EP2356215A1 - Substrate zur selektion und spezifischen beeinflussung der funktion von zellen - Google Patents

Substrate zur selektion und spezifischen beeinflussung der funktion von zellen

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EP2356215A1
EP2356215A1 EP09764742A EP09764742A EP2356215A1 EP 2356215 A1 EP2356215 A1 EP 2356215A1 EP 09764742 A EP09764742 A EP 09764742A EP 09764742 A EP09764742 A EP 09764742A EP 2356215 A1 EP2356215 A1 EP 2356215A1
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EP
European Patent Office
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substrate
cells
cell
ligands
specific
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09764742A
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English (en)
French (fr)
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Joachim P. Spatz
Nadine Perschmann
Ann-Kathrin Schmieder
Roberto Fiammengo
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the invention relates to methods and substrates for specifically influencing the function of cells by their adhesion to substrate surfaces with predetermined properties.
  • the invention also relates to examination facilities and
  • ECM extracellular matrix
  • Concepts for the artificial construction of a matrix for the regulation of cell cultures in vitro are very often based on polymeric and inorganic scaffolds.
  • the goal here is that the polymeric or inorganic scaffold give physical signals to the cell system for cell orientation, cell migration and cell spreading.
  • the pores of the scaffold give the cell system sufficient space to define the tissue structure after a certain culture period.
  • Traditional polymer systems include polytetrafluoroethylene, silicones or polyethylene.
  • inorganic frameworks for example, bioactive glass, ceramics or calcium phosphates can be used.
  • bioactive matrices in the field of implant technology.
  • the artificial matrices known in the prior art take into account only a part of the factors which under natural conditions determine the interaction between the extracellular matrix and different cell types.
  • the present invention is based on the surprising finding that not only are the chemical properties, e.g. Presence of zeolite ligands and / or signal molecules, but also the mechanical properties of a substrate, e.g. the hardness, strength or rigidity of the substrate, allowing mechanical stimulation of cells through the substrate, and the geometric properties, e.g. the spatial arrangement of cell attachment sites of a substrate not only have a significant impact on cell adhesion (Discher et al., (2005) Science 320: 1139-1143; Arnold et al., (2004) Chemphyschem 5: 383-388) also exert a direct and specific influence on certain cell functions of adherent cells in many cases.
  • the chemical properties e.g. Presence of zeolite ligands and / or signal molecules
  • mechanical properties of a substrate e.g. the hardness, strength or rigidity of the substrate, allowing mechanical stimulation of cells through the substrate
  • geometric properties e.g. the spatial arrangement of cell attachment sites of a substrate not
  • the present invention provides, in one aspect, substrates for binding cells according to claim 1, the substrates having different surface areas, each representing at least one condition affecting cell adhesion and / or cell function.
  • substrates for binding cells according to claim 1 the substrates having different surface areas, each representing at least one condition affecting cell adhesion and / or cell function.
  • such substrates are part of a biomaterial chip according to claim 19 or an examination device according to claim 21.
  • the invention also encompasses the use of the above substrates, chips and inspection devices in various, in particular medical, applications according to claims 25-34.
  • a method for selectively affecting protein synthesis of target cells on a substrate according to claim 36 which induces or affects the synthesis of desired proteins by the arrangement of zeolite ligands at predetermined distances on the substrate.
  • a method of selecting and / or identifying cells according to claim 41 wherein the specific response of cells residing on a substrate is recorded and evaluated for mechanical stimulation.
  • the conditions influencing cell adhesion and / or cell function are determined. Typically, at least determined by a geometric property and / or a mechanical property or a combi ⁇ nation of a geometric property and / or a mechanical property with a chemical property of the respective surface area.
  • a geometric property and / or a mechanical property or a combi ⁇ nation of a geometric property and / or a mechanical property with a chemical property of the respective surface area can also play an important role in influencing cell adhesion and / or cell function. Any combinations of further properties with the chemical, mechanical and geometric properties explained in more detail herein are therefore also encompassed by the present invention.
  • the chemical property of the substrate is first determined by the molecular structure of the inorganic or organic substrate.
  • the substrate may e.g. Glass, metal or a plastic.
  • On this base substrate e.g. Nano Design Schemee be provided with a predetermined distance from nanostructures. Such nanostructures are e.g. by depositing gold nanoclusters of desired size and spacings on a substrate.
  • the chemical property of a desired surface area or of several surface areas is preferably predetermined or decisively determined by the functionalization of the base substrate and / or the nanostructures with specific zeolite ligands, in particular extracellular matrix (ECM) molecules in natural tissues or fragments thereof.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell ligands are selected from molecules that bind to cell adhesion receptors (CAM) of cells. More particularly, they are molecules that bind to cell adhesion receptors of the groups of cadherins, immunoglobulin superfamily (Ig-CAMS), selectins, and integrins, particularly integrins.
  • CAM cell adhesion receptors
  • Ig-CAMS immunoglobulin superfamily
  • the ligands are selected from fibronectin, laminin, fibrinogen, tenascin, VCAM-I, MadCAM-1, collagen, or a cell adhesion receptor, particularly integrins, specific binding fragment thereof or a cell adhesion receptor specific binding derivative thereof.
  • the geometric property of the substrate typically comprises the arrangement of cell sites, in particular functionalized with cell ligands, at predetermined intervals on the substrate.
  • the arrangement of the contact sites or cell ligands represents a nanostructure.
  • nanostructure refers to an array of nanometer-sized islands, hereinafter referred to as “nanostructure regions”, which may serve as contact sites and may be selectively occupied by other molecules, eg, cell ligands.
  • the size of the islands should not be greater than a countable amount of molecules that interact with the surface of the cells. Desirable is the size of an island, which allows only the interaction of a single molecule due to the size of the island.
  • Island diameter in the range of less than 100 nm, in particular those less than 20 nm, for example less than 10 nm, are of particular interest in this case and are preferably used.
  • the spacing of the islands must be in ranges between 1 and 1000 nanometers, especially 1-300 nm, e.g. 1 - 200 nm or preferably 1 - 100 nm, be flexible and adjustable to an accuracy of 1-2 nanometers.
  • This connection may involve a simple or multiple connection of a single cell. Multiple binding has the advantage in particular in the presence of currents or, more generally, applied external forces, of keeping the cells significantly more stable at the interface than would be possible by single bonds, and thus, if appropriate, facilitating their separation from mixed media.
  • micellar block copolymer nanolithography R. Glass, M. Moller, JP Spatz, Nanotechnology 2003, 14 (10), 1153-1160, Arnold, M. Cavalcanti-Adam, R. Glass, J. Blummel, W. Eck, M. Kantlehner, H. Kessler, and JP Sparrow. (2004) Chemphyzem. 5: 383-8, DE 199 52018.6; DE 19747813.1; DE 29747815.8; DE 19747816.6).
  • nanoclusters desired size and desired spacings are produced on a substrate.
  • These nanostructures are typically ordered quasi-hexagonally.
  • all materials are suitable as the substrate on which the desired nanostructures can be formed.
  • Some suitable but non-limiting examples are glass, silica and plastic surfaces, including hydrogels.
  • the nanostructure regions form gradients of at least one of the geometric (e.g., distances and sizes of the regions) and chemical properties (e.g., type of functionalization). These gradients can also be formed by a sequence of spatially separated regions (see Fig. 6).
  • the mechanical property comprises the hardness or rigidity of the substrate and / or its viscous, elastic or viscoelastic properties.
  • the hardness or stiffness expressed as a Young 's modulus, can be varied, for example, in a range from 0.1 kPa to 100 MPa.
  • the mechanical property may include mechanical stimulation of the cells through the substrate.
  • the base substrates used are, for example, elastic plastics such as polydimethylsiloxane (PDMS) or hydrogels, preferably based on PEO, particularly preferably polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) hydrogels).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PEGDA polyethylene glycol diacrylate hydrogels
  • PEGDA polyethylene glycol diacrylate hydrogels
  • These offer using PEGs of different molecular weights and using different mass percentages (concentrations) of a wide span with respect to the Young's modulus see (MPa to kPa areas). Nanostructures as described above can also be transferred to these base substrates (for example as described in DE 10 2004 043 908 A1).
  • These gold nanostructures which can have different particle density and thus varying particle spacings (in the form of a gradient or precise homogeneous regions) and can be selectively adjusted in this respect, serve as binding sites for various ligands and / or functional groups after transfer to the hydrogel there , such as thiol groups.
  • a surface (eg glass) of a base substrate is first activated / hydroxylated to link the PEG hydrogel and functionalized with a compound which, for example, contains an unsaturated function, eg allyltriethoxysilane (FIG , In this case, the unsaturated function serves to networking with the hydrogel during the polymerization process.
  • an unsaturated function eg allyltriethoxysilane
  • Nanostructuring of the hydrogel is made possible by a transfer process.
