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Technisches
Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung, welche eine
Gruppe von einer oder mehreren, vorzugsweise von mehr als 5, bedeckten
Mikrokanalstrukturen umfasst, welche in der Oberfläche eines
planaren Substrats gefertigt bzw. hergestellt sind.
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Der
Ausdruck „bedeckt" bedeutet, dass die Mikrokanalstrukturen
eine Abdeckung bedeckt, wodurch sie die unerwünschte Verdampfung von Flüssigkeiten
auf ein Mindestmaß beschränkt oder
verhindert. Die Abdeckung/der Deckel kann eine Mikrostruktur aufweisen,
welche der jeweiligen Mikrokanalstruktur in der Substratoberfläche entspricht.
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Der
Ausdruck „gefertigt" bedeutet, dass in der
Oberfläche
zweidimensionale und/oder dreidimensionale Mikrostrukturen vorliegen.
Der Unterschied zwischen einer zweidimensionalen Mikrostruktur und
einer dreidimensionalen Mikrostruktur ist der, dass es in der ersten
Ausführungsform
keine die Struktur begrenzenden physikalischen Schranken gibt, während es
in der letzteren Ausführungsform welche
gibt. Vergleiche zum Beispiel WO 99/58245 (Larsson et al.).
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Der
dem Innern des Mikrokanals zugewandte Teil der Abdeckung/des Deckels
ist in die Oberfläche
einer Mikrokanalstruktur eingeschlossen.
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Das
planare Substrat ist typischerweise aus anorganischem und/oder organischem
Material, vorzugsweise aus Kunststoff, hergestellt. Bezüglich Beispiele
von verschiedenen anorganischen und organischen Materialien siehe
unter der Überschrift „Materialien
in der mikrofluidischen Vorrichtung" nach.
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Eine
mikrofluidische Vorrichtung beinhaltet einen Flüssigkeitsstrom, welcher den
Massentransport von Gelöstem
und/oder in der Flüssigkeit
dispergierten Teilchen von einem funktionellen Teil der Struktur
zu einem anderen verursacht. Lediglich Kapillaren, die möglicherweise
einen Bereich für
die Anwendung und einen Bereich für den Nachweis aufweisen, wie
sie in der Kapillarelektrophorese verwendet werden, bei der gelöste Stoffe
für Trennzwecke durch
eine angelegtes elektrisches Fels veranlasst werden zu wandern,
sind keine mikrofluidischen Vorrichtungen wie sie im Zusammenhang
mit der Erfindung vorgesehen sind. Eine Kapillare zur Elektrophorese
kann jedoch Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung sein, wenn die
Kapillare Teil einer Mikrokanalstruktur ist, in der es eine oder
mehrere zusätzliche funktionelle
Teile gibt, von und/oder zu der, wie vorstehend definiert, ein Massentransport
eines gelösten
Stoffs durch einen Flüssigkeitsstrom
erfolgt.
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Die
Flüssigkeit
ist polar und wässrig
wie Wasser.
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Technischer
Hintergrund
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Bei
mikrofluidischen Vorrichtungen muss die Flüssigkeit die Kanäle leicht
durchströmen
und die unspezifische Adsorption von Reagenzien und Analyten so
gering als möglich
sein, d. h. unbedeutend für
die durchgeführten
Reaktionen.
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Reagenzien
und/oder Analyten schließen Proteine,
Nukleinsäuren,
Kohlenhydrate, Zellen, Zellteilchen, Bakterien, Viren etc. ein.
Proteine schließen alle
Verbindungen ein, die eine Poly- oder Oligopeptidstruktur aufweisen.
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Die
Hydrophilizität
von Oberflächen
innerhalb von Mikrokanalstrukturen soll ein reproduzierbares und
vorausbestimmbares Eindringen einer Flüssigkeit in die verschiedenen
Teile einer Struktur unterstützen.
Es ist wünschenswert,
dass eine Flüssigkeit,
sobald sie eine mögliche
Schwelle am Eingang zu einem Teil der Struktur passiert hat, die
Flüssigkeit in
das Teil dann durch die Kapillarwirkung eintritt (passive Bewegung).
Dies bedeutet wiederum, dass die Hydrophilizität der Oberflächen innerhalb
der Mikrokanalstrukturen beim Übergang
von einem Makroformat zu einem Mikroformat steigende Bedeutung erlangt.
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Nach
unserer Erfahrung können
oft Wasserkontaktwinkel um 20 Grad oder darunter erforderlich sein,
um eine verlässliche
passive Fluidbewegung in Mikrokanalstrukturen hinein zu erzielen.
Es ist jedoch nicht einfach Oberflächen herzustellen, die auf
Dauer derart niedrige Wasserkontaktwinkel besitzen. Es besteht oft
die Tendenz zur Änderung
von Wasserkontaktwinkeln während
der Lagerung, was es schwierig macht, mikrofluidische Vorrichtungen
mit standardisierten Strömungseigenschaften
zu vermarkten.
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Die
Situation wird durch die Tatsache kompliziert, dass Verfahren zur
Herstellung von Oberflächen
mit sehr niedrigen Wasserkontaktwinkeln nicht notwendigerweise die
Fähigkeit
zur Absorption von unspezifischen Reagenzien und Probenbestandteilen
verringern. Das Oberfläche/Volumen-Verhältnis nimmt
beim Übergang
von einem Makroformat hinab zu kleineren Formaten zu. Das bedeutet,
dass die Kapazität
für die
unspezifische Adsorption einer Oberfläche umgekehrt zu dem von der
Oberfläche umgebenen
Volumen zunimmt. Die unspezifische Adsorption wird daher im Mikroformat
kritischer als bei größeren Vorrichtungen.
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Mit
dem Vorliegen hydrophober Oberflächenstrukturen
ist oft eine unannehmbare unspezifische Adsorption von Biomolekülen verbunden.
