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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums.
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In
der Biologie werden Zellkompartimente, die die Fähigkeit
besitzen, sich mit Gehirnzellen zu verbinden, Neuriten genannt.
Im Nachfolgenden bezeichnet ein Neurit folgendes:
Neuriten,
Axonen, Dendriten, intermediäre Segmente, terminale Segmente,
Filipoden und/oder Wachstumskegel. Der Begriff ”neurale
Zelle” umfasst die Vielfalt der Gehirnzellen von Menschen,
Mäusen und anderen Säugetieren.
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Die
funktionelle Integrität des Nervensystems ist einerseits
durch verschiedene Typen von Nervenzellen (z. B. Neuronen, Glia-Zellen)
und andererseits durch die Interaktion zwischen diesen verschiedenen
Gehirnzellen garantiert. Die strukturelle und funktionelle Grundlage
dieser Zusammenschaltung sind Axone und Dendriten, welche die Informationen
von einem Neuron zum anderen transportieren. Diese Netzwerke oder
Schaltungen sind hochadaptiv und sowohl im sich entwickelnden Gehirn
als auch im erwachsenen Gehirn werden fast kontinuierlich neue Synapsenverbindungen
durch Axons und Dendriten angelegt. Fremdstoffe, wie Umweltchemikalien,
Arzneimittel, chemische Arbeitsstoffe oder Drogen, können
den Prozess der Zusammenschaltung entweder fördern (Neurogeneration)
oder hemmen (Neurotoxizität). In verschiedenen Forschungszweigen
(Medikamentenentwicklung, Regulationstoxikologie) werden verlässliche
Werkzeuge und Auswahlprüfverfahren benötigt, um
solche Effekte in einer standardisierten Umgebung zu detektieren.
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Dabei
spielt die Analyse des Neuritenwachstums eine wichti ge Rolle. Sogenannte ”neurite
outgrowth assays” erfassen die Ausbildung von neuronalen
Verbindungen durch Axone und Dendriten (zusammen als Neuriten bezeichnet).
Diese Messverfahren werden vielfältig eingesetzt, da sie
einfach zu handhaben sind und zu relativ geringen Materialkosten
führen.
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Das
Neuritenwachstum kann anhand der Anzahl von Verbindungen zwischen
den Zellen, der Neuritenwachstumsrate oder der Länge der
Neuriten zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen werden. Aus diesen
Messungen kann dann ein Neuritenwachstumsindex ermittelt werden.
Für die effiziente Entwicklung von der chemischen Leitstruktur
(lead) zum Arzneimittel (drug-lead-discovery) können diese Verfahren
durch den Einsatz von Robotertechnik und Mikrotiterplatten parallel
genutzt und so die Produkte im Hochdurchsatzverfahren untersucht
werden.
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Bei
den bisher bekannten Verfahren werden die Zellen zufällig
und dicht kultiviert, wodurch hochspezifische Färbungen
nötig sind, um die Neuritenverbindungen sichtbar zu machen.
So ist beispielsweise ein selektiver Neuritenmarker (teurer Antikörper)
verfügbar und die Firma Millipore Corporation, Massachussats,
USA vertreibt ein sogenanntes ”Assay-Kit”, das
Neuriten markiert, um sie mittels automatisierter Bildverarbeitung
in einem Hochdurchsatzverfahren zu analysieren. Bei diesen Techniken
variiert der Abstand zwischen benachbarten Zellen stark. Einerseits
sind die Zellen, die sich berühren, zu dicht beieinander,
andererseits sind Zellen durch große Distanzen voneinander
getrennt, so dass unterschiedliche Gradienten für lösliche
Faktoren vorliegen, die das Neuritenwachstum regulieren. Diese Distanzunterschiede
erschweren es, substanzinduzierte Verhaltensänderungen
der Zellen zu erkennen. Um diese Probleme zu bewältigen,
sind umfangreiche Bilderfassungen in Kombination mit Mustererkennungsalgorithmen
und statistische Prozeduren notwendig. Diese Verfahren bedürfen
eines großen Aufwandes und können ggf. dazu führen,
das wesentliche Effekte im Verhalten der interagierenden Zellen übersehen
werden, die zusätzlichen Aufschluss über die Wirkung
der Testsubstanz geben könnten. Ein Verfahren der vorbeschriebenen
Art ist z. B. aus
DE
600 23 905 T2 bekannt.
