CN112430528B - 一种基于喷雾辅助的高通量微生物接种装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物分析和微制造领域，公开了一种基于喷雾辅助的微生物接种装置，自上而下依次包括：气溶胶液滴发生装置，用于对含有目标微生物菌种的微生物溶液进行雾化处理以形成气溶胶液滴；气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，并形成液滴扩散沉降通道，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；并且，所述气溶胶液滴约束沉降通道的末端用于与固体培养基无缝相连，实现固体培养基上目标微生物的接种，以便于后续对目标微生物单菌落的培养。本发明通过对装置内各组件的设置以及相应的配合工作方式等进行改进，能够有效解决现有技术中缺乏兼具操作简单、设备廉价、高通量微生物单菌落培养装置的问题。

Description

一种基于喷雾辅助的高通量微生物接种装置

技术领域

本发明属于微生物分析和微制造领域，更具体地，涉及一种基于喷雾辅助的高通量微生物接种装置，尤其是一种基于超声喷雾辅助的高通量微生物接种装置，便于微生物的高通量单菌落培养。

背景技术

微生物与人类的生活密切相关，被广泛应用于医药化工、农业产品、化学能源、环境保护等领域。传统的微生物纯培养方法有划线接种、涂布接种和液体接种等方法，但是这些传统的接种方法存在工作量大，需要操作经验，可数性好的单菌落培养通量低等问题。例如，最常用的涂布接种法，将未知样品通过梯度稀释，在固体培养基上进行涂布培养，待形成单菌落后进行微生物数量统计和单菌落分析。然而，涂布平板法形成的分散单细胞通量和效率较低。一般而言，一个90mm培养皿容器最多只能容纳30～300个微生物单菌落。因此，原始样品通常需要经过梯度稀释处理，而这会导致大量的低丰度生物微生物被丢失，而其本身并不一定不可培养。这严重的影响了功能微生物的发掘和临床早期诊断的准确性。此外，微生物在样本中除了以单细胞存在，还可以以微生物团簇或者微生物膜形式存在，稀释涂布平板法无法有效的将团簇分散成单个微生物。这导致有些可培养的稀有的微生物可能会被菌团中的其他微生物掩盖或者是竞争而得到无法微生物纯培养单菌落。随着分子生物学的发展，微生物的鉴定已经呈现快速准确的趋势，特别是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)等微生物快速鉴定方法的发展，使得微生物的研究越来越受限于微生物的培养和纯化等繁琐流程。

近些年，微生物高通量培养方法有了一定的技术进步，比如基于微加工制造技术的微流控芯片技术、高通量液滴培养技术、多孔板等。这些技术普遍采用的是通过微环境的构建，将微生物样品尽量分散在微环境(微腔室或者微液滴)中，实现微生物的单个分离和高通量培养。然而，这些微生物培养技术系统往往需要昂贵且复杂的硬件制造和软件配合，才能实现微腔室或者液滴的加工和生产。而培养过后，仍然需要对微生物进行挑选，和扩大培养。这些复杂的制造和培养过程尽管提高了微生物的可培养性，但是目前还无法满足市场上高通量、自动化的微生物培养和检测的需求。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于喷雾辅助的高通量微生物接种装置，其中通过对装置内各组件的设置以及相应的配合工作方式等进行改进，能够有效解决现有技术中缺乏兼具操作简单、设备廉价、高通量单菌落培养装置的问题。本发明通过喷雾作用产生数以百万计的气溶胶液滴，同时，喷雾过程能够有效分散样品中的微生物团簇，形成包含单细胞的气溶胶液滴，从而利于高通量的单细胞接种，能够实现微生物高通量接种。本发明装置具有操作简单、装置廉价易得、微生物样品无需梯度稀释、单细胞接种高分散、通量高、密度可控的优势，可广泛应用于高通量、自动化的微生物纯培养和病原菌检测等研究领域，与微生物快速鉴定相结合，具有广阔的商业应用价值。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种基于喷雾辅助的微生物接种装置，其特征在于，自上而下依次包括：