Dieses spezielle Problem ist daher in Bezug auf Kunststoffoberflächen und
andere hydrophobe Materialien oft gravierender als bei Oberflächen aus
gediegenem Silicium und anderen ähnlichen
anorganischen Materialien.
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Es
ist eine Reihe von Verfahren zur Behandlung von Oberflächen verfügbar, um
sie hydrophil zu machen, um die unspezifische Adsorption von verschiedenen
Arten von Biomolekülen
und anderen Reagenzien zu verringern. Diese Verfahren betreffen jedoch
nicht den Ausgleich einer geringen unspezifischen Adsorption mit
einer verlässlichen
und reproduzierbaren Flüssigkeitsströmung bei
der Verkleinerung von Makroformaten hinab zu Mikroformaten. Vergleiche
zum Beispiel Elbert et al., (Annu. Rev. Mater. Sci. 26: 365–394 (1996).
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Oberflächen, welche
für Biopolymere
im Allgemeinen durch Beschichten mit Addukten zwischen Polyethyleniminen
und hydrophilen Polymeren abstoßend
gemacht worden sind, sind während
des letzten Jahrzehnts beschrieben worden (Brink et al., US-A 5,240,994;
Bergström
et al., US-A 5,250,613; Holmberg et al., J. Adhesion Sci. Technol.
7[6]: 503–517
(1993); Bergström
et al., Polymer Biomaterials, Hrsg. Cooper, Bamfors, Tsuruta, VSP
1995, 195–204;
Holmberg et al.. Mittal Festschrift, Hrsg. Van Ooij, Anderson, VSP
1998, 443–460;
und Holmberg et al., Biopolymers at Interfaces, Dekker 1998 (Sufactant
Science Series 75), 597–626).
Die aufeinander folgende Anbindung eines Polyethylenimins und eines
hydrophilen Polymers ist ebenfalls beschrieben worden (Kiss et al.,
Prog. Colloid Polym. Sci. 74: 113–118 (1987)).
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Die
unspezifische Adsorption und/oder Elektroendosmose ist bei der Kapillarelektrophorese durch
Beschichten der inneren Oberfläche
der verwendeten Kapillare mit einer hydrophilen Schicht, typischerweise
in Form eines hydrophilen Polymeren, gesteuert worden (z. B. van
Alstine et al., US-A 4,690,749; Ekström & Arvidsson, WO 98/00709; Hjertén, US-A
4,680,201 (Polymethacrylamid); Karger et al., US-A 5,840,388 (Polyvinylalkohol
(PVA)); und Soane et al., US-A 5,858,188 und US-A 6,054,034 (Acryl-Mikrokanäle). Kapillarelektrophorese
ist eine übliche
Bezeichnung für
Trennverfahren, die in einer engen Kapillare erfolgen, welche für den Massentransport
und die Trennung der Analyten ein angelegtes elektrisches Feld verwenden.
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Larsson
et al (WO 99/58245, Amersham Pharmacia Biotech) geben unter anderem
eine mikrofluidische Vorrichtung an, bei der zwischen zwei planaren
Substraten Mikrokanäle
durch Grenzflächen
zwischen hydrophilen und hydrophoben Bereichen in mindestens einem
der Substrate definiert sind. Für
wässrige
Flüssigkeiten
definieren die hydrophilen Bereiche die Fluidwege. Es werden verschiedene
Wege erörtert,
um ein Muster von hydrophoben und hydrophilen Oberflächen für unterschiedliche Zwecke
zu erhalten, wie zum Beispiel Plasmabehandlung, Beschichten einer
hydrophoben Oberfläche
mit einem hydrophilen Polymer etc. Die zur hydrophilen Beschichtung
vorgeschlagenen Polymeren können
Arylgruppen tragen oder auch nicht, wobei angenommen wird, dass
Larsson et al. sich nicht auf die größtmögliche Erniedrigung des Wasserkontaktwinkels
oder auf die Vermeidung der unspezifischen Adsorption konzentriert
haben.
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Larsson,
Ocklind und Derand (WO 00/56808) beschreiben die Herstellung hoch
hydrophiler Oberflächen
aus Kunststoff. Die Oberflächen behalten
ihre Hydrophilizität
sogar beim Kontakt mit wässrigen
Flüssigkeiten
bei. Ein zusätzlicher
Punkt in WO 00/56808 betrifft die Abstimmung einer permanenten Hydrophilizität mit guten
Zellbindungseigenschaften. Die Oberflächen werden hauptsächlich für die Verwendung
in mikrogefertigten Vorrichtungen vorgeschlagen.
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Polyethylenglycol
ist direkt an die Oberfläche eines
in Silicon hergestellten Mikrokanals gebunden worden, um die Fähigkeit
von Polyethylenglycol zur Verhinderung der Proteinadsorption zu
prüfen.
Vergleiche Bell, Brody und Yager (SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 1998,
3258 (Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical
Environmental Applications) 134–140).
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Aufgaben der
Erfindung
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Eine
erste Aufgabe ist es, einen hinreichend verlässlichen und reproduzierbaren
Massentransport von Reagenzien und Probenbestandteilen (z. B. Analyte)
in mikrofluidischen Vorrichtungen zu erzielen.
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Eine
zweite Aufgabe ist es, in mikrofluidischen Vorrichtungen eine verlässliche
und reproduzierbare wässrige
Flüssigkeitsströmung zu
ermöglichen.
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Eine
dritte Aufgabe ist es, die unspezifische Adsorption und Hydrophilizität im Verhältnis zueinander
für Oberflächen von
Fluidwegen in mikrofluidischen Vorrichtungen zu optimieren.
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Die Erfindung
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Wir
haben gefunden, dass man durch Anbindung eines hydrophilen nicht-ionischen Polymers
an die Oberfläche
einer Mikrokanalstruktur in einer mikrofluidischen Vorrichtung die
vorstehend erwähnten Probleme
auch bei den kritischsten Oberflächenmaterialien
leicht minimieren kann. Dieser Befund erleichtert die Schaffung
von Oberflächen,
welche den verlässlichen
und reproduzierbaren Transport von Reagenzien und Probenbestandteilen
in mikrofluidischen Vorrichtungen erlauben.