  • the nanostructure is first applied to a glass surface by means of a diblock copolymer micelle technique (eg similar to that described in DE 19747813.1; DE 29747815.8; DE 19747816.6) and then using a linker, for example a prophenol or N, N V - Bis (acryloyl) cystamine linker, transferred to the hydrogel.
  • a linker for example a prophenol or N, N V - Bis (acryloyl) cystamine linker
  • the representation of the entire substrate is now carried out by simultaneous transfer of the gold structure and attachment of the hydrogel during the polymerization process.
  • the respective surfaces function as a flow cell (FIG. 1b), whereby the polymer solution can be filled between both surfaces without bubbles.
  • the hydrogel is stored in water, resulting in a water absorption of the gel and a gentle detachment of the upper glass.
  • the PEG hydrogel can also be functionalized completely or partially with a carboxylic acid. This laterally controlled functionalization of the surface of the gel occurs through a transfer process.
  • a carboxylic acid preferably a long-chain and polyunsaturated carboxylic acid (fatty acid, eg linolenic acid) is first applied to a hydrophilic glass.
  • This process is associated with a high degree of lateral precision and enables functionalization in the form of a microstructure (FIG. 1c) which can also be transferred to the gel.
  • the unsaturated end of the acid is then cross-linked with the PEG hydrogel during the polymerization process, whereby the carboxylic acid is covalently bonded to the surface of the gel ( Figure Id).
  • FIG. 2 clearly shows in the left panel the exclusive growth of the cells on the carboxylic acid functionalized hydrogel side.
  • the unfunctionalized side has a passivating effect on cells.
  • the right panel shows the binding of the fluorescent dye Oregon Green 488 cadaverine by EDC / NHS activation of the carboxyl function.
  • a substrate which comprises at least 3 different surface areas with at least 3 different conditions influencing cell adhesion and / or cell function.
  • this substrate is characterized in that the at least 3 different conditions that influence the cell adhesion and / or cell function, the functional at least one surface area with certain cell ligands, the geometric arrangement of zeolite ligands in at least one surface area, the substrate hardness or substrate stiffness in at least one surface area. A combination of two or more properties in one or more of these surface areas is possible and generally preferred (FIG. 3).
  • the substrate has a three-dimensional structure.
  • a structure may e.g. a tube or microtube with a diameter of a few to several 100 microns.
  • Such tubes may be made of various plastics and hydrogels, e.g. based on polyalkylene glycol, and also nanostructures, e.g. prepared as described above.
  • the different surface regions of the substrate are spatially separated from one another by barriers.
  • the different surface areas may be in separate chambers of the substrate.
  • the present invention also includes supports comprising two or more of the substrates of the invention in a three-dimensional array.
  • supports comprising two or more of the substrates of the invention in a three-dimensional array.
  • two identical or different substrates which, for example, carry different zeolite ligands, can be set against each other.
  • the optimum distance can be achieved, for example, by means of a frame (eg made of Teflon). Ion) of certain thickness between the two substrates.
  • a medium exchange can be made by the weak pumping of new medium.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a biomaterial chip which comprises at least one substrate according to the invention and is constructed from different separate chambers which represent different but specific conditions influencing cell adhesion and / or cell function as explained above and the completed cultivation of cells in each Chamber allow.
  • a biomaterial chip preferably comprises at least 16 chambers.
  • the subject matter of the present invention is also an examination device comprising a) a substrate, a carrier or a biomaterial chip as defined above, b) a sample holder in which the substrate or the carrier or biomaterial chip is arranged, c) a Measuring device for detecting at least one cell-specific analysis parameter and d) an evaluation device.
  • the measuring device comprises a direct or inverted optical microscope and preferably a device for digital image processing.
  • the cell-specific analysis parameter is, but is not limited to, the number of cells, the cell shape, or the presence of a label, especially fluorescent label, for, for example, adhesion molecules or certain specific proteins, eg, cell differentiation, or other specific molecules, eg, nucleic acids or membrane components.
  • a label especially fluorescent label, for, for example, adhesion molecules or certain specific proteins, eg, cell differentiation, or other specific molecules, eg, nucleic acids or membrane components.
  • Other suitable parameters will be for the Skilled skilled in the art, depending on the cells studied and the conditions of cultivation and be easily detectable by standard methods.
  • the above-described substrates, biomaterial chips, or assay devices may be used to identify suitable substrate conditions for a specific cell system or cell function.
  • this specific cell function is the synthesis of specific proteins.
  • the substrates, chips and assay devices according to the invention are particularly suitable for carrying out a screening with high numbers of samples and / or many different substrate conditions ("high-through-put-screening", HTS) by combining different ones for cell adhesion and / or Cell function of essential substrate parameters in one or more surface regions and their specific variation in other surface regions can be used to quickly and efficiently identify suitable or optimized substrate conditions for specific cell types or cell functions, as well as rapid selection and identification of specific cell types.
  • HTS high-through-put-screening
  • the investigated cells are not limited in cell type or type of species. Both prokaryotic and eukaryotic cells can be examined. Preferably, it is cells of a vertebrate, in particular a mammal, more preferably of humans. In a specific embodiment, the cells examined are stem cells or the differentiated cells derived therefrom.
  • the substrates, chips and inspection devices according to the invention have wide potential applications on many offer biology, biochemistry and medicine, including medical diagnostics. Special fields of application are eg investigations in immunology and allergology. A specific example of this is the identification of substrate conditions for triggering allergic reactions of T or mast cells.
  • Another possible application relates to the promotion or investigation of the selective cell colonization of boundary surfaces, in particular in cardiology or implant technology.
  • the result of this study may e.g. the identification of suitable or optimized matrix properties for implants in different body areas, e.g. Bone, ear, etc., be.
  • substrates, biomaterial chips, or assay devices can also be used to select or identify cells.
  • a related application is the identification of disease states characterized by the change in cell type, e.g. Cancer or malaria.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for influencing the protein synthesis of target cells, comprising a) providing a substrate for binding cells to the surface of this substrate, the substrate having at least one surface region having zeolite ligands at predetermined intervals are arranged on the substrate, is functionalized; b) applying the target cells to the substrate; c) cultivating the target cells on the substrate, wherein the synthesis of desired proteins induced by the arrangement of Zellli- ganden at predetermined intervals on the substrate or influenced.
  • This method may further include additionally providing a particular mechanical property of the functionalized surface area that also affects cell function.
  • This mechanical property can be provided, for example, by predetermining a certain rigidity or hardness of the substrate or by providing mechanical stimulation of adhering cells.
  • this aspect relates to a method for the selection and / or identification of numbers which comprises: a) providing a substrate for binding cells to the surface of said substrate, wherein the substrate has at least one surface area providing mechanical stimulation to the surface Can exercise cells; b) applying the target cells to the substrate; c) mechanical stimulation of the target cells on the substrate; d) recording the response of the cells to the stimulation; e) Evaluation of the reaction of the cells and, if appropriate, comparison with reference values and thereby identification of cells of a specific cell type and / or a specific origin.
  • Fig. Ia shows schematically the functionalization of a base substrate (eg glass) with allyltriethoxyethane for attachment of a hydrogel
  • Fig. Ib shows schematically the attachment of the hydrogel and the transfer of a gold nanostructure to the hydrogel;
  • Fig. Ic shows the microstructuring of a hydrophilic glass with carboxylic acid for subsequent transfer to a hydrogel
  • Fig. Id shows schematically the functionalization of the tethered hydrogel by the carboxylic acid.
  • Fig. 2 shows various hydrogels bound to glass.
  • the right panel illustrates the transfer of the gold nanostructure by means of “electroless deposition", which increases the gold particles.
  • Fig. 3 is a schematic representation of a combination of three variable parameters on a substrate having different surface areas.
  • Figure 4 shows a comparison of the growth of cells on a carboxylic acid functionalized versus an unfunctionalized hydrogel.
  • Fig. 5 shows contact angle measurements of surfaces with and without carboxylic acid functionalization.
  • Fig. 6 shows schematically an embodiment of a substrate with several spatially separated surface areas, in which two parameters, namely the type of ligand (biomolecule 1-4) and the distances between the ligands are systematically varied.
  • Figure 7 shows the differential synthetic activity of 3T3 fibroblasts with respect to the protein fibronectin as a function of the structure of the substrate surface), as detected by gel electrophoresis of the corresponding mRNA.
  • 8 shows a bar graph of the different synthesis activity of mouse osteoblasts with respect to the protein Vinkulin as a function of the structure of the substrate surface.
