CN117535150A - 一种2d微型培养芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种2D微型培养芯片及其制备方法和应用，所述培养芯片包括亲疏水图案化基底和培养液，所述亲疏水图案化基底上排布有亲水区，亲水区外围由疏水区域包围，所述亲水区包括细胞区和细胞间交流区；所述细胞区包括若干亲水点，所述细胞间交流区包括若干细胞通道，所述细胞通道用于连通不同的亲水点。本发明采用的2D微型培养芯片的图案化亲/疏水区协同富集作用，富集效果好，细胞生长率和存活率高，克服了单一亲水区域液滴大面积聚集、单一疏水区域液滴成核密度低等缺点。

Description

一种2D微型培养芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种2D微型培养芯片及其制备方法与应用。
背景技术
亲疏水图案化表面的制作作为微流控领域一种常见的研究课题，近些年得到了快速的发展和广泛的应用。图案化基底表面的亲疏水区域之间存在张力差，这使得液滴在张力的作用下自发地从疏水区域流到亲水区域形成微液滴。在自组装液滴微阵列、水收集、形状可控的图案化液体阵列、细胞阵列、水凝胶阵列等应用中，都活跃着亲疏水图案化表面的身影。
制备微型培养基的基础和关键是基底的研制。目前，微型培养基的基底材料通常采用膜材料和玻片，其中，膜材料如尼龙膜、硝酸纤维素膜或聚丙烯膜等。然而，这些基材材料在制备微型培养基时存在一些缺点，如膜材料的多孔性虽然可提高生物分子的固载量，但是也存在点阵密度低、点易扩散、背景噪音大、杂交速度慢的缺点；又如玻片在修饰时存在均一性和重复性相对差等缺点，并且进口已修饰的玻片基底价格较贵。另外，目前在利用上述基底材料制备微型培养基时主要采用先合成后点样方法，而该方法一般使用相对亲水的基底，但存在点样后样点的面积较大、样点的密度不高、富集效果差的缺点。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种2D微型培养芯片及其制备方法与应用。其解决了现有技术中存在的微型培养芯片富集效果差的问题。
本发明第一方面，提供一种2D微型培养芯片，所述2D微型培养芯片包括亲疏水图案化基底和培养液；
所述亲疏水图案化基底上排布有亲水区，亲水区外围由疏水区包围；
所述亲水区包括细胞区和细胞间交流区；
所述细胞区包括若干亲水点，所述细胞间交流区包括若干细胞通道，所述细胞通道用于连通不同的亲水点；
所述亲水区包括所述培养液。
本发明一实施方式中，所述亲水点的形状包括圆形、方形、三角形、多边形、花形、星形或不规则形状等。
本发明一实施方式中，所述亲水点的形状为若干微柱排列而成的阵列图案。优选所述阵列图案为圆形、三角形或方形。
本发明一实施方式中，所述微柱数量为3-6个，优选为3或4个。其中，相邻微柱的距离和微柱的直径之间的比值大于2。其中，相邻微柱的距离大于等于30μm，小于100μm。其中，阵列图案的中心到每个微柱的距离不小于50μm。
优选地，所述微柱的直径为10-30μm。
本发明一实施方式中，所述细胞通道的形状可以为直道、弯道或不规则道。
本发明一实施方式中，所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为圆形，所述细胞通道为直道，所述细胞通道连通不同的亲水点，所述细胞通道的横向截面为半圆形。
本发明一实施方式中，所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为若干微柱排列而成的阵列图案，所述阵列图案为三角形或正方形，所述细胞通道为直道，所述细胞通道连通不同亲水点的微柱。优选地，所述细胞通道的中央设置有若干微柱。
本发明一实施方式中，所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为若干微柱排列而成的阵列图案，所述阵列图案为多边形、花形、星形或不规则形状，所述细胞通道为直道、弯道或不规则道，所述细胞通道连通不同亲水点的微柱。优选地，所述细胞通道的中央设置有若干微柱。
本发明一实施方式中，所述亲水点的直径为10-2000μm，可以为10μm和2000μm之间的任意一个数值，比如可以为10μm、20μm、50μm、100μm、500μm、800μm、1000μm、2000μm。示例性地，所述亲水点的直径为800μm。