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Der
Hauptgegenstand der Erfindung ist die Verwendung gemäß Anspruch
1 und die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Anspruch 16. Charakteristische
Merkmale sind aus den Ansprüchen
offensichtlich.
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Das
nicht-ionische hydrophile Polymer kann direkt an die Oberfläche der
Mikrokanalstruktur oder über
ein Polymergerüst
gebunden sein, welches wiederum an die Oberfläche über eine multipunktuelle Anbindung
gebunden ist.
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Das nicht-ionische
hydrophile Polymer
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Das
nicht-ionische hydrophile Polymer enthält eines Vielzahl von hydrophilen
neutralen Gruppen. Neutrale Gruppen schließen ungeladene Gruppen aus, welche
durch pH-Änderung
geladen werden können.
Typische neutrale Gruppen enthalten ein Heteroatom (Sauerstoff,
Schwefel oder Stickstoff) und können
gewählt
werden aus Hydroxy, Ether wie Ethylenoxy (z. B. Polyethylenoxid),
Amiden, die N-substituiert sein können etc. Das Polymer selbst
ist gegenüber
den Reagenzien und Chemikalien, die in der mikrofluidischen Vorrichtung
verwendet werden sollen, ebenfalls inert.
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Beispielhafte
nicht-ionische hydrophile Polymere sind vorzugsweise wasserlöslich, wenn
sie an keine Oberfläche
gebunden sind. Ihr Molekulargewicht liegt innerhalb eines Bereichs
on etwa 400 bis etwa 1.000.000 Dalton, beträgt vorzugsweise etwa 1000 bis
etwa 200.000, wie unter 100.000 Dalton.
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Nicht-ionische
hydrophile Polymere werden veranschaulicht durch Polyethylenglycol
oder mehr oder weniger statistisch verteilte oder in Blockform verteilte
Homo- und Copolymere niederer Alkylenoxide (C1-10,
wie C2-20) oder niederer Alkylen(C1-10, wie C2-10)-Bisepoxide,
in denen die Epoxidgruppen über eine
2–10 sp3 umfassende Kohlenstoffkette verknüpft sind.
Die Kohlenstoffkette kann an einer oder mehreren Stellen durch einen
Ethersauerstoff unterbrochen sein, d. h. ein Ethersauerstoffatom
ist zwischen die zwei Kohlenstoffatome eingeschoben. An einer oder mehreren
der Methylengruppen kann ein Wasserstoffatom durch Hydroxylgruppen
oder niedere Alkoxygruppen (C1-4) ersetzt
sein. Aus Stabilitätsgründen sollte
höchstens
ein Sauerstoffatom an ein und dasselbe Kohlenstoffatom gebunden
sein.
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Andere
geeignete nicht-ionische hydrophile Polymere sind Polyhydroxypolymere,
welche ganz oder teilweise natürlich
oder vollsynthetisch sein können.
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Ganz
oder teilweise natürliche
Polyhydroxypolymere werden durch Polysaccharide repräsentiert wie
Dextran und seine wasserlöslichen
Derivate, wasserlösliche
Stärkederivate,
und wasserlösliche Cellulosederivate
wie bestimmte Celluloseether. Potentiell interessante Celluloseether
sind Methylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose und Ethylhydroxyethylcellulose.
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Synthetische
Polyhydroxypolymere von Interesse sind auch Polyvinylalkohole, gegebenenfalls
in partiell acetylierter Form, Poly(hydroxyniederalkylvinylether)polymere,
Polymere aus der Polymerisation von Epichlorhydrin, Glycidol und ähnlichen
bifunktionellen reaktiven Monomeren, welche Polyhydroxypolymere
liefern.
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Polyvinylpyrrolidon
(PVP), Polyacrylamide, Polymethacrylamide etc. sind Beispiele von
Polymeren, in denen eine Vielfalt von Amidgruppen vorliegt.
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Weitere
geeignete hydrophile Polymere sind die Reaktionsprodukte (Addukte)
zwischen Ethylenoxid, wahlweise in Kombination mit höheren Alkylenoxiden
oder Bisepoxiden, oder Tetrahydrofuran, und einer Dihydroxy- oder
Polyhydroxyverbindung wie Glycerol, Pentaerythritol und irgendeiner
der Polyhydroxypolymeren, auf die in den vorangehenden Abschnitten
Bezug genommen wurde.
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Das
nicht-ionische hydrophile Polymer kann die gleiche Struktur besitzen,
wie sie für
die in Berg et al. (WO 98/33572) definierten Streckungsmittel beschrieben
ist. Im Gegensatz zu Berg et al. gibt es keinen Notwendigkeit für das Vorliegen
eines Affinitätsliganden
auf dem bei der vorliegenden Erfindung verwendeten hydrophilen Polymer.
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Im
nicht-ionischen hydrophilen Polymer können eine oder mehrere Stellen
für die
Verknüpfung verwendet
werden. Um das hydrophile Polymer flexibel zu machen sollte die
Zahl der Verknüpfungsstellen
so gering wie möglich
sein, zum Beispiel eine, zwei oder drei Stellen pro Polymermolekül betragen. Bei
geradkettigen Polymeren wie Niederalkylenoxidpolymeren, ähnlich Polyethylenoxid,
beträgt
die Zahl der Verknüpfungsstellen
typischerweise eine oder zwei, wobei eine bevorzugt ist.
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Abhängig von
der Stellung eines beschichteten Oberflächenteils innerhalb der Mikrokanalstruktur kann
das hydrophile Polymer einen immobilisierten Reaktanten (oft als
Ligand bezeichnet, wenn Affinitätsreaktionen
betrachtet werden) tragen. In Abhängigkeit von der speziellen
Verwendung einer Mikrokanalstruktur können solche Reaktanten so genannte
Affinitätsreaktanten
sein, welche dazu verwendet werden, einen Analyten oder einen zugesetzten
Reaktanten oder eine in der Probe vorhandene Verunreinigungen abzufangen.