  • KNNQKSEPLIGRKKT C-terminal Hepa ⁇ n- A 4 Pi binding domain
  • HSRNSI cell-binding domain
  • KNSFMALYLSKGRLVFALG LG4 module, La-Syndecan 2 minm-alpha 3
  • PPFLMLLKGSTR LG3 domain, laminin 5-A 3 ⁇ i alpha 3-chain
  • IAFQRN LG2 domain, laminin-alpha 1- Aeßi
  • HHLGGAKQAGDV (gamma chain) ⁇ ub ⁇ a
  • CAM Cell Adhesion Molecule
  • Other peptides cyclo (RGDfK) Oysss Q vss
  • a surface (glass) is first activated / hydroxylated and functionalized with allyltriethoxysilane (FIG. 1 a).
  • the unsaturated function serves for subsequent crosslinking with the hydrogel during the polymerization process.
  • the nanostructuring of the hydrogel is done by a transfer process.
  • the nanostructure is first applied to a glass surface by means of a diblock copolymer micelle technique, as already described, and then transferred to the hydrogel using a prophenol or N, IST-bis (acryloyl) cystamine linker.
  • the unsaturated end of the linker serves to form covalent bonds during the polymerization of the hydrogel.
  • the representation of the entire substrate is now carried out by simultaneous transfer of the gold structure and attachment of the hydrogel during the polymerization process.
  • the respective surfaces function as a flow cell (FIG. 1b), whereby the polymer solution can be filled between both surfaces without bubbles.
  • the hydrogel is stored in water, which leads to a water absorption of the gel and to a gentle detachment of the upper glass.
  • Such a PEG hydrogel can also be functionalized in whole or in part with a carboxylic acid. This laterally controlled functionalization of the surface of the gel occurs through a transfer process.
  • a long-chain and polyunsaturated carboxylic acid (fatty acid, eg linolenic acid) is first applied to a hydrophilic glass (FIG. 1c). The unsaturated end of the acid is then cross-linked with the PEG hydrogel during the polymerization process, whereby the carboxylic acid is covalently bonded to the surface of the gel ( Figure Id).
  • Figure 4 clearly shows the exclusive growth of cells on the carboxylic acid functionalized hydrogel side.
  • the unfunctionalized side has a passivating effect on cells.
  • the right panel shows the binding of the fluorescent dye Oregon Green 488 cadaverine by EDC / NHS activation of the carboxyl function.
  • 3T3 fibroblasts were applied to glass substrates containing an array of specific cell ligands, C- (-RGDfK-) -thiol, on gold nanostructures of different distances or a homogeneous surface.
  • These fibroblasts synthesize two different types of fibronectin, which differ in molecular weight.
  • both species are synthesized in almost the same amount.
  • the specification of a nanostructure and its variation can lead to a drastic preference for one or the other type of protein.
  • FIG. 7 shows the gel electrophoresis of the mRNAs which are responsible for the synthesis of the two different fibronectins. The results show a strongly different expression activity for both genes as a function of the distance between the nanostructural regions and thus the cell ligands (58 nm and 73 nm, respectively).
  • Fig. 8 shows a bar graph of the different synthetic activity of mouse osteoblasts with respect to the protein Vinkulin as a function of the structure of the substrate surface over a period of 24 h.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Substrate zur Selektion und spezifischen Beeinflussung der Funktion von Zellen durch deren Adhäsion an Substratoberflächen mit vorgegebenen Eigenschaften. Diese Substrate weisen unterschiedliche Oberflächenbereiche auf, die jeweils eine die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussende Bedingung repräsentieren und diese Bedingungen werden durch eine geometrische Eigenschaft und/oder eine mechanische Eigenschaft oder eine Kombination einer geometrischen Eigenschaft und/oder einer mechanischen Eigenschaft mit einer chemischen Eigenschaft des jeweiligen Oberflächenbereichs bestimmt. Die Erfindung betrifft auch Untersuchungseinrichtungen und Untersuchungsverfahren unter Verwendung dieser Substrate zur Identifizierung und Selektion bestimmter Zelltypen, zur Identifizierung geeigneter Substratbedingungen zur Beeinflussung einer bestimmten Zellfunktion oder bestimmter Zelltypen oder zur Identifizierung von Krankheitszuständen, die durch eine Veränderung des Zelltyps oder der Zellfunktion gekennzeichnet sind.

Description

Substrate zur Selektion und spezifischen Beeinflussung der Funktion von Zellen
Die Erfindung betrifft Verfahren und Substrate zur spezifischen Beeinflussung der Funktion von Zellen durch deren Adhäsion an Substratoberflächen mit vorgegebenen Eigenschaften. Die Erfindung betrifft auch Untersuchungseinrichtungen und
Untersuchungsverfahren unter Verwendung dieser Substrate zur Identifizierung und Selektion bestimmter Zelltypen, zur Identifizierung geeigneter Substratbedingungen zur Beeinflussung einer bestimmten Zellfunktion oder bestimmter Zelltypen oder zur Identifizierung von Krankheitszuständen, die durch eine
Veränderung des Zelltyps oder der Zellfunktion gekennzeichnet sind.
Es ist bekannt, dass das Wachstum und die Entwicklung von biologischen Zellen durch deren räumliches Umfeld in natürlichen Geweben und deren Kontakt mit Signalmolekülen in der extrazellulären Matrix (ECM) wesentlich bestimmt wird. Im Rahmen umfangreicher Forschung auf diesem Gebiet wurde ein große Anzahl solcher Signalmoleküle und entsprechender Rezep- toren verschiedener Zellen untersucht und deren Struktur ermittelt.
Konzepte für den künstlichen Aufbau einer Matrix zur Regulierung von Zellkulturen in vitro basieren sehr häufig auf poly- meren und anorganischen Gerüsten. Im Allgemeinen wird hierbei das Ziel verfolgt, dass das polymere oder anorganische Gerüst einem Zellsystem physikalische Signale für die Zellorientierung, die Zellmigration und das Ausbreiten der Zellen vorgibt. Die Poren des Gerüsts geben dem Zellsystem dabei hin- reichend Platz, um nach einer gewissen Kulturzeit die Gewebestruktur zu definieren. Traditionelle Polymersysteme sind z.B. Polytetrafluorethylen, Silikone oder Polyethylen. Als anorganische Gerüste können z.B. bioaktives Glas, Keramiken oder Calcium-Phosphate eingesetzt werden.
Als Konsequenz der in jüngerer Zeit erhaltenen Erkenntnisse auf dem Gebiet der Signalmoleküle und deren Wechselwirkung mit verschiedenen Zelltypen werden zunehmend Matrices entwi- ekelt, die eine bioaktive Komponente aufweisen. Der Einbau von spezifischen Signalmolekülen, wie z.B. Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, in eine inerte Polymermatrix erlaubt eine sehr viel bessere Kontrolle der Zelladhäsion in Kontakt mit diesen Signalmolekülen (Sakiyama-Elbert und Hu- bell (2001), Annu. Rev. Mater. Res . 31:183-201) .
Von besonderem Interesse sind solche bioaktiven Matrices auf dem Gebiet der Implantattechnik. Dort wird z.B. versucht, eine bessere Integration der Implantate dadurch zu erreichen, dass die Grenzflächen zum Gewebe mit Signalfaktoren funktio- nalisiert werden, um die Besiedlung mit gewünschten Zelltypen in vitro oder in vivo zu fördern.
Die im Stand der Technik bekannten künstlichen Matrices be- rücksichtigen jedoch nur einen Teil der Faktoren, welche unter natürlichen Bedingungen die Wechselwirkung zwischen der extrazellulären Matrix und verschiedenen Zelltypen bestimmen.
Die Kenntnis weiterer Faktoren und Matrixeigenschaften, wel- che die Wechselwirkung mit verschiedenen Zelltypen bestimmen und mittelbar Funktionen dieser Zellen beeinflussen, wäre von großem Nutzen bei der Identifizierung und Selektion bestimmter Zelltypen sowie für Verfahren zur spezifischen Beeinflussung einer oder mehrerer Zellfunktionen von Zielzellen. Eine Aufgabe der vorliegende Erfindung ist somit die Bereitstellung von neuen Verfahren und Werkzeugen, mit denen eine spezifische Beeinflussung der Funktion von Zellen durch deren Adhäsion an Substratoberflächen und/oder die Selektion und Identifizierung bestimmter Zelltypen möglich ist. Eine damit in engem Zusammenhang stehende weitere Aufgabe ist die Identifizierung geeigneter Substratbedingungen zur Beeinflussung einer bestimmten Zellfunktion oder bestimmter Zelltypen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass nicht nur die chemischen Eigenschaften, z.B. Anwesenheit von Zeilliganden und/oder Signalmolekülen, sondern auch die mechanischen Eigenschaften eines Substrats, z.B. die Härte, Festigkeit oder Steifigkeit des Substrats, Ermöglichung einer mechanischen Stimulation von Zellen durch das Substrat, und die geometrischen Eigenschaften, z.B. die räumliche Anordnung von Zellbindungsstellen, eines Substrats nicht nur einen wesentlichen Einfluss auf die Zelladhäsion haben (Discher et al. (2005), Science 320:1139-1143; Arnold et al. (2004), Chemphyschem. 5:383-388) sondern auch in vielen Fällen einen direkten und spezifischen Einfluss auf bestimmte Zellfunktionen von adhärierenden Zellen ausüben.
