DE102014203280A1

DE102014203280A1 - Vorrichtung zur Bestimmung von Messgrößen an Membranen

Info

Publication number: DE102014203280A1
Application number: DE102014203280.6A
Authority: DE
Inventors: Thomas Knott; Michael Huber; Peter van Stiphout
Original assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Current assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2015-08-27
Anticipated expiration: 2034-02-25
Also published as: DE102014203280B4; US20160363578A1; WO2015124628A1

Abstract

Eine Vorrichtung 1 zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen weist zum einen mindestens ein erstes plattenartiges oder folienartiges Substrat 2 aus mindestens einem ersten Material auf, das durchgehende Öffnungen oder Poren 3 besitzt oder das perforierbar ist, und zum anderen ein zweites plattenartiges oder folienartiges Substrat 4 aus mindestens einem zweiten Material, dem Messelemente zugeordnet sind oder auf dem sich Messelemente befinden. Auf dem ersten Substrat können Zellen oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden. Erfindungsgemäß sind das erste Substrat und das zweite Substrat zumindest während des Messvorgangs für die Bestimmung der entsprechenden Messgrößen einander zugeordnet und zwar vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten. Insbesondere handelt es sich bei dieser Zuordnung um eine Verbindung der beiden Substrate miteinander, vorzugsweise um ein Zusammenfügen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen, einen Substratverbund, der für eine solche Bestimmung geeignet ist, sowie ein Verfahren, das mit Hilfe der genannten Vorrichtung durchgeführt werden kann.
Die Bestimmung von Messgrößen an elektrochemischen Gradienten, Potentialen, Widerständen oder Ladungsverschiebungen, die an Membranen, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen auftreten, ist bereits seit längerem bekannt. Zum technischen Hintergrund wird hier beispielsweise auf die Offenbarung der WO 02/10747 A2 verwiesen, insbesondere auf die einleitenden Erläuterungen dieser Druckschrift.
In diesem Zusammenhang sind auch Messmethoden und Messvorrichtungen bekannt, bei denen (in der Regel dünne) flache Substrate, die mit durchgehenden Öffnungen versehen, d.h. perforiert sind, zum Einsatz kommen. Als Offenbarung des Standes der Technik wird hier beispielsweise auf die US 2006/0194255 A1 verwiesen.
Allerdings sind derartige flache Substrate in der Anwendung für Patch Clamp mit Gigaseal in der Regel beschränkt auf Zellen in Suspension, d.h. Whole cell- oder Perforated Patch Clamp ist nur möglich an Zellen in Suspension, die auf die frischen Substrate aufgebracht werden. Besteht bereits ein Kontakt der Zellen zum Substrat oder werden gar Zellen auf dem Substrat kultiviert, liegen die Abdichtwiderstände typischerweise in der Größenordnung von 100 Mega Ohm (Megaseal), und Giga Ohm (Gigaseals) können nicht mehr erreicht werden.
Für die meisten Zellen wird durch die Vereinzelung und / oder Suspendierung die Lebensfähigkeit dramatisch eingeschränkt. Für in Suspension befindliche Zellen – vereinzelt oder nicht – ist eine maximale Lebensdauer von einigen Minuten bis hin zu vielleicht wenigen Stunden erreichbar. Ausnahme hiervon bilden lediglich solche Zellen die natürlicherweise in Suspension vorliegen (bspw. Blutzellen).
Adhärente Zellen, d.h.Zellen, die an andere Zellen oder sonstige Strukturen anhaften, oder Zellen im Zellverbund zeigen darüber hinaus biologische Phänomene (wie z.B. Reizfortleitung oder Induktion), die in einer einzelnen suspendierten Zelle nicht beobachtet werden können. Gewünscht ist daher ein Verfahren, das für beliebige Zellen oder Gewebe anwendbar ist, ohne auf die durch Patch Clamp erfassten intrazelluläre Messparameter zu verzichten. Gewünscht ist auch, andere oder weitere Messparameter wie z.B. Impedanz, Energiestoffwechsel und extrazelluläre Potentiale zu erfassen.
Bisher erfolgte der Einsatz von Substraten für Impedanzmessung, Erfassung des Energiestoffwechsels und Messung von extrazellulären Potentialen häufig durch die direkte Aufbringung der Messelemente und – elektroden auf die Oberseite des entsprechenden Substrates – dort wo auch die zu untersuchenden Zellen adhärieren und ggf. Anforderungen an das Substrat stellen, die den Eigenschaften der Messelemente auf dem Substrat entgegen stehen.
Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine reversible Messsituation für mehrere Zellen (einzeln, zusammenhängend oder im Verbund), gleich ob suspendiert, adhärent oder im Gewebeverbund herzustellen.
Aufgabe dieser Erfindung ist es auch, die Messelemente, einschließlich der (Mess-)Elektroden, so vorzusehen, dass diese über die Perforation oder die Patchpipette mit den zu messenden Zellen und Geweben in Verbindung stehen, z.B. um eine zellfreundliche Oberfläche zu ermöglichen oder z.B. um technisch einfacheren Zugang zu den Messelementen zu erhalten.
Schließlich ist Aufgabe dieser Erfindung, den Anwendungsbereich von Vorrichtungen mit Substraten für die Erfassung von mehreren Meßparametern auszurüsten. Angestrebte Meßparameter sind intrazelluläre Potentiale oder Ströme wie bspw. durch Gigaseal Patch Clamp erfasst, Impedanz, Energiestoffwechsel, pH bis hin zur Messung von extrazellulären Potentialen oder zur extrazellulären Stimulation.
Diese Aufgaben werden zumindest teilweise gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1, den Verbund mit den Merkmalen des Anspruchs 18 und das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 20. Bevorzugte Ausführungen sind in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen beschrieben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme ausdrücklich zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen – wie elektrochemischer Gradient, Potential, Widerstand, Ladung und deren Verschiebung oder Veränderung – an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle, aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung

– mindestens ein erstes plattenartiges oder folienartiges Substrat aus mindestens einem ersten Material aufweist, das durchgehende Öffnungen oder Poren besitzt oder das perforierbar ist, und auf dem Zellen, einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können,
– mindestens ein zweites plattenartiges oder folienartiges Substrat aus mindestens einem zweiten Material aufweist, dem Messelemente zugeordnet sind oder auf dem sich Messelemente befinden,

Vorzugsweise ist dabei der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar.
Der Ausdruck „Substrat“ soll nach der Erfindung umfassend verstanden werden, d.h. es soll sich hier um ein Material nach Art eines Trägers, einer Grundplatte oder dergleichen handeln, an dem die zur Durchführung der Patch-Clamp-Messungen notwendigen Strukturen, Komponenten und dergleichen ausgebildet oder vorgesehen sind. Im vorliegenden Fall handelt es sich hierbei um ein flaches Substrat nach Art einer Platte oder Folie. Dies soll bedeuten, dass derartige Substrate in der Regel eine größere Breite bzw. Länge, insbesondere eine wesentlich größere Breite bzw. Länge, gegenüber der Dicke (oder Höhe) eines solchen flachen Substrats aufweisen. Breite und Länge definieren dabei die beiden Flachseiten des Substrats. Dabei wird in der Regel die Dicke eines folienartigen Substrats, das auch flexibel ausgestaltet sein kann, geringer sein als die Dicke eines plattenartigen Substrats.
„Mikrofluidische Komponenten“ oder „mikrofluidische Strukturen“ sind Komponenten, Strukturen, Bauteile und dergleichen, die eine Bevorratung, Bewegung, Mischung, Trennung oder sonstige Handhabung von flüssigen Medien auf kleinem und kleinstem Raum ermöglichen. Flüssige Medien können dabei gelöste Gase enthalten. Wie eingangs erläutert, werden bei den entsprechenden Patch-Clamp-Messungen die zu untersuchenden Membranen oder Zellen in der Regel in Form von Suspensionen in geeigneten Lösungsmitteln gehandhabt, und dabei u.a. an die entsprechende Patch-Clamp-Öffnung herangeführt oder von dieser abtransportiert. Derartige Suspensionen werden durch die genannten mikrofluidischen Komponenten und Strukturen hindurchgeführt. Das entsprechende Fachgebiet ist dem Fachmann unter dem Begriff der Mikrofluidik bekannt.
Unter „Membranen“ im Sinne der Erfindung sollen alle Trennschichten oder auch Schichten mit anderer Funktion verstanden werden, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht werden können. Es kann sich hier ohne weiteres auch um künstliche Membranen handeln, die beispielsweise in Form von Lipid-Doppelschichten realisierbar sind. Bei den sogenannten Biomembranen, die erfindungsgemäß bevorzugt untersucht werden, handelt es sich in der Regel um Trennschichten zwischen verschiedenen Bereichen innerhalb einer lebenden Zelle (intrazellulär) oder auch zwischen dem Inneren einer Zelle und dem Zellaußenraum. Dementsprechend ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl einzelne Membranfragmente, vollständige Membranen oder auch vollständige Zellen zu untersuchen. Auch Zellverbunde sollen von der Erfindung mit umfasst sein.