本发明一实施方式中，相邻亲水点之间的间距为500～5000μm。
本发明一实施方式中，所述亲水区与基底边缘的距离大于50μm，优选为大于100μm。
本发明一实施方式中，所述细胞通道的宽度大于等于5μm，进一步地，所述宽度小于等于10mm；优选地，所述细胞通道的长宽比大于等于10。
本发明一实施方式中，所述细胞通道之间可以相互独立、互不连通；所述细胞通道位于每两个相邻的亲水点之间，并将两个亲水点之间互相连通。
本发明一实施方式中，所述细胞通道之间是相互连通的；每两个相互连通的细胞通道之间的夹角不小于30°
本发明一实施方式中，所述培养液为现有技术中任何用于细胞培养的培养基。包括但不限于 DMEM培养基、 RPMI 1640培养基、 MEM培养基、 DMEM/F12培养基、M199培养基、IMDM培养基、 L15培养基。
本发明一实施方式中，所述基底可以为柔性材料，也可以为硬性材料。
本发明一实施方式中，所述的柔性材料包含高分子膜、水凝胶界面等一种或多种材料。所述的高分子膜例如为聚二甲基硅氧烷膜（PDMS）、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（PET）、ABS塑料膜、聚四氟乙烯膜。所述的水凝胶例如为透明质酸水凝胶、海藻酸水凝胶、纤维素水凝胶、壳聚糖水凝胶、胶原蛋白水凝胶、明胶水凝胶、丝素水凝胶、琼脂水凝胶、DNA水凝胶、去细胞化组织水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、聚乙二醇水凝胶、聚多巴胺（PDA）水凝胶或聚丙烯酸酯水凝胶等；优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜或聚多巴胺水凝胶。
本发明一实施方式中，所述的硬性材料包含塑料类、硅类、金属类等一种或多种材料，所述的塑料类例如为常见的培养皿、细胞培养孔板（材质可为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚硅氮烯、聚四氟乙烯），所述硅类例如为玻璃片、单晶硅片、二氧化硅片、石英片或聚二甲基硅氧烷薄膜等，所述金属类例如为铝片、铜片、镍片或氧化铝片等；优选为铝片或玻璃片。
本发明第二方面，提供一种所述2D微型培养芯片的制备方法，所述方法包括：利用打印法或掩模板光照法制备所述亲疏水图案化基底；在亲水区中加入培养液，得到所述2D微型培养芯片；
其中，所述亲疏水图案化基底上排布有亲水区，亲水区外围由疏水区包围；所述亲水区包括细胞区和细胞间交流区；所述细胞区包括若干亲水点，所述细胞间交流区包括若干细胞通道，所述细胞通道用于连通不同的亲水点。
本发明一实施方式中，采用打印法制备所述亲疏水图案化基底，具体的，所述打印法包括以下步骤：
1）制备疏水基底；
2）在疏水基底上打印表面改性分子溶液，使疏水基底表面接枝亲水性分子形成亲水区；
3）在亲水区上打印墨点，形成亲疏水图案化基底；
4）在亲水区加入培养液，形成2D微型培养芯片。
本发明一实施方式中，所述疏水基底为硅烷偶联剂修饰的基底。
优选地，所述硅烷偶联剂包括氨基硅烷、环氧基硅烷、硫基硅烷、乙烯基硅烷、甲基丙烯酰氧基硅烷、脲基硅烷、异氰酸酯基硅烷、硅烷酯类。具体地，包括乙烯基三氯硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷、γ-缩水甘油丙基-三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基-三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)- γ-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)- γ-氨丙基-甲基-三甲氧基硅烷、γ-氯丙基-三甲氧基硅烷、γ-巯丙基-三甲氧基硅烷、γ-氨丙基-三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷中的至少一种。
