handhabungen mit sich bringen. Fluidprozeßschritte umfassen auch jede beliebige Handhabung von Fluiden, wobei das Fluid eine Probe umfasst, wie beispielsweise einen Testanalyten oder ein Reagenz, insbesondere wenn der Testanalyt oder ein Reagenz ein Biomolekül ist, und stärker bevorzugt eine Handhabung von Fluiden, wobei der Testanalyt oder das Reagenz eine Nukleinsäure oder eine Aminosäure ist. Verschiedene Beispiele von Fluidprozeßschritten, die in Mikrokanälen ausgeführt werden können, sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/45481 beschrieben. Bevorzugte Beispiele von Fluidprozeßschritten umfassen auch die Handhabung von Proteinen in einem Kanal, wie beispielsweise auf dem Gebiet der Proteomik, von welchen beispielhafte Anwendungen in WO 01/07159 dargestellt sind.
In einem Beispiel werden Mikrofluidvorrichtungen verwendet, um Fluidhandhabungen von Reagenzien durchzuführen, wie beispielsweise die Vereinigung von Reagenzien für ein Reaktionsgemisch, die Aufteilung von Reagenzien in mehrfache Zusammensetzungen. In einem Aspekt können Verdünnungen von Proben oder Reagenzien in kleinen Volumina ausgeführt werden, insbesondere können Verdünnungen serienmäßig ausgeführt werden. In einem weiteren Beispiel können Titrationen ausgeführt werden, wie beispielsweise die Titration einer Untersuchung für das Normieren einer Untersuchung. Zum Beispiel können die verschiedenen Bestandteile einer Untersuchung titriert werden, um den dynamischen Bereich festzulegen, in welchem die einzelnen Bestandteile in dem Bereich liegen, der es ermöglicht, dass quantitative Ergebnisse erhalten werden. Die Mikrofluidvorrichtungen sind nicht auf Reagenzien und Testanalyten eingeschränkt, sondern können auch für die Handhabung von Zellen verwendet werden, wie in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 99/67639 beschrieben ist. Die Kanäle und Mikrofluidvorrichtungen können auch in Arzneimittelscreening-Untersuchungen verwendet werden, welche im Allgemeinen das Mischen verschiedener Bestandteile, Inkubation und die Untersuchung eines Ergebnisses in einem Nachweisschritt mit sich bringen. Man erkennt, dass jedes beliebige gewünschte Reagenz oder jeder beliebige gewünschte Testanalyt verwendet werden kann; Beispiele umfassen Nukleinsäuren; Aminosäuren, Lipide, chemische Verbindungen und insbesondere Rezeptoren oder Antikörper und deren Liganden, Zellen und Wachstumsfaktoren sowie Wachstumsinhibitoren, Enzyme und Substrate, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Die Mikrofluidvorrichtungen können auch zum Nachweis jedes beliebigen gewünschten Testanalyten verwendet werden, wie beispielsweise in einer Diagnoseuntersuchung. Zum Beispiel kann ein Testanalyt wie beispielsweise eine Nukleinsäure oder eine Proteinprobe durch einen Kanal geführt werden, wobei ein Nachweisgerät die An- oder Abwesenheit eines bestimmten Signals bestimmt. Eine Mikrofluidvorrichtung kann weiterhin einen Kanal oder ein Mittel zum Trennen von Bestandteilen umfassen, wie beispielsweise durch Elektrophorese. In bestimmten Ausführungsformen wird ein oberflächenadsorbierendes Polymer in einer Lösung bereitgestellt, in welcher im Wesentlichen keine Trennmatrix vorhanden ist. Das oberflächenadsorbierende Polymer kann auch in An- oder Abwesenheit von freien Teilchen (z.B. Silicium) in dem Kanal bereitgestellt werden, an welche oberflächenadsorbierende Polymer binden kann.
