CN111979090B - 一种基于磁性微模块的细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磁性微模块及其制备方法、基于磁性微模块的细胞培养方法,磁性微模块包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,胶原蛋白层上能够接种待培养细胞,磁性聚对二甲苯层能够与放置于培养皿下方的磁吸附板块相配合,使得微模块能够固定在培养皿中,便于细胞培养基的更换,有效解决了现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题;此外,在进行细胞培养时,磁性微模块平铺在培养皿上,磁吸附板块固定在培养皿底部,使微模块在磁力的吸附下不会出现滑落和移动的情况,克服了传统方法采用胰蛋白酶消化、细胞刮子等方式进行细胞传代时造成的细胞损伤的缺陷,并降低了细胞培养实验操作难度。
Description
技术领域
本发明属于微米级操作以及生物细胞培养技术领域,尤其涉及一种磁性微模块及其制备方法、基于磁性微模块的细胞培养方法。
背景技术
进入二十一世纪的今天,在物质生活有了大幅度的提高的同时,人们对身体健康的关注程度也在不断提升。生物医学领域的研究致力于解决现今存在的医学难题,例如癌症,艾滋病,各种传染病等,为人们健康生活提供坚实基础。而细胞培养是细胞生物学的实验基础,更是生命科研研究中的重要研究方法。
当前,科研人员普遍采用细胞培养皿(瓶)来培养贴壁细胞。然而,当细胞培养密度达到峰值时,细胞的生长繁殖能力就会下降,进而影响细胞的生理指标,降低后续实验数据的可靠性和精确度。另外,由于与细胞相关的大部分实验都需要在特定细胞数量上进行,为了能在细胞处于对数生长期时收集一定数量细胞并开展后续实验,就需要用胰蛋白酶消化、细胞刮子刮取等方式,将细胞从原来生长的皿(瓶)中分离出来。但是这些传统方式在分离过程中,容易造成细胞的丢失和损伤,从而影响细胞的生长形态和生理活性。
为了得到准确数量且状态更好的细胞,细胞培养的皿(瓶)和方式都需要做出进一步的改进和优化。
发明内容
为解决上述传统细胞培养方式的缺陷,本发明提供一种磁性微模块及其制备方法、基于磁性微模块的细胞培养方法,能够有效解决现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题,以及用胰蛋白酶消化、细胞刮子等方式进行细胞传代时造成的细胞损伤的问题。
一种磁性微模块,包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,所述磁性聚对二甲苯层中混合有磁纳米颗粒。
可选的,所述磁性聚对二甲苯层的厚度为3μm,胶原蛋白层的厚度为1μm。
一种磁性微模块的制备方法,包括以下步骤:
S1:将海藻酸钠溶液均匀涂抹在玻璃片表面,得到海藻酸钠层;
S2:采用化学淀积法在海藻酸钠层上沉积磁性聚对二甲苯层,其中,所述磁性聚对二甲苯层中混合有磁纳米颗粒;
S3:采用热蒸发沉淀法在磁性聚对二甲苯层上制备金属Al层,然后在金属Al层上粘贴保护膜,其中,保护膜被划分为微模块区域和非微模块区域;
S4:采用化学蚀刻法去除非微模块区域的保护膜,然后采用化学腐蚀法去除金属Al层的非微模块区域,在金属Al层上得到两个以上相互独立的微模块形状;
S5:按照金属Al层的微模块形状,采用等离子空气切割法对磁性聚对二甲苯层和海藻酸钠层进行切割,得到微模块形状的层合结构,其中,所述层合结构从上至下依次为保护膜、金属Al层、磁性聚对二甲苯层以及海藻酸钠层;
S6:将MPC溶液均匀涂抹在层合结构以及各层合结构之间的玻璃片表面上,得到MPC疏水层;
S7:将步骤S6中得到的成品浸入含有Ca2+离子的-NMD-3溶液中,去除金属Al层;
S8:将胶原蛋白溶液均匀涂抹在去除金属Al层后的磁性聚对二甲苯层上,得到胶原蛋白层;
S9:采用海藻酸钠裂解酶溶解海藻酸钠层,使得磁性聚对二甲苯层与胶原蛋白层整体与玻璃片分离,得到磁性微模块。
一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,所述磁性微模块包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,所述磁性聚对二甲苯层中混合有磁纳米颗粒,所述方法包括以下步骤:
S1:在装有细胞培养基的培养皿中分别平铺两个以上的接种有待培养细胞的微模块和未接种有待培养细胞的空白微模块,其中,待培养细胞接种在微模块的胶原蛋白层上;
S2:将培养皿置于设定培养条件下,使得空白微模块上相继附着上待培养细胞;