本发明一实施方式中，所述表面改性分子为生物友好性分子，包括海藻酸钠、亲水性高分子（如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚多巴胺、聚丙烯酸）、改性纤维素（如羧甲基纤维素）、多肽（如RGD）、氨基酸（如多聚赖氨酸）、蛋白（如层粘蛋白），以及亲水改性的分子(修饰氨基、羧基、环氧基、磺酸基或羟基等基团)中的至少一种。
本发明一实施方式中，通过墨点形状来控制亲水点和细胞通道的图案。
本发明一实施方式中，利用打印机或者移液枪等方式将墨水点胶于亲水区，每个亲水区单元可点1个或多个胶点，待胶点固化。
本发明一实施方式中，所述墨点包括基质胶或水凝胶。
本发明一实施方式中，所述基质胶或水凝胶包括但不限于海藻酸盐、羧甲基纤维素、甲基丙烯酰化海藻酸钠、引发剂（LAP）、层粘蛋白/RGD、培养基、细胞因子、纤维素酶。
本发明一实施方式中，采用掩模板光照法制备所述亲疏水图案化基底，具体的，所述掩模板光照法包括以下步骤：
1’）基底预处理：将基底进行表面氧化处理；
2’）制备疏水基底；
3’）基于亲疏水图案制备掩膜板，并利用所述掩膜板对疏水基底表面进行紫外光曝光，形成亲疏水图案化基底；
4’）在亲水区加入培养液，形成2D微型培养芯片。
本发明第三方面，提供一种2D细胞培养方法，所述培养方法包括：利用上述2D微型培养芯片对细胞进行培养。
本发明一实施方式中，所述2D细胞培养方法具体包括：
将亲疏水图案化基底浸入含悬浮细胞的培养液中，或者用移液枪对准细胞区滴加含悬浮细胞的培养液，然后置于37℃的细胞培养箱；
待细胞贴壁后，将基底置于PBS中清洗干净后加入新的培养液，然后置于37℃的细胞培养箱。
本发明一实施方式中，贴壁细胞的传代过程为：先用PBS清洗干净含贴壁细胞的基底，然后将基底浸入含胰酶等的消化液中，将基底上的贴壁细胞消化脱落，制备成细胞悬浮液，进行新一轮的接种培养。
本发明第四方面，提供一种3D细胞培养方法，所述培养方法包括：利用上述2D微型培养芯片对细胞进行培养。
本发明一实施方式中，所述3D细胞培养方法具体包括：
利用打印机或移液枪对准细胞区滴加培养液，然后置于37℃的细胞培养箱；
换培养液的流程与2D细胞培养方法中的过程相同；
3D细胞的传代过程，具体的为：将含细胞和水凝胶墨点的基底浸泡入含水凝胶降解酶和胰酶的混合消化液中，将基底上的水凝胶降解脱落，制备成含成体干细胞（如干细胞、肿瘤细胞）的基质胶或水凝胶，进行新一轮的接种培养。
本发明第五方面，提供上述2D微型培养芯片在细胞毒性测试、药物筛选及材料合成中的应用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用的图案化亲/疏水区，亲水区对水性液体的粘附性强，疏水区不粘附水性液滴，能够在不使用物理阻隔的情况下，通过疏水区的作用将液滴高效分割，液滴只聚集在亲水区域，能够替代传统细胞培养所用的孔板。
2、本发明采用的2D微型培养芯片表面，超亲水图案具有微柱阵列图案和带有微柱的细胞通道，集水效率高。
3、本发明采用的2D微型培养芯片的制备方法，工艺简单、操作方便、加工快捷、效率高、能耗少，成本低、绿色环保、可大规模工业生产。
附图说明
图1为2D微型培养芯片的图案化亲疏水区，其中，1为基底；2为细胞区；3为细胞通道；
图2为打印法制备图案化基底的流程图；
图3为2D微型培养芯片的图案化亲疏水区；
图4为掩模板光照法制备图案化基底的流程图；
图5为2D细胞培养的接种与换液过程；
图6为2D细胞培养状态的侧视图；
图7为3D细胞培养的接种与换液过程；
图8为3D细胞培养状态的侧视图；
图9为3D细胞培养后进行定向药物实验的过程。
图10为使用柱子模板制备的2D微型培养芯片用于2D/3D细胞药物试验的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1 亲疏水图案化基底的制备
1）制备疏水基底：将羟基化的 PET薄片、铝片基底贴在干净的上表面皿上，用移液枪吸取10μL十七氟癸基三甲氧基硅烷滴加在下表面皿，随后扣上上表面皿，在150℃下加热生长2h，从而使整个的PET薄片、铝片基底的表面上都修饰上含氟硅烷，使得PET薄片、铝片基底表面具备疏水性；
2）制备亲水区：将亲水性分子（多巴胺盐酸盐）和Tris-HCl（pH=8.8）混合得到亲水溶液1；亲水性分子PVA和海藻酸钠混合得到亲水溶液2；将疏水基底放置在喷墨打印设备的打印区域，按照预设阵列打印亲水溶液1，然后打印亲水溶液2，置于恒温恒湿箱中反应6小时。