Die Zuordnung der beiden Substrate kann erfindungsgemäß beispielsweise so erfolgen, dass sich das zweite Substrat auf derselben Seite des ersten Substrats befindet wie die Zellen, an deren Membran die Messung durchgeführt werden soll. Dementsprechend befinden sich bei solchen Ausführungsformen die Zellen mit ihren Membranen zwischen dem ersten Substrat und dem zweiten Substrat.
Bei anderen Ausführungsformen wird die Zuordnung zwischen den beiden Substraten so realisiert, dass sich das zweite Substrat auf der den Zellen gegenüberliegenden (abgewandten) Seite des ersten Substrats befindet.
Grundsätzlich kann die Zuordnung der beiden Substrate, d.h. insbesondere deren Verbindung oder deren Zusammenfügen, mechanisch, pneumatisch, magnetisch, elektrostatisch, chemisch oder durch Kapillarkräfte bewirkt werden. Die entsprechenden Kräfte sorgen dann dafür, dass die beiden Substrate nahe aneinander oder nahe aufeinander gebracht und ggf. auch dort gehalten werden können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist mit Vorteil zusätzliche Mittel zum Ausrichten und/oder zum Abstandhalten der beiden Substrate bei deren Zuordnung auf, wobei es sich bei diesen Mitteln vorzugsweise um insbesondere zueinander passende Vertiefungen, Ausnehmungen, Erhebungen und dergleichen im ersten Substrat und/oder im zweiten Substrat handelt.
Das Ausrichten der beiden Substrate zueinander, d.h. deren Justieren kann optisch, mechanisch, elektromechanisch, elektrisch, magnetisch oder akustisch erfolgen, wobei die in diesen Fällen verwendeten Mittel dann dafür sorgen, dass die beiden Substrate in der richtigen geometrischen Anordnung, ggf. im richtigen Abstand zueinander, ausgerichtet sind und bleiben.
In Weiterbildung ist mit der Zuordnung der beiden Substrate mindestens ein Kanal ausgebildet, der fluidisch und/oder elektrisch kontaktierbar ist, wobei vorzugsweise mit Hilfe des Kanals der Abstand der beiden Substrate einstellbar, insbesondere hydraulisch oder pneumatisch einstellbar, ist.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung beträgt die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats oder des zweiten Substrats zwischen 0,1 µm und 1 mm, vorzugsweise zwischen 0,1 µm und 100 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 20 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 10 µm.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorzugsweise die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats kleiner als die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des zweiten Substrats, wobei vorzugsweise die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats das 0,2-fache bis 0,8-fache, insbesondere das 0,3-fache bis 0,6-fache der Gesamtdicke oder Gesamthöhe des zweiten Substrats beträgt.
Erfindungsgemäß ist es weiter bevorzugt, wenn der Durchmesser bzw. die größte Querschnittsabmessung der Öffnung oder Pore im ersten Substrat zwischen 0,01 µm und 1 mm, vorzugsweise zwischen 0,01 µm und 100 µm, insbesondere zwischen 0,01 µm und 20 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 20 µm, beträgt.
Die flächigen Abmessungen der erfindungsgemäß verwendeten ersten und zweiten Substrate, d.h. die Abmessungen von deren Flachseiten liegen in der Größenordnung der Abmessungen üblicher Zellkultur-Behältnisse. Hier sind flächige Abmessungen dieser Behältnisse, die es in sehr vielen Größen und Formen gibt, zwischen 1 mm² und 1000 cm² zu nennen. Bevorzugt sind flächige Abmessungen einer üblichen Mikrotiterplatte, beispielsweise mit Seitenlängen von 8 cm auf 12 cm. Als übliche Abmessungen sind auch diejenigen üblicher Zellkulturbehältnisse zwischen 10 cm² und 250 cm² zu nennen, beispielsweise Behältnisse mit Flächen von 25 cm², 75 cm² und 175 cm². Selbstverständlich können auch beliebig kleinere Substrate eingesetzt werden, die beispielsweise auch nur einen Teil eines genannten Behältnisses abdecken.
In Weiterbildung handelt es sich bei dem ersten Material des ersten Substrats vorzugsweise um ein dielelektrisches Material, insbesondere um Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Aluminiumoxid, Glas und/oder um einen Kunststoff.
Alternativ kann es sich bei dem ersten Material des ersten Substrates vorzugsweise um ein Metall, eine mit Metall beschichtete Folie und/oder einen leitfähigen Kunststoff handeln, wobei vorzugsweise die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats zwischen 1 µm und 20 µm beträgt.