S3:将磁吸附板块置于培养皿下方,使得微模块与待培养细胞的复合体吸附在培养皿上,然后更换细胞培养基;
S4:采用磁吸附微纳米级镊子转移完成细胞培养的微模块,并在培养皿中加入新的空白微模块;
S5:采用胶原蛋白酶溶解转移出来的微模块的胶原蛋白层,实现待培养细胞与微模块的分离,完成细胞培养。
进一步地,上述步骤S1在培养皿中平铺接种有待培养细胞的微模块和未接种有待培养细胞的空白微模块后,采用磁吸附微纳米级镊子移动微模块,使各微模块的摆放呈设定的阵列。
进一步地,上述步骤S3中将带有磁吸附能力的板块置于培养皿下方后,将两者的复合体置于设定振幅和频率的交流磁场中,使得微模块在磁场作用下呈均匀分布或聚集分布,实现细胞的阵列化培养。
进一步地,所述更换培养基的方法为:
倾斜培养皿,采用带有移液管的移液器将细胞培养基吸出培养皿,再加入新的细胞培养基。
可选的,所述设定培养条件为37摄氏度,CO2的浓度为5%。
有益效果:
1、本发明提供一种磁性微模块,包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,胶原蛋白层上能够接种待培养细胞,磁性聚对二甲苯层能够与放置于培养皿下方的磁吸附板块相配合,使得微模块能够固定在培养皿中,便于细胞培养基的更换,有效解决了现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题。
2、本发明提供一种磁性微模块的制备方法,依次采用均匀涂布法、化学淀积法、热蒸发沉淀法得到海藻酸钠层、磁性聚对二甲苯层以及金属Al层后,再采用化学蚀刻法以及等离子空气切割法等制备磁性微模块,得到的磁性微模块由磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层构成,其中,胶原蛋白层上能够接种待培养细胞,磁性聚对二甲苯层能够与放置于培养皿下方的磁吸附板块相配合,使得微模块能够固定在培养皿中,便于细胞培养基的更换,有效解决了现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题。
3、本发明提供一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,磁性微模块平铺在培养皿上,磁吸附板块固定在培养皿底部,使微模块在磁力的吸附下不会出现滑落和移动的情况;固定在移液器上的移液管用于更换培养皿中的培养基;磁吸附板块和微纳米级镊子相配合,能够转移已完成培养的附着有单个细胞的微模块,然后加入空白微模块;由此可见,本发明有效解决了现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题,以及用胰蛋白酶消化、细胞刮子等方式进行细胞传代时造成的细胞损伤的问题,同时降低细胞培养实验操作难度,提升实验效率和实验数据可信度,是对传统细胞培养方式的改革和创新。
附图说明
图1为本发明提供的微模块制备过程中的中间产品示意图;
图2为本发明提供的微模块制备过程中经过第一次刻蚀后的中间产品示意图;
图3为本发明提供的微模块制备过程中经过第二次刻蚀后的中间产品示意图;
图4为本发明提供的微模块制备过程中经过两次刻蚀后涂布MPC疏水层的中间产品示意图;
图5为本发明提供的微模块制备过程中溶解金属Al层后的中间产品示意图;
图6为本发明提供的接种有待培养细胞的微模块示意图;
图7为本发明提供的微模块从玻璃片表面分离后的示意图;
图8为本发明提供的微模块在培养皿中的随机分布示意图;
图9为本发明提供的微模块与磁吸附板块的示意图;
图10为本发明提供的微模块与磁吸附板块的结合体示意图;
图11为本发明提供的采用微纳米级镊子移动微模块的示意图;
图12为本发明提供的微模块在培养皿中随机排布的示意图;
图13为本发明提供的微模块在培养皿中随机排布的俯视图;
图14为本发明提供的采用磁性微纳米级镊子移动微模块的示意图;
图15为本发明提供的微模块在培养皿中阵列排布的示意图;
图16为本发明提供的微模块在培养皿中阵列排布的俯视图;
1-培养皿底壁、2-海藻酸钠层、3-磁性聚对二甲苯层、4-金属Al层、5-MPC疏水层、6-胶原蛋白层、7-表面有细胞附着生长的微模块、8-表面无细胞附着生长的微模块、9-培养皿、10-磁吸附板块、11-移液器、12-移液管、13-微纳米级镊子、14-磁吸附微纳米级镊子。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一
一种磁性微模块,包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,所述磁性聚对二甲苯层中混合有磁纳米颗粒。