3）在亲水区上打印层粘蛋白（亲水点），亲水点为圆形，亲水点直径为800μm，细胞通道为直道，细胞通道的长度（相邻亲水点之间的间距）为3000μm，置于37℃的细胞培养箱中，反应3小时，形成亲疏水图案化基底：细胞通道可交叉可也不交叉，如图1所示，1a为未设置细胞通道的基底，1b为细胞通道不交叉的基底，1c为细胞通道交叉的基底。
4）在亲水区加入培养液，形成微型培养基。打印法制备图案化基底的流程图如图2所示。2a为打印亲水溶液1，2b为打印亲水溶液2，2c为打印亲水点和细胞通道。
实施例2 亲疏水图案化基底的制备
1)基底预处理：将PET薄片、铝片基底先后放入乙醇、超纯水中分别超声清洗，用高纯氮吹干。随后利用O2-Plasma以100W的功率，处理2min，使硅片表面羟基化。
2)制备疏水基底：同实施例1步骤1）。
3)制备亲疏水图案化基底：将阵列化图案的掩模板(图案为三角形柱状阵列，掩模板中微柱的直径为10μm，相邻微柱的距离为80μm，阵列图案的中心到每个微柱的距离为40μm，细胞通道为直道，细胞通道的两端分别连通相邻两个亲水点的微柱，细胞通道的中央设置一个微柱，细胞通道的长度(相邻亲水点之间的间距）为800μm，细胞通道的宽度为10μm))覆盖在疏水基底。采用基于DMD的无掩膜光刻技术在基底上加工出预先设定的图案；所用紫外光的曝光强度约为40mW/cm2，曝光时间为6小时，表面的水接触角较大，疏水性较好。
随后，将基底用超纯水清洗，高纯氮吹干，即可在PET薄片、铝片基底上留下阵列化的亲水-疏水的图案。结果如图3所示，图3中1'为细胞区，2'为细胞通道。掩模板光照法制备图案化基底的流程图如图4所示。
实施例3 2D细胞的培养
将实施例1制备的亲疏水图案化基底浸入含悬浮细胞(肠癌细胞系或海拉细胞)的DMEM培养液中，或者用移液枪对准细胞区滴加滴加含悬浮细胞的培养液，置于37℃的细胞培养箱；待细胞贴壁后，将基底置于PBS中清洗干净后加入新的培养液，取出置于37℃的细胞培养箱。贴壁细胞的传代过程为，先用PBS清洗干净含贴壁细胞的基底，然后将基底浸入含胰酶等的消化液中，将基底上的贴壁细胞消化脱落，制备成细胞悬浮液，进行新一轮的接种培养。显微镜下观察细胞形态和存活率。2D细胞培养的接种与换液过程如图5所示。2D细胞培养状态的侧视图如图6所示。可以观察到细胞贴壁生长。细胞存活率为90%以上。细胞生长率大于1.5倍。
实施例4 3D细胞的培养
取基质胶/海藻酸钠水凝胶中的肠癌类器官，通过胰酶消化法将类器官消化分解成单细胞，然后将细胞悬浮液重新混合基质胶/海藻酸钠水凝胶，利用打印机或移液枪对准实施例1制备的亲疏水图案化基底上的细胞区进行含细胞基质胶/水凝胶的接种，固化（基质胶37℃保温10-15分钟固化，水凝胶蓝光照射30秒固化或者滴加1.5%的Ca2+溶液浸泡10分钟固化）完成后，滴加培养液，然后置于37℃的细胞培养箱；换培养液的流程与2D培养过程相同3D细胞的传代过程为，将含细胞和水凝胶墨点的基底浸泡入含水凝胶降解酶和胰酶的混合消化液中，将基底上的水凝胶降解脱落，制备成含成体干细胞（如干细胞、肿瘤细胞）的基质胶或水凝胶，进行新一轮的接种培养。显微镜下观察细胞形态和存活率。3D细胞培养的接种与换液过程如图7所示。 3D细胞培养状态的侧视图如图8所示。
可以观察到细胞形成3D细胞球。细胞存活率为90%以上。细胞生长率大于1.5倍。
实施例5 亲疏水图案化基底的富集
利用培养液来评估亲水-疏水图案化表面对样品的富集效率。采用实施例1所得的亲水-疏水图案化表面和一般的相对亲水的基底。将两种载板粘贴在冷凝集水实验装置中进行集水实验，并用高精度电子天平称量集水重量。上述冷凝实验装置由冷凝台，烧杯，加湿器，具有观察窗的亚克力密封腔体，相机组成。实验时，冷凝台温度设为2℃，加湿器流量为280mL/h。对比集水结果，实施例2所得的亲水-疏水图案化表面的超亲水、超疏水区域协调工作，收集到的液滴不会铺展整个表面，具有高效集水效果。
实施例6 定向药物对流/扩散实验
如图9所示，制备具有物质定向富集的细胞培养基底，按照实施例4在A区域进行3D细胞（人结肠癌类器官）培养；7天后，在B区域滴加药物（奥沙利铂，浓度：10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032 μM，药物分散于培养基中，A和B区域所用培养基相同），根据基底图案，即A区域与B区域相连的通道（b'为B区域的通道宽度，a'为A区域的通道宽度，c'为A区域和B区域之间的细胞通道长度，b'＞a'），促使B区域的物质会定向流向A区域。3天后进行活死细胞染色，细胞存活率如下表1所示。由结果可知，制备细胞培养基底可以实现定向药物对流/扩散。