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Aufgabe
der Erfindung ist es demgegenüber, eine einfache aber effektive
Möglichkeit zu schaffen, die Neuritenbildung bzw. das Neuritenwachstum
zu analysieren.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums
gelöst, bei welchem ein Substrat mit einem Rastermuster
bereitgestellt wird, welches erste Bereiche aufweist, auf denen
sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können,
wobei die ersten Bereiche jeweils von zweiten Bereichen umgeben
sind, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen
nicht anlagern können, wobei Neuronen oder neuronenähnliche
Zellen auf den ersten Bereichen des Substrates angelagert werden
und anschließend die Neuronen oder neuronenähnlichen
Zellen einer oder mehreren oder keiner Testsubstanz(en) ausgesetzt
werden und während dessen und/oder danach die Neuritenauswüchse
aus den Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen analysiert
werden.
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Die
Erfindung basiert auf der Anwendung von Zell-Patterning-Techniken,
um ein räumlich standardisiertes Assay für die
Messung des Neuritenwachstums während des Einwirkens von
Testsubstanzen zu liefern. Dazu werden Substrate verwendet, die
ein Rastermuster mit ersten und zweiten Bereichen aufweisen, wobei
die ersten Bereiche Anlagerungsorte für die Neuronen oder
neuronenähnlichen Zellen bilden und die diese ersten Bereiche
umgebenden zweiten Bereiche so ausgebildet sind, dass eine Anlagerung
von Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen nicht möglicht
ist.
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Dabei
wird bevorzugt jeweils ein Substrat verwendet, welches erste Bereiche
mit standardisierter Größe und Position aufweist,
wobei besonders bevorzugt die ersten Bereiche äquidistant
voneinander beabstandet sind. Durch diese Ausgestaltung sind die
Abstände zwischen benachbarten Zellen einheitlich. Daraus
ergeben sich zwei große Vorteile:
Zum einen entstehen
homogene Gradienten löslicher Faktoren, die in die Formierung
der Neuritenauswüchse involviert sind, und zum anderen
können Neuritenauswüchse ohne Markierungsschritte
beobachtet werden. Um statistisch abgesicherte Ergebnisse zu erhalten,
muss eine große Anzahl von Nervenzellen und deren Neuritenauswüchse
gemessen werden. Zell-Patterning-Techniken eignen sich für dieses
Problem, indem sie hochparallele Testsysteme in der Form von Substraten
mit einem Rastermuster (Zell-Arrays) mit hunderten von Stellen für
die selektive Anlagerung von Neuronen zur Verfügung stellen.
Jede dieser Stellen (erste Bereiche) kann eine oder mehrere Nervenzellen
enthalten, wobei die Verbindung zwischen ersten Bereichen und nicht
die Verbindung innerhalb erster Bereiche den Gegenstand der Messung
darstellt.
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Bevorzugt
sind dabei die ersten Bereiche in einem hexagonalen Muster angeordnet,
um gleiche Distanzen zwischen allen benachbarten Zellanlagerungsstellen
(ersten Bereichen) bereitzustellen. Alternativ können die
ersten Bereiche auch in einem linearen Muster angeordnet sein. Die
ersten Bereiche sind bevorzugt rund ausgebildet und weisen einen Durchmesser
zwischen 20 bis 200 μm auf. Dabei sind die ersten Bereiche
bevorzugt in einem Abstand zwischen 50 bis 1.000 μm voneinander
getrennt.
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Bevorzugt
werden Substrate verwendet, bei dem benachbarte erste Bereiche durch
Pfade miteinander verbunden sind, an denen sich Neuronen und neuronenähnliche
Zellen anlagern können, wobei die Breite dieser Pfade bevorzugt
zwischen 100 nm und 5 μm liegt.
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Die
Erfindung stellt ein neues Protokoll für die Messung des
Neuritenwachstums zur Verfügung:
Die Zellen werden
zunächst in einem Rastermuster auf ein Substrat angeordnet
und nach einer Zeit werden die Neuritenauswüchse durch
eine Auswahl von möglichen Methoden inklusive der Anzahl
der Neuritenauswüchse pro lebensfähige Zelle,
Anzahl der Neuritenauswüchse und/oder der Neuritenwachstumsraten
gemessen. Zellmuster können mit oder ohne eine oder mehrere
Testsubstanzen behandelt werden. Wenn die Zellmuster nicht einer
Testsubstanz ausgesetzt werden, liefert dies eine experimentelle
Kontrolle für die Bestimmung des relativen Effektes einer
oder mehrerer interessierender Substanzen.