其中,磁性微模块在磁吸附板块的吸附作用下,能够时磁性微模块固定在培养皿中,从而达到不损伤细胞且可以更换培养基的目的。
实施例二
基于以上实施例,本实施例通过涂抹和光刻的方法来生产适合单细胞生长的微模块,主要流程为:海藻酸钠层2直接涂抹在培养皿底壁1,磁性聚对二甲苯层3采用化学淀积法对混合有直径为1-100nm的磁纳米颗粒的聚对二甲苯溶液进行沉淀而制成;金属Al层4附着在聚对二甲苯层3上,采用热蒸发沉淀的方法制成,然后用化学蚀刻法,即利用强酸或强碱溶液直接对金属Al层4未保护部位进行化学腐蚀,在金属Al层4底面得到特定的微模块形状;采用切割灵活且变形小的等离子空气切割,将海藻酸钠层2和磁性聚对二甲苯层3切割成上述微模块形状;MPC疏水层5用于防止细胞在非微模块部分贴壁生长;微模块上的金属Al层4和MPC疏水层5经Ca2+-NMD-3溶液进行移除;胶原蛋白层附着在微模块的磁性聚对二甲苯层表面。
具体的,一种磁性微模块的制备方法,包括以下步骤:
1)首先把亲水性玻璃片用丙酮和异丙醇清洗。海藻酸钠在纯净水中溶解成为1%(w/v),用涂胶仪以2000rpm,30s的条件均匀环形涂抹在玻璃片表面,海藻酸钠层厚度为3μm。然后浸入1mMCaCl2的溶液中。把磁颗粒均匀的混入聚对二甲苯溶液中,然后在涂有海藻酸钠的玻璃片上,采用化学淀积的方法沉积3μm厚的聚对二甲苯层,最后用热蒸发沉淀的方法在聚对二甲苯层上获得3μm厚的金属Al层,成品如图1所示,从下至上依次为1mm厚的培养皿底壁1,3μm厚的海藻酸钠层2,3μm厚的磁性聚对二甲苯层3,3μm厚的金属Al层4;在金属Al层上粘贴保护膜,其中,保护膜被划分为微模块区域和非微模块区域。
2)如图2所示,用化学蚀刻法,即将要蚀刻区域,即非微模块区域的保护膜去除,金属Al层上无保护膜的蚀刻区域接触强酸或强碱溶液,进行化学腐蚀,在金属Al层底面得到特定的微模块形状。
3)根据不同的微模块形状,如图3所示,采用切割灵活且变形小的等离子空气切割法对磁性聚对二甲苯层和海藻酸钠层进行切割。
4)如图4所示,MPC溶液均匀涂布(2000rpm,30s)于上一步的成品上,在室温条件下乙醇气体密室处理20min,紧接着在70摄氏度的烤箱中脱水处理4小时,MPC疏水层5的厚度为2μm。
5)在进行细胞培养前,如图5所示,将上一步的成品浸入含有Ca2+离子的-NMD-3溶液30s,去除微模块上的金属Al层,则附着与金属Al层上的MPC疏水层也会随之脱落,然后用蒸馏水清洗整个微板块,用氮气气体烘干。把微板块置于紫外线下灭菌5min。在微模块的磁性聚对二甲苯层表面涂布1μm厚的胶原蛋白Collagen IV溶液(300ug/ml),孵育1h后用细胞培养基漂洗3次。
6)此时,如图6所示,可以在整个微板块上接种细胞,细胞只在涂布有胶原蛋白Collagen IV的微模块上附着生长,而在非微模块区域因为有MPC疏水层的存在使细胞不能成功贴壁。
需要说明的是,接种细胞时是将含有细胞的悬浮液涂在布置有微模块的培养皿上,然后再由细胞自主吸附在胶原蛋白层上。
7)如图7所示,在微板块加入适量的海藻酸钠裂解酶,微模块内的海藻酸钠层会从凝胶裂解成溶液,微模块随之与玻璃基板分离;然后用微纳米级镊子即可夹取和移动单个微模块。
需要说明的是,上述步骤6)和步骤7)的先后顺序可以调换,即也可先执行步骤7)再执行步骤6),还可以跳过步骤6),直接执行步骤7)。
实施例三
由以上实施例可知,磁性微模块可以用于细胞的无损伤培养,则本实施例基于以上实施例,提供一种基于磁性微模块的可循环的低损伤细胞培养方法,即在磁吸附板块的吸附作用下固定微模块,从而能达到不损伤细胞就可以更换培养基的目的;同时,磁吸附板块配合微纳米级镊子从而实现对细胞的循环培养,具体包括以下步骤:
1)如图8所示,在装有细胞培养基的培养皿9中不规则地平铺多个微模块,其中有些微模块7表面有细胞附着生长,而有些微模块8是空白的。
其中,细胞培养基为含有待培养细胞的悬浮液。
2)如图9所示,培养皿在适宜的培养条件下(37摄氏度,5%CO2),空白微模块8上会相继附着上单个细胞。也就是说,细胞培养基中的细胞会慢慢附着到微模块的胶原蛋白层上。
3)如图10所示,把带有磁吸附能力的板块10置于培养皿9下方,并倾斜整个组合体30°,微模块与待培养细胞的复合体因为在磁力的吸附下不会出现滑落和移动的情况。移液管12固定在移液器11上,则使用带有移液管12的移液11可以把细胞培养基吸出培养皿,并再加入新的培养基。
