DE112020000990T5

DE112020000990T5 - Zelladhäsionszusammensetzung und Zelladhäsionssubstrat

Info

Publication number: DE112020000990T5
Application number: DE112020000990.4T
Authority: DE
Inventors: Yuji Kimura; Sayaka KAZAMI; Hiroyasu Itoh
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2021-12-16
Also published as: JP7378212B2; US20220041968A1; JP2020137457A; WO2020174932A1; TW202045721A; CN113454203A

Abstract

Eine Zelladhäsionszusammensetzung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: eine amphiphile Verbindung; und ein Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül, wobei die amphiphile Verbindung eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe aufweist, und wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats größer ist als das gewichtsgemittelte Molekulargewicht eines hydrophilen Moleküls, von dem die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung abstammt. Gemäß einer solchen Zelladhäsionszusammensetzung ist es möglich, einem Basismaterial zu einem beliebigen Zeitpunkt eine Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, indem Licht mit einer beliebigen Wellenlänge verwendet wird.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelladhäsionszusammensetzung und ein Zelladhäsionsbasismaterial.
Stand der Technik
Als Verfahren zur Steuerung der Zelladhäsionseigenschaften eines Basismaterials durch Licht sind verschiedene Techniken bekannt, die in der Patentliteratur 1 bis Patentliteratur 3 offenbart sind. Gemäß diesen Techniken ist es möglich, einem Basismaterial eine Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, indem das Basismaterial mit Licht bestrahlt wird.
Zitationsliste
Patentliteratur

[Patentliteratur 1] Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 2015-73460
[Patentliteratur 2] Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 2009-65945
[Patentliteratur 3] Ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 2006-8975

Zusammenfassung der Erfindung
Technisches Problem
In den in Patentliteratur 1 bis Patentliteratur 3 offenbarten Verfahren wird Licht, das verwendet wird, um einem Basismaterial eine Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, auf Licht mit einer bestimmten Wellenlänge, wie z. B. ultraviolette Strahlen (UV), beschränkt. UV-Strahlen sind nicht wünschenswert, weil sie Zellen schädigt. Da Zellen, die an einem Basismaterial haften, häufig mit einem Fluoreszenzfarbstoff beobachtet werden, ist die Auswahl an Fluoreszenzfarbstoffen, die zur Beobachtung von Zellen verwendet werden können, begrenzt, wenn die Wellenlänge des Lichts, das verwendet wird, um einem Basismaterial die Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, auf eine bestimmte Wellenlänge begrenzt ist.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einem Basismaterial zu einem beliebigen Zeitpunkt eine Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, indem Licht mit einer beliebigen Wellenlänge verwendet wird.
Lösung des Problems
Eine Zelladhäsionszusammensetzung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: eine amphiphile Verbindung; und ein Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül. Die amphiphile Verbindung weist eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe auf. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats ist größer als das gewichtsgemittelte Molekulargewicht eines hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Die hydrophile Gruppe kann ein Rest eines hydrophilen Moleküls sein, das aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid ausgewählt ist. Die hydrophobe Gruppe kann eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines Phospholipids mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen sein. Die hydrophile Gruppe ist vorzugsweise ein Rest von Polyethylenglykol. Die hydrophobe Gruppe ist vorzugsweise eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines Phospholipids mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen. Das hydrophile Molekül des Konjugats kann ein hydrophiles Molekül sein, das aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid ausgewählt wird. Die Zelladhäsionszusammensetzung kann ein oder mehrere Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung enthalten. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats kann mehr als das 1-fache des gewichtsgemittelten Molekulargewichts des hydrophilen Moleküls betragen, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Ein Zelladhäsionsbasismaterial gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Basismaterial; eine oder mehrere amphiphile Verbindungen; und ein oder mehrere Konjugate aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül. Jede der amphiphilen Verbindungen weist eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe auf. Die hydrophile Gruppe jeder der amphiphilen Verbindungen und die DNA jedes der Konjugate sind an das Basismaterial gebunden. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats ist größer als das gewichtsgemittelte Molekulargewicht eines hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Das Zelladhäsionsbasismaterial kann ein oder mehrere Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung enthalten.
Ein Zelladhäsionsbasismaterial gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Basismaterial; und ein oder mehrere Konjugate einer amphiphilen Verbindung und einer DNA. Jede der amphiphilen Verbindungen weist eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe, die an die DNA gebunden ist, auf. Die DNA ist an das Basismaterial gebunden.
Das Zelladhäsionsbasismaterial kann ferner eine fotoreaktive Substanz enthalten, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt.
Eine Mikrokanalvorrichtung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst einen Kanal, in dem mindestens ein Abschnitt einer Innenseite mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung beschichtet ist.
Die Mikrokanalvorrichtung kann umfassen: einen ersten Kanal; einen zweiten Kanal, der an den ersten Kanal angrenzt; und einen Verbindungsabschnitt, der den ersten Kanal mit dem zweiten Kanal verbindet und eine Öffnung auf der Seite des ersten Kanals aufweist, in der eine Zelle eingefangen werden kann, und eine Innenseite des ersten Kanals kann mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung beschichtet sein.
Ein Verfahren des Anhängens einer Zelle an ein Basismaterial gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst: Beschichten des Basismaterials mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung; Inkontaktbringen einer fotoreaktiven Substanz, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt, mit dem Basismaterial; Bestrahlen des Basismaterials mit Licht, um die fotoreaktive Substanz anzuregen; und Inkontaktbringen der Zelle mit dem Basismaterial.
Vorteilhafte Auswirkungen der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, einem Basismaterial zu einem beliebigen Zeitpunkt eine Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, indem Licht mit einer beliebigen Wellenlänge verwendet wird, wobei eine Lichtbestrahlungszeit, die erforderlich ist, um dem Basismaterial die Zelladhäsionsfähigkeit zu verleihen, kurz ist. Genauer gesagt, gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Basismaterial, an das eine beliebige Zelle zu einem beliebigen Zeitpunkt unter Verwendung von Licht mit einer beliebigen Wellenlänge angehängt werden kann, eine Mikrokanalvorrichtung, die dieses Basismaterial umfasst, und eine Zusammensetzung, die zu deren Herstellung verwendet werden kann, bereitgestellt. Des Weiteren wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, mit dem eine beliebige Zelle an einem Basismaterial zu einem beliebigen Zeitpunkt unter Verwendung von Licht mit einer beliebigen Wellenlänge angeheftet werden kann. Darüber hinaus ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, auf einfache Weise ein Zellmuster in beliebiger Form zu erhalten.