Ausgehend von diesen Befunden, stellt die vorliegende Erfin- düng zur Lösung der obigen Aufgaben in einem Aspekt Substrate zur Bindung von Zellen gemäß Anspruch 1 bereit, wobei die Substrate unterschiedliche Oberflächenbereiche aufweisen, die jeweils mindestens eine die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussende Bedingung repräsentieren. Durch die Kombi- nation verschiedener für die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion wesentlicher Substratparameter in einem Oberflächenbereich und deren gezielte Variation in anderen Oberflächenbereichen können schnell und effizient geeignete oder optimierte Substratbedingungen für bestimmte Zelltypen oder bestimmte Zellfunktionen identifiziert werden. Auch die schnelle Selektion und Identifizierung bestimmter Zelltypen wird damit möglich. Diese Substrate eignen sich daher besonders für ein Hochdurchsatz-Screening von Zellen, wie z.B. nach Anspruch 35.
In spezielleren Ausführungsformen sind solche Substrate Bestandteil eines Biomaterial-Chips nach Anspruch 19 oder einer Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 21.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der obigen Substrate, Chips und Untersuchungseinrichtungen in verschiedenen, insbesondere medizinischen, Anwendungen nach den Ansprüchen 25-34.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur gezielten Beeinflussung der Proteinsynthese von Zielzellen auf einem Substrat nach Anspruch 36 bereitgestellt, mit dem die Synthese gewünschter Proteine durch die Anordnung von Zeilliganden in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat induziert oder beeinflusst wird.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Selektion und/oder Identifizierung von Zellen nach Anspruch 41 bereitgestellt, bei dem die spezifische Reaktion von Zellen, die sich auf einem Substrat befinden, aufeine mechanische Stimulation aufgezeichnet und ausgewertet wird.
Weitere spezielle und/oder bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Bei den Substraten der vorliegenden Erfindung werden die die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussenden Bedingun- gen typischerweise mindestens durch eine geometrische Eigenschaft und/oder eine mechanische Eigenschaft oder eine Kombi¬ nation einer geometrische Eigenschaft und/oder einer mechanischen Eigenschaft mit einer chemischen Eigenschaft des jewei- ligen Oberflächenbereichs bestimmt. Es ist jedoch durchaus möglich, dass noch weitere Eigenschaften, z.B. der Zeitpunkt und die Zeitdauer des Kontakts zwischen Substrat und Zellen, ebenfalls einen wichtige Rolle bei der Beeinflussung von Zelladhäsion und/oder Zellfunktion spielen können. Beliebige Kombinationen weiterer Eigenschaften mit den vorliegend näher erläuterten chemischen, mechanischen und geometrischen Eigenschaften werden daher ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die chemische Eigenschaft des Substrats wird zunächst durch den molekularen Aufbau des anorganischen oder organischen Substrats bestimmt. Das Substrat kann z.B. Glas, Metall oder ein Kunststoff sein. Auf diesem Basissubstrat können z.B. Nanostrukturbereiche mit einem vorbestimmten Abstand von Nanostrukturen vorgesehen sein. Solche Nanostrukturen werden z.B. durch Aufbringen von Gold-Nanoclustern gewünschter Größ- ße und gewünschter Abstände auf einem Substrat erzeugt. Vorzugsweise wird die chemische Eigenschaft eines gewünschten Oberflächenbereich oder mehrerer Oberflächenbereiche durch die Funktionalisierung des Basissubstrats und/oder der Nanostrukturen mit bestimmten Zeilliganden, insbesondere Molekülen der extrazellulären Matrix (ECM) in natürlichen Geweben oder Fragmenten davon, vorgegeben oder maßgeblich bestimmt.
Eine nicht-beschränkende Auswahl geeigneter Liganden ist im folgenden angegeben. Der Fachmann wird jedoch unschwer erkennen, dass Variationen dieser Moleküle sowie beliebige andere Moleküle mit spezifischen Bindungseigenschaften für bestimmte Zielzellen ebenso eingesetzt werden können. Typischerweise sind die Zellliganden aus Molekülen ausgewählt, die an Zeiladhäsionsrezeptoren (CAM) von Zellen binden. Spezieller handelt es sich um Moleküle, die an Zeiladhäsionsrezeptoren der Gruppen der Cadherine, Immunglobulin- Superfamilie (Ig-CAMS), Selectine und Integrine, insbesondere an Integrine, binden.
Noch spezieller sind die Liganden aus Fibronectin, Laminin, Fibrinogen, Tenascin, VCAM-I, MadCAM-1, Collagen oder einem an Zeiladhäsionsrezeptoren, insbesondere Integrine, spezifisch bindenden Fragment davon oder einem an Zeiladhäsionsrezeptoren spezifisch bindenden Derivat davon ausgewählt.
Eine nicht-beschränkende Auflistung geeigneter spezifisch bindender Aminosäuresequenzen ist in Tab. 1 angegeben.
Die geometrische Eigenschaft des Substrats umfasst typischerweise die Anordnung von Kontaktstellen für die Zellen, insbesondere funktionalisiert mit Zellliganden, in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat.
In einer spezielleren Ausführungsform stellt die Anordnung der Kontaktstellen bzw. Zellliganden eine Nanostruktur dar.
Der Begriff „Nanostruktur", wie hier verwendet, bezeichnet eine Anordnung von nanometergroßen Inseln, im folgenden als „Nanostrukturbereiche" bezeichnet, welche als Kontaktstellen dienen können und mit weiteren Molekülen, z.B. Zelliganden, selektiv belegt sein können. Der Größe der Inseln sollte nicht größer sein als eine abzählbare Menge an Molekülen, die mit der Oberfläche der Zellen wechselwirkt. Anstrebenswert ist die Größe einer Insel, welche nur die Wechselwirkung eines einzelnen Moleküls auf Grund der Größe der Insel ermöglicht. Inseldurchmesser im Bereich kleiner 100 nm, insbeson- dere weniger als 20 nm, z.B. weniger als 10 nm, sind hierbei von besonderem Interesse und werden bevorzugt verwendet.
Zur Herstellung einer gewünschten Topologie muss der Abstand der Inseln in Bereichen zwischen 1 und 1000 Nanometern, insbesondere 1 - 300 nm, z.B. 1 - 200 nm oder vorzugsweise 1 - 100 nm, flexibel und einer Genauigkeit von 1-2 Nanometer einstellbar sein. Auf diese Weise kann z.B. die in entlang von Zellmembranen vorgegebene Längenskala passend bereitgestellt werden (Schlüssel-Loch-Prinzip) , so dass eine selektive Anbindung bestimmter Zellen an den Grenzflächen erreicht werden kann. Diese Anbindung kann eine einfache oder vielfache Anbindung einer einzelnen Zelle beinhalten. Vielfachbindung hat insbesondere in Gegenwart von Strömungen oder, allgemeiner, angelegten äußeren Kräften den Vorteil, die Zellen deutlich stabiler an der Grenzfläche zu halten als durch Einfachbindungen möglich wäre, und erleichtert so gegebenenfalls deren Abtrennung von gemischten Medien.
Zur molekülgenauen Positionierung von Nanostrukturen, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, an beliebig geformten, großflächigen Grenzflächen eignen sich die konventionellen Strukturierungsmethoden für Oberflächen wie Photolithographie und Elektronenstrahllithographie beziehungsweise darauf ba- sierende Strukturierungsmethoden nur bedingt. Dagegen sind
Strukturierungsmethoden auf der Basis von molekularer Selbstorganisation aufgrund der Natur der spontan entstehenden Strukturordnung für die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Nanostrukturen gut geeignet. Besonders vorteilhaft ist hierfür die Technik der Mizellen-Block-Copolymer-Nano- lithographie (R. Glass, M. Möller, J. P. Spatz, Nanotechnology 2003, 14 (10), 1153 - 1160, Arnold, M. Cavalcanti-Adam, R. Glass, J. Blummel, W. Eck, M. Kantlehner, H. Kessler, and J. P. Spatz. (2004) Chemphyschem. 5:383-8, DE 199 52018.6; DE 19747813.1; DE 29747815.8; DE 19747816.6) .
Auf diese Weise können z.B. Gold-Nanocluster gewünschter Grö- ße und gewünschter Abstände auf einem Substrat erzeugt werden. Diese Nanostrukturen sind typischerweise quasihexagonal geordnet. Als Substrat kommen grundsätzlich alle Materialien in Frage, auf denen die gewünschten Nanostrukturen gebildet werden können. Einige geeignete, jedoch nicht beschränkende Beispiele sind Glas-, Siliciumdioxid- und KunststoffOberflächen, einschließlich Hydrogele.