气溶胶液滴发生装置，用于对含有目标微生物菌种的微生物溶液进行雾化处理以形成气溶胶液滴；该气溶胶液滴发生装置是由雾化器与固定底座衔接而成；所述底座上开设有出口，用于向下输出所述气溶胶液滴；

气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，并形成液滴扩散沉降通道，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；并且，所述气溶胶液滴约束沉降通道的末端用于与固体培养基无缝相连，使沉降后得到的液滴能够被所述固体培养基承接、收集形成液滴阵列，从而实现固体培养基上目标微生物的接种，以便于后续对目标微生物菌落的培养。

作为本发明的进一步优选，所述雾化器优选选用超声雾化片，所述底座优选安装多个超声雾化片；

在所述气溶胶液滴约束沉降通道内、且靠近所述气溶胶液滴约束沉降通道末端的区域内还设置有带有预先设计图案的掩膜，该掩膜用于微生物在所述固体培养基上图案化区域的选择性沉降和培养。

作为本发明的进一步优选，所述掩膜为疏水性掩膜，并含有支撑脚，所述支撑脚用于支撑掩膜使掩膜悬于所述固体培养基之上；优选的，所述掩膜的支撑脚的高度不超过1mm。

作为本发明的进一步优选，所述超声雾化片保持水平，其喷雾方向垂直于水平线。

作为本发明的进一步优选，所述底座与所述液滴约束沉降通道通过螺口进行连接，以确保连接处的密封性；所述液滴约束沉降通道是采用透明通道，以便于观察；

优选的，所述底座与所述液滴约束沉降通道均采用塑料材料；

更优选的，所述底座与所述液滴约束沉降通道是由带有瓶盖的塑料瓶制作而成，其中，所述底座是将该塑料瓶的瓶盖开口制成，所述液滴约束沉降通道是将该塑料瓶的瓶体切割瓶底、形成开放通道制作而成。

作为本发明的进一步优选，所述液滴约束沉降通道的总高度H不小于所述超声雾化片喷雾距离s的1.2倍，确保液滴在所述固体培养基上是自由随机沉降，从而保证微生物能够均匀接种在所述固体培养基上。

作为本发明的进一步优选，所述超声雾化片出雾孔径为5-9微米。

作为本发明的进一步优选，所述超声雾化片还与时间继电器相连，该时间继电器用于控制所述超声雾化片的工作时间，以控制接种量。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明通过喷雾作用每秒能产生数以百万计的气溶胶液滴，同时，喷雾过程能够有效分散样品中的微生物团簇，形成包含单细胞的气溶胶液滴，从而摆脱了传统的溶液由于表面张力的存在而无法高效分散微生物的问题，极大地增加了单细胞接种通量和效率，能够实现微生物单菌落的高通量培养。通过设置沉降通道的高度长于喷雾长度的1.2倍，有利于这些包含有微生物单细胞的气溶胶液滴通过自由沉降，能够随机均匀分布在固体培养基上(当然，也可优选通过掩膜进行选择性沉降在预先选定的特定区域)。以琼脂糖固体培养基为例，气溶胶沉降到琼脂表面后，液滴水分会迅速被琼脂吸收，而留下微生物细胞，从而实现微生物单细胞的高通量接种。此外，如果微生物样品浓度较大，分散的微生物间距较小，微生物之间的竞争会加剧，也不利于稀有微生物单菌落的生长，通过设置更大的沉降通道和更大面积的固体培养基(例如150mm甚至是米级的琼脂板)，有效的控制单细胞微生物之间的接种距离，实现超高通量的微生物菌落的培养。