Figurenliste

1 (A) und 1(B) sind schematische Ansichten, die ein Beispiel für eine Mikrokanalvorrichtung zeigen.
2(A), 2(B) und 2(C) sind schematische Ansichten, die einen Überblick über ein Verfahren zum Aufheften einer Zelle an ein Basismaterial darstellen.

Beschreibung der Ausführungsformen
Eine Zelladhäsionszusammensetzung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine amphiphile Verbindung und ein Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül. Die amphiphile Verbindung hat eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe. Wenn die Zelladhäsionszusammensetzung mit einem Basismaterial in Kontakt gebracht wird, werden die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung und die DNA des Konjugats an das Basismaterial gebunden, und dadurch kann das Basismaterial mit der amphiphilen Verbindung und dem Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül beschichtet werden. Um die Bindung an das Basismaterial zu verbessern, kann eine bindende Substanz an die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung und die DNA des Konjugats gebunden werden. Die amphiphile Verbindung hat eine Zelladhäsionsfähigkeit, während das Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül die Wirkung aufweist, die Zelladhäsionsfähigkeit der amphiphilen Verbindung zu maskieren. Dementsprechend besitzt das mit der Zelladhäsionszusammensetzung beschichtete Basismaterial eine potenzielle Zelladhäsionsfähigkeit. Wie später beschrieben wird, wird durch Bestrahlung des Basismaterials mit Licht, um das Konjugat abzubauen, die Zelladhäsionsfähigkeit der amphiphilen Verbindung gezeigt, und dadurch können Zellen an das Basismaterial angeheftet werden.
Die hydrophile Gruppe kann ein Rest eines oder mehrerer hydrophiler Moleküle sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid besteht. Insbesondere kann die hydrophile Gruppe ein Rest eines oder mehrerer hydrophiler Moleküle sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Pentaerythritol, Glycerin, Diglycerin, Triglycerin, Tetraglycerin, Pentaglycerin, Hexaglycerin, Heptaglycerin und Octaglycerin besteht. Die hydrophile Gruppe ist vorzugsweise ein Rest von Polyethylenglykol. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Rest eines hydrophilen Moleküls eine Gruppe, die durch Entfemen eines oder mehrerer Atome (z. B. Wasserstoff) oder Gruppen erhalten wird, die bei der Bildung einer kovalenten Bindung mit einem anderen Molekül aus dem hydrophilen Molekül entfernt werden.
Um die Bindung an das Basismaterial oder an die Bindesubstanz zu verbessern, kann die hydrophile Gruppe eine reaktive funktionelle Gruppe aufweisen. Die reaktive funktionelle Gruppe ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um eine bekannte reaktive funktionelle Gruppe handelt, z. B. eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe (NHS) oder eine Maleimid-Gruppe.
Die hydrophile Gruppe kann ein Rest eines hydrophilen Moleküls mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 200 oder mehr, 400 oder mehr, 600 oder mehr, 1000 oder mehr, 2000 oder mehr, 3000 oder mehr, 5000 oder mehr oder 8000 oder mehr sein. Die hydrophile Gruppe kann ein Rest eines hydrophilen Moleküls mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht von 20000 oder weniger, 10000 oder weniger, 8000 oder weniger, 5000 oder weniger, 3000 oder weniger, 2000 oder weniger, 1000 oder weniger oder 600 oder weniger sein. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht kann z. B. mit Hilfe der Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt werden.
Die hydrophobe Gruppe ist nicht besonders begrenzt, solange sie nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und sie kann zum Beispiel eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines Phospholipids mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen sein. Die aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe kann gesättigt oder ungesättigt sein und kann eine gerade oder verzweigte Kette sein. Die aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe kann 10 bis 20 oder 11 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Die aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe kann zum Beispiel eine gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe wie eine Octyl-Gruppe (C8), eine Decyl-Gruppe (C10), eine Dodecyl-Gruppe (C12), eine Tetradecyl-Gruppe (C14), eine Hexadecyl-Gruppe (C16), eine Octadecyl-Gruppe (C18), eine Isostearyl-Gruppe (C18), eine Eicosyl-Gruppe (C20) und eine Docosyl-Gruppe (C22) sein; oder sie kann beispielsweise eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe wie eine Myristoleyl-Gruppe (C14), eine Palmitoleyl-Gruppe (C16), eine Oleyl-Gruppe (C18), eine Linoleyl-Gruppe (C18), eine Arachidonyl-Gruppe (C20) und eine Erucyl-Gruppe (C22) sein. Die Anzahl der aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen im Phospholipid kann 1 oder mehr oder 2 oder mehr betragen, vorzugsweise 1 oder 2. Beispiele für Phospholipide sind Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerin und Phosphatidylserin. Das Phospholipid kann z. B. 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DSPE) sein. Bei den nicht kovalenten Bindungen kann es sich um hydrophobe Wechselwirkungen handeln. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Rest eines Phospholipids eine Gruppe, die durch Entfernen eines oder mehrerer Atome (z. B. Wasserstoff) oder Gruppen erhalten wird, die bei der Bildung einer kovalenten Bindung mit einem anderen Molekül aus dem Phospholipid entfernt werden.
Die amphiphile Verbindung kann beispielsweise eine Verbindung sein, in der ein hydrophiles Molekül und ein hydrophobes Molekül kovalent aneinander gebunden sind, wobei das hydrophile Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid ausgewählt ist, und das hydrophobe Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen und einem Phospholipid mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen. Die Einzelheiten des hydrophilen Moleküls und des hydrophoben Moleküls sind wie oben beschrieben. Das hydrophile Molekül kann die oben beschriebenen reaktiven funktionellen Gruppen aufweisen. Konkrete Beispiele für die amphiphile Verbindung sind eine Verbindung (PEG-Lipid), in der Polyethylenglykol und ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen kovalent aneinander gebunden sind, und eine Verbindung (PEG-Phospholipid), in der Polyethylenglykol und ein Phospholipid mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen kovalent aneinander gebunden sind. Das PEG-Lipid kann beispielsweise Oleyl-O-Polyethylenglykol-Succinyl-N-Hydroxy-Succinimidyl-Ester sein. Bei dem PEG-Phospholipid kann es sich beispielsweise um N-[N'-(3'-Maleimido-1'-oxopropyl)aminopropylpolyoxyethylen-oxycarbonyl]-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin handeln.