In einer spezielleren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bilden die Nanostrukturbereiche Gradienten von mindes- tens einer der geometrischen (z.B. Abstände und Größe der Bereiche) und chemischen Eigenschaften (z.B. Art der Funktiona- lisierung) . Diese Gradienten können auch durch eine Sequenz von räumlich getrennten Bereichen gebildet werden (siehe Fig. 6) .
In einer typischen Ausführungsform der Erfindung umfasst die die mechanische Eigenschaft die Härte oder Steifigkeit des Substrats und/oder dessen viskose, elastische oder visko- elastische Eigenschaften. Die Härte oder Steifigkeit, ausge- drückt als Young'sches Modul, kann dabei z.B. in einem Bereich von 0,1 kPa bis 100 MPa variiert werden. Alternativ oder zusätzlich kann die mechanische Eigenschaft eine mechanische Stimulation der Zellen durch das Substrat umfassen.
Zur Variation der mechanischen Eigenschaften werden als Basissubstrate z.B. elastische Kunststoffe wie Polydimethylsi- loxan (PDMS) oder Hydrogele, vorzugsweise auf PEO-Basis, besonders bevorzugt Polyethylenglykol-Diacrylat (PEGDA)- Hydrogele) , verwendet. Zur Bereitstellung von unterschiedli- chen Steifigkeiten können unterschiedliche Hydrogele, z.B. Polyethylenglykol-Diacrylat-Hydrogele (PEGDA), verwendet werden. Diese bieten unter Verwendung von PEGs verschiedener Molekulargewichte und unter Einsatz unterschiedlicher Massen- prozente (Konzentrationen) eine breite Spannweite hinsichtlich des Young s sehen Moduls (MPa bis kPa-Bereiche) . Auf diese Basissubstrate können ebenfalls Nanostrukturen wie oben beschrieben übertragen werden (z.B. wie in DE 10 2004 043 908 Al beschrieben) . Diese Gold-Nanostrukturen, welche unter- schiedliche Partikeldichte und somit variierende Partikelabstände (in Form eines Gradienten oder präziser homogener Bereiche) aufweisen können und diesbezüglich gezielt einstellbar sind, dienen nach der Übertragung auf das Hydrogel dort als Bindungsstellen für verschiedene Liganden und/oder funktionelle Gruppen, wie z.B. Thiolgruppen .
Ein prinzipielles Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Substrate auf Hydrogel-Basis wird im Folgenden und in Beispiel 1 näher beschrieben. Für den Fachmann wird jedoch er- sichtlich sein, dass durch Verwendung alternativer Reagenzien, welche dieselbe Funktion erfüllen, und sinnvolle Variation der Reaktionsparameter ebenfalls geeignete Substrate herstellbar sind. In Kenntnis der hier offenbarten allgemeinen technischen Lehre und Beispiele liegen solche Abwandlun- gen im Rahmen der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns und erfordern nicht mehr als Routineversuche.
Bei der Herstellung eines solchen Hydrogel-Substrates wird zur Anbindung des PEG-Hydrogels zunächst eine Oberfläche (z.B. Glas) eines Basissubstrats aktiviert/ hydroxyliert und mit einer Verbindung, die z.B. eine ungesättigte Funktion enthält, z.B. Allyltriethoxysilan (Fig. Ia), funktionali- siert. Hierbei dient die ungesättigte Funktion zur nachfol- genden Vernetzung mit dem Hydrogel während des Polymerisationsprozesses .
Die Nanostrukturierung des Hydrogels wird durch einen Über- tragungsprozess ermöglicht. Hierfür wird die Nanostruktur zunächst mittels einer Diblockcopolymer-Mizelltechnik (z.B. ähnlich wie beschrieben in DE 199 52018.6; DE 19747813.1; DE 29747815.8; DE 19747816.6) auf eine Glasoberfläche aufgebracht und anschließend unter Verwendung eines Linkers, z.B. eines Propenthiol- oder N,NV-Bis (acryloyl) cystamin-Linkers, auf das Hydrogel übertragen. Dabei dient das ungesättigte Ende des Linkers zur Bildung kovalenter Bindungen während der Polymerisation des Hydrogels.
Die Darstellung des gesamten Substrates erfolgt nun durch gleichzeitige Übertragung der Goldstruktur und Anbindung des Hydrogels während des Polymerisationsprozesses. Hierzu fungieren die betreffenden Oberflächen als Flusszelle (Fig. Ib), wodurch die Polymerlösung blasenfrei zwischen beide Oberflä- chen gefüllt werden kann. Nach anschließender Bestrahlung mit UV-Licht, z.B. mit einer Wellenlänge von 365 nm, zur Polymerisation wird das Hydrogel in Wasser gelagert, wodurch es zu einer Wasseraufnahme des Gels und zu einem sanften Ablösen des oberen Glases kommt. Mittels dieser Methode ist es mög- lieh, die verschiedenen Hydrogele auch auf große Flächen (z.B. 8 cm x 12 cm) zu binden.
Durch Verwendung mehrer kleiner Flusszellen mit unterschiedlichen Nanostrukturen lässt sich so ein Substrat herstellen, welches zugleich unterschiedlich feste Hydrogele sowie variierende Goldpartikel-Abstände aufweist. An diese Goldpartikel der nanostrukturierten Hydrogele können nun unterschiedliche Liganden gebunden und somit ein weiterer variabler Parameter hinzugefügt werden. Neben den bisher genannten Parametern kann das PEG-Hydrogel zudem ganz oder partiell mit einer Carbonsäure funktionali- siert werden. Diese lateral kontrollierte Funktionalisierung der Oberfläche des Gels erfolgt durch einen Übertragungspro- zess. Hierzu wird zunächst eine Carbonsäure, vorzugsweise eine langkettige und mehrfach ungesättigte Carbonsäure (Fettsäure, z.B. Linolensäure), auf ein hydrophiles Glas aufgetragen. Dieser Vorgang ist mit einer hohen lateralen Präzision verbunden und ermöglicht eine Funktionalisierung in Form ei- ner Mikrostruktur (Fig. Ic) , die auch auf das Gel übertragen werden kann. Das ungesättigte Ende der Säure wird anschließend während des Polymerisationsprozesses mit dem PEG- Hydrogel vernetzt, wodurch die Carbonsäure kovalent an die Oberfläche des Gels gebunden wird (Fig. Id) .
Diese Funktionalisierung hat ebenfalls erhebliche Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten von Zellen auf dem entspre-' chenden Substrat. Fig. 2 zeigt im linken Feld deutlich das ausschließliche Wachstum der Zellen auf der mit Carbonsäure funktionalisierten Hydrogelseite . Die unfunktionalisierte Seite wirkt passivierend gegenüber Zellen. Im rechten Feld ist die Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffs Oregon Green 488 Cadaverin mittels EDC/NHS-Aktivierung der Carboxylfunktion gezeigt .
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Substrat bereitgestellt, welches mindestens 3 verschiedene Oberflächenbereiche mit mindestens 3 verschiedenen, die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussenden Bedingungen umfasst.
Vorzugsweise zeichnet sich dieses Substrat dadurch aus, dass die mindestens 3 verschiedenen Bedingungen, welche die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussen, die Funktionali- sierung mindestens eines Oberflächenbereichs mit bestimmten Zelliganden, die geometrische Anordung von Zeilliganden in mindestens einem Oberflächenbereich, die Substrathärte oder Substratsteifigkeit in mindestens einem Oberflächenbereich umfassen. Auch eine Kombination von zwei oder mehreren Eigenschaften in einem oder mehreren dieser Oberflächenbereiche ist möglich und in der Regel bevorzugt (Fig. 3) .
Diese Parameter können in präzisen Bereichen des Substrats in unterschiedlichen Kombinationen variiert und für spezielle Anwendungen angepasst werden und umfassen drei der wichtigsten Beobachtungsschwerpunkte in Bezug auf die Beeinflussung adhärenter Zellen.
In einer speziellen Ausführungsform weist das Substrat eine dreidimensionale Struktur auf. Eine solche Struktur kann z.B. eine Röhre bzw. Mikroröhre mit einem Durchmesser von einigen wenigen bis einigen 100 Mikrometern sein. Solche Röhren können aus verschieden Kunstoffen und Hydrogelen, z.B. auf PoIy- ethlenglykol-Basis, aufgebaut sein und auch Nanostrukturen, z.B. hergestellt wie oben beschrieben, aufweisen.