Immobilisierte Liganden schließen
auch immobilisierte Enzyme ein. Erfindungsgemäß liegt diese Art von Reaktanten
vorzugsweise in Reaktionskammern/Aushöhlungen vor (vergleiche unten).
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Das Gerüst
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Das
Gerüst
kann ein organisches oder anorganisches, kationisches, anionisches
oder neutrales Polymer aus anorganischem oder organischem Material
sein.
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Was
die anorganischen Gerüste
betrifft, sind die bevorzugten Ausführungsformen Polymere wie Siliciumdioxid.
Vergleiche den Versuchsteil!
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Was
die organischen Gerüste
betrifft, sind die bevorzugten Ausführungsformen kationische Polymere
wie Polyamine, d. h. Polymere, welche zwei oder mehr primäre, sekundäre oder
tertiäre
Aminogruppen oder quaternäre
Ammoniumgruppen enthalten. Die bevorzugten Polyamine sind Polyalkylenimine,
d. h. Polymere, in denen die Aminogruppen durch Alkylenketten verknüpft sind.
Die Alkylenketten sind zum Beispiel gewählt aus C1-6-Alkylenketten.
Die Alkylenketten können
neutrale hydrophile Gruppen tragen, wie zum Beispiel Hydroxy(HO)-
oder Poly(einschließend
oligo)-niederalkylenoxygruppen [-O-(C2H4)nO)mH,
worin n 1–5
und m von 1 bis aufwärts
von zum Beispiel ≤ 100
oder ≤ 50
ist], Amidgruppen, Acyl, Acyloxy, Niederalkyl (zum Beispiel C1-5) und andere neutrale Gruppen und/oder
Gruppen, welche unter den in der mikrofluidischen Vorrichtung angewendeten
Bedingungen nicht-reaktiv sind.
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Das
bevorzugte Molekulargewicht des Gerüsts, einschließlich des
Polyamingerüsts,
liegt im Bereich von 10.000–3.000.000
Dalton, vorzugsweise von 50.000–2.000.000
Dalton. Die Struktur des Gerüsts
kann linear, verzweigt, hyperverzweigt oder nadelförmig sein.
Das bevorzugte Polyamingerüst
ist Polyethylenimin, eine Verbindung, welche z. B. durch Polymerisieren
von Ethylenimin erhältlich
ist, was gewöhnlich
hyperverzweigte Ketten liefert.
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Verknüpfung mit
dem nicht-ionischen hydrophilen Polymer
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Die
Einführung
einer nicht-ionischen hydrophilen Polymergruppe in eine Kanaloberfläche kann nach
den auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren erfolgen wie zum
Beispiel durch direkte Verknüpfung
des hydrophilen Polymers mit dem gewünschten Teil der Oberfläche oder über die
Art des vorstehend erörterten
Gerüsts.
Das Addukt zwischen dem Gerüst
und dem nicht-ionischen hydrophilen Polymer kann (i) getrennt davon
gebildet werden, ehe es an die Oberfläche gebunden wird oder (ii)
an die Oberfläche
gebunden werden, indem zuerst das Gerüst und dann das hydrophile
Polymer gebunden wird. Die Alternative (ii) kann erfolgen durch
(a) Aufpfropfen eines vorbereiteten nicht-ionischen hydrophilen
Polymer auf das Gerüst
oder (b) durch Pfropfpolymerisation von geeigneten Monomeren.
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Sowohl
das nicht-ionische Polymer als auch das Gerüst können durch kovalente Bindungen,
elektrostatische Wechselwirkung etc. und/oder in situ oder anschließende Vernetzung
an den darunter liegenden Oberflächen
stabilisiert werden. Ein Polyamingerüst kann zum Beispiel durch
Reaktion seiner Aminfunktionen mit aminreaktiven Gruppen, welche von
Haus aus vorliegen oder in die unbeschichtete Substratoberfläche eingeführt wurden,
kovalent verknüpft
werden. Es ist wichtig, dass der erfindungsgemäß zu beschichtende nackte Teil
der Oberfläche Gruppen
besitzt, welche eine stabile Wechselwirkung zwischen dem nicht-ionischen
hydrophilen Polymer und der Oberfläche und zwischen dem Gerüst und der
Oberfläche
ermöglichen.
Bei kationischen Gerüsten,
wie zum Beispiel Polyamine, müssen
die negativ geladenen oder aufladbaren Gruppen oder typischerweise
hydrophile Gruppen, welche sich anderweitig an Amingruppen binden
können,
an der Oberfläche ausgesetzt
sein. Polare und/oder geladene oder aufladbare Gruppen können leicht
in Kunststoffoberflächen
eingeführt
werden wie zum Beispiel durch Behandlung mit O2-
und Acrylsäure
enthaltenden Plasmas, durch Oxidation mit Permanganat oder Dichromat
in konzentrierte Schwefelsäure,
durch Beschichten mit diesen Arten von Gruppen enthaltenden Polymeren
etc. Mit anderen Worten, durch in der Wissenschafts- und Patentliteratur
wohlbekannten Verfahren. Die Kunststoffoberfläche als solche kann auch ohne
Vorbehandlung diese Art von Gruppen enthalten, d. h. indem sie durch
Polymerisation von Monomeren erhalten wurden, welche entweder die
vorstehend erwähnten
Arten von Gruppen tragen, oder Gruppen, welche anschließend an
die Polymerisation leicht zu solchen Gruppen umgewandelt werden können.
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Besteht
die zu beschichtende Oberfläche aus
Metall, zum Beispiel aus Gold oder Platin, und weist das nicht-ionische
hydrophile Polymer oder Gerüst
Thiolgruppen auf, kann die Verknüpfung über Bindungen
erreicht werden, welche partiell kovalent sind.