In Weiterbildung ist bei der Vorrichtung das erste Substrat vorzugsweise aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Materialien aufgebaut, wobei vorzugsweise mindestens eine den Zellen oder den ähnlichen Strukturen zugewandte Schicht aus mindestens einem ersten Material besteht.
In diesem Zusammenhang ist hervorzuheben, dass insbesondere auf dem ersten Substrat sogenannte funktionelle Beschichtungen vorgesehen sein können, mit deren Hilfe die Immobilisierung von Zellen oder ähnlichen Strukturen auf dem entsprechenden Substrat beeinflusst werden kann. Solche funktionellen Beschichtungen sind vorzugsweise um die Öffnungen oder Poren des ersten Substrats herum vorgesehen.
Funktionelle Beschichtungen dienen beispielsweise der Auswahl der zu kontaktierenden Zellen aus einer Suspension heraus, die die entsprechenden Zielzellen neben anderen Zellen oder Strukturen enthält. Dieser isolierte Aspekt der Erfindung ist beispielsweise in der WO 02/03058 A2 beschrieben, deren Offenbarung zumindest diesbezüglich durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht wird.
Vorzugsweise ist bei der Erfindung dem ersten Substrat mindestens eine Messkammer zugeordnet, in der beispielsweise die Zelle mit der zu untersuchenden Membran während des Messvorgangs an der entsprechenden Öffnung oder Pore im ersten Substrat festgelegt oder immobilisiert ist. Dabei erfolgt die Kontaktierung dieser Messkammern im ersten Substrat vorzugsweise auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite des ersten Substrats über die Flüssigkeitsbrücken, die durch die im ersten Substrat vorhandenen Öffnungen bzw. Poren entstehen. Ggf. kann mit Vorteil die Feuchtigkeit auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite (Unterseite des ersten Substrats) gesteuert und ggf. begrenzt werden über die Hydrophobie bzw. Hydrophilie des Materials des ersten Substrats an dieser den Zellen gegenüberliegenden Seite.
Bei den Messelementen, die dem zweiten Substrat zugeordnet sind oder sich auf diesem befinden, kann es sich bei der Erfindung vorzugsweise um Elektroden und/oder um Biosensoren handeln, wobei vorzugsweise die Elektroden planar oder insbesondere in Form dreidimensionaler Körper wie Nadel, Zylinder, Pyramide, Würfel, Tetraeder, Prisma, Pilzform u.a. ausgebildet sind.
Die genannten Elektroden können dabei vorzugsweise die Kontaktierung von Flüssigkeitsbrücken, die Messung von Sauerstoff oder anderen gelösten Gasen, die Messung des pH-Wertes oder die Messung von extrazellulären Potentialen vermitteln, und die extrazelluläre Stimulation mit Spannungs- und/oder Strompulsen.
Die Messelemente können dabei durch chemische oder physikalische Verfahren in das zweite Substrat und ggf., sofern von Vorteil, auch in das erste Substrat, eingebracht oder auf dieses aufgebracht werden. Alternativ oder zusätzlich können hier auch Prägeverfahren, wie das sogenannte Mikro-Imprinting zum Einsatz kommen.
Bezüglich der als Messelemente verwendeten Elektroden ist es von Vorteil, wenn auf dem ersten Substrat mindestens eine Elektrode vorgesehen ist, wobei vorzugsweise den beiden Seiten dieses ersten Substrats jeweils mindestens eine Elektrode zugeordnet ist. Sind die Flachseiten der Substrate im Funktionszustand der erfindungsgemäßen Vorrichtung horizontal angeordnet, so befinden sich dann die entsprechenden Elektroden oberhalb und/oder unterhalb des ersten Substrats.
In den Fällen, in denen das erste Substrat (mindestens teilweise) aus einem leitfähigen Material besteht, kann das Material des Substrats selbst die entsprechende Elektrode bilden, wobei vorzugsweise im Falle von vorhandenen Messkammern pro Messkammer mindestens eine Elektrode vorgesehen ist.
Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Vorrichtung auf dem zweiten Substrat als Messelement mindestens einen Kanal, vorzugsweise eine Vielzahl von Kanälen, nach Art einer Patch-Clamp-Pipette auf, die vom zweiten Substrat im Wesentlichen vertikal abragen, und durch deren Inneres zumindest während des Messvorgangs eine fluidische, insbesondere mikrofluidische, Kontaktierung möglich ist.