Die DNA ist nicht besonders begrenzt, solange sie durch aktiven Sauerstoff abgebaut werden kann, und es kann eine DNA beliebiger Länge und Sequenz verwendet werden. Zum Beispiel ist 17-mer bis 30-mer, 18-mer bis 25-mer oder 20-mer bis 22-mer DNA ohne weiteres verfügbar. Die DNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die DNA kann eine reaktive funktionelle Gruppe aufweisen, um die Bindung an das hydrophile Molekül und das Basismaterial oder das Bindemolekül zu verstärken. Die reaktive funktionelle Gruppe ist nicht besonders begrenzt und kann beispielsweise aus bekannten reaktiven funktionellen Gruppen wie einer Carboxy-Gruppe, einer Thiol-Gruppe und einer Aminogruppe ausgewählt werden, je nach Art des hydrophilen Moleküls und des Basismaterials oder des Bindemoleküls. Wenn es sich bei dem Bindemolekül beispielsweise um Rinderserumalbumin (BSA) und bei dem hydrophilen Molekül um PEG mit einer Maleimid-Gruppe handelt, kann die DNA eine Carboxygruppe aufweisen, die mit der Aminogruppe von BSA durch ein Vemetzungsmittel reagiert, sowie eine Thiol-Gruppe, die mit der Maleimid-Gruppe von PEG reagiert.
Das hydrophile Molekül des Konjugats kann ein oder mehrere hydrophile Moleküle sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid besteht. Insbesondere kann das hydrophile Molekül des Konjugats ein oder mehrere hydrophile Moleküle sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Pentaerythrit, Glycerin, Diglycerin, Triglycerin, Tetraglycerin, Pentaglycerin, Hexaglycerin, Heptaglycerin und Octaglycerin besteht. Das hydrophile Molekül des Konjugats ist vorzugsweise Polyethylenglykol.
Um die Bindung an die DNA zu verstärken, kann das hydrophile Molekül des Konjugats eine reaktive funktionelle Gruppe aufweisen. Die reaktive funktionelle Gruppe ist nicht besonders begrenzt und kann beispielsweise eine bekannte reaktive funktionelle Gruppe wie eine NHS-Gruppe und eine Maleimid-Gruppe sein.
Unter dem Gesichtspunkt der Maskierung der Zelladhäsionsfähigkeit der amphiphilen Verbindung kann das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls beispielsweise 2000 oder mehr, 5000 oder mehr oder 10000 oder mehr betragen, und es kann 80000 oder weniger, 60000 oder weniger, 40000 oder weniger, 30000 oder weniger, 20000 oder weniger, 10000 oder weniger oder 5000 oder weniger betragen.
Um die Bindung an das Basismaterial zu verbessern, kann eine bindende Substanz mit der hydrophilen Gruppe der amphiphilen Verbindung und der DNA des Konjugats konjugiert werden. Die bindende Substanz ist nicht besonders begrenzt, solange sie eine funktionelle Gruppe aufweist, die in der Lage ist, an das Basismaterial, die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung und die DNA des Konjugats zu binden. Bei der bindenden Substanz kann es sich beispielsweise um ein Protein wie BSA, Ovalbumin und Kollagen oder um ein Polypeptid wie Polylysin handeln.
Die Zelladhäsionszusammensetzung kann ferner eine oder mehrere fotoreaktive Substanzen enthalten, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugen. Die fotoreaktive Substanz ist nicht besonders begrenzt, solange es sich um eine Substanz handelt, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt, und jede fotoreaktive Substanz, die durch Licht mit einer gewünschten Wellenlänge angeregt werden kann, kann ausgewählt werden. Bei der fotoreaktiven Substanz kann es sich beispielsweise um eine oder mehrere fotoreaktive Substanzen handeln, die aus der Gruppe bestehend aus einem fluoreszierenden Farbstoff, einem Fotosensibilisator und einem Fotokatalysator ausgewählt werden. Bei der fotoreaktiven Substanz handelt es sich vorzugsweise um eine DNA-bindende fotoreaktive Substanz, die in der Lage ist, an eine DNA zu binden, und noch bevorzugter um einen DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff. Ein Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise ein DNA-bindender Fluoreszenzfarbstoff sein, der aus der Gruppe bestehend aus YOYO (eingetragenes Warenzeichen)-1, YO-PRO (eingetragenes Warenzeichen)-1, TOTO (eingetragenes Warenzeichen)-1, TO-PRO (eingetragenes Warenzeichen)-1, BOBO (eingetragenes Warenzeichen)-1 und BO-PRO (eingetragenes Warenzeichen)-1 ausgewählt ist. Beispiele für Fotosensibilisatoren sind Porphyrin-Derivate wie Porfimer-Natrium und Talaporfin-Natrium. Beispiele für Fotokatalysatoren sind Titan(IV)-oxid. Unter dem Gesichtspunkt der Verhinderung von Zellschäden ist die fotoreaktive Substanz vorzugsweise eine Substanz, die durch Licht von mehr als 380 nm angeregt wird. Die fotoreaktive Substanz kann zum Beispiel eine Substanz sein, die durch Licht von 430 nm oder mehr, 450 nm oder mehr oder 480 nm oder mehr angeregt wird.
Die Zelladhäsionszusammensetzung kann 1 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 15 oder mehr oder 20 oder mehr Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung enthalten. Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats kann mehr als das 1-fache, 5-fache oder mehr, 10-fache oder mehr oder 20-fache oder mehr des gewichtsgemittelten Molekulargewichts des hydrophilen Moleküls betragen, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet. Eine Kombination des gewichtsgemittelten Molekulargewichts des hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet, und des gewichtsgemittelten Molekulargewichts des hydrophilen Moleküls des Konjugats kann z.B. 200 bis 600 und 2000 bis 5000, 1000 bis 5000 und 10000 bis 60000 oder 8000 bis 20000 und 10000 bis 80000 betragen.
Ein Zelladhäsionsbasismaterial gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Basismaterial; eine oder mehrere amphiphile Verbindungen, vorzugsweise eine Vielzahl von amphiphilen Verbindungen; und ein oder mehrere Konjugate einer DNA und eines hydrophilen Moleküls, vorzugsweise eine Vielzahl der Konjugate. Mindestens ein Abschnitt einer Oberfläche des Basismaterials ist mit den amphiphilen Verbindungen und den Konjugaten beschichtet, und die hydrophile Gruppe jeder der amphiphilen Verbindungen und die DNA jedes der Konjugate sind an das Basismaterial gebunden. Das heißt, das Basismaterial und die amphiphile Verbindung sind so gebunden, dass jedes Element in der Reihenfolge Basismaterial-hydrophile Gruppe-hydrophobe Gruppe ausgerichtet ist, und das Basismaterial und das Konjugat sind so gebunden, dass jedes Element in der Reihenfolge Basismaterial-DNA-hydrophiles Molekül ausgerichtet ist. Das Zelladhäsionsbasismaterial gemäß der vorliegenden Ausführungsform kann durch Beschichtung des Basismaterials mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung erhalten werden. Einzelheiten der amphiphilen Verbindung und des Konjugats aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül sind wie oben beschrieben.