具体说来，本发明能够取得以下技术效果：

(1)本发明装置中的气溶胶液滴发生装置，也是一种微生物雾化喷头，能够将溶液中的微生物进行雾化分散，雾化分散作用可以有效的分散团聚的微生物细胞(以超声喷雾片为例，超声喷雾片能够充分分散微生物细胞，并且将其包裹在皮升级液滴气溶胶中)；通过液滴的自由沉降过程可以显著的增加微生物的接种通量和分布的均一性；气溶胶沉降到琼脂表面后，液滴水分会迅速被琼脂吸收，而留下微生物，不需要手工操作即可完成高度分散的单细胞接种。雾化接种法摆脱了传统的稀释划线法或者平板涂布法的效率低、涂布不均匀和稀有微生物因稀释而丢失等缺点。

(2)接种过程操作简单，无需额外的设备或软件辅助；优先地采用超声雾化器，产生时间秒级精确可控；本发明装置对应的喷雾接种方法，其喷雾接种量可以由时间继电器精确控制。

(3)喷雾方法接种微生物完全排除人为操作因素，通过设置沉降通道的直径，可以进一步扩大固体培养基的尺寸，有效减少接种单细胞微生物之间的相互干扰，实现超高通量的微生物单细胞接种和纯菌落培养。

(4)可优选通过掩膜系统能够实现微生物空间分布精确可控的接种过程。即，通过图案化的掩膜，可以实现气溶胶在培养基上的选择性沉降，实现微生物的空间分布的多样化控制。

(5)装置廉价易得，无需昂贵的仪器设备即可实现高通量单细胞接种培养。

本发明的超声喷雾接种装置及其相应的使用方法，为高通量的微生物接种和菌落培养提供了一种新颖的途径，在高通量、自动化的微生物纯培养和分离、高阶微生物相互作用和低丰度临床病原菌检测等微生物研究领域将具有广泛的应用前景。

以固体培养基为琼脂板为例，利用本发明装置，通过喷雾(如超声喷雾，出雾孔径例如可以6微米)将微生物溶液样品以每秒数百万的速度分散成气溶胶微生物液滴，然后通过气溶胶随机沉降形式，接种到琼脂板上(即，经过约束通道均匀分散的沉降在固体培养基的表面)，含有微生物单细胞的液滴沉降在琼脂板上，水分被琼脂板吸收留下微生物，完成单细胞的接种；后续培养一定时间，分散的单细胞能形成高通量的微生物单菌落。该装置操作简单，微生物分散成单细胞效果好，沉降过程单细胞分布均匀。较传统的涂布法，单位面积内的微生物接种量显著提高，用较少的菌落溶液培养的得到的单菌落数量提高了至少十倍。本发明为微生物单菌落培养提供了一种新颖途径，可广泛应用于微生物高通量、自动化的纯培养和微生物功能筛选和鉴定等研究领域，能够进一步推动微生物分析和培养领域的技术进步。

综上，本发明基于喷雾辅助的微生物高通量单细胞接种装置，可用于实现微生物单菌落高通量培养。本发明的微生物单细胞高通量接种装置加工简单、成本低廉、操作方便、接种量可控和微生物单菌落通量高，摆脱了传统单菌落培养通量低，分散度低，操作繁琐等问题，为构建高通量的微生物单菌落提供了一种新颖途径，可广泛应用于高通量、自动化的微生物纯培养、病原菌检测和功能筛选等研究领域。

附图说明

图1为本发明喷雾接种装置示意图。

图2为微生物原样品(微生物原样品溶液的浓度约7*10⁵CFU每毫升)经传统涂布平板法接种和本发明的接种效果对比图，其中，图2中的(a)对应传统涂布平板法接种(所采用的为70微升微生物原样品)，图2中的(b)对应本发明接种(所采用的原溶液的溶液量为30微升)。