Bei Vorhandensein dieser Kanäle (Patch-Clamp-Pipetten) ist ein Zusammenbringen des ersten Substrats und des zweiten Substrats in der Weise möglich, dass die Kanäle/Pipetten auf dem zweiten Substrat an die Öffnungen/Poren des ersten Substrats herangeführt und ggf. sogar durch diese Öffnungen/Poren hindurchgeführt werden können. Auf diese Weise kann auch das Durchstoßen einer auf dem ersten Substrat vorhandenen Perforation erfolgen. Durch die beschriebene Vorgehensweise wird es möglich, dass die Kanäle/Pipetten zu den Zellen auf dem ersten Substrat vordringen und diese kontaktieren. Dadurch wird dann der eigentliche Messvorgang bei solchen Ausführungsformen in besonders effektiver Weise ermöglicht.
Bei den genannten Ausführungsformen ist es von Vorteil, wenn jedem Kanal / jeder Pipette eine Elektrode zugeordnet ist, die sich entweder innerhalb des Kanals / der Pipette befindet oder im mikrofluidischen oder sogar makrofluidischen Zufluss zu diesem Kanal / zu dieser Pipette.
Mit Vorteil sind bei der Erfindung insgesamt, und insbesondere bei den zuletzt genannten Ausführungsformen, pro Quadratmillimeter (mm²) bis zu 4000 Känäle/Pipetten bzw. Messkontakte auf dem zweiten Substrat vorhanden.
Die Kanäle nach Art einer Patch-Clamp-Pipette auf dem zweiten Substrat besitzen dabei insbesondere eine Länge bzw. Höhe zwischen 0,1 µm und 1 mm, einen äußeren Durchmesser bzw. eine äußere größte Querschnittsabmessung zwischen 0,1 µm und 1 mm, und eine Wandstärke zwischen 0,01 µm und 500 µm.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise weiter dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zweiten Material des zweiten Substrats mindestens teilweise um einen Halbleiter oder insbesondere um ein dielektrisches Material handelt, das insbesondere zur Ausbildung eines sogenannten Gigaseals geeignet ist, wobei es sich bei dem zweiten Material vorzugsweise um Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Aluminiumoxid und/oder Glas handelt.
Auch das zweite Substrat ist vorzugsweise aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Materialien aufgebaut.
In Weiterbildung ist die Vorrichtung vorzugsweise so ausgestaltet, dass nur die auf dem zweiten Substrat vorgesehenen Kanäle nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mindestens teilweise aus dem Halbleiter oder insbesondere mindestens teilweise aus dem dielektrischen Material bestehen, wobei vorzugsweise nur der Bereich der Enden der vom zweiten Substrat abragenden Kanäle, d.h. die Spitzen der sogenannten Patch-Clamp-Pipetten, aus diesem Material gefertigt sind.
Weiter umfasst die Erfindung einen Verbund aus zwei plattenartigen oder folienartigen Substraten zur Verwendung bei der Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, wobei ein erstes Substrat aus mindestens einem ersten Material durchgehende Öffnungen oder Poren besitzt oder perforierbar ist, und auf diesem Substrat Zellen, einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können, und ein zweites Substrat aus mindestens einem zweiten Material, dem Messelemente zugeordnet sind oder auf dem sich Messelemente befinden, vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten, einander zugeordnet sind, insbesondere miteinander reversibel oder irreversibel verbunden, vorzugsweise zusammengefügt, sind.
Bei diesem Verbund ist vorzugsweise der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar.
Bezüglich weiterer bevorzugter Merkmale des erfindungsgemäßen Verbunds aus mindestens einem ersten Substrat und mindestens einem zweiten Substrat wird ausdrücklich auf die bisherigen Ausführungen im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen. Die dort genannten Merkmale können, soweit sie sich auf die Substrate beziehen, auch Gegenstand des beanspruchten Verbunds sein.
Schließlich umfasst die Erfindung noch ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen – wie elektrochemischer Gradient, Potential, Widerstand, Ladung und deren Verschiebung oder Veränderung – an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, dadurch gekennzeichnet, dass zwei plattenartige oder folienartige Substrate vorgesehen sind, wobei ein erstes Substrat aus mindestens einem ersten Material durchgehende Öffnungen oder Poren besitzt oder perforierbar ist, und auf diesem Substrat Zellen, einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können, und wobei einem zweiten Substrat aus mindestens einem zweiten Material Messelemente zugeordnet sind oder sich Messelemente auf diesem Substrat befinden, und wobei das erste Substrat und das zweite Substrat für den zur Bestimmung der Messgrößen vorgesehenen Messvorgang, vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten, entweder bereits im einander zugeordneten, insbesondere im miteinander verbundenen Zustand bereitgestellt oder unmittelbar vor dem Messvorgang einander zugeordnet, insbesondere miteinander verbunden werden.