Man erkennt ebenso, dass die Kanäle und Mikrofluidvorrichtungen der Erfindung für viele Arten von biochemischen Reaktionen vorteilhaft sind. Insbesondere da die oberflächenadsorbierenden Polymerbeschichtungen der Erfindung bei höheren Temperaturen, die für viele Reaktionen erforderlich sind, stabil sind, und da die Beschichtungen über einen Bereich von Temperaturen stabil sind, die in Reaktionen mit zyklischem Temperaturwechsel angetroffen werden, ist die Erfindung für Reaktionen wie beispielsweise Nukleinsäureamplifikation und Primer-Extensionsreaktionen wie beispielsweise Sequenzieren oder verschiedene Genotypisierungsverfahren gut geeignet. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Vorgänge ermöglichen die Ausführung biochemischer Protokolle in kontinuierlichem Fluss, welche einen Schritt mit zyklischem Temperaturwechsel umfassen. Die Erfindung ist besonders gut zum Ausführen von Polymerasekettenreaktion (PCR), welche in genetischen Untersuchungen vielfach verwendet wird, geeignet.
Die Erfindung, die in genetischen Untersuchungen verwendet werden kann, kann jedoch auch für zahlreiche Protokolle im Bereich der Biochemie und der Molekularbiologie verwendet werden. Daher umfasst die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zum Durchführen einer biochemischen Reaktion, wobei ein Reaktionsgemisch in einem Kanal, der mit einem oberflächenadsorbierenden Polymer beschichtet ist, gebildet oder bereitgestellt wird, und wobei ein zyklischer Temperaturwechsel des Gemischs durchgeführt wird. Beispiele bevorzugter Protokolle, welche zyklischen Temperaturwechsel erfordern, stammen von der PCR (Polymerasekettenreaktion) einschließlich RT-PCR, allelspezifische PCR und TaqMan PCR [Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B. A. Ausg. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) und der Veröffentlichung mit dem Titel "PCR Methods and Applications", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)]. LCR-(Ligasekettenreaktions-) Methoden sind ebenso bekannt, wie beispielsweise LCR, Gap-LCR, RT-LCR, asymmetrische Gap-LCR (RT-AGLCR) Marshall R. L. et al. (PCR Methods and Applications 4: 80–84, 1994, the Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)) und PCR-OLA [Nikiforov, T., Anal Biochem 227(1): 201–9 (1995)], [Marshall, R. L., PCR Methods Appl. 4(2): 80–4 (1994)), (Nickerson, D. A. et al., Proc. Natl Acad Sci USA. 87(22): 8923–7 (1990)]. Zyklische Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von Klonen oder PCR-Reaktionen sind ebenso bekannt, sowie zyklisches Mikrosequenzieren (Einzelnukleotid-Primerextension-)Reaktionen (Cohen, D., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/02087).
Das bekannteste Beispiel einer Reaktion mit zyklischem Temperaturwechsel, die ausgeführt werden kann, ist die Nukleinsäureamplifikation. Ein bevorzugtes Verfahren im Fachbereich ist die PCR, die die Verwendung eines Stranges einer Nukleinsäuresequenz einer Probe umfasst, um Komplemente des Stranges zu erzeugen, wobei die Komplemente weiter als Nukleinsäurematrizen für weitere Reaktionszyklen dienen. Im Allgemeinen werden zwei Primersequenzen, die gegenüber verschiedenen Enden des zu erzeugenden Zielnukleinsäurefragmentes komplementär sind, mit der Nukleinsäure der Probe hybridisiert oder annealed. Bei Inkubation in Gegenwart eines Polymeraseenzyms und Nukleosidtriphosphaten werden die Primer entlang der Zielsequenz in Richtung des entgegengesetzten Primers verlängert. Die verlängerten Primer werden anschließend von der Matrizennukleinsäure durch Erhöhen der Temperatur abgetrennt und der Vorgang wird wiederholt.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße auszuführende Reaktionen sind Sequenzierreaktionen. Es sind mehrere unterschiedliche Methoden zum Sequenzieren einer Nukleinsäure bekannt, einschließlich dem Dideoxykettenabbruchverfahren nach Sanger (Sanger et al., PNAS USA 74: 5463–5467 (1977), dem Sequenzieren durch Hybridisierung (Drmanac et al., US-Patent Nr. 5,202,231) und dem chemischen Abbauverfahren nach Maxam-Gilbert. Das Sequenzieren in einem Mikrokanal wird in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 98/45481 beschrieben.