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Bevorzugt
werden Substrate verwendet, bei dem die ersten Bereiche eines oder
mehrere der folgenden Materialien enthalten:
Zell-Adhäsions-Proteine,
Laminin, Fibronectin, Kollagen und Vitronecitin, Peptid-Sequenzen,
Poly-Lysin, hydrophiles Polystyren, Glas, aminierte Oberflächen, hydrophiles
Poly-Dimethylsiloxan (PDMS).
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Selbstverständlich
sind auch andere Materialien geeignet, die für eine Zellanlagerung
benutzt werden können.
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Hinsichtlich
der zweiten Bereiche, die eine Anlagerung von Zellen verhindern,
werden vorzugsweise folgende Materialien verwendet:
Polyethylen-Glycol,
Polyethylenoxid, Agarose, Albumin, hydrophobes Poly-Dimethylsiloxan
(PDMS) und Poly-Acrylamid.
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Ferner
können auch andere Materialien verwendet werden, die eine
Zellanlagerung verhindern oder zumindest unterdrücken.
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Die
ersten Bereiche des jeweiligen Substrates sind bevorzugt hydrophil
und die zweiten Bereiche bevorzugt hydrophob ausgebildet.
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Ferner
können die ersten Bereiche eine freiliegende Fläche
des betreffenden Substrates sein, welches selbst ein Standardgewebekultursubstrat
ist einschließlich Polystyren, Polypropylen und Glas. Dabei
können zellabweisende PDMS als dünnes Filmmuster
auf Standardgewebekultursubstraten einschließlich Polystyren,
Polypropylen und Glas gedruckt oder geprägt sein.
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Ganz
besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen
Zellen ohne Fixation und Markierung auf dem Substrat angelagert
und nachfolgend analysiert werden. Diese Verfahrensführung
bietet eine besonders einfache, aber effektive Möglichkeit,
das Neuritenwachstum zu bestimmen.
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In
bestimmten Fällen kann alternativ aber auch vorgesehen
sein, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen mittels
Standardmethoden am Substrat fixiert werden und/oder dass die Neuronen oder
neuronenähnlichen Zellen ganz oder teilweise markiert werden.
Zu diesen Standardfixiermethoden gehören z. B. Formaldehyd
und Glutaraldehydmethoden, die Markierung kann z. B. mit Giemsa
oder anderen Gesamtzellfarbstoffen erfolgen. Dabei können
Teile der Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen markiert
werden einschließlich ihrer Zellkerne, ihres Cytoskeletts
oder anderer cellulärer Kompartimente, ihrer Neuritenauswüchse
oder Teile ihrer Neuritenauswüchse.
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Die
Markierungen können fluoreszent sein, wobei DAPI für
die Zellkerneinfärbung, Phalloidin für die Actin-Anfärbung
und fluoreszente Moleküle oder Partikel, welche an Antikörper
oder Aptamere gebunden sind, verwendet werden können.
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Das
Neuritenwachstum kann durch eine oder mehrere der folgenden Messungen
analysiert werden:
Anzahl der Neuriten, Anzahl der lebensfähigen
Neuriten, Anzahl der Neuriten besitzenden Zellen, Anzahl der Neuriten
pro Zelle, Neuritenlänge, Neuritenwachstumsrate, Neuritenverzweigung,
Anzahl Neuriten pro lebensfähiger Zelle.
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Die
Messungen des Neuritenwachstums können kontinuierlich,
periodisch oder am Ende der Expositionszeitdauer der Testsubstanz
durchgeführt werden.
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Das
jeweilige Substrat kann in einer Kammer für Standardgewebekulturen
oder Molekularanalysen angeordnet werden einschließlich
6-, 12-, 24-, 96-, 384-, 1.536-Well-Plates.
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Dabei
kann die Kammer selbst mit dem Substrat entsprechenden ersten Bereichen
und zweiten Bereichen zur Anlagerung oder Nichtanlagerung von Neuronen
oder neuronenähnlichen Zellen versehen werden.
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Das
Zuführen oder Entfernen von Flüssigkeiten und
insbesondere Testsubstanzen kann mittels Pipetten, automatisierter
Systeme zur Handhabung von Flüssigkeiten oder mikrofluidischen
Systemen erfolgen.