Bei diesem Verfahren ist vorzugsweise der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar.
Bezüglich weiterer bevorzugter Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ausdrücklich auf die bisherigen Ausführungen im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen. Die dort genannten Merkmale können auch Gegenstand des beanspruchten Verfahrens sein.
Gemäß der Erfindung weist die Vorrichtung also vorzugsweise mindestens ein plattenartiges oder folienartiges Substrat aus einem ersten Material (wahlweise leitend oder nicht leitend) auf, das insbesondere nicht gigasealfähig ist. Das Substrat ist sehr dünn und leicht perforierbar oder mit durchgehenden Öffnungen versehen. Vorzugsweise ist es dünner oder weniger dick als die Pipetten des zweiten Substrates (welches ebenso wahlweise leitend oder nicht leitend konfiguriert werden kann) hoch sind. Das zweite Substrat – plattenartig oder folienartig – enthält Messelemente und ist vorzugsweise gigaseal-fähig. Vorzugsweise befinden sich darauf eine oder mehrere Pipettenspitzen, die mikrofluidisch kontaktiert sind. Ggf. sind nur die Pipetten gigasealfähig, ggf. auch nur an der Spitze der Pipetten.
Für den Messvorgang wird das zweite Substrat mit dem ersten Substrat zusammengefügt. Das Zusammenfügen der beiden Substrate kann dabei irreversibel erfolgen, beispielsweise durch eine Verklebung, oder reversibel mit Hilfe von lösbaren Verbindungen. Beim Zusammenfügen dringen vorzugsweise die Pipetten des zweiten Substrates in die Öffnungen des ersten Substrates ein oder perforieren das erste Substrat.
Die Öffnungen oder Poren im ersten Substrat sind erfindungsgemäß durchgehend, d.h. sie verlaufen von einer Seite des Substrats (ggf. dessen “Oberseite“ im Funktionszustand) zur anderen Seite des Substrats (ggf. dessen „Unterseite“). Vorzugsweise weisen diese Öffnungen/Poren eine kreisförmige Querschnittsfläche auf, wobei jedoch grundsätzlich auch andere Querschnittsformen (quadratisch, rechteckförmig, oval o.a.) möglich sind. Die Querschnittsfläche der Öffnungen/Poren kann über den Verlauf der Öffnung/Pore konstant sein oder sich zu einer Seite des Substrats verjüngen.
Die Pipetten auf dem zweiten Substrat ragen über die Substratgrundfläche dieses zweiten Substrates bis zu 1000 µm hinaus, bevorzugt jedoch nur wenige 10 µm, bevorzugt jedoch nur wenige µm.
Es versteht sich, dass in einem Substrat nicht nur Öffnungen oder Pipetten gleichen Typs (bzgl. Größe, Form und dgl.) vorgesehen sein können, sondern gleichzeitig unterschiedliche Öffnungen und Pipetten verschiedenen Typs.
Die Öffnungen und auch die Pipetten können in beliebiger Weise in die entsprechenden Materialien, aus denen die Substrate gebildet sind, eingebracht sein. Vorzugsweise werden die Öffnungen und die Pipetten jedoch chemisch oder physikalisch erzeugt, beispielsweise durch einen Ätzvorgang mit Chemikalien.
Zur Messung werden Zellen oder Gewebe auf das erste Substrat aufgebracht und ggf. dort kultiviert. Die Messung erfolgt sofort nach dem Aufbringen der Zellen/Gewebe oder nach beliebiger Zeit der Zellen/Gewebe in Kultur.
Wesentliche Punkte bei der Erfindung sind auch noch drei „enabling factors“

1) Mit der Erfindung ist es möglich, dass die beiden Substrate für die Messung nahe zueinander gebracht werden. Dabei entsteht ein separater Kanal, der fludisch kontaktiert wird. Vorzugsweise dringen dabei die Pipetten im zweiten Substrat durch die Perforationen des ersten Substrats oder durch die vorhandenen Öffnungen im ersten Substrat zu den auf dem ersten Substrat befindlichen Zellen vor und stellen den Messkontakt (vorzugsweise mit Gigaseal) her. Nach der Messung können die beiden Substrate wieder getrennt und die Zellen auf dem ersten Substrat 1 ggf. weiter kultiviert werden.