图3为传统稀释平板法在90mm培养皿上接种和本发明在150mm培养皿上经的接种效果对比图；其中，图3中的(a)为传统的稀释平板法(27倍稀释条件下)90mm培养皿上微生物菌落培养图；图3中的(b)为150mm培养皿上喷雾3秒获得的高通量微生物菌落培养图。通过图3中(a)和图3中的(b)对比可知，本发明接种方法，利用30微升微生物溶液，所得菌落总数为4760个，是传统的稀释平板法(27倍稀释条件下)培养的可数的菌落数的十倍；可见，本发明方法能够克服人工涂布不均匀的劣势，可以在更大的培养皿上进行高密度的接种，进而培养更多的微生物。

图4为通过旋转式掩膜系统形成“井”型微生物图案化空间分布培养。

图5为掩膜控制下的“井”型微生物空间分布示意图，“井“字型的通道宽度在100微米，长度两厘米。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以雾化采用超声雾化为例，本发明中的装置主要包括：超声雾化发生装置，用于产生百万级气溶胶液滴；和气溶胶液滴约束通道，用于液滴沉降的路径约束，延长沉降时间和保证液滴不外泄损失。在实际应用时，该装置配合固体培养基使用(该固体培养基用于接收液滴)。在使用时，液滴约束沉降通道的末端与固体培养基之间为无缝衔接，以避免气溶胶液滴外漏，影响液滴分布。另外，沉降约束通道的直径应略小于培养皿直径(例如，常用的培养皿约为90mm或者150mm，但不限于此直径)；沉降通道形状可以为柱状或者是呈截面不断放大的喇叭状，适合于不同尺寸的培养基接种。也就是说，在使用时，喷雾装置、约束通道和固体培养基界面都要无缝衔接，防止微生物气溶胶液滴外漏。

根据液滴产生的要求，可以选择出不同的雾孔径大小。根据微生物的宽度范围主要分布在0.5-5微米，本发明优先的选择超声辅助雾化器，用于展示的雾化片出雾孔径为6-9微米。

当液滴喷出后，微生物气溶胶会在约束通道内逐渐沉降在固体培养基(如，琼脂板)上，完成接种过程。为了精确地控制微生物的接种量，可以在电路中优选设置一个时间继电器。

约束通道可采用透明的玻璃或者塑料瓶为材料，本实施例中，选择常见直径约70mm塑料瓶，去除底部，根据喷雾长度可加长拼接多级。将喷雾片固定在约束通道上。设置的约束通道应该至少1.2倍长于垂直喷雾的长度。这样气溶胶液滴在约束通道的末端可以认为是随机自由沉降，防止出现微生物直接喷涂过程，液滴直接碰撞在收集琼脂板上，影响微生物样品接种的均匀性。固体培养基可采用实验室常用的80mm培养皿制成，将固体培养基置于约束通道下方完成喷雾接种装置的组装。完成喷雾接种过程后，将培养皿用蜡膜封装于实验条件下培养。此外，为了进一步较少接种微生物单菌落之间的相互作用影响，可以选择不同尺寸的培养皿制作更大的固体培养基，实现更高通量菌落量培养。

例如，约束通道的制作工艺，可以按如下步骤进行制作：

(1)制作雾化片固定底座；

(2)采用塑料瓶盖，确定圆心后，对塑料进行切割，形成比喷雾片大小略小的圆孔。通过喷雾片上的橡胶套环的形变作用，将其嵌入圆孔中实现固定。雾化片安装需与水平面平行，这样其产生的喷雾就会喷出直线然后沉降，而不会附着在沉降通道内壁；

(3)约束通道结构的构建；通过水平方向喷雾的方式，确定喷雾的直线长度，按照1.5倍的长度确定约束通道的高度。

(4)确定喷雾和沉降距离后，选取适合高度的约500ml塑料瓶，洗净；通过多级嵌套的方式增加液滴的沉降时间，提高微生物接种的均匀性。

(5)采用橡皮筋箍紧瓶底，沿橡皮筋划线确定要剪掉的瓶底的剪切线；裁剪后，后用细砂纸进行打磨，无明显残缺和突兀部分，能和承接面相切，无明显漏缝。

另外，掩膜可用于调节微生物的图案化分布接种，可以采用旋转式掩膜的制作工艺进行制作，可以包括如下步骤：

采用CAD绘制所需的图形；旋转式掩膜一般分为两层，其中底部为支撑图形，局部镂空用于微生物的接种；上层为所需个性化图案。此外，还需要在掩膜中心设置小孔用于掩膜的中心孔对准和旋转。