In einer anderen speziellen Ausführungsform sind die unterschiedlichen Oberflächenbereiche des Substrats durch Barrie- ren räumlich von einander getrennt. Beispielsweise können sich die unterschiedlichen Oberflächenbereiche in separaten Kammern des Substrats befinden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Träger, die zwei oder mehr der erfindungsgemäßen Substrate in einer dreidimensionalen Anordnung umfassen. Beispielsweise können zwei gleiche oder unterschiedliche Substrate, welche z.B. unterschiedliche Zeilliganden tragen, gegeneinander gestellt werden. Der optimale Abstand kann z.B. mittels eines Rahmens (z.B. aus Tef- Ion) bestimmter Dicke zwischen den beiden Substraten bereitgestellt werden. Ein Mediumaustausch kann dabei durch das schwache Durchpumpen von neuem Medium vorgenommen werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Biomaterial-Chip, der mindestens ein erfindungsgemäßes Substrat umfasst und aus unterschiedlichen separaten Kammern aufgebaut ist, welche unterschiedliche aber bestimmte, die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussende Bedingungen wie oben erläutert repräsentieren und die abgeschlossene Kultivierung von Zellen in jeder Kammer ermöglichen. Ein solcher Biomaterial-Chip umfasst vorzugsweise mindestens 16 Kammern.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Untersu- chungsvorrichtung, umfassend a) ein Substrat, einen Träger oder einen Biomaterial-Chip wie oben definiert, b) eine Probenaufnahme, in der das Substrat oder der Träger oder Biomaterial-Chip angeordnet ist, c) eine Messeinrichtung zur Erfassung mindestens eines zellspezifischen Analyseparameters und d) eine Auswertungseinrichtung.
Die Messeinrichtung umfasst in der Regel ein direktes oder invertiertes optisches Mikroskop und vorzugsweise eine Einrichtung zur digitalen Bildverarbeitung.
Typischerweise ist der zellspezifische Analyseparameter die Zellanzahl, die Zellform oder die Anwesenheit eines Markers, insbesondere Fluoreszenzmarkers, für beispielsweise Adhäsionsmoleküle oder bestimmte spezifische Proteine, z.B. für die Zelldifferenzierung, oder andere spezifische Moleküle, z.B. Nukleinsäuren oder Membrankomponenten, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Weitere geeignete Parameter werden für den geschulten Fachmann in Abhängigkeit von den untersuchten Zellen und den Kultivierungsbedingungen unschwer ersichtlich und nach Standardverfahren ermittelbar sein.
Die oben beschriebenen Substrate, Biomaterial-Chips oder Untersuchungseinrichtungen können beispielweise zur Identifizierung von geeigneten Substratbedingungen für ein spezifisches Zellsystem oder eine spezifische Zellfunktion eingesetzt werden. In einer speziellen Ausführungsform ist diese spezifische Zellfunktion die Synthese spezifischer Proteine.
Die erfindungsgemäßen Substrate, Chips und Unersuchungsein- richtungen sind besonders für die Durchführung eines Screenings mit hohen Probenzahlen und/oder vielen verschiedenen Substratbedingungen ( „High-through-put-Screening" ; HTS) geeignet. Durch die Kombination verschiedener für die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion wesentlicher Substratparameter in einem oder mehreren Oberflächenbereich (en) und deren gezielte Variation in weiteren Oberflächenbereichen können schnell und effizient geeignete oder optimierte Substratbedingungen für bestimmte Zelltypen oder bestimmte Zellfunktionen identifiziert werden. Auch die schnelle Selektion und Identifizierung bestimmter Zelltypen wird damit möglich.
Die untersuchten Zellen sind weder hinsichtlich Zelltyp noch Art der Spezies beschränkt. Es können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen untersucht werden. Vorzugsweise handelt es sich um Zellen eines Vertebraten, insbesondere eines Säugers, besonders bevorzugt des Menschen. In einer spe- ziellen Ausführungsform sind die untersuchten Zellen Stammzellen oder die davon abgeleiteten differenzierten Zellen.
Die erfindungsgemäßen Substrate, Chips und Untersuchungseinrichtungen haben breite Einsatzmöglichkeiten auf vielen Ge- bieten der Biologie, Biochemie und Medizin, einschließlich der medizinischen Diagnostik. Spezielle Anwendungsgebiete sind z.B. Untersuchungen in der Immunologie und Allergologie. Ein spezielles Beispiel hierfür ist die Identifizierung von Substratbedingungen zur Auslösung allergischer Reaktionen von T- oder Mastzellen.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit betrifft die Förderung oder Untersuchung der selektiven Zellbesiedlung von Grenzflä- chen, insbesondere in der Kardiologie oder Implantattechnik. Das Ergebnis dieser Untersuchung kann z.B. die Identifizierung von geeigneten oder optimierten Matrixeigenschaften für Implantate in unterschiedlichen Körperbereichen, z.B. Knochen, Ohr etc., sein.
Die oben beschriebenen Substrate, Biomaterial-Chips oder Untersuchungseinrichtungen können auch zur Selektion oder Identifizierung von Zellen eingesetzt werden. Eine damit in Zusammenhang stehende Anwendung ist die Identifizierung von Krankheitszuständen, welche durch die Veränderung des Zelltyps gekennzeichnet sind, z.B. Krebs oder Malaria.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflussung der Proteinsynthese von Zielzel- len, umfassend a) Bereitstellen eines Substrats zur Bindung von Zellen an die Oberfläche dieses Substrats, wobei das Substrat mindestens einen Oberflächenbereich aufweist, der mit Zeilliganden, die in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat angeordnet sind, funktionalisiert ist; b) Aufbringen der Zielzellen auf das Substrat; c) Kultivieren der Zielzellen auf dem Substrat, wobei die Synthese gewünschter Proteine durch die Anordnung der Zellli- ganden in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat induziert oder beeinflusst wird.
Dieses Verfahren kann ferner umfassen, dass zusätzlich eine bestimmte mechanische Eigenschaft des funktionalisierten Oberflächenbereichs, welche die Zellfunktion ebenfalls beeinflusst, bereitgestellt wird. Diese mechanische Eigenschaft kann beispielsweise durch Vorgabe einer bestimmten Steifigkeit oder Härte des Substrats oder durch Vorsehen einer mechanischen Stimulation von adhärierenden Zellen bereitge- stellt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung nutzt die bereits erwähnte Erkenntnis, dass verschiedene Zellen sehr unterschiedlich auf eine mechanische Stimulation eines Sub- strats, auf dem sie sich befinden, reagieren. Demgemäß betrifft dieser Aspekt ein Verfahren zur Selektion und/oder Identif zierung von Zahlen, welches umfasst: a) Bereitstellen eines Substrats zur Bindung von Zellen an die Oberfläche dieses Substrats, wobei das Substrat mindes- tens einen Oberflächenbereich aufweist, der eine mechanische Stimulation auf die Zellen ausüben kann; b) Aufbringen der Zielzellen auf das Substrat; c) Mechanische Stimulation der Zielzellen auf dem Substrat; d) Aufzeichnung der Reaktion der Zellen auf die Stimula- tion; e) Auswertung der Reaktion der Zellen und gegebenenfalls Vergleich mit Referenzwerten und dadurch Identifizierung von Zellen eines bestimmten Zelltyps und/oder einer bestimmten Herkunft.
Figurenbeschreibung :
Fig. Ia zeigt schematisch die Funktionalisierung eines Basissubstrats (z.B. Glas) mit Allyltriethoxyethan zur Anbindung eines Hydrogels; Fig. Ib zeigt schematisch die Anbindung des Hydrogels und die Übertragung einer Gold-Nanostruktur auf das Hydrogel;
Fig. Ic zeigt die Mikrostrukturierung eines hdrophilen Glases mit Carbonsäure zur anschließenden Übertragung auf ein Hydro- gel;
Fig. Id zeigt schematisch die Funktionalisierung des angebundenen Hydrogels durch die Carbonsäure.
Fig. 2 zeigt verschiedene an Glas gebundene Hydrogele. Das rechte Feld verdeutlicht die Übertragung der Gold- Nanostruktur mittels „electroless deposition", durch welche die Goldpartikel vergrößert werden.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung einer Kombination von drei variablen Parametern auf einem Substrat mit unterschiedlichen Oberflächenbereichen .
Fig. 4 zeigt einen Vergleich des Wachstums von Zellen auf einem mit Carbonsäure funktionalisierten gegenüber einem unfunktionalisierten Hydrogel.
Fig. 5 zeigt Kontaktwinkelmessungen von Oberflächen mit und ohne Carbonsäurefunktionalisierung.