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Besitzt
das nicht-ionische hydrophile Polymer oder Gerüst Kohlenwasserstoffgruppen,
zum Beispiel reine Alkylgruppen oder Phenylgruppen, kann man sich
vorstellen, dass die Anbindung an die Substratoberfläche über hydrophobe
Wechselwirkungen erfolgen kann.
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Wasserkontaktwinkel
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Der
optimale Wasserkontaktwinkel hängt von
der Analyse und den in der Mikrokanalstruktur erfolgenden Reaktionen,
den Abmessungen der Mikrokanäle
und Kammern der Strukturen, der Zusammensetzung und Oberflächenspannung
der verwendeten Flüssigkeiten
etc. ab. Als Faustregel gilt, dass die erfindungsgemäße Beschichtung
so gewählt
werden sollte, dass sie einen Wasserkontaktwinkel ≤ 30°, wie ≤ 25° oder ≤ 20° liefert.
Diese Zahlen beziehen sich auf bei der Verwendungstemperatur erhaltene
Werte, hauptsächlich
auf Raumtemperatur.
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Bisher
sind die überlegendsten
Oberflächen die
gewesen, welche auf Addukten zwischen Polyethylenimin und Polyethylenglycol
beruhen mit einseitiger (eine endständige Gruppe) Verknüpfung des nicht-ionischen
hydrophilen Polymers mit dem Polyethylenimingerüst. Die derzeit optimale Ausführungsform
dieser bevorzugten Variante ist im experimentellen Teil (Beispiel
1) wiedergegeben.
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Dicke der
Beschichtung
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Die
Dicke der hydratisierten, von einem nicht-ionischen hydrophilen
Polymer bereit gestellten Schicht sollte ≤ 50%, zum Beispiel ≤ 20%, des
kleinsten Abstands zwischen zwei gegenüber liegenden Seiten eines
Teils der Mikrokanalstruktur betragen, umfassend eine erfindungsgemäß beschichtete Oberfläche. Dies
bedeutet typischerweise, dass die optimale Dicke innerhalb eines
Intervalls von 0,1–1000
nm, zum Beispiel von 1–100
nm liegt, mit der Maßgabe,
dass die Beschichtung einen gewünschten
Durchfluss zulässt.
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Strukturen
in der mikrofluidischen Vorrichtung
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Die
mikrofluide Vorrichtung kann scheibenförmig mit verschiedener Geometrie
sein, wobei die runde Form die bevorzugte Variante ist (CD-Form).
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Bei
Vorrichtungen mit runder Form können die
Mikrokanalstrukturen radial angeordnet werden, mit einer vorgesehenen
Strömungsrichtung
von einem inneren Aufgabebereich radial nach dem Umfang der Scheibe.
Bei dieser Ausführungsform
ist der praktischste Weg zum Antreiben der Strömung die Kapillarwirkung, die
Zentripetalkraft (Rotieren der Scheibe) und/oder hydrodynamisch.
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Jede
Mikrokanalstruktur umfasst einen oder mehrere Kanäle und/oder
eine oder mehrere Aushöhlungen
im Mikroformat. Unterschiedliche Teile der Struktur können unterschiedliche
diskrete Funktionen besitzen. Folglich kann es einen oder mehrere Teile
geben, welche als (a) Aufgabekammer/-aushöhlung/-bereich,
(b) Leitung für
den Flüssigkeitstransport,
(c) Reaktionskammer/-aushöhlung,
(d) volumendefinierende Einheit, (e) Mischkammer/-aushöhlung, (f)
Kammer zur Trennung der Komponenten in der Probe, zum Beispiel durch
Kapillarelektrophorese, Chromatographie und dergleichen, (g) Detektionskammer/-aushöhlung, (h)
Abfallleitung/-kammer/-aushöhlung etc.
fungieren. Erfindungsgemäß kann wenigstens
einer dieser Teile eine erfindungsgemäße Beschichtung auf seiner
Oberfläche
tragen, d. h. er entspricht dem vorstehend erörterten Oberflächenteil.
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Bei
Verwendung der Struktur werden die erforderlichen Reagenzien und/oder
die Probe, einschließlich
des Analyten auf einen Aufgabebereich aufgegeben und in der Struktur
durch eine aufgegebene Flüssigkeitsströmung stromabwärts transportiert.
Manche der Reagenzien können
einer Kammer/Aushöhlung
vorher zugeteilt worden sein. Der Flüssigkeitsstrom kann durch Kapillarkräfte und/oder die
Zentripetalkraft, extern über
eine Mikrokanalstruktur ausgeübte
Druckunterschiede und auch durch andere nicht-elektrokinetische Kräfte, welche extern ausgeübt werden,
angetrieben werden, und verursacht den Transport der Flüssigkeit
und der Analyten sowie der Reagenzien in der gleichen Richtung.
Der Flüssigkeitsstrom
kann auch Druck angetrieben werden, welcher durch innerhalb der
Struktur erzeugte Elektroendosmose erzeugt wird. Die Flüssigkeitsströmung transportiert
auf diese Weise Reagenzien und Analyten sowie andere Bestandteile
von einem Aufgabebereich/-aushöhlung/-kammer
durch eine Folge, umfassend eine besondere Ordnung vorgewählter Teile
(b)–(h).
Der Flüssigkeitsstrom
kann unterbrochen werden, wenn ein Reagenz und/oder Analyt einen
vorbestimmten Teil erreicht hat, in dem es/er einer bestimmten Behandlung
unterworfen wird, zum Beispiel der Kapillarelektrophorese in einem
Trennabschnitt, einer Reaktion in einem Reaktionsteil, einem Nachweis
in einem Detektionsteil etc.
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Die
nachstehend erörterten
analytischen und präparativen
Methoden unter Verwendung der mikrofluidischen Vorrichtung der Erfindung
mit dem in den vorstehend Abschnitten beschriebenen Transport der Flüssigkeit,
Reagenzien und Analyten, stellen einen getrennten Aspekt der Erfindung
dar.