2) Das Herauslaufen von Flüssigkeit durch die Öffnungen des ersten Substrates während der Handhabung des ersten Substrates (solange erstes und zweites Substrat nicht zusammengefügt sind) kann durch geeignete Maßnahmen verhindert werden, z.B. durch eine hydrophobe Unterseite am ersten Substrat oder bspw. durch eine mit Flüssigkeit gefüllte Transportschale für das erste Substrat.

Benutzte Pipetten auf dem zweiten Substrat werden vor einer erneuten Benutzung „abisoliert“, d.h. elektrisch und/oder fluidisch abgetrennt. Nicht benutzte Pipetten, d.h. solche Pipetten, die beim vorherigen Messvorgang nicht zu einer Zelle vorgedrungen sind und zu einem Messvorgang verwendet wurden, können ohne Reinigungsschritt erneut selektiv benutzt werden. Nach Reinigung können alle Pipetten, benutzt oder unbenutzt, die nicht während der Benutzung mechanisch zerstört wurden, erneut verwendet werden.
Vor dem Zusammenbringen von Substrat eins und Substrat zwei kann eine ausgewählte Untermenge der Pipetten mit Hilfe einer Auswahl/Steuerung der mikrofluidischen Kontaktierung (gezielt) abisoliert werden, so dass die entsprechenden Pipetten keinen Messvorgang durchführen und so unbenutzt bleiben.

3) Durch die mikrofluidische Kontaktierung der Pipetten ist auch intrazelluläre Perfusion möglich.

Der Vollständigkeit halber wird darauf hingewiesen, dass das Substrat bzw. der Träger/die Aufnahme nicht notwendigerweise vollständig aus den entsprechenden Materialien (erstes Material und/oder zweites Material) bestehen müssen. Es kann sich hier auch um Beschichtungen aus den entsprechenden Materialien handeln, die dann beispielsweise auf einen Grundkörper aus einem ganz anderen Material, beispielsweise einem Kunststoffmaterial, aufgebracht sind.
Neben der Forschung an elektrisch aktiven Geweben wird mit der Erfindung auch bspw. der Einsatz in der Krebsdiagnostik ermöglicht, z.B. um die Empfindlichkeit von aus dem menschlichen Körper entnommenen (ex vivo) Krebszellen auf unterschiedliche Chemotherapeutika in vitro zu untersuchen.
Besondere Aspekte der Erfindung lassen sich auch durch die folgende Beschreibung darstellen:
Array von Messkammern auf einem perforierten oder perforierbaren ersten Substrat gleich welchen Materials mit an die jeweilige Messgröße angepasster Anordnung und Durchmesser (0,01–1.000 µm) der Öffnungen und Stärke (0,1–1.000 µm), auf welchem ersten Substrat einzelne oder suspendierte Zellen oder Gewebestücke oder natürliche oder künstliche Vesikel durch Gravitation und/oder Flüssigkeitsströmung platziert werden oder auf dem Zellkulturen oder Gewebekulturen wachsen oder aufgebracht werden. Das erste Substrat ist dabei mit Beschichtung und/oder mechanischer, chemischer oder biologischer Oberflächenmodifikation so versehen, dass das Wachstum oder die Anhaftung der Zellkultur stimuliert oder gehemmt oder die Sauerstoffmessung, pH-Messung oder extrazelluläre Messung verbessert oder erleichtert werden, z.B. durch Beschichtung mit Poly-Lysin oder anderen Proteinen. Messelektroden oder Messeinrichtungen für Sauerstoffmessung, pH-Messung oder extrazelluläre Messung oder Stimulation sind entweder auf dem Substrat oder unter dem Substrat aufgebracht oder ins Substrat eingebracht.
Erfindungsgemäß wird ein zweites Substrat, insbesondere aus Silicium, Siliciumoxid oder Glas an das erste Substrat so nahe herangebracht, dass die Pipetten auf dem zweiten Substrat in das erste Substrat eindringen und es ggf. durchdringen und so das durch die Pipetten auf dem zweiten Substrat Teraseals oder jedenfalls Gigaseals an den Zellen auf dem ersten Substrat ermöglicht werden. Jedenfalls so nahe, dass mit den Meßelementen auf dem zweiten Substrat an den Zellen auf dem ersten Substrat Messungen vorgenommen werden können.
Die Zellen auf dem ersten Substrat können sich alternativ auf der gleichen Seite wie das zweite Substrat befinden und so die Annäherung des zweiten Substrates an die Zellen erleichtern.