5. Polymeradsorption auf Kunststoffoberflächen
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Vermindern der Adsorption von organischen Materialien auf der Oberfläche von Kunststoffgeräten bereit, umfassend: (a) Hinzufügen eines Polymers, welches in einer wässrigen Lösung beinhaltet ist, zu einer Fluidprobe; und (b) Durchführen eines oder mehrerer Fluidprozeßschritte in dem Kunststoffgerät. Alternativ können die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Vermindern der Adsorption organischer Materialien auf jeder beliebigen polar/nicht-polar-Grenzfläche angewendet werden (z.B. Wasser/Öl- oder Wasser/Luft-Grenzflächen).
Verfahren der Erfindung sind beim Durchführen von Fluidprozeßschritten in kleinen Volumina besonders geeignet. Beim Arbeiten in kleinen Mengen ist die Häufigkeit von Wechselwirkungen organischer Moleküle mit der Grenzfläche (z.B. die Flüssig/Fest-Grenzfläche zwischen der Oberfläche einer Kunststoffvorrichtung und einem Reaktionsgemisch, die Flüssig/Flüssig-Grenzfläche zwischen Öl und einem Reaktionsgemisch, oder eine Wasser/Luft-Grenzfläche) als Folge eines verminderten Abstandes, über welchen Moleküle die Grenzfläche erreichen müssen, nicht mehr vernachlässigbar. Die Häufigkeitsskalen von Wechselwirkung nehmen mit den Volumina für eine Kugelgeometrie zu, da V^–1/3 gilt, und gleichzeitig nimmt das Grenzflächen-zu-Volumen-Verhältnis (GVR) mit abnehmenden Volumina (GVR ~V^–1) zu. Folglich nimmt die Wahrscheinlichkeit der Adsorption organischer Moleküle beim Arbeiten in kleinen Volumina erheblich zu. Daher ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt auf das Durchführen von Fluidprozeßschritten in Volumina von weniger als jeder beliebigen ganzen Zahl, die zwischen 20 und 0,1 μl liegt, gerichtet.
Das Vermindern der Adsorption organischer Materialien auf der Oberfläche von Kunststoffgeräten unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann auf das Erhöhen der Ausbeute biochemischer Reaktionen gerichtet sein. Eine optimale Polymermenge, die zu einem festgelegten Reaktionsgemisch eines festgelegten Volumens hinzugefügt werden sollte, kann durch ein Verfahren bestimmt werden, das die Schritte umfasst (i) Hinzufügen eines Gemisches verschiedener Mengen des Polymers, welches in einer wässrigen Lösung beinhaltet ist, zu dem Reaktionsgemisch; (ii) Durchführen der Reaktion in einer Kunststoffvorrichtung, und (iii) Bestimmen der Menge des Polymers, die hinzugefügt werden sollte, um die höchste Ausbeute zu erhalten.
Das Vermindern der Adsorption organischer Materialien auf der Oberfläche von Kunststoffvorrichtungen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann auch auf das Vermindern der Kontamination von nachfolgenden Fluidprozeßschritten durch organische Moleküle aus dem ersten Fluidprozeßschritt gerichtet werden. Die optimale Polymermenge, die zu einer vorgegebenen Fluidprobe eines vorgegebenen Volumens hinzugefügt werden sollte, kann durch ein Verfahren bestimmt werden, welches umfasst: (a) Hinzufügen verschiedener Mengen des Polymers, das in einer wässrigen Lösung beinhaltet ist, zu der ersten Fluidprobe; (b) Durchführen aufeinanderfolgender Fluidprozeßschritte in einer Kunststoffvorrichtung, und (c) Bestimmen der Menge eines Polymers, die hinzugefügt werden sollte, um die niedrigste Kontamination von aufeinanderfolgenden Fluidprozeßschritten durch organische Moleküle aus dem ersten Fluidprozeßschritt zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Kontamination das unerwünschte Vorliegen von Deoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs).