Vorzugsweise sollten Material, Form und Gestalt des Basismaterials für die Anhaftung von Zellen geeignet sein, doch sind sie nicht besonders begrenzt. Ein Material des Basismaterials kann beispielsweise Glas, Keramik, Metall oder Kunstharz sein. Bei dem Kunstharz kann es sich zum Beispiel um ein Polystyrolharz, ein Silikonharz, ein Acrylharz, ein Polyethylenharz, ein Polypropylenharz, ein Polycarbonatharz oder ein Epoxidharz handeln. Das Basismaterial kann zum Beispiel die Form einer flachen Platte, eines Films, eines Partikels, eines Stabes oder eines porösen Körpers haben. Die Oberfläche des Basismaterials kann eine ebene oder eine gekrümmte Oberfläche sein.
Das Basismaterial kann ein Basismaterial sein, dessen Oberfläche mit einer bindenden Substanz beschichtet ist, um die Bindung an die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung und an die DNA des Konjugats zu verstärken. Einzelheiten der Bindesubstanz sind wie oben beschrieben.
Das Zelladhäsionsbasismaterial kann ferner eine fotoreaktive Substanz enthalten, die bei Lichteinstrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt. Insbesondere kann die fotoreaktive Substanz an die DNA des Konjugats gebunden sein. Einzelheiten der fotoreaktiven Substanz sind wie oben beschrieben.
Das Zelladhäsionsbasismaterial kann 1 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 15 oder mehr oder 20 oder mehr Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung umfassen.
Auf der Oberfläche des Basismaterials sind die amphiphilen Verbindungen so ausgerichtet, dass die hydrophilen Gruppen auf einer Seite näher an der Oberfläche des Basismaterials und die hydrophoben Gruppen auf einer Seite weiter von der Oberfläche des Basismaterials entfernt angeordnet sind; und die Konjugate sind so ausgerichtet, dass die DNA auf einer Seite näher an der Oberfläche des Basismaterials und die hydrophilen Moleküle auf einer Seite weiter von der Oberfläche des Basismaterials entfernt angeordnet sind. Wie oben beschrieben, ist das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats größer als das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet. Dementsprechend sind die hydrophilen Moleküle der Konjugate auf dem äußersten Abschnitt des Zelladhäsionsbasismaterials gemäß der vorliegenden Ausführungsform exponiert, und die hydrophoben Gruppen mit der Zelladhäsionsfähigkeit der amphiphilen Verbindungen sind unter den hydrophilen Molekülen der Konjugate verborgen. Wie später beschrieben wird, wird die DNA der Konjugate gespalten und die hydrophilen Moleküle werden dissoziiert, indem die fotoreaktive Substanz auf das Basismaterial aufgebracht und dann mit Licht angeregt wird. Dadurch werden die hydrophoben Gruppen der amphiphilen Verbindungen im äußersten Abschnitt freigelegt. Daher ist es mit dem Zelladhäsionsbasismaterial gemäß der vorliegenden Ausführungsform möglich, beliebige Zellen zu einem beliebigen Zeitpunkt unter Verwendung von Licht mit einer beliebigen Wellenlänge anzuheften. Darüber hinaus ist es gemäß dem Zelladhäsionsbasismaterial gemäß der vorliegenden Ausführungsform möglich, auf einfache Weise ein beliebiges Zellmuster zu erhalten.
Ein Zelladhäsionsbasismaterial gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst: ein Basismaterial; und ein oder mehrere Konjugate einer amphiphilen Verbindung und einer DNA, vorzugsweise eine Vielzahl der Konjugate. Jede der amphiphilen Verbindungen hat eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe, die an die DNA gebunden ist. Die DNA ist an das Basismaterial gebunden. Das heißt, das Basismaterial und das Konjugat sind so gebunden, dass jedes Element in der Reihenfolge Basismaterial-DNA-hydrophile Gruppe-hydrophobe Gruppe ausgerichtet ist.
Einzelheiten zu den amphiphilen Verbindungen, der DNA und dem Basismaterial sind wie oben beschrieben. In der vorliegenden Ausführungsform ist die amphiphile Verbindung jedoch an die DNA gebunden, anstatt an das Basismaterial oder eine Bindesubstanz gebunden zu sein. Darüber hinaus ist in der vorliegenden Ausführungsform die DNA an die hydrophile Gruppe gebunden, anstatt an das oben beschriebene hydrophile Molekül gebunden zu sein.
Die DNA und die amphiphile Verbindung können über eine reaktive funktionelle Gruppe gebunden sein. Die reaktive funktionelle Gruppe ist nicht besonders begrenzt und kann beispielsweise eine bekannte reaktive funktionelle Gruppe wie eine Carboxygruppe, eine Thiol-Gruppe, eine Aminogruppe, eine NHS-Gruppe und eine Maleimid-Gruppe sein.
Das Zelladhäsionsbasismaterial kann ferner eine fotoreaktive Substanz enthalten, die bei Lichteinstrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt. Insbesondere kann die fotoreaktive Substanz an die DNA des Konjugats gebunden sein. Einzelheiten der fotoreaktiven Substanz sind wie oben beschrieben.
Auf der Oberfläche des Basismaterials sind die Konjugate aus einer amphiphilen Verbindung und einer DNA so ausgerichtet, dass die DNA auf einer Seite näher an der Oberfläche des Basismaterials positioniert ist und die hydrophoben Gruppen auf einer Seite weiter von der Oberfläche des Basismaterials entfernt positioniert sind. Dementsprechend sind die hydrophoben Gruppen, die die Zelladhäsionsfähigkeit besitzen, auf dem äußersten Abschnitt des Zelladhäsionsbasismaterials gemäß der vorliegenden Ausführungsform exponiert, und dadurch werden Zellen angeheftet. Indem man die oben beschriebene fotoreaktive Substanz auf das Basismaterial aufbringt und sie dann mit Licht anregt, wird die DNA gespalten und die anhaftenden Zellen werden zusammen mit den Konjugaten vom Basismaterial gelöst. Daher ist es gemäß dem Zelladhäsionsbasismaterial nach der vorliegenden Ausführungsform möglich, beliebige Zellen, die an dem Basismaterial haften, zu einem beliebigen Zeitpunkt unter Verwendung von Licht mit einer beliebigen Wellenlänge freizusetzen und zu gewinnen. Darüber hinaus ist es gemäß dem Zelladhäsionsbasismaterial gemäß der vorliegenden Ausführungsform möglich, auf einfache Weise ein beliebiges Zellmuster zu erhalten.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Mikrokanalvorrichtung bereit, die einen Kanal umfasst, in dem mindestens ein Abschnitt einer Innenseite mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung beschichtet ist. Die Mikrokanalvorrichtung ist im Allgemeinen eine Vorrichtung, die einen oder mehrere Mikrokanäle umfasst und als Mittel zum Einfangen und Analysieren von Zellen verwendet werden kann.