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Die
Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher
erläutert. Diese zeigt jeweils in stark vergrößerter
schematischer Darstellung in
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1 ein
Substrat mit hexagonaler Anordnung der zur Anlagerung von Zellen
geeigneten ersten Bereiche,
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2 ein
der 1 ähnliches Substrat mit durch Pfade
miteinander verbundenen ersten Bereichen,
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3a bis 3c einen
Verfahrensablauf zur Herstellung eines Substrates durch Mikrokontaktdrucken,
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4a bis 4c einen
Verfahrensablauf zur Herstellung eines Substrates durch Prägetechnik,
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5 ein
Substrat mit hexagonaler Anordnung der ersten Bereiche, wobei jeder
erste Bereich eine Neuronenzelle enthält und in
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6 das
Substrat nach 5 mit beispielhafter Darstellung
des Neuritenwachstums.
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In
den 1 und 2 sind zwei verschiedene Substrattypen
dargestellt, die sich für die Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens als besonders geeignet
herausgestellt haben.
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In 1 ist
ein Substrat dargestellt, welches mit 1 bezeichnete erste
Bereiche aufweist, die hexagonal angeordnet sind. Diese ersten Bereiche 1 sind so
beschaffen, dass sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen
auf diesen anlagern können. Diese ersten Bereiche 1 weisen
aufgrund der hexagonalen Anordnung einen äquidistanten
Abstand auf und sind vorzugsweise rund ausgebildet. Sie haben beispielsweise
einen Durchmesser zwischen 20 bis 200 μm und sind in einem
Abstand von 50 bis 1.000 μm voneinander angeordnet. Die
ersten Bereiche 1 sind von zweiten Bereichen 2 umgeben,
die den Hintergrund bzw. die Substratgrundfläche bilden.
Diese zweiten Bereiche 2 sind so beschaffen, dass sich
auf ihnen Neuronen und neuronenähnliche Zellen nicht anlagern
können.
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In 2 ist
ein Substrat dargestellt, das grundsätzlich demjenigen
nach 1 entspricht, d. h. es sind hexagonal angeordnete
erste Bereiche 1 vorgesehen, welche von zweiten Bereichen 2,
d. h. der Substratgrundfläche umgeben sind. Zusätzlich sind
benachbarte erste Bereiche 1 durch Pfade 3 miteinander
verbunden, an denen sich Neuronen und neuronenähnliche
Zellen anlagern können. Die Breite dieser Pfade 3 liegt
zwischen 100 nm und 5 μm.
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Es
versteht sich von selbst, dass auf einem Substrat eine Vielzahl
von ersten Bereichen 1 und 2 vorgesehen sind.
In den 1 und 2 ist beispielhaft jeweils nur
eine einzige hexagonale Anordnung gezeigt.
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Zur
Herstellung eines solchen Substrates gibt es grundsätzlich
verschiedenste Möglichkeiten. In der 3 ist
eine erste Verfahrensabfolge dargestellt, nämlich der Prozess
des Mikrokontaktdruckens für die Anordnung von Mustern
aus dünnem PDMS. Dazu wird ein Stempel 4 mit einem
dünnen PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 kontaktiert,
der auf einem ebenen Substrat, z. B. Glassubstrat 6, angeordnet
ist (3a).
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Der
Stempel 4, der anschließend mit dem PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 benetzt
ist, wird abgehoben und mit einem Zellkultursubstrat 7 kontaktiert,
um den PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 auf das Substrat 7 zu übertragen
(3b).
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Nachfolgend
wird der Stempel 4 entfernt und das so auf dem Zellkultursubstrat 7 erzeugte
Muster (zweite Bereiche aus PDMS) wird thermisch gehärtet (3c).
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Somit
werden gemäß 3 zellabstoßende hydrophobe
Materialien auf hydrophilen Substraten, wie Glas oder Polysteren,
gedruckt, auf denen Zellen SiO gewöhnlich anlagern und
wachsen können. Dazu wurde flüssiges PDMS in Chloroform
(1:0, m/m) gelöst, ein Volumen von 500 μl auf
das Glassubstrat 6 gegeben und bei 6.000 U/min für
30 s aufgeschleudert. Nach dem Verdunsten des Chloroform bleibt
eine gleichförmige PDMS-Filmschicht 5 zurück.
Die Benutzung des Stempels 4 mit dem flüssigen
PDMS-Film 5 wurde durch einen Kontakt des Stempels 4 mit
dem dünnen Film 5 für maximal 10 s erreicht.
Der benetzte Stempel 4 wurde dann benutzt, um den PDMS-Film 5 auf
Substrate 7 aus Glas oder Polysteren der Güteklasse/Gewebekultur
für maximal 10 s zu drucken. Danach folgte ein Härtungsschritt
bei 70°C für etwa 30 min, um das Dünnfilmmuster(Substrat)
zu erzeugen.