Die Verfahren der Erfindung können zum Vermindern der Adsorption einer großen Auswahl an organischen Molekülen auf der Oberfläche von Kunststoffvorrichtungen verwendet werden. Zum Beispiel umfassen organische Moleküle Nukleinsäuren, Aminosäuren, Aminosäuren, Lipide und chemische Moleküle. Die Verfahren der Erfindung können in Übereinstimmung mit einer großen Auswahl an Fluidprozeßschritten verwendet werden, die in Kunststoffvorrichtungen durchgeführt werden, einschließlich Reaktionen, Inkubationen, Verdünnungen, Titrationen, Reinigungen, Nachweise, Mischen, Bindungsuntersuchungen, Messuntersuchungen (z.B. Messung von Kinetik) und Arzneimittel-Screeninguntersuchungen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Jede beliebige Anzahl oder Kombination von Fluidprozeßschritten kann gemäß den Verfahren der Erfindung durchgeführt werden. Insbesondere können die aufeinanderfolgenden Fluidprozeßschritte das Durchführen eines Genotypisierungsvorgangs umfassen, der aus einer Polymerasekettenreaktion (PCR), Enzymreinigung mittels alkalischer Phosphatase aus Garnelen (SAP) und Mikrosequenzieren (MIS) besteht. Ein besonders bevorzugter erster Fluidprozeßschritt ist die PCR.
Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um Fluidprozeßschritte in einer großen Vielfalt von Kunststoffvorrichtungen durchzuführen. Solche Vorrichtungen umfassen Teströhrchen, Multi-Well-Platten, Mikrotiterplatten, Pipettenspitzen, Reaktionsweils und Mikrozentrifugenröhrchen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Solche Vorrichtungen können z.B. aus Polydimethylsiloxanen, Polymethylmethacrylat, Polyurethan, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polysulfon, Polycarbonat, Polytetrafluorethylen, Polypropylen, Polyethylen, Polymethylpenten, Polyethylen, Fluorpolymeren und Elastomeren hergestellt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf das Durchführen von Fluidprozeßschritten in Mikrotiterplatten gerichtet, welche im Allgemeinen in einer Vielzahl biologischer Methoden verwendet werden. Im Allgemeinen wird eine biologische Reaktion in einem Well einer Mikrotiterplatte ausgeführt. Einige Vorgänge erfordern jedoch aufeinanderfolgende Reaktionen und es ist daher effizient und wirtschaftlich, die Adsorption organischer Materialien auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten-Wells zu vermindern, um zwei oder mehrere aufeinanderfolgende Reaktionen in demselben Well einer einzigen Mikrotiterplatte durchzuführen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung auf aufeinanderfolgende Fluidprozeßschritte gerichtet, die in Mikrotiterplatten mit hoher Dichte, z.B. Mikrotiterplatten von 96, 384, 1536 oder mehr Wells, durchgeführt werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Kits zum Durchführen von Fluidprozeßschritten in Kunststoffvorrichtungen unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung. Solche Kits umfassen (a) eine wässrige Zusammensetzung, die ein wie hierin beschriebenes Polymer umfasst; (b) Reagenzien zum Durchführen der Fluidprozeßschritte; und (c) eine Anzeige, die die Menge der Zusammensetzung, die zu den Reagenzien hinzugefügt werden sollte, vorschlägt. Alternativ kann das Polymer in den Reagenzien beinhaltet sein. Der Kit kann auf das Durchführen eines einzelnen Fluidprozeßschrittes oder eines Vorgangs, welcher verschiedene Fluidprozeßschritte umfasst, gerichtet sein. Die Zusammensetzung, die das Polymer umfasst, kann zu allen Reagenzien oder zu mindestens einem Reagenz hinzugefügt werden, um jeden beliebigen Fluidprozeßschritt durchzuführen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Kit, der das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, ein Kit zum Durchführen von PCR oder zum Durchführen eines Vorgangs, der eine PCR-Reaktion umfasst. Noch stärker bevorzugt ist der Kit, der die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, ein Kit zum Durchführen von Genotypisierungsvorgängen.
Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht und beschrieben worden ist, erkennt man, dass verschiedene Änderungen daran durch einen Fachmann durchgeführt werden können, ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen, wie er durch die beigefügten Ansprüche festgelegt ist.