1(A) und 1(B) zeigen ein Beispiel für eine Mikrokanalvorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform. Eine in 1(A) dargestellte Mikrokanalvorrichtung 40 umfasst einen Kanal 23, einen an den Kanal 23 angrenzenden Kanal 24 und einen Verbindungsabschnitt 30, der den Kanal 23 mit dem Kanal 24 verbindet. Der Kanal 23, der Kanal 24 und der Verbindungsabschnitt 30 sind allesamt Nuten, die auf einem Substrat 22 vorgesehen sind, und ein Deckglas 21 ist auf die Hauptoberfläche auf der Seite des Substrats 22 laminiert, auf der die Nuten ausgebildet sind. Das Substrat 22 ist nicht besonders begrenzt und kann z. B. aus einem Harz wie Silikonkautschuk (z. B. Dimethylpolysiloxan) hergestellt werden. Wenn das Substrat 22 aus einem Harz besteht, können der Kanal 23, der Kanal 24 und der Verbindungsabschnitt 30 leicht durch Fotolithographie gebildet werden.
Im Kanal 23 befinden sich die Einlässe 25 und 26 und ein Auslass 28 für eine Flüssigkeit, im Kanal 24 ein Einlass 27 und ein Auslass 29 für eine Flüssigkeit. In die Einlässe 25 bis 27 werden Flüssigkeiten wie z. B. Zellsuspensionen, Proben, Standardproben und Puffer injiziert. Eine über die Einlässe 25 und 26 in den Kanal 23 eingeleitete Flüssigkeit wird über den Auslass 28 nach außerhalb der Mikrokanalvorrichtung 40 abgeleitet, und eine über den Einlass 27 in den Kanal 24 eingeleitete Flüssigkeit wird über den Auslass 29 nach außerhalb der Mikrokanalvorrichtung 40 abgeleitet. Die Flüssigkeit kann z. B. mit einer Spritze in die Einlässe injiziert werden. Es können so viele Einlässe vorhanden sein, wie Flüssigkeiten verwendet werden, aber es reicht aus, wenn es mindestens einen Einlass für einen Kanal gibt. Daher kann der Einlass 26 entfallen, oder es können ein oder mehrere Einlässe in den Kanal 23 und/oder den Kanal 24 eingefügt werden. Ebenso können dem Kanal 23 und/oder dem Kanal 24 ein oder mehrere Auslässe hinzugefügt werden.
1(B) zeigt eine vergrößerte Ansicht des Verbindungsabschnitts 30. In dieser Figur wird eine Zellsuspension in den Kanal 23 eingeführt. Der Verbindungsabschnitt 30 umfasst ein Loch 32, das den Kanal 23 mit dem Kanal 24 verbindet, und eine Öffnung (offenes Ende) 31, in die eine Zelle C eingefangen werden kann. Hier bedeutet „eine Zelle C kann eingefangen werden“, dass die im Kanal 23 vorhandene Zelle C an der Öffnung 31 auf der Seite des Kanals 23 unter Bedingungen gehalten werden kann, bei denen der Druck im Kanal 23 höher ist als der Druck im Kanal 24. In 1(B) bildet die Öffnung 31 eine Vertiefung, aber die Form der Öffnung 31 ist nicht besonders begrenzt, solange sie die Zelle C aufnehmen kann, und sie kann auch flach sein. Der Verbindungsabschnitt 30 muss eine Form aufweisen, durch die die Zelle C nicht hindurchgehen kann. Daher ist es vorzuziehen, dass der Lochdurchmesser des Lochs 32 ausreichend kleiner ist als der Durchmesser der Zelle C. Außerdem verbindet der Verbindungsabschnitt 30 in 1(A) und 1(B) den Kanal 23 mit dem Kanal 24 über das Loch 32, aber das Loch 32 kann durch einen Schlitz ersetzt werden. Die Öffnung 31 braucht nur auf der Seite des Kanals vorgesehen zu werden, in der sich die Zelle C befindet. Da in 1(B) die Zellsuspension in den Kanal 23 eingebracht wird, muss die Öffnung 31 nur auf der Seite des Kanals 23 vorgesehen werden. Wird eine Zellsuspension in den Kanal 24 eingebracht, muss die Öffnung 31 nur auf der Seite des Kanals 24 angebracht werden.
2(A) zeigt eine weitere vergrößerte schematische Ansicht des Verbindungsabschnitts 30. In dieser Figur wird die Zelle C an der Öffnung 31 durch eine Kraft eingefangen, die in einer Richtung vom Kanal 23 zum Kanal 24 wirkt (die in der Figur durch einen Pfeil P angegebene Richtung). Die in Richtung des Pfeils P wirkende Kraft wird durch einen Druckunterschied zwischen dem Kanal 23 und dem Kanal 24 erzeugt. In 2(A) haftet die Zelle C nicht an einer Innenwand, die den Kanal 23 bildet, und wenn ein Druckunterschied zwischen dem Kanal 23 und dem Kanal 24 beseitigt wird, wird die Zelle C von der Öffnung 31 freigegeben.
Eine Innenseite des Kanals 23 ist mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung beschichtet. In dieser Figur umfasst eine amphiphile Verbindung 4 eine bindende Substanz 1, eine hydrophile Gruppe 2 und eine hydrophobe Gruppe 3; und ein Konjugat 7 umfasst eine bindende Substanz 1, eine DNA 5a und ein hydrophiles Molekül 6. Die hydrophile Gruppe 2 jeder der amphiphilen Verbindungen 4 und die DNA 5a jedes der Konjugate 7 sind an die den Kanal 23 bildende Innenwand, d. h. an eine Innenfläche des Kanals 23, gebunden, gegebenenfalls über die Bindesubstanzen 1. Wie oben beschrieben, ist die Bindesubstanz 1 nicht unbedingt erforderlich. Es ist auch nicht erforderlich, dass die gesamte Innenseite des Kanals 23 beschichtet ist, und es reicht aus, wenn zumindest ein Abschnitt der Innenseite des Kanals 23, insbesondere zumindest die Öffnung 31, beschichtet ist.