表1 药物试验
实施例7 定向药物对流/扩散实验
与实施例6不同的是，此次使用实施例2制备的柱子模板制备亲疏水化的基底进行2D/3D细胞药物实验。如图10所示，在区域2''滴加药物后，药物从2''区域扩散到1''区域。由结果可知，制备细胞培养基底可以实现定向药物对流/扩散。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种2D微型培养芯片，其特征在于：所述2D微型培养芯片包括亲疏水图案化基底和培养液；
所述亲疏水图案化基底上排布有亲水区，亲水区外围由疏水区包围；
所述亲水区包括细胞区和细胞间交流区；
所述细胞区包括若干亲水点，所述细胞间交流区包括若干细胞通道，所述细胞通道用于连通不同的亲水点；
所述亲水区包括所述培养液。
2.如权利要求1所述的2D微型培养芯片，其特征在于：所述亲水点的形状包括圆形、方形、三角形、多边形、花形、星形或不规则形状；
或者，所述亲水点的形状为若干微柱排列而成的阵列图案；
或者，所述细胞通道的形状为直道、弯道或不规则道。
3.如权利要求1所述的2D微型培养芯片，其特征在于：所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为圆形，所述细胞通道为直道，所述细胞通道连通不同的亲水点，所述细胞通道的横向截面为半圆形；
或，所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为若干微柱排列而成的阵列图案，所述阵列图案为三角形或正方形，所述细胞通道为直道，所述细胞通道连通不同亲水点的微柱；
或，所述亲水点和细胞通道的排布方法为：所述亲水点为若干微柱排列而成的阵列图案，所述阵列图案为多边形、花形、星形或不规则形状，所述细胞通道为直道、弯道或不规则道，所述细胞通道连通不同亲水点的微柱。
4.如权利要求1所述的2D微型培养芯片，其特征在于：所述亲水点的直径为10-2000mm；所述细胞通道的宽度大于等于5mm；所述细胞通道的长度为500～5000mm。
5.权利要求1-4任一项所述的2D微型培养芯片的制备方法，其特征在于：所述方法包括：利用打印法或掩模板光照法制备所述亲疏水图案化基底；在亲水区中加入培养液，形成2D微型培养芯片；
其中，所述亲疏水图案化基底上排布有亲水区，亲水区外围由疏水区包围；所述亲水区包括细胞区和细胞间交流区；所述细胞区包括若干亲水点，所述细胞间交流区包括若干细胞通道，所述细胞通道用于连通不同的亲水点；所述亲水区包括所述培养液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述打印法包括以下步骤：
1）制备疏水基底；
2）在疏水基底上打印表面改性分子溶液，使疏水基底表面接枝亲水性分子形成亲水区；
3）在亲水区上打印墨点，形成亲疏水图案化基底；
4）在亲水区加入培养液，形成2D微型培养芯片；或
所述掩模板光照法包括以下步骤：
1’）基底预处理：将基底进行表面氧化处理；
2’）制备疏水基底；
3’）基于亲疏水图案制备掩膜板，并利用所述掩膜板对疏水基底表面进行紫外光曝光，形成亲疏水图案化基底；
4’）在亲水区加入培养液，形成2D微型培养芯片。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述疏水基底为硅烷偶联剂修饰的基底；所述表面改性分子包括海藻酸钠、亲水性高分子、改性纤维素、多肽、氨基酸、蛋白，以及亲水改性的分子中的至少一种。
8.一种2D细胞培养方法，其特征在于：所述培养方法包括：利用权利要求1-4任一项所述2D微型培养芯片对细胞进行培养。
9.一种3D细胞培养方法，其特征在于：所述培养方法包括：利用权利要求1-4任一项所述2D微型培养芯片对细胞进行培养。
10.权利要求1-4任一项所述2D微型培养芯片在细胞毒性测试、药物筛选及材料合成中的应用。
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