BEISPIELE
Referenzbeispiel 1: Herstellung eines oberflächenadsorbierenden Polymers
Ein bevorzugtes Polymer, PDMA, wurde gemäß dem folgenden Protokoll synthetisiert. 2,8 g N,N-Dimethylacrylamid wurde in 30 ml MiliQ Wasser gelöst und für 2 Stunden mit Stickstoff entgast. Anschließend wurde ein Redoxpaar, das aus Natriummetabisulfit (Na₂S₂O₅, 0,451 ml, Konzentration von 2,5 g/l), Ammoniumpersulfat (Na₂S₂O₈, 0,451 ml, Konzentration von 20 g/l) zu der Acrylamidlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde zur Polymerisation für 3 Stunden unter ständigem Rühren stehen gelassen (Viovy, J.-L., Hourdet, D., Sudor, J., Französisches Patent Nr. 98 16676; J. Sudor et al., Elektrophoresis, 2001, 22: 720–28). Das polymerisierte Polydimethylacrylamid (PDMA) wurde durch Ultrafiltration (Milipore, USA) mit einer Membran mit einem Molekulargewichtcut off von 100 000 Dalton gereinigt. Das gereinigte PDMA wurde über Nacht gefriergetrocknet.
Referenzbeispiel 2: Durchführen einer biologischen Reaktion: PCR
Mikrofluidsubstrate aus Silicium mit Kanälen, die darin angeordnet sind, wurden vor der Verwendung mit heißem Wasser (~90°C) gespült. Jeder Kanal (mit einem Volumen von 10 μl) wurde mit 1 ml Wasser mittels einer 5 ml Polypropylenspritze gespült. Die Träger wurden anschließend unter Verwendung der Spritze, die Luft durch die Kanäle bläst, getrocknet.
Eine Mikropipette von 10 μl wurde verwendet, um die Kanäle mit PCR-Gemisch zu füllen. Die Spitze des Pipettenkegels wurde am Eingang der Kanäle positioniert und 10 μl Gemisch wurde in die Kanäle ausgestoßen.
Die mit PDMA zu beschichtenden Kanäle erhielten ein PCR-Gemisch, das MgCl₂ (2 mM), Nukleotide dATP, dGTP, dCTP, dTTP (jeweils 200 μm), Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 300 nM), TaqGold (Perkin Elmer) (0,04 U/μl), DNA (1 ng/μl), FDMA (0,1%) und H₂O enthielt.
Mit BSA zu beschichtende Kanäle erhielten ein PCR-Gemisch, das MgCl₂ (2 mM), Nukleotide dATP, dGTP, dCTP, dTTP (jeweils 200 μm), Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 300 nM), TaqGold (Perkin Elmer) (0,04 U/μl), DNA (1 ng/μl), BSA (0,5%) und H₂O enthielt.
Eine haftende Aluminiumfolie wurde zum Verschließen der Kanäle verwendet, um Verdampfen während des zyklischen Temperaturwechsels zu verhindern. Die Folie wurde nur auf die Oberseite des Chips gelegt. Die Rückseite der Chips wurde "rein" gelassen, um die beste Wärmeübertragung während des zyklischen Temperaturwechsels bereitzustellen.
Sobald der Chip verschlossen wurde, wurde er auf einen ebenen Block auf einen Tetrade-Thermocycler (MJ Research) gegeben. Ein winziger Öltropfen wurde zwischen den Chip und den ebenen Block gegeben, um einen besseren Wärmekontakt und folglich eine bessere Wärmeübertragung bereitzustellen.
Der Chip mit dem PCR-Gemisch wurde im Anschluss an die Präaktivierung der Taq-Polymerase (94°C für 10 Min) für 35 Zyklen von 30 s bei 94°C, 60 s bei 55°C und 30 s bei 72°C Zyklen zyklisiert.
Das Gemisch wurde anschließend aus den Kanälen gewonnen und das Ergebnis wurde mit Gelelektrophorese (Agarosegel) und mit Quantifizierung doppelsträngiger DNA mit dem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen untersucht.
Beispiel 1: Mikrosequenzieren in einer Mikrotiterplatte
Das unten angegebene Protokoll ermöglicht eine Genotypisierungsmethode, die in einer 384-Well-Mikrotiterplatte ohne Wechseln der Wells durchzuführen ist.