2(B) und 2(C) zeigen ein Verfahren zum Anhaften der Zelle an der Öffnung 31. Um die Zelle in dem in 2(A) gezeigten Zustand an die Öffnung 31 anzuheften, wird zunächst die oben beschriebene fotoreaktive Substanz (nicht gezeigt) in die Öffnung 31 eingebracht. Die fotoreaktive Substanz kann der Öffnung 31 im Voraus zugeführt werden. Alternativ kann die fotoreaktive Substanz in die Öffnung 31 eingebracht werden, indem die fotoreaktive Substanz in den Kanal 23 eingeführt wird. Die fotoreaktive Substanz ist vorzugsweise an die DNA 5a gebunden. Danach wird, wie in 2(B) gezeigt, die Öffnung 31 mit Licht bestrahlt, um die fotoreaktive Substanz anzuregen. Der durch die Anregung der fotoreaktiven Substanz erzeugte aktive Sauerstoff spaltet die DNA 5a, und dadurch wird das hydrophile Molekül 6, das eine nicht-kovalente Bindung zwischen der hydrophoben Gruppe 3 und einer Zellmembran der Zelle C verhindert hat, von der Innenwand des Kanals 23 abgespalten. Da das verbleibende DNA-Fragment 5b nicht groß genug ist, um die Bindung zwischen der hydrophoben Gruppe 3 und der Zelle C zu hemmen, gehen die hydrophobe Gruppe 3 und die Zellmembran der Zelle C eine nicht-kovalente Bindung miteinander ein, und dadurch haftet die Zelle C an der Öffnung 31.
In der Mikrokanalvorrichtung 40 gemäß der vorliegenden Ausführungsform kann eine Zelladhäsionsfähigkeit der Öffnung 31 zu einem beliebigen Zeitpunkt ausgedrückt werden. Dementsprechend kann, wenn eine Verunreinigung oder eine andere Zelle als die Zielzelle C an der Öffnung 31 eingefangen wird, diese durch Umkehrung der Druckdifferenz zwischen dem Kanal 23 und dem Kanal 24 aus der Öffnung 31 gelöst werden. Wird hingegen die Zielzelle C an der Öffnung 31 eingefangen, kann die Zelle C durch Bestrahlung der Öffnung 31 mit Licht an der Öffnung 31 haften. Sobald die Zelle C an der Öffnung 31 haftet, ist es nicht erforderlich, den Druckunterschied zwischen dem Kanal 23 und dem Kanal 24 aufrechtzuerhalten. Mit der Mikrokanalvorrichtung 40 gemäß der vorliegenden Ausführungsform können Zellen selektiv und einfach zu einem beliebigen Zeitpunkt erfasst und analysiert werden, indem Licht mit einer beliebigen Wellenlänge verwendet wird.
Als nächstes wird ein Verfahren zum Anheften einer Zelle an ein Basismaterial unter Verwendung der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung beschrieben. Das Verfahren zum Aufkleben einer Zelle auf ein Basismaterial gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte: (a) Beschichten des Basismaterials mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung; (b) Inkontaktbringen der oben beschriebenen fotoreaktiven Substanz mit dem Basismaterial; (c) Bestrahlen des Basismaterials mit Licht zur Anregung der fotoreaktiven Substanz; und (d) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Basismaterial.
In Schritt a wird das oben beschriebene Zelladhäsionsbasismaterial durch Beschichten des Basismaterials mit der oben beschriebenen Zelladhäsionszusammensetzung erhalten.
Das in Schritt a beschichtete Basismaterial ist nicht besonders begrenzt, und Beispiele für Materialien und Formen des Basismaterials sind wie oben beschrieben. Konkrete Beispiele für das Basismaterial sind Objektträger, Kulturschalen, Multiwell-Platten, die Innenwand eines Mikrokanals einer Mikrokanalvorrichtung und dergleichen.
Ein Beschichtungsverfahren ist nicht besonders begrenzt, und beispielsweise kann das Basismaterial beschichtet werden, indem die Zelladhäsionszusammensetzung in flüssiger Form mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht wird. Ein Verfahren, bei dem die Zelladhäsionszusammensetzung mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht wird, ist nicht besonders beschränkt, und beispielsweise kann die Zelladhäsionszusammensetzung tropfenweise auf das Basismaterial gegeben werden, oder das Basismaterial kann in die Zelladhäsionszusammensetzung eingetaucht werden.
In Schritt b wird die fotoreaktive Substanz mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht. In diesem Schritt wird die fotoreaktive Substanz dem Basismaterial zugeführt. Die fotoreaktive Substanz ist vorzugsweise an die DNA des an das Basismaterial gebundenen Konjugats gebunden. Die Einzelheiten der fotoreaktiven Substanz sind wie oben beschrieben. Schritt b kann nach Schritt a oder gleichzeitig mit Schritt a durchgeführt werden. Mit anderen Worten, die fotoreaktive Substanz kann mit dem mit der Zelladhäsionszusammensetzung beschichteten Basismaterial in Kontakt gebracht werden, oder die Zelladhäsionszusammensetzung und die fotoreaktive Substanz können gleichzeitig mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht werden. Wenn die Zelladhäsionszusammensetzung und die fotoreaktive Substanz gleichzeitig mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht werden, kann die fotoreaktive Substanz in der Zelladhäsionszusammensetzung enthalten sein.
In Schritt c wird das Basismaterial mit Licht bestrahlt, um die fotoreaktive Substanz anzuregen. Die angeregte fotoreaktive Substanz erzeugt aktiven Sauerstoff, und der aktive Sauerstoff spaltet die DNA des Konjugats. Dementsprechend wird durch diesen Schritt das hydrophile Molekül, das die Zelladhäsion gehemmt hat, von dem Konjugat dissoziiert, und dadurch wird die hydrophobe Gruppe, die die Zelladhäsionsfähigkeit hat und unter dem hydrophilen Molekül verborgen war, der amphiphilen Verbindung dem äußersten Abschnitt der Oberfläche des Basismaterials ausgesetzt.
Die Wellenlänge des Lichts, die Bestrahlungsintensität und die Bestrahlungszeit sind nicht besonders begrenzt, solange die fotoreaktive Substanz angeregt werden kann. Die Wellenlänge des Lichts beträgt vorzugsweise mehr als 380 nm, um eine Schädigung der Zellen zu vermeiden. Die Wellenlänge des Lichts kann beispielsweise 430 nm oder mehr, 450 nm oder mehr oder 480 nm oder mehr betragen. Die Bestrahlungszeit kann z. B. 1 Sekunde oder länger, 10 Sekunden oder länger oder 60 Sekunden oder länger betragen.
Schritt c kann nach Schritt b durchgeführt werden.