采用激光雕刻机在具有一定硬度的PET膜或者是亚克力板上切割出特定的图形；采用75％酒精浸泡杀菌，干燥后将支撑图案和上层图依次放置在90mm的琼脂板上。然后通过采用与中心孔直径相当的细针进行贯穿固定。

另外，掩膜可以设计成两层疏水性掩膜，用于多目标微生物的选择性沉降控制；其中，底层掩膜与支撑脚固定相连，上层掩膜包含有设计图案；上层相较于低层可以产生相对移动，如相对旋转，如图4所示；旋转上层掩膜前后，各有一次喷雾。两次喷雾的间隔期间，旋转上层掩膜即可以得到设计的不同微生物在特定区域的沉降培养，可以应用于微生物的相互作用分析和共生培养等。

以下为具体实施例：

实施例1

本发明中基于喷雾辅助的高通量微生物接种装置，在使用时可配合固体培养基使用，即，由喷雾发生装置、沉降通道、掩膜组件和固体培养基四部分组成(当然，掩膜组件也是可选、可不选的)。

如图1所示，喷雾装置固定在带螺口的沉降通道上。本实施例中优先地选择超声雾化片，其外径为18mm。通过固定坐的螺口与沉降通道的固定和密封，防止喷雾液滴的外泄。

本实施例中，沉降通道优先地选择500ml塑料瓶改装，成本低，便于加工。将塑料瓶底部剪掉，用砂纸打磨成水平，与固体培养基直接无缝承接，防止喷雾气溶胶液滴外泄。本实施例中喷雾片产生的喷雾距离约为15cm，因此，沉降通道的长度设置为至少22.5cm。

本实施例中对微生物样品进行喷雾接种培养，同时以传统法涂布平板法接种作对照组。首先，由顶部雾化片加入一定体积微生物样品，覆盖在雾化片的进口处。接通电源，随即电流通过压电陶瓷片产生高频振动，引起溶液振动，进而促使部分液滴表面的动能增加，摆脱液体表面张力作用，形成液滴连续喷出。喷出的液滴在约束通道中运动和沉降。在飞行过程中，除了垂直向下运动，沉降通道内也会出现局部乱流促使液滴在水平方向上发生扩散，进而在底部会逐渐均匀的分布。据测算，本实施中液滴的出口为6μm，其形成的液滴的最小粒径在6～10μm，其体积约为0.1pL。本实验中，测定雾化片喷雾速度为10mg/s。因此，该方法每秒钟可以产生约10⁷个气溶胶液滴。

在喷雾时间较长(>3s)的操作中，为了防止喷雾量太大，琼脂吸收水分速度有限而导致微生物之间混在一起，我们采用脉冲喷雾法进行接种，即喷雾3s后暂停30s再喷雾循环。在喷雾一定时间结束后，需要等待约1分钟，待瓶内无明显雾气时说明气溶胶液滴基本沉降完成。将培养皿用蜡膜封装于实验条件下培养。

实施例中的培养结果可以看到，如图2所示，采用传统培养方法在70μl微生物样品中得到的菌落呈现不均匀的分布，而且微生物数量不可以计数，且微生物菌落种类相对单一，需要进行进一步稀释处理才能获得可数的单菌落。而采用喷雾接种方法(3s喷雾)培养30μl微生物原样品(该微生物原样品无需稀释)发现，微生物能很均匀的分布在琼脂板上。而且其个数清晰可数，其菌落的多样性也较为丰富。