Mikrosequenzieren
Ein PCR-Gemisch wurde mit dem Synperonic P105 Block-Copolymer (Endkonzentration 0,5%), 2 μl DNA (1 mg/μl), 2 μl TaqGold (0,02 U/μl) und 2 μl PCR-Primer (300 nM) hergestellt. Ein Reinigungsgemisch wurde mit 4 μl SAP (0,4 U/μl) und 4 μl EXO (0,2 U/μl) hergestellt. Ein MIS-Gemisch wurde mit 8 μl Thermosequenase (0,05 U/μl), 8 μl MIS-Oligonukleotiden (0,5 μm) und 8 μl markierter ddNTPs (9 nM) hergestellt.
2 μl PCR-Gemisch wurde zu dem Well der Mikrotiterplatte hinzugefügt. Die Mikrotiterplatte wurde im Anschluss an die Präaktivierung der Taq-Polymerase (94°C für 10 Min) für 35 Zyklen von 30 s bei 94°C, 60 s bei 55°C und 30 s bei 72°C zyklisiert. Ein Elongationsschritt wurde am Ende des Zyklisierens (72°C für 7 min) durchgeführt. 2 μl des Reinigungsgemisches wurden zu demselben Well hinzugefügt, und die Mikrotiterplatte wurde für 30 Min bei 37°C und für 10 Min bei 94°C inkubiert. Schließlich wurden 4 μl des MIS-Gemischs zu demselben Well hinzugefügt, und die Mikrotiterplatte wurde für 1 Min bei 94°C inkubiert und für 20 Zyklen von 15 s bei 55°C, 5 s bei 72°C und 10 s bei 94°C zyklisiert.
Untersuchung der Genotypisierungsdaten
Unter Verwendung der patentrechtlich geschützten Software von Genset wurde das Fluoreszenzsignal aus der Mikrosequenziermethode untersucht. Ein Problem der Genotypisierungsmethode, auf das man im Allgemeinen stößt, ist jedoch die Adsorption von Deoxynukleotiden (dNTPs) auf der Oberfläche der Mikrotiterplatten, insbesondere während der Genotypisierungsvorgänge. Die Adsorption von dNTPs auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte, die während des ersten Schritts einer Genotypisierungsmethode (z.B. PCR) hinzugefügt wurden, machen diese während der nachfolgenden Schritte (z.B. Enzymreinigung) weniger zugänglich gegenüber der alkalischen Phosphatase aus Garnelen (SAP), und die adsorbierten dNTPs werden nicht dephosphoryliert. Da dNTPs aus der Oberfläche der Mikrotiterplatte bei hoher Temperatur (z.B. während der Denaturierung von EXO- und SAP-Enzymen oder während des zyklischen Temperaturwechsels der MIS-Reaktionen) freigesetzt werden, kontaminieren sie den dritten Schritt des Genotypisierungsvorganges (d.h. MIS) erheblich. Als Ergebnis kann das MIS-Oligonukleotidprodukt durch mehr als eine Base (dNTPs) verlängert sein; daher können die SNP-spezifischen fluoreszenzmarkierten ddNTPs fehlerhaft in das Oligonukleotidprodukt mehrerer Basen stromabwärts der SNP-Stelle von Interesse eingebaut werden, wodurch unspezifische Signale entstehen (siehe 5 und 6).