Fig. 6 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Substrats mit mehreren räumlich getrennten Oberflächenbereichen, bei denen zwei Parameter, nämlich die Art des Liganden (Biomolekül 1-4) und die Abstände zwischen den Liganden systematisch variiert werden. Fig. 7 zeigt die unterschiedliche Syntheseaktivität von 3T3- Fibroblasten bezüglich des Proteins Fibronektin in Abhängigkeit von der Struktur der Substratoberfläche) , nachgewiesen mittels Gelelektrophorese der entsprechenden mRNA. Fig. 8 zeigt ein Balkendiagramm der unterschiedlichen Synthe- seaktivitat von Maus-Osteoblasten bezüglich des Proteins Vinkulin in Abhängigkeit von der Struktur der Substratoberflache.
Tabelle 1
Fibronectin-Peptide
Aminosäuresequenz Rezeptoren Rezeptoren
YRVRVTPKEKTGPMKEM (C-termιnale Hepa- A4Pi rιn-bιndende Domäne)
YEKPGSPPREWPRPRPGV (C-termιnale A4P1
Hepaπn-bindende Domäne)
KNNQKSEPLIGRKKT (C-termιnale Hepaπn- A4Pi bindende Domäne)
DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST (IIICS, A4Pi α4ß7
CS1)
GEEIQIGHIPREDVDYHLYP (IIICS, CS5) A4Pi α4p7
IDAPS (IIICS) A4Pi
LDVPS (IIICS) A4ßi α4p7
WQPPRARI A4ßi
HSRNSI (zellbindende Domäne) α„bß3
ATETTITISWRTKTE (C-termιnale Hepann- α„bß3 bindende Domäne)
PHSRN (Repeat III 9) A5ßi
KLDAPT (Repeat III5) A4Pi α4ß7
EDGIHEL A,ßi α9ßi
Laminin-Peptide
Aminosäuresequenz Rezeptoren Rezeptoren
DYAVLQLHGGRLHFMFDLG (LG4-Modul, A2ßi
Lamιnιn-alpha1 -Kette hEF-1)
KNSFMALYLSKGRLVFALG (LG4-Modul, La- Syndecan 2 minm-alpha 3
PPFLMLLKGSTR (LG3-Domane, Laminin 5- A3ßi alpha 3-Kette)
SIYITRF (LG1-Domäne, Laminin-alpha 1- Aeßi
Kette)
IAFQRN (LG2-Domäne, Laminin- alpha 1- Aeßi
Kette)
YIGSR 67 Kd-Proteιnrezeptor
LGTIPG 67 Kd-Proteιnrezeptor
CSRARKQAASI KVAVSADR 32 Kd Mac 2-Pproteιn, 67 Kd-
Rezeptor
RYWLPRPVCFEKGMNYTVR Heparin
Fibrinogen-Peptide
Aminosäuresequenz Rezeptoren Rezeptoren ganma 190-202 or P1 A|V|ß2 (Mac-1) ganma 228-253 in P1 ganma 377-395 oder P2 AMP2 (Mac-1) ganma 383-395 or P2C / TMKIIPFNRLTIG AMß2 αxß2
HHLGGAKQAGDV (gamma-Kette) αubßa
GPR (Alpha-Kette) Aχß2 ganma 373-385 Q||bß3 Tenascin
Aminosäuresequenz Rezeptoren Rezeptoren
DLXXL Avß6 AEIDGIEL A9P1
Collagen
Aminosäuresequenz Rezeptoren Rezeptoren
GFOGER AiP1 α2ßi
CAM= „Cell Adhesion Molecule" Weitere Peptide: cyclo(RGDfK) Oyßs Qvßs
GRGDS Oyßi. α5ßi
GRGDSP Ml
GRGDNP Ml
RGDSPASSKP Ml
Collagen DGEA A2B1
Von Laminin abgeleitete Peptide (Bindung an Nervenzellen)
CDPGYIGSR ?
IKVAV ?
RNIAEIIKDI ?
YFQRYLI ?
PDSGR ?
Heparin-bindende Sequenz KRSR
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese jedoch darauf zu beschränken. BEISPIEL 1 Herstellung eines Hydrogel-Substrates
Zur Anbindung des PEG-Hydrogels wird zunächst eine Oberfläche (Glas) aktiviert/hydroxyliert und mit Allyltriethoxysilan (Fig. Ia) funktionalisiert . Hierbei dient die ungesättigte Funktion zur nachfolgenden Vernetzung mit dem Hydrogel während des Polymerisationsprozesses.
Die Nanostrukturierung des Hydrogels geschieht durch einen Übertragungsprozess. Hierfür wird die Nanostruktur zunächst mittels einer Diblockcopolymer-Mizelltechnik wie bereits beschrieben auf eine Glasoberfläche aufgebracht und anschließend unter Verwendung eines Propenthiol- oder N, IST- Bis (acryloyl) cystamin-Linkers auf das Hydrogel übertragen. Dabei dient das ungesättigte Ende des Linkers zur Bildung ko- valenter Bindungen während der Polymerisation des Hydrogels.
Die Darstellung des gesamten Substrates erfolgt nun durch gleichzeitige Übertragung der Goldstruktur und Anbindung des Hydrogels während des Polymerisationsprozesses. Hierzu fungieren die betreffenden Oberflächen als Flusszelle (Fig. Ib), wodurch die Polymerlösung blasenfrei zwischen beide Oberflächen gefüllt werden kann. Nach anschließender Bestrahlung mit UV-Licht einer Wellenlänge von 365 nm wird das Hydrogel in Wasser gelagert, wodurch es zu einer Wasseraufnahme des Gels und zu einem sanften Ablösen des oberen Glases kommt.
Durch Verwendung mehrer kleiner Flusszellen mit unterschied- liehen Nanostrukturen lässt sich ein Substrat herstellen, welches zugleich unterschiedlich feste Hydrogele sowie variierende Goldpartikel-Abstände aufweist. An diese Goldpartikel der nanostrukturierten Hydrogele können nun unterschiedliche Liganden gebunden werden. Ein solches PEG-Hydrogel kann ferner ganz oder partiell mit einer Carbonsäure funktionalisiert werden. Diese lateral kontrollierte Funktionalisierung der Oberfläche des Gels erfolgt durch einen Übertragungsprozess . Hierzu wird zunächst eine langkettige und mehrfach ungesättigte Carbonsäure (Fettsäure, z.B. Linolensäure) auf ein hydrophiles Glas aufgetragen (Fig. Ic) . Das ungesättigte Ende der Säure wird anschließend während des Polymerisationsprozesses mit dem PEG-Hydrogel vernetzt, wodurch die Carbonsäure kovalent an die Oberfläche des Gels gebunden wird (Fig. Id) .
Fig. 4 zeigt deutlich das ausschließliche Wachstum der Zellen auf der mit Carbonsäure funktionalisierten Hydrogelseite . Die unfunktionalisierte Seite wirkt passivierend gegenüber Zellen. Das rechte Feld zeigt die Anbindung des Fluoreszenzfarbstoffs Oregon Green 488 Cadaverin mittels EDC/NHS-Aktivierung der Carboxylfunktion.
Des Weiteren wurden die Oberflächeneigenschaften auch mittels Kontaktwinkelmessungen überprüft. Im Rahmen dieser Messungen zeigten die Carbonsäure- funktionalisierten Oberflächen einen deutlich stärkeren hydrophilen Charakter. Eine Tropfenbildung zur Messung der Kontaktwinkel war hier nicht möglich (Fig. 5) .
BEISPIEL 2
Unterschiedliche Syntheseaktivität von 3T3-Fibroblasten bezüglich des Proteins Fibronektin in Abhängigkeit von der Struktur der Substratoberfläche
3T3-Fibroblasten wurden auf Glas-Substrate aufgebracht, die eine Anordnung von spezifischen Zelliganden, C- (-RGDfK- )- thiol, auf Gold-Nanostrukturen unterschiedlicher Abstände aufwiesen oder eine homogene Oberfläche. Diese Fibroblasten synthetisieren zwei verschiedene Fibronektinarten, welche sich im Molekulargewicht unterscheiden. Auf einer homogenen Oberfläche werden beide Arten in nahezu gleicher Menge syn- thetisiert. Dagegen kann die Vorgabe einer Nanostruktur und deren Variation zu einer drastischen Bevorzugung der einen oder anderen Proteinart führen. Fig. 7 zeigt die Gelektropho- rese der mRNAs, welche für die Synthese der beiden unterschiedlichen Fibronektine verantwortlich sind. Die Ergebnisse belegen eine stark unterschiedliche Expressionsaktivität für beide Gene in Abhängigkeit vom Abstand der Nanostrukturberei- che und damit der Zelliganden (58 nm bzw. 73 nm) .
BEISPIEL 3 unterschiedliche Syntheseaktivität von Maus-Osteoblasten bezüglich des Proteins Vinkulin in Abhängigkeit von der Struktur der Substratoberfläche
Maus-Osteoblasten wurden auf Glas-Substrate aufgebracht, die eine Anordnung von spezifischen Zelliganden, C- (-RGDfK- )- thiol, auf Gold-Nanostrukturen unterschiedlicher Abstände aufwiesen oder eine homogene Oberfläche. Der Umfang und der Zeitverlauf der Synthese des Proteins Vinkulin ist stark abhängig von der Wahl der Nanostruktur (Abstand 58 nm gegen 73 nm) .