此外，我们还展示了采用150mm大培养皿进行了高通量的单菌落培养，并且通过选择培养基对能降解纤维素的微生物进行了筛选。原始样品采自武汉东湖水样。微生物溶液的浓度为约7*10⁵CFU每毫升。实验中采用的是LB培养基(酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，1000毫升水),七叶苷素0.5g，柠檬酸铁氨1g。具有水解纤维素活性的微生物能够分泌β-葡萄糖苷酶能够水解七叶苷素，产物七叶苷能够和亚铁离子形成深褐色的黑光晕。结果对比可以看见，采用标准的梯度稀释培养法(27倍稀释)，如图3中的(a)所示，只能在三个重复培养中获得一个阳性克隆，而采用本发明原样喷雾培养法能够获得至少17个阳性菌落，如图3中的(b)所示。水解得到的菌经过鉴定为Bacillus cereus。如图3中的(b)所示，我们获得了4760个单菌落的培养。该结果是传统的稀释平板法的至少10倍以上，并且菌落之间相互独立分散，易于下一步的菌落挑选和进一步下游应用分析。出现有大的黑色光圈菌落17个，而采用传统方法培养，因为微生物样品经过稀释、丰度较低，只能在三次重复中得到了一个活性微生物菌落。结果充分的表明，本发明方法能够直接采用不经稀释的微生物原样进行接种，能够获得更高通量的微生物单菌落，微生物种类也极大地提高，避免传统方法因为稀释带来的微生物菌种的损失。

此外，存在两种菌随机组合在一起形成菌落的可能性，为了进一步分离这两种菌，我们可以将其挑出来，重新悬浮后，再次进行喷雾接种培养实现两种菌的纯培养分离。

本实施例可以进一步扩展到更大的固体培养基上，能够实现更高通的单菌落的培养和筛选，完全摆脱了传统的稀释涂布法的束缚。

此外，我们构建了能够满足多次喷雾和接种的掩膜系统。通过旋转式的掩膜的多次旋转，配合多次喷雾实现了不同的微生物在固体培养基上的差异性分布。喷雾形成的微生物气溶胶液滴的直径在6～10微米，我们的掩膜系统能够通过激光雕刻机实现直径小于100微米的孔径，这意味着我们可以在在100微米精度下实现不同微生物间隔距离的接种，这为我们研究特定微生物相互作用距离提供了良好的工具。传统的涂布法不仅无法在微观尺度控制微生物的间距，手工操作效率很低。该结果将显著的增强我们对微生物的单菌落培养和微生物与微生物相互作用的空间分布的操控能力，在微生物的功能发掘和合成微生物组的构建具有重要的应用价值。

因此，喷雾接种法能够较传统的稀释涂布法操作更简单，培养效果更好。由于接种方法摆脱了手工操作，自由沉降接种保证了菌落的均匀的分布性，该方法可以应用于大面积的更高通量的微生物单菌落培养，具有大规模自动化微生物培养和鉴定、多种微生物中间互作和共生微生物住的发掘的潜力。

基于本发明，相应得到的高通量微生物单菌落培养装置的具体制作工艺流程如下：

(1)超声雾化片的安装制作。雾化片采用商用直径18mm的雾化片，其出雾孔直径为6μm。该尺寸仅为本实施例中所用尺寸，本发明不限于该尺寸。具体的制作过程为：

本实施例中，选取直径为70mm的500ml塑料瓶盖，将其瓶盖中央钻出圆孔，圆孔直径约为18mm，并将雾化片嵌入瓶盖，采用速凝胶水进行固定。雾化片跟发生器控制芯片相连，接通电源，即可进行喷雾。为了进一步精确控制喷雾量，可以在电路中加入时间继电器进行调控。

(2)约束通道的设计和制作：设计喷雾通道目的是为了产生的雾气能够保证气溶胶在指定区域自由沉降。其设计高度应至少1.2倍于喷雾片的喷雾长度。喷雾通道的直径略小于接种琼脂平板的大小。本实施例中，选取常见500ml塑料瓶，直径为70mm。将瓶底部切除底部打磨平整即可。根据喷雾器的喷雾距离，适当调整约束通道的高度，可以提高液滴形成的均匀度。