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Mikroformat
bedeutet, dass mindestens eine Flüssigkeitsleitung in der Struktur
eine Tiefe und/oder Breite im Mikroformatbereich aufweist, d. h. < 103 μm, vorzugsweise < 102 μm. Alle Mikrokanalstrukturen
erstrecken sich in einer gemeinsamen Ebene des planaren Substratmaterials.
Es kann zusätzlich
Ausdehnungen in andere Richtungen geben, hauptsächlich senkrecht zur gemeinsamen
Ebene. Solche anderen Ausdehnungen können zum Beispiel als Probe
oder flüssige
Aufgabebereiche oder Verbindungen zu anderen Mikrokanal-strukturen
fungieren, welche nicht in der gemeinsamen Ebene liegen.
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Der
Abstand zwischen zwei gegenüberliegenden
Wänden
im Kanal beträgt ≤ 1000 μm, wie ≤ 100 μm, oder sogar ≤ 10 μm, wie ≤ 1 μm. Die Strukturen
können
auch eine oder mehrere Kammern oder Aushöhlungen aufweisen, welche mit
den Kanälen verbunden
sind und Volumina ≤ 500 μl, wie ≤ 100 μl und sogar ≤ 10 μl, wie ≤ 1 μl besitzen.
Die Tiefe der Kammern/Aushöhlungen
kann typischerweise im Intervall ≤ 1000 μm, wie ≤ 100 μm, wie ≤ 10 μm, oder sogar ≤ 1 μm betragen.
Die Untergrenze ist immer beträchtlich
größer als
die größte der
verwendeten Reagenzien. Die Untergrenzen der Kammern und Kanäle liegen
für Vorrichtungen,
die in trockener Form geliefert werden sollen, typischerweise im
Beeich von 0,1–0,01 μm.
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Es
wird angenommen, dass die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen mikrofluidischen
Vorrichtungen an den Kunden in trockenem Zustand geliefert werden.
Die Oberflächen
der Mikrokanalstrukturen der Vorrichtung sollten daher eine Hydrophilizität aufweisen,
welche es der zu verwendenden wässrigen
Flüssigkeit
gestattet, die unterschiedlichen Teile der Kanäle der Struktur durch Kapillarkräfte (Eigensaugung)
zu durchdringen.
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Es
können
Leitungen vorliegen, welche die Flüssigkeitskommunikation zwischen
den einzelnen Mikrokanalstrukturen innerhalb eines Satzes ermöglichen.
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Material in
der mikrofluidischen Vorrichtung
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Die
erfindungsgemäß zu beschichtende Oberfläche ist
typischerweise aus anorganischem und/oder organischem Material hergestellt,
vorzugsweise aus Kunststoff. Diamantmaterial und andere Formen von
elementarem Kohlenstoff sind in den Ausdruck organisches Material
eingeschlossen. Von den geeigneten anorganischen Oberflächenmaterialien
können
Metalloberflächen
erwähnt
werden, z. B. aus Gold, Platin etc.
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Die
erfindungsgemäß zu beschichtenden Kunststoffe
können
durch Polymerisation von Monomeren erhalten worden sein, welche
Ungesättigtheit aufweisen
wie Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen und/oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen.
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Die
Monomeren können
zum Beispiel aus mono-, di- und poly/oligoungesättigten Verbindungen, z. B.
Vinylverbindungen und anderen Verbindungen ausgewählt sein,
welche Ungesättigtheit
enthalten. Anschauungsbeispiele von Monomeren sind:
- (i) Alkene/Alkadiene (wie Ethylen, Butadien, Propylen, einschließend substituierte
Formen wie Vinylether), Cycloalkane, Polyfluorvinylkohlenwasserstoffe
(zum Beispiel Tetrafluorethylen), Alkenenthaltende Säuren, Ester,
Amide, Nitrile etc. wie zum Beispiel verschiedene Methacryl/Acryl-Verbindungen;
und
- (ii) Vinylarylverbindungen (wie Mono-, Di- und Trivinylbenzole),
die zum Beispiel wahlweise mit niederen Alkylgruppen (C1-6)
substituiert sein können.
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Ein
anderer Typ Kunststoffe beruht auf Kondensationspolymeren, in denen
die Monomeren aus Verbindungen gewählt sind, welche zwei oder
mehr Gruppen aufweisen, gewählt
aus Amino-, Hydroxy-, Carboxygruppen etc. Besonders herausragende
Monomere sind Polyaminomonomere, Polycarboxymonomere (einschließend die
entsprechenden reaktionsfähigen
Halogenide, Ester und Anhydride), Polyhydroxymonomere, Aminocarboxymonomere,
Aminohydroxymonomere und Hydroxycarboxymonomere, in denen Poly für zwei,
drei oder mehr funktionelle Gruppen steht. Polyfunktionelle Verbindungen
schließen
Verbindungen mit einer zweifach reaktiven funktionellen Gruppe ein,
zum Beispiel eine Carbonsäure-
und oder eine Formaldehydgruppe. Die vorgesehenen Kunststoffe sind
typischerweise Polycarbonate, Polyamide, Polyamine, Polyether etc.
Polyether schließen
die entsprechenden Siliciumanalogen wie Siliconkautschuk ein.
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Die
Polymeren der Kunststoffe können
in vernetzter Form vorliegen.
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Die
Kunststoffe können
eine Mischung aus zwei oder mehr unterschiedlichen Polymer(en)/Copolymer(en)
sein.
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Besonders
interessante Kunststoffe sind jene, welche eine unbedeutende Fluoreszenz
für Exitationswellenlängen im
Intervall von 200–800
nm und Emissionswellenlängen
im Intervall von 400–900
nm aufweisen. Unbedeutende Fluoreszenz bedeutet, dass die Fluoreszenzintensität in dem
vorstehend angegebenen Wellenlängenintervall
unter 50% der Fluoreszenzintensität für einen Referenzkunststoff
(= einem Polycarbonat von Bisphenol A ohne Fluoreszenzadditive)
liegen sollte. Es schadet jedoch nicht, wenn die Fluoreszenzintensität der Kunststoffe
sogar niedriger ist, wie < 30%
oder < 15%, wie < 5% oder < 1% der Fluoreszenzintensität der Referenzkunststoffe.