Fig. 8 zeigt ein Balkendiagramm der unterschiedlichen Syntheseaktivität von Maus-Osteoblasten bezüglich des Proteins Vinkulin in Abhängigkeit von der Struktur der Substratoberfläche über einen Zeitraum von 24 h.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Substrat zur Bindung von Zellen an die Oberfläche dieses Substrats, wobei das Substrat unterschiedliche Oberflä- chenbereiche aufweist, die jeweils eine die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussende Bedingung repräsentieren und diese Bedingungen durch eine geometrische Eigenschaft und/oder eine mechanische Eigenschaft oder eine Kombination einer geometrischen Eigenschaft und/oder einer mechanischen Eigenschaft mit einer chemischen Eigenschaft des jeweiligen Oberflächenbereichs bestimmt werden.
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geometrische Eigenschaft die Anordnung von Zellli- ganden in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat um- fasst .
3. Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung der Zelliganden eine Nanostruktur darstellt.
4. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanische Eigenschaft die Härte oder Steifigkeit des Substrats, gemessen als Young'sches Modul, umfasst.
5. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanische Eigenschaft eine mechanische Stimulation der Zellen umfasst.
6. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Eigenschaft die Funktionalisierung eines Oberflächenbereichs mit be- stimmten Zeilliganden, insbesondere Molekülen der extrazellulären Matrix (ECM) in natürlichen Geweben oder Fragmenten davon, umfasst.
7. Substrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelliganden aus Molekülen, die an Zeiladhäsionsrezeptoren (CAM) von Zellen binden, ausgewählt sind.
8. Substrat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeilliganden aus Molekülen, die an Zelladhäsions- rezeptoren der Gruppen der Cadherine, Immunglobulin- Superfamilie ( Ig-CAMS) , Selectine und Integrine, insbesondere an Integrine, binden, ausgewählt sind.
9. Substrat nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeilliganden aus Fibronectin, Lami- nin, Fibrinogen, Tenascin, VCAM-I, MadCAM-1, Collagen oder einem an Zelladhäsionsrezeptoren spezifisch bindenden Fragment davon, insbesondere einem Fragment mit ei- ner in Tab. 1 angegebenen Aminosäuresequenz, oder einem an Zelladhäsionsrezeptoren spezifisch bindenden Derivat davon ausgewählt sind.
10. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-9, da- durch gekennzeichnet, dass das Substrat mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, verschiedene Oberflächenbereiche mit mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, verschiedenen, die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussenden Bedingungen umfasst.
11. Substrat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens 3 verschiedenen Bedingungen, welche die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussen, die Funktionalisierung mindestens eines Oberflächenbereichs mit bestimmten Zeilliganden, die geometrische Anordung von Zeilliganden in mindestens einem Oberflächenbereich, und die Substratsteifigkeit in mindestens einem Oberflächenbereich umfassen.
12. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dreidimensionale Struktur aufweist.
13. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Oberflächenbereiche durch Barrieren räumlich von einander getrennt sind.
14. Substrat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich die unterschiedlichen Oberflächenbereiche in separaten Kammern des Substrats befinden.
15. Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Oberflächenbereich (e) ein Hydrogel, vorzugsweise ein Polye- thenglykol-Diacrylat- (PEGDA) -Hydrogel, vorgegebener Steifigkeit umfasst/en.
16. Substrat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sich auf dem Hydrogel Gold-Nanostrukturen mit vorbestimmten Partikelabständen als Bindungsstellen für ZeIl- liganden befinden.
17. Träger, umfassend zwei oder mehr Substrate nach mindesten einem der Ansprüche 1 bis 16 in einer dreidimensionalen Anordnung.
18. Träger nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, das die Substrate räumlich von einander getrennt sind.
19. Biomaterial-Chip, umfassend mindestens ein Substrat nach mindestens einem der Ansprüche 1-16 und aufgebaut aus unterschiedlichen separaten Kammern, welche unterschiedliche aber bestimmte, die Zelladhäsion und/oder Zellfunktion beeinflussende Bedingungen repräsentieren und die abgeschlossene Kultivierung von Zellen in jeder Kammer ermöglichen.
20. Biomaterial-Chip nach Anspruch 19, umfassend mindestens 16 Kammern.
21. Untersuchungsvorrichtung, umfassend a) ein Substrat nach einem der Ansprüche 1-16, einen Träger nach Anspruch 17 oder 18 oder einen Biomaterial-Chip nach Anspruch 19 oder 20, b) eine Probenaufnahme, in der das Substrat oder der Träger oder Biomaterial-Chip angeordnet ist, c) eine Messeinrichtung zur Erfassung mindestens eines zellspezifischen Analyseparameters und d) eine Auswertungseinrichtung.
22. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, das die Messeinrichtung ein direktes oder invertiertes optisches Mikroskop umfasst.
23. Untersuchungseinrichtung nach Anspruch 21 oder 22, da- durch gekennzeichnet, dass die Messeinrichtung eine Einrichtung zur digitalen Bildverarbeitung umfasst.
23.
24. Untersuchungseinrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 21-23, dadurch gekennzeichnet, das der zellspe- zifische Analyseparameter die Zellanzahl, die Zellform oder die Anwesenheit eines Markers, insbesondere Fluo- reszenzmarkers, für Adhäsionsmoleküle oder die Zelldifferenzierung darstellt.
25. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Iden- tifizierung von geeigneten Substratbedingungen für ein spezifisches Zellsystem oder eine spezifische Zellfunktion.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, das die spezifische Zellfunktion die Synthese spezifischer
Proteine ist.
27. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellsystem Stammzellen umfasst oder die ZeIl- funktion eine Stammzellfunktion ist.
28. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Substratbedingungen zur Auslösung allergischer Reaktionen von T- oder Mastzellen identifiziert werden.
29. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Identifizierung von geeigneten Matrixeigenschaften für Implantate in unterschiedlichen Körperbereichen.
30. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Se¬ lektion oder Identifizierung von Zellen.
31. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Identifizierung von Krankheitszuständen, welche durch die Veränderung des Zelltyps gekennzeichnet sind.
32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Krankheitszustand Krebs oder Malaria ist.
33. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 für Untersuchungen in der Immunologie und Allergologie.
34. Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur För- derung oder Untersuchung der selektiven Zellbesiedlung von Grenzflächen, insbesondere in der Kardiologie oder Implantattechnik.
35. Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Zellen unter Verwendung des Substrats nach einem der Ansprüche 1-16, des Trägers nach Anspruch 17 oder 18, des Biomaterial- Chips nach Anspruch 19 oder 20 oder der Untersuchungseinrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24.
36. Verfahren zur Beeinflussung der Proteinsynthese von Zielzellen, umfassend a) Bereitstellen eines Substrats zur Bindung von Zellen an die Oberfläche dieses Substrats, wobei das Sub- strat mindestens einen Oberflächenbereich aufweist, der mit Zelliganden wie in den Ansprüchen 6 bis 9 an¬ gegeben, die in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat angeordnet sind, funktionalisiert ist; b) Aufbringen der Zielzellen auf das Substrat; c) Kultivieren der Zielzellen auf dem Substrat, wobei die Synthese gewünschter Proteine durch die Anordnung der Zellliganden in vorbestimmten Abständen auf dem Substrat induziert oder beeinflusst wird.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass ferner eine bestimmte mechanische Eigenschaft des funk- tionalisierten Oberflächenbereichs, welche die Zellfunktion ebenfalls beeinflusst, bereitgestellt wird.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, das die mechanische Eigenschaft durch Vorgabe einer bestimmten Steifigkeit oder Härte des Substrats oder durch Vorsehen einer mechanischen Stimulation von adhärierenden Zellen bereitgestellt wird.
39. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16 ist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Stammzellen sind.
41. Verfahren zur Selektion und/oder Identifzierung von Zellen, umfassend a) Bereitstellen eines Substrats zur Bindung von Zellen an die Oberfläche dieses Substrats, wobei das Sub- strat mindestens einen Oberflächenbereich aufweist, der eine mechanische Stimulation auf die Zellen ausüben kann; b) Aufbringen der Zielzellen auf das Substrat; c) Mechanische Stimulation der Zielzellen auf dem Sub- strat; d) Aufzeichnung der Reaktion der Zellen auf die Stimulation; e) Auswertung der Reaktion der Zellen und gegebenenfalls Vergleich mit Referenzwerten und dadurch Identifi- zierung von Zellen eines bestimmten Zelltyps und/oder einer bestimmten Herkunft.
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