4)培养完成的附着有单个细胞的微模块在磁吸附板块和微纳米级镊子的合作下完成转移,并在原来的培养皿上加入一定数量的空白微模块。重复图8~图11的操作。
需要说明的是,细胞在胶原蛋白层上贴壁生长一段时间后,若其生理性能已处于对数生长期,则认为该细胞培养完成;同时,本实施例为了便于采用单个细胞开展实验研究,可以将微模块的表面积设计为单个细胞的大小,这样一个微模块上就只附着有一个细胞。
5)若需要将培养完成的单个细胞从微模块上进行分离,可将附着有单个细胞的微模块加入胶原蛋白酶水解微模块中的胶原蛋白层,实现单细胞与微模块的分离。
由此可见,相较于传统胰蛋白酶消化或者细胞刮子刮取的细胞培养方法,本发明可以达到无损伤可循环计数的培养细胞和细胞传代。
需要说明的是,如图12和图13所示,本实施例步骤1)中只是不规则排布微模块,即微模块在培养皿中随机分布;除此之外,由于单个细胞附着在可移动的微模块上,则本实施例还可以采用如下两种方法实现微模块的重新排列组合,使得各细胞之间形成特定形状阵列,以满足针对不同种类细胞进行科学研究的需求。具体的,第一种方法,如图14所示,可采用微纳米级镊子13或磁吸附微纳米级镊子14夹取和释放微模块来摆放出规则的阵列,如图15和图16所示。磁吸附微纳米级镊子14可直接吸附微模块1移动到特定位置,从而实现微模块的规则阵列,降低操作难度,且提高操作效率。第二种方法,可将带有磁吸附板块10的培养皿9置于特定振幅和频率的交流磁场中,从而在磁场作用下微模块呈均匀分布或聚集分布,且微模块中磁性聚对二甲苯层3位于最底层。
在以上实施方式中,本领域技术人员能够理解,对交流磁场的产生以及控制可以采用现有技术中任何适用的装置和技术,本实施例对此不作赘述。
由此可见,本发明提出一种新的性微模块及制备方法、基于磁性微模块的细胞培养方法,包含磁性微模块结构的构成、磁性微模块制作、可循环培养方法以及阵列排布组装四个部分,利用磁性吸附微模块实现对细胞的阵列化培养以及组装;此方法有效解决了现阶段在培养皿中培养细胞时,对培养皿的大量浪费问题,以及用胰蛋白酶消化、细胞刮子等方式进行细胞传代时造成的细胞损伤的问题,同时降低细胞培养实验操作难度,提升实验效率和实验数据可信度,是对传统细胞培养方式的改革和创新。
当然,本发明还可有其他多种实施例,在不背离本发明精神及其实质的情况下,熟悉本领域的技术人员当然可根据本发明作出各种相应的改变和变形,但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,其特征在于,所述磁性微模块包括磁性聚对二甲苯层及附着在磁性聚对二甲苯层上的胶原蛋白层,其中,所述磁性聚对二甲苯层中混合有磁纳米颗粒,所述方法包括以下步骤:
S1:在装有细胞培养基的培养皿中分别平铺两个以上的接种有待培养细胞的微模块和未接种有待培养细胞的空白微模块,其中,待培养细胞接种在微模块的胶原蛋白层上;
S2:将培养皿置于设定培养条件下,使得空白微模块上相继附着上待培养细胞;
S3:将磁吸附板块置于培养皿下方,使得微模块与待培养细胞的复合体吸附在培养皿上,然后更换细胞培养基;
S4:采用磁吸附微纳米级镊子转移完成细胞培养的微模块,并在培养皿中加入新的空白微模块;
S5:采用胶原蛋白酶溶解转移出来的微模块的胶原蛋白层,实现待培养细胞与微模块的分离,完成细胞培养。
2.如权利要求1所述的一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,其特征在于,步骤S1在培养皿中平铺接种有待培养细胞的微模块和未接种有待培养细胞的空白微模块后,采用磁吸附微纳米级镊子移动微模块,使各微模块的摆放呈设定的阵列。
3.如权利要求1所述的一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,其特征在于,步骤S3中将带有磁吸附能力的板块置于培养皿下方后,将两者的复合体置于设定振幅和频率的交流磁场中,使得微模块在磁场作用下呈均匀分布或聚集分布,实现细胞的阵列化培养。
4.如权利要求1所述的一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,其特征在于,所述更换培养基的方法为:
倾斜培养皿,采用带有移液管的移液器将细胞培养基吸出培养皿,再加入新的细胞培养基。
5.如权利要求1所述的一种基于磁性微模块的低损伤细胞培养方法,其特征在于,所述设定培养条件为37摄氏度,CO2的浓度为5%。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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