Typische Kunststoffe mit einer annehmbaren Fluoreszenz beruhen auf
Polymeren aliphatischer Monomerer, welche polymerisierbare Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen
enthalten wie Polymere von Cycloalkenen (z. B. Norboren oder substituierte Norborene),
Ethylen, Propylene etc. ebenso wie andere hochreine nicht-aromatische Polymere,
z. B. bestimmte Qualitäten
von Polymethylmethacrylat.
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Bei
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung gelten die gleichen Fluoreszenzgrenzwerte auch für die mikrofluidische
Struktur, nachdem sie erfindungsgemäß beschichtet worden ist.
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Anwendungen unter Verwendung
der erfindungsgemäßen mikrofluidischen
Vorrichtung
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Die
Hauptanwendung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen
Vorrichtungen liegt auf dem Gebiete der analytischen und präparativen
chemischen und biochemischen Systeme.
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Typische
analytische Systeme, in denen die hierin beschriebenen mikrofluidischen
Systeme als Hauptschritte einen oder mehrere umfassen können aus
(a) Probenbereitung, (b) Versuchsreaktionen und (c) Nachweis. Probenbereitung
bedeutet die Bereitung einer Probe, um sie für die Versuchsreaktion und/oder
den Nachweis einer gewissen Aktivität oder molekularen Spezies
geeignet zu machen. Dies kann zum Beispiel bedeuten, dass Substanzen,
welche die Versuchsreaktion und/oder den Nachweis stören, entfernt
oder anderweitig neutralisiert werden, dass Substanzen aufkonzentriert
und/oder derivatisiert etc. werden. Typische Beispiele sind (1)
die Vermehrung einer oder mehrere Nukleinsäuresequenzen in einer Probe
wie zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (2) Entfernung
von Spezies durch Vernetzung mit einem Analyten bei Versuchen, welche
Affinitätsreaktionen
etc. beinhalten. Typische Versuchsreaktionen sind (i) Reaktionen,
welche Zellen beinhalten, (ii) Affinitätsreaktionen wie zum Beispiel
biospezifische Affinitäten,
einschließend
Immunreaktionen, enzymatische Reaktionen, Hybridisierung/Aufschmelzen
etc., (iii) Fällungsreaktionen, (iv)
rein chemische Reaktionen, welche die Bildung oder das Aufbrechen
kovalenter Bindungen etc. beinhalten. Die Detektionsreaktion kann
Fluorometrie, Chemiluminometrie, Massenspektrometrie, Nephelometrie,
Trübungsmessung
etc. beinhalten. Die Detektionsreaktion hat das Ziel, das Ergebnis
der Versuchsreaktionen) nachzuweisen und das gefundene Ergebnis
qualitativ oder quantitativ dem Vorliegen einer Aktivität in der
Originalprobe zuzuordnen. Die Aktivität kann eine biologische, eine
chemische, eine biochemische etc. Aktivität sein. Sie kann im Vorliegen einer
Verbindung als solcher oder einfach in der Aktivität einer
bekannten oder unbekannten Verbindung bestehen. Wird das System
für diagnostische
Zwecke verwendet, wird das Ergebnis aus dem Detektionsschritt weiterhin
mit dem medizinischen Status des Individuums in Beziehung gesetzt,
von dem die Probe stammt. Das anwendbare analytische System kann
demzufolge Affinitätsversuche
wie Immunversuche, Hybridisierungsversuche, zellbiologische Versuche,
den Mutationsnachweis, die Gencharakterisierung, Enzymversuche,
Durchmusterungsversuche zur Suche neuer Affinitätspaare etc. umfassen. Verfahren
zur Analyse des Probengehalts von Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten,
Lipiden und anderen Molekülen,
mit besonderer Betonung auf andere bioorganische Moleküle, sind
ebenfalls eingeschlossen.
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Die
mikrofluidische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann zum
Beispiel durch Synthese in fester Phase auch zur Aufstellung von
Katalogen für
Verbindungen verwendet werden, einschließend Kataloge für synthetische
Peptide und Oligonukleotide. Eingeschlossen ist auch die Aufstellung
so genannter Kombinationskataloge.
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Die
Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf Versuche, welche als
Nachweis für
die Funktion des Prinzips dienen, jedoch ohne Beschränkung darauf,
beschrieben.
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Experimenteller Teil
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A. Beschichtung mit einem
PEG-PEI-Addukt
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a. Synthese des PEG-PEI-Addukts
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0,43
g Polyethylenimin (Polymin SN von der BASF, Deutschland) wurden
in 45 ml 50 mM Natriumboratpuffer (pH 9,5) bei 45°C gelöst. 5 g
Glycidylether von Monomethoxypolyethylenglycol (Mw 5000) wurden
unter Rühren
zugegeben und die Mischung 3 h bei 45°C gerührt.
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b. Oberflächenbehandlung
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Eine
Polycarbonat CD-Scheibe (Polycarbonat von Bisphenol A, Macrolon
DP-1265, Bayer AG, Deutschland)
mit einem Mikrokanalkammermuster wurde in einen Plasmareaktor (Plasma
Science PS0500, BOC Coating Technology, USA) platziert und mit einem
Sauerstoffplasma bei einem Gasfluss von 5 sccm und einer Stromstärke von
500 W 10 min. behandelt. Nach der Belüftung des Reaktors wurde die
Scheibe 1 h in eine 0,1% Lösung
des PEG-PEI-Addukts in Boratpuffer von pH 9,5 getaucht. Die Scheibe
wurde dann mit destilliertem Wasser gespült, mit Stickstoff trocken
geblasen und der Wasserkontaktwinkel (freiem Tropfen) auf einer manuellen
Ramé-Hart
Goniometerbank gemessen. Der Mittelwert aus sechs Gleichgewichtsmessungen (drei
Tropfen) betrug 24°.