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Für
eine Musterung in höherer Auflösung entfernt man überflüssiges
PDMS durch einen ersten Kontaktdruck für maximal 10 s auf
einen sogenannten ”Opfer”-Glasträger,
gefolgt von einem zweiten Druckschritt, wiederum für maximal
10 s auf das Zellkultursubstrat 7. Eine hexagonale Anordnung
erster Bereiche 1 auf dem Substrat mit gleichmäßig
verteilten runden ersten Bereichen mit typischen Durchmessern von
70 μm und Abständen von 100 μm zwischen
den einzelnen Stellen kann so erreicht werden.
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Als
Alternative zum Mikrokontaktdrucken kann eine in 4a bis
c dargestellte Prägetechnik verwendet werden. Zunächst
wird, wie beim Drucken (3), ein dünner Film
aus PDMS 8 durch Aufschleudern oder ähnliches
auf ein Substrat 9 aus Glas oder Polysteren abgeschieden.
Das Substrat wird dann auf einer Wärmeplatte bei ca. 70°C
platziert und ein Stempel 10 wird gegen das Substrat für etwa
1 min gepresst (Druck 0,15 Nmm–2)
und danach entfernt (4b). Darauf folgt
ein weiterer Schritt für das thermische Härten
(etwa 10 min). Dies ist in 4c dargestellt.
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Die
Zellen wurden auf ein Substrat gemäß 1,
hergestellt entweder nach dem Verfahren gemäß 3 oder
nach 4 in einem Serum-Protein enthaltenden Medium geimpft
und über Nacht inkubiert. Nach dem Austausch des Mediums
verbleiben adhärente Zellen als Muster an den frei liegenden Regionen
des zugrundeliegenden Substrates angelagert. Um die Erfindung zu
veranschaulichen wurden menschliche SH-SY5Y Neuroblastoma-Zellen benutzt
und vor der Anlagerung auf dem Substrat durch Kultivierung in Trans-Retinolsäure
für drei Tage in neuronenähnliche Zellen differenziert.
Dadurch wurde für das Experiment ein zusätzlicher
Vorteil durch die Synchronisierung der Zellen erreicht. Die Neuronenmuster
wurden kultiviert, während dessen es zum Neuritenwachstum
kam, was wiederum zu Verbindungen zwischen den Neuronen benachbarter erster
Bereiche (Anlagerungsstellen) führte.
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5 zeigt
die Anordnung bzw. Anlagerung der neuronenähnlichen Zellen
auf einem Substrat mit hexagonaler Anordnung der ersten Bereiche 1.
Dabei sind die neuronenähnlichen Zellen mit Z bezeichnet.
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In 6 sind
die die neuronenähnlichen Zellen Z verbindenden Neuritenauswüchse
bzw. Verbindungen dargestellt und mit V bezeichnet.
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Die
so auf einem Substrat angeordneten Neuronen bzw. neuronenähnlichen
Zellen können verwendet werden, um Substanzeffekte auf
das Wachstum von Neuriten zu untersuchen. Modellsubstanzen können
verwendet werden, um die Eignung der Neuronenmuster für
die Messung von erhöhten und verminderten Wachstumsraten
zu bewerten. Z. B. verstärkt der Nervenwachstumsfaktor
(nerve growth factor, NGF) das Neuritenwachstum, während Acrylamid
es unterdrückt. Die Experimente beinhalten das Patterning
von Neuronen gefolgt von der Kultivierung in Anwesenheit von interessierenden
Substanzen. Parallel dazu wurden Neuronenmuster im normalen Medium
ohne diese Substanzen kultiviert, um eine Kontrolle zu liefern.
Nach einer Kultivierungszeit von z. B. zwei Tagen wurden die Neuritenauswüchse
gemessen (z. B. Anzahl der Neuriten besitzenden Neuronen und/oder
die Anzahl der Neuriten pro Neuronen). Die Messungen wurden mittels der
Phasenkontrastmikroskopie durchgeführt, z. B. mit einem
inversen Mikroskop IX 71 der Firma Olympus. Durch Vergleich mit
der Kontrollprobe können die toxischen oder fördernden
Effekte bestimmt werden. Darüber hinaus können
Neuronenmuster, die erwünschten Konzentrationen der toxischen
oder fördernden Modellsubstanzen ausgesetzt werden, die als
negative bzw. positive Kontrollen dienen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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