(3)固体培养基。培养基可根据实验需要使用不同的固体培养基，培养基大小可选取实验室常见的80mm细胞培养皿。也可选取更大规格的培养皿制作培养基，但需要选取合适直径的约束通道。

(4)系统的组装。将含喷雾片的瓶盖通过螺口在塑料沉降通道上进行固定。雾化片通过导线链接电路控制器。然后，将平整的沉降通道放入固体培养基的培养皿中。

(5)高通量接种。用移液枪吸取一定量(如0.1ml)样品，覆盖在喷雾片的进样口处。设置时间继电器的输出模式，接通电源，立即产生喷雾。喷出的雾滴通过沉降通道均匀沉降在固体培养基表面。观察沉降通道上无明显雾气时，既表明沉降完成。

(6)图案化的微生物培养。

将2片直径约80mm的图案化掩膜依次放置在固体培养基上，然后通过中心针联通中心孔实现掩膜的固定安装(也就是说，2层掩膜，最上面的第一层可以旋转，方便操作；最下面的一层可以额外连接支撑脚)，然后用沉降通道的底部压住掩膜实现喷雾通道的密封。调整图形的位置后，进行第一次微生物喷雾接种；静置两分钟后。将掩膜旋转90°后，再次喷雾，静置两分钟后完成图案化接种。培养后，结果如图5所示。

除了超声雾化片外，本发明还可以采用喷射雾化器等其他雾化机理的雾化器。当然，在使用前，超声雾化片和约束沉降通道均需用消毒酒精进行多次消毒杀菌处理，并用纯净水接种以验证杀菌效果。所有操作过程均需在无菌操作台内酒精灯火焰附近操作。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于喷雾辅助的微生物接种装置在微生物的高通量单菌落培养中的应用，其特征在于，该装置自上而下依次包括：

气溶胶液滴发生装置，用于对含有目标微生物菌种的微生物溶液进行雾化处理以形成气溶胶液滴；该气溶胶液滴发生装置是由雾化器与固定底座衔接而成；所述底座上开设有出口，用于向下输出所述气溶胶液滴；所述雾化器具体为超声雾化片；超声雾化片出雾孔径为5-9微米；

气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，并形成液滴扩散沉降通道，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；并且，所述气溶胶液滴约束沉降通道的末端用于与固体培养基无缝相连，使沉降后得到的液滴能够被所述固体培养基承接、收集形成液滴阵列，从而实现固体培养基上目标微生物的接种，以便于后续对目标微生物菌落的培养；

其中，所述液滴约束沉降通道的总高度H不小于所述超声雾化片喷雾距离s的1.2倍，确保液滴在所述固体培养基上是自由随机沉降，从而保证微生物能够均匀接种在所述固体培养基上。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述底座安装多个超声雾化片；

在所述气溶胶液滴约束沉降通道内、且靠近所述气溶胶液滴约束沉降通道末端的区域内还设置有带有预先设计图案的掩膜，该掩膜用于微生物在所述固体培养基上图案化区域的选择性沉降和培养。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述掩膜为疏水性掩膜，并含有支撑脚，所述支撑脚用于支撑掩膜使掩膜悬于所述固体培养基之上；所述掩膜的支撑脚的高度不超过1mm。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述超声雾化片保持水平，其喷雾方向垂直于水平线。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道通过螺口进行连接，以确保连接处的密封性；所述液滴约束沉降通道是采用透明通道，以便于观察。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道均采用塑料材料。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道是由带有瓶盖的塑料瓶制作而成，其中，所述底座是将该塑料瓶的瓶盖开口制成，所述液滴约束沉降通道是将该塑料瓶的瓶体切割瓶底、形成开放通道制作而成。

8.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述超声雾化片还与时间继电器相连，该时间继电器用于控制所述超声雾化片的工作时间，以控制接种量。

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