In Schritt d wird eine Zelle mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht. In diesem Schritt bindet die hydrophobe Gruppe der amphiphilen Verbindung nicht kovalent an die Zellmembran, wodurch die Zelle an das Basismaterial angeheftet wird. Die Art und Weise, wie die Zelle mit dem Basismaterial in Kontakt gebracht wird, ist nicht besonders begrenzt; so kann beispielsweise eine Zellsuspension tropfenweise auf das Basismaterial gegeben oder das Basismaterial in die Zellsuspension getaucht werden. Schritt d kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt nach Schritt a durchgeführt werden. Wird Schritt d vor Schritt b durchgeführt, so ist es vorzuziehen, dass Schritt b (Inkontaktbringen der fotoreaktiven Substanz) und die Bestrahlung mit Licht (Schritt c) durchgeführt werden, während ein Zustand aufrechterhalten wird, in dem die Zelle mit dem Basismaterial in Kontakt ist. In einem Fall, in dem Schritt d gleichzeitig mit Schritt b oder nach Schritt b und vor Schritt c durchgeführt wird, ist es vorzuziehen, dass die Bestrahlung mit Licht (Schritt c) durchgeführt wird, während ein Zustand aufrechterhalten wird, in dem die Zelle in Kontakt mit dem Basismaterial ist.
Nach dem Verfahren zum Binden einer Zelle an ein Basismaterial gemäß der vorliegenden Ausführungsform können Zellen zu einem beliebigen Zeitpunkt und in einer kurzen Bestrahlungszeit unter Verwendung von Licht mit einer beliebigen Wellenlänge an das Basismaterial gebunden werden.
Beispiele
(Zubereitung)
1. Herstellung von PEG-DNA-BSA
20-mer DNA (Sequenz: TCTATCTGCAGGCGCTCTCC) mit einer Carboxy-Gruppe am 5'-Ende und einer Thiol-Gruppe am 3'-Ende wurde synthetisiert. Diese DNA und BSA wurden jeweils in 10 mM MOPS-KOH bei pH 7,0 gelöst, wodurch eine DNA-Lösung und eine BSA-Lösung erhalten wurden. Die BSA-Lösung und die DNA-Lösung wurden in einem molaren Verhältnis von 1:5 gemischt. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC) wurde mit dieser gemischten Lösung vermischt, so dass eine Endkonzentration von 10 mM erreicht wurde, und die Carboxygruppe am 5'-Ende der DNA und eine Aminogruppe der BSA wurden gebunden. Überschüssige DNAs wurden mit Hilfe einer Spinsäule entfernt. Danach wurde PEG-Maleimid (gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von PEG: 20000) zusammen mit 10 mM MOPS-KOH bei pH 7,0 zugegeben, so dass sich ein Molverhältnis von BSA und PEG von 1:10 ergab, und sie wurden gemischt. DNA-BSA und PEG wurden durch 30-minütiges Inkubieren der gemischten Lösung gebunden, und die Reaktion wurde durch Mischen von DTT in einer Endkonzentration von 1 mM gestoppt.
2. Herstellung von PEG-Lipid-BSA
BSA und PEG-Lipid-NHS wurden jeweils in 10 mM MOPS-KOH bei pH 7,0 gelöst, wodurch eine BSA-Lösung und eine PEG-Lipid-Lösung erhalten wurden. Als PEG-Lipid-NHS wurde Oleyl-O-Polyethylenglykol-Succinyl-N-Hydroxy-Succinimidyl-Ester (gewichtsgemitteltes Molekulargewicht von PEG: 2000, „SUNBRIGHT OE-020CS“ hergestellt von NOF CORPORATION) verwendet. Die BSA-Lösung und die PEG-Lipid-Lösung wurden in einem molaren Verhältnis von 1:10 gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Stoppen der Reaktion wurde Tris-HCI mit einem pH-Wert von 6,8 zugegeben.
3. Herstellung von PEG-Phospholipid-DNA-BSA
PEG-Phospholipid-DNA-BSA wurde auf die gleiche Weise hergestellt wie PEG-DNA-BSA, mit der Ausnahme, dass PEG-Phospholipid-Maleimid anstelle von PEG-Maleimid verwendet wurde. Als PEG-Phospholipid-Maleimid wurde N-[N'-(3'-Maleimido-1'-oxopropyl)aminopropylpolyoxyethylenoxycarbonyl]-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (gewichtsgemitteltes PEG-Molekulargewicht: 2000, „SUNBRIGHT DSPE-020MA“, hergestellt von NOF CORPORATION) verwendet.
(Beispiel 1)
PEG-DNA-BSA und PEG-Lipid-BSA wurden im Verhältnis 1:5 gemischt, so dass die Gesamtkonzentration von BSA 0,5 mg/ml betrug. Diese gemischte Lösung wurde tropfenweise auf ein gewaschenes Deckglas (24 mm × 36 mm, t 0,17 mm) gegeben, wodurch ein Substrat mit einer mit PEG-DNA-BSA und PEG-Lipid-BSA beschichteten Oberfläche erhalten wurde.
YOYO-1 (maximale Absorptionswellenlänge 491 nm, maximale Fluoreszenzwellenlänge 509 nm) wurde in einen Puffer gegeben, so dass eine Endkonzentration von 10 µM erreicht wurde, und die Mischung wurde tropfenweise auf das Substrat gegeben. Danach wurde ein vorbestimmter kreisförmiger Bereich 10 Sekunden lang mit Anregungslicht bestrahlt, wobei eine Blende verwendet wurde, um dem kreisförmigen Bereich zelladhäsive Eigenschaften zu verleihen. Nach der Bestrahlung wurden freigesetztes PEG, der Fluoreszenzfarbstoff, abgebaute DNAs und dergleichen mit einem Puffer abgewaschen.
Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium suspendiert, so dass eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml erreicht wurde. Die Zellsuspension wurde mit dem Substrat in Kontakt gebracht, und nach 10 Minuten wurden überschüssige Zellen mit einem serumhaltigen Medium abgewaschen. Die Zellen auf dem Substrat wurden kultiviert, und nach einem Tag wurden die Zellen auf dem Substrat mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Die Zellen hafteten an dem kreisförmigen Bereich und dehnten sich darin aus und bildeten ein kreisförmiges Muster.
(Beispiel 2)
PEG-DNA-BSA und PEG-Lipid-BSA wurden in einem Verhältnis von 1:5 gemischt, so dass die Gesamtkonzentration von BSA 0,5 mg/ml betrug. Diese gemischte Lösung wurde in den Kanal 23 der Mikrokanalvorrichtung eingeführt, wie in den 1(A) und 1(B) gezeigt, um die Innenseite des Kanals 23 mit PEG-DNA-BSA und PEG-Lipid-BSA zu beschichten.