Ein XPS-Spektrum der behandelten Oberfläche lieferte die folgende molare Elementarzusammensetzung:
73,2% C, 3,7% N, 23,1% O, was zeigte, dass die Oberfläche im Wesentlichen
von adsorbiertem PEG-PEI-Addukt bedeckt war.
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c. Kapillarbenetzung
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Eine
andere Polycarbonat CD-Scheibe aus dem gleichen Material wie oben
mit einem Mikrokanalkammermuster wurde wie in Beispiel 2 behandelt. Sie
wurde dann mit einer dünnen
Abdeckung aus Siliconkautschuk bedeckt, die über einem Mikrokanal ein Loch
aufwies. Wurde mit einer Mikropipette ein Tröpfchen Wasser in das Loch gegeben,
wurde das Wasser durch Kapillarkräfte eingesaugt und durchdrang
das gesamte verfügbare
Kanalsystem.
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d. Vergleichsbeispiele
von Oberflächenbehandlungen
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- a) Eine Polycarbonat-Scheibe aus dem gleichen Material
wie oben mit einem Mikrokanalkammermuster wurde 1 h in eine 0,5%
wässrige
Lösung von
Phenyldextran (Substitutionsgrad: 0,2 pro Monosaccharideinheit Dextran,
Mw 40.000) getaucht. Nach dem Spülen
mit Wasser wurde die Scheibe mit Stickstoff trocken geblasen. Der
Wasserkontaktwinkel betrug 30 Grad. Wurde eine Abdeckung aus Siliconkautschuk
mit einem Loch über
einen Kanal auf die Scheibe gelegt wurde der Tropfen nicht spontan
eingezogen. Wurde auf den Kanal über
ein anderes Loch der Abdeckung Vakuum angelegt, konnte das Tröpfchen jedoch eingesaugt
werden.
- b) Eine Polycarbonat-Scheibe aus dem gleichen Material wie oben
mit einem Mikrokanalkammermuster wurde über Nacht in eine 1% wässrige Lösung von
Polyethylenglycol „propylene
glycol" Polyethylenglycoltriblockcopolymer
(Pluronic F108 der BASF) getaucht. Nach dem Spülen mit Wasser wurde die Scheibe
mit Stickstoff trocken geblasen. Der Wasserkontaktwinkel betrug
60 Grad. Wurde ein Deckel aus Siliconkautschuk mit einem Loch über einem
Kanal auf die Scheibe gelegt, wurde der Tropfen nicht spontan eingezogen. Wurde
auf den Kanal über
ein anderes Loch der Abdeckung Vakuum angelegt, konnte das Tröpfchen jedoch
eingesaugt werden.
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B. Poly(acrylamid)beschichtung
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a. Aktivierung der Oberfläche
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Eine
PET-Folie (Polyethylenterephthalat, Melinex®, ICI),
welche mit einem dünnen
aufgedampften Siliciumdioxidfilm beschichtet war, wurde als Abdeckung
verwendet. Die Siliciumdioxidseite der PET-Folie wurde mit Ethanol
gewaschen und anschließend
5 Minuten mit UV/Ozon behandelt (UVO-Reiniger, Modell Nr. 144A X-220, Jelight
Company, USA). 15 mm Bind Silan (3-Methacryloloxypropyltrimethoxysilan,
Amersham Pharmacia Biotech), 1,25 ml 10% Essigsäure und 5 ml Ethanol wurden
gemischt und anschließend
mithilfe einer Bürste
auf die Folie aufgetragen. Nach Verdampfung des Lösungsmittels
wurde die Folie mit Ethanol gewaschen und mit Stickstoff trocken
geblasen. Der Wasserkontaktwinkel (freier Tropfen) wurde auf einer manuellen
Ramé-Hart
Goniometerbank gemessen. Der Mittelwert aus wiederholten Messungen
betrug 62 Grad.
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b. Aufpfropfen von Polyacrylamid
auf die aktivierte Oberfläche
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8,5
ml 3 M Acrylamid in Wasser und 1,5 ml 100 mM Irgacure 184 (gelöst in Ethylenglycol,
Ciba-Geigy) wurden gemischt. Die resultierende Lösung wurde auf einer Quarzplatte
ausgebreitet und die aktivierte PET-Folie oben darauf gelegt. Die
Monomerlösung
wurde 20 Minuten durch die Quarzplatte belichtet. Die PET-Folie
wurde anschließend gründlich in
Wasser gewaschen und der mittlere Kontaktwinkel aus wiederholten
Messungen betrug 17 Grad.
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c. Kapillarbenetzung
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Ein
Stück bei
Raumtemperatur vulkanisierter Siliconkautschuk (Memosil, Wacker
Chemie) mit einer Mikrokanalstruktur und zwei Löschern wurde auf die mit Polyacrylamid
gepfropfte PET-Folie (Abdeckung) (gemäß b oben) aufgebracht. Wurde
mit einer Mikropipette ein Tröpfchen
Wasser in das Loch gegeben, wurde das Wasser durch Kapillarkräfte eingesaugt,
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d. Vergleichbeispiel zur
Kapillarbenetzung
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Ein
Stück bei
Raumtemperatur vulkanisierter Siliconkautschuk (Memosil, Wacker
Chemie) mit einer Mikrokanalstruktur und zwei Löschern wurde auf die aktivierte
PET-Folie (Abdeckung) (gemäß a oben) aufgebracht.
Wurde mit einer Mikropipette ein Tröpfchen Wasser in das Loch gegeben,
wurde kein Wasser durch Kapillarkräfte eingesaugt, Wurde auf den Kanal
durch eine anderes Loch Vakuum angelegt, wurde das Tröpfchen in
den Kanal gesaugt.