Claims

Verfahren zum Vermindern der Adsorption eines organischen Materials an einer Oberfläche, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Fluidprobe, die ein organisches Material umfasst; b) Hinzufügen einer wirksamen Menge eines oberflächenadsorbierenden Polymers zu der Fluidprobe, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer ein Block-Copolymer ist, dass Polypropylenoxide und Polyethylenoxide umfasst; c) Inkontaktbringen der Fluidprobe, die das organische Material und das oberflächenadsorbierende Polymer umfasst, mit einer Oberfläche; und d) Durchführen eines Fluidprozeßschrittes, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer: (i) nicht-kovalent an die Oberfläche bindet; (ii) die adsorbierte Menge des organischen Materials an die Oberfläche vermindert; und (iii) keiner der Reaktionspartner des Fluidprozeßschrittes ist oder im Überschuss der üblicherweise hinzugefügten Menge zu der Fluidprobe zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht des oberflächenadsorbierenden Polymers mindestens 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶, oder 5 × 10⁶ Dalton beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oberfläche ein Polymer umfasst, welches ausgewählt ist aus: Polystyrol, Polypropylen, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polymethylpenten, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfon, Fluorpolymeren, Polyamiden, Silikonen und Elastomeren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei: a) die Fluidprobe eine wässrige Lösung ist; oder b) die Fluidprobe eine nicht-wässrige Lösung ist; oder c) der Fluidprozeßschritt eine PCR-Reaktion oder eine Primer-Extensionsreaktion ist; oder d) das organische Material dNTPs umfasst; oder e) das oberflächenadsorbierende Polymer ein Molekulargewicht von mindestens 1 × 10⁶ Dalton aufweist; oder f) die Oberfläche Teil einer Mikrotiterplatte ist; oder g) die Oberfläche Teil eines Kanals ist; oder h) der Fluidprozeßschritt in einer Mikrofluidvorrichtung durchgeführt wird; oder i) das organische Material als Nukleinsäuren, dNTPs, ddNTPs, Aminosäuren, Proteine, Lipide, oder chemische Verbindungen vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das organische Material ausgewählt ist aus: Nukleinsäuren, Aminosäuren, Lipiden, Fluoreszenzmarkierungen, Rezeptoren, Antikörpern, Rezeptorliganden, Antikörperliganden, Zellen, Wachstumsfaktoren, Wachstumsinhibitoren, Enzymen und Enzymsubstraten.
Verfahren zum Bestimmen der Menge eines oberflächenadsorbierenden Polymers, welches zu einem Fluidprozeßschritt nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hinzuzufügen ist, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Gerätes, das eine Oberfläche umfasst; b) Hinzufügen einer Fluidprobe und eines oberflächenadsorbierenden Polymers zu dem Gerät, wobei das oberflächenadsorbierende Polymer ein Block-Copolymer ist, welches Polypropylenoxide und Polyethylenoxide umfasst; c) Durchführen einer oder mehrerer Fluidprozeßschritte in demselben Gerät; d) Bestimmen der optimalen Menge des oberflächenadsorbierenden Polymers, welche in der Lage ist, die höchste Reaktionsausbeute oder die niedrigste adsorbierte Menge des organischen Materials an der Oberfläche zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Molekulargewicht des oberflächenadsorbierenden Polymers mindestens 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶, oder 5 × 10⁶ Dalton beträgt.
Verfahren zum dynamischen Aufrechterhalten oder Regenerieren einer Polymerbeschichtung, die auf einer Oberfläche eines Mikrokanals adsorbiert ist, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Kanals, der in einem Träger angeordnet ist; b) Einbringen von mindestens zwei Fluidproben in den Kanal, so dass zwei Fluidprobenbereiche entstehen, wobei jede der mindestens zwei Fluidproben eine Probe von Interesse umfasst; c) Bereitstellen von mindestens einem Fluidtrennbereich, der zwischen zwei der Fluidprobenbereiche liegt; wobei: (i) mindestens ein Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, oder (ii) mindestens ein Trennbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, oder (iii) mindestens ein Trennbereich und mindestens ein Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, oder (iv) jeder der Fluidprobenbereiche ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, oder (v) jeder Trennbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst, oder (vi) jeder Trennbereich und jeder Fluidprobenbereich ein oberflächenadsorbierendes Polymer umfasst; wobei das oberflächenadsorbierende Polymer ein Block-Copolymer ist, welches Propylenoxide und Polyethylenoxide umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei: a) mindestens ein erster Fluidprobenbereich das oberflächenadsorbierende Polymer umfasst, welches in der Lage ist, an die Oberfläche des Kanals nicht-kovalent zu binden; oder b) mindestens ein Fluidtrennbereich zwischen den zwei Fluidprobenbereichen positioniert ist, welche eine Probe von Interesse umfassen.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Molekulargewicht des oberflächenadsorbierenden Polymers mindestens 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶, oder 5 × 10⁶ Dalton beträgt.