Die Zellen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, so dass eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml erreicht wurde. Die Zellsuspension wurde in den Kanal 23 und PBS in den Kanal 24 eingeleitet. Die Fließgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass der Druck im Kanal 23 höher wurde als der Druck im Kanal 24, und die gewünschte Zelle wurde an der Öffnung 31 gehalten. Wenn Zelltrümmer oder andere Zellen als die gewünschte Zelle an der Öffnung 31 festgehalten wurden, wurde der Druckunterschied umgekehrt, um sie aus der Öffnung 31 zu lösen.
Nachdem die gewünschte Zelle an der Öffnung 31 eingefangen wurde, wurde PBS, das YOYO-1 enthält, in den Kanal 23 eingeführt. Die Öffnung 31 wurde 10 Sekunden lang mit Anregungslicht bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde PBS in den Kanal 23 eingeführt, um freigesetztes PEG, den Fluoreszenzfarbstoff, abgebaute DNAs und ähnliches wegzuwaschen. Die gewünschte Zelle wurde an der Öffnung 31 gefunden.
(Beispiel 3)
PEG-Phospholipid-DNA-BSA wurde in einem Puffer suspendiert, so dass eine BSA-Konzentration von 0,5 mg/ml erreicht wurde. Diese Suspension wurde tropfenweise auf ein gewaschenes Deckglas (24 mm × 36 mm, t0,17 mm) gegeben, wodurch ein Substrat mit einer mit PEG-Phospholipid-DNA-BSA beschichteten Oberfläche erhalten wurde.
Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium suspendiert, so dass eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml erreicht wurde. Die Zellsuspension wurde mit dem oben beschriebenen Substrat in Kontakt gebracht. Nach Bestätigung der Adhäsion der Zellen am Substrat wurde das Substrat mit einem serumhaltigen Medium gewaschen, und die Zellen wurden kultiviert, bis sie zusammenwuchsen.
YOYO-1 wurde in das Medium gegeben, so dass die Endkonzentration 10 µM betrug, und die Mischung wurde tropfenweise auf das Substrat gegeben. Danach wurde ein vorbestimmter kreisförmiger Bereich mit Hilfe einer Blende 10 Sekunden lang mit Anregungslicht bestrahlt. Die Zellen in dem kreisförmigen Bereich lösten sich vom Substrat und schwammen im Medium. Die im Medium schwimmenden Zellen wurden wiedergewonnen.
Bezugszeichenliste

1: Bindesubstanz
2: Hydrophile Gruppe
3: Hydrophobe Gruppe
4: Amphiphilische Verbindung
5a: DNA
5b: DNA-Fragment
6: Hydrophiles Molekül
7: Konjugat
21: Deckglas
22: Substrat
23, 24: Kanal
25, 26, 27: Einlass
28, 29: Auslass
40: Mikrokanalvorrichtung
30: Verbindungsabschnitt
31: Öffnung
32: Loch
C: Zelle

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

JP 201573460 [0002]
JP 200965945 [0002]
JP 20068975 [0002]

Claims

Zelladhäsionszusammensetzung, die Folgendes umfasst: eine amphiphile Verbindung; und ein Konjugat aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül, wobei die amphiphile Verbindung eine hydrophobe Gruppe, die nicht kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe aufweist, und wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats größer ist als das gewichtsgemittelte Molekulargewicht eines hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Gruppe ein Rest eines hydrophilen Moleküls ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid, und die hydrophobe Gruppe eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines Phospholipids mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 7 bis 22 Kohlenstoffatomen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das hydrophile Molekül des Konjugats ein hydrophiles Molekül ist, das aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylenglykol, Polyglycerin, Polysaccharid, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure und Polyacrylamid ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die hydrophile Gruppe ein Rest von Polyethylenglykol ist und die hydrophobe Gruppe eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines Phospholipids mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ein oder mehrere Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats mehr als das 1-fache des gewichtsgemittelten Molekulargewichts des hydrophilen Moleküls beträgt, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Zelladhäsionsbasismaterial, das Folgendes umfasst: ein Basismaterial; eine oder mehrere amphiphile Verbindungen; und ein oder mehrere Konjugate aus einer DNA und einem hydrophilen Molekül, wobei jede der amphiphilen Verbindungen eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe aufweist, die hydrophile Gruppe jeder der amphiphilen Verbindungen und die DNA jedes der Konjugate an das Basismaterial gebunden sind, und ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht des hydrophilen Moleküls des Konjugats größer ist als ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht eines hydrophilen Moleküls, von dem sich die hydrophile Gruppe der amphiphilen Verbindung ableitet.
Zelladhäsionsbasismaterial nach Anspruch 7, das ein oder mehrere Konjugate pro Molekül der amphiphilen Verbindung umfasst.
Zelladhäsionsbasismaterial, das Folgendes umfasst: ein Basismaterial; und ein oder mehrere Konjugate aus einer amphiphilen Verbindung und einer DNA, wobei jede der amphiphilen Verbindungen eine hydrophobe Gruppe, die nicht-kovalent an eine Zellmembran binden kann, und eine hydrophile Gruppe, die an die DNA gebunden ist, aufweist, und die DNA ist an das Basismaterial gebunden.
Zelladhäsionsbasismaterial nach einem der Ansprüche 7 bis 9, das femer eine fotoreaktive Substanz enthält, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt.
Mikrokanalvorrichtung, umfassend einen Kanal, in dem mindestens ein Abschnitt einer Innenseite mit der Zelladhäsionszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 beschichtet ist.
Mikrokanalvorrichtung nach Anspruch 11, umfassend: einen ersten Kanal; einen zweiten Kanal, der an den ersten Kanal angrenzt; und einen Verbindungsabschnitt, der den ersten Kanal mit dem zweiten Kanal verbindet und eine Öffnung auf der Seite des ersten Kanals aufweist, in der eine Zelle eingefangen werden kann, wobei eine Innenseite des ersten Kanals mit der Zelladhäsionszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 beschichtet ist.
Verfahren zum Anheften einer Zelle an ein Basismaterial, wobei das Verfahren umfasst: Beschichten des Basismaterials mit der Zelladhäsionszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6; Inkontaktbringen einer fotoreaktiven Substanz, die bei Lichtbestrahlung aktiven Sauerstoff erzeugt, mit dem Basismaterial; Bestrahlen des Basismaterials mit Licht, um die fotoreaktive Substanz anzuregen; und Inkontaktbringen der Zelle mit dem Basismaterial.