Die resultierende Sandwich-Struktur aus erstem und zweitem Substrat wird vorzugsweise nur für den Vorgang der Messung aufrechterhalten. Das zweite Substrat mit den Pipetten oder den ihm eigenen Messelementen besteht aus einem Träger aus bspw. Silicium, Siliciumoxid oder Glas und enthält vorzugsweise mikrofluidisch kontaktierte Pipetten (0,1–1.000 µm stark, 0,1–1.000 µm hoch) aus Siliciumoxid, Siliciumnitrid, Aluminiumoxid oder anderen dielektrischen Materialien, die einen Gigaseal ermöglichen. Das Verhältnis von Pipetten zu Messkammern beträgt n:m. Erstes Substrat mit den Messkammern und zweites Substrat sind direkt oder über ein Verbindungselement verbunden.
Je eine oder mehrere Elektrode(n) sind oberhalb und je eine oder mehrere Elektrode(n) unterhalb des ersten Substrates so angeordnet, dass sich in jeder Messkammer mindestens eine Elektrode befindet, die zur Erfassung von extrazellulären Potentialen wie Spikes, Summen- oder Feldpotentialen, zur Impedanzmessung und zum intrazellulären Spannungs- und Strom-Klemme geeignet ist.
Zusätzlich sind eine oder mehrere sauerstoffsensitive Elektrode(n) und eine oder mehrere pH-sensitive Elektrode(n) oberhalb oder unterhalb des ersten Substrates oder auf beiden Seiten der Substrates so angeordnet, dass sich in jeder Messkammer mindestens eine sauerstoffsensitive oder eine pH-sensitive Elektrode befinden, die zur Erfassung bspw. des Energiestoffwechsels geeignet sind.
Zusätzlich sind ein oder mehrere Kanäle auf der Ober- und Unterseite des ersten Substrat und des zweiten Substrat angeordnet, die das Einbringen von Zellen und den Wechsel von Medien, von Nährstoffen, von Porenbildnern für Perforated Patch und von pharmakologisch, biologisch oder chemisch aktiven Substanzen ermöglichen.
Die genannten und weitere Merkmale sowie Vorteile der Erfindung ergeben sich auch aus der nun folgenden Beschreibung von Figuren in Verbindung mit den Unteransprüchen. Dabei können die einzelnen Merkmale der Erfindung für sich alleine oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
In den Zeichnungen zeigen
1 eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in schematischer Schnittansicht
2 eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in schematischer Schnittansicht,
3 die zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer weiteren Anwendung und
4 die zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer noch weiteren Anwendung.
Gemäß 1 umfasst die Vorrichtung 1 zwei Substrate 2 und 4, die plattenartig oder folienartig ausgebildet sind. Das erste Substrat 2 besitzt mehrere, insbesondere eine Vielzahl von Öffnungen oder Poren 3, die durch das Substrat 2 in vertikaler Richtung hindurchgehen. Im dargestellten Fall der 1 handelt es sich dabei um Poren 3 mit einer im Wesentlichen kreisförmigen Querschnittsfläche.
Weiter zeigt 1 das zweite Substrat 4, bei dem mehrere, vorzugsweise eine Vielzahl von Kanälen 7 nach Art einer Patch-Clamp-Pipette in vertikaler Richtung von der Grundfläche des Substrats 4 abragen. Die Kanäle 7 sind, was in 1 zeichnerisch nicht im Einzelnen dargestellt ist, im Inneren hohl, so dass durch diese Kanäle hindurch beispielsweise ein Flüssigkeitsaustausch und/oder eine elektrische Kontaktierung ermöglicht ist.
Weiter sind gemäß 1 bei der Vorrichtung 1 auf den Substraten 2 und 4 Mittel 5, 6 vorgesehen, die zum Ausrichten oder Justieren der beiden Substrate 2 und 4 zueinander vorgesehen sind. Im dargestellten Fall der 1 handelt es sich bei dem am Substrat ausgebildeten Mittel 5 um eine Ausnehmung oder Vertiefung, die mit einem dazu (mindestens teilweise) passenden Mittel 6 in Form einer Erhebung auf dem Substrat 4 derart zusammenwirken kann, dass die Lage der beiden Substrate 2 und 4 zueinander definiert ist. Auf diese Weise wird die Zuordnung der beiden Substrate 2 und 4 zueinander, insbesondere deren Verbindung, beispielsweise in Form eines Zusammenfügens in einfacher Weise ermöglicht.
Das Ausrichten der beiden Substrate 2 und 4 zueinander, mit Hilfe der Mittel 5 und 6, erfolgt dabei vorzugsweise in der Weise, dass die pipettenartigen Kanäle 7 auf dem Substrat 4 in eine richtige Lage für ein Zusammenwirken mit den Poren auf dem Substrat 2 gebracht werden.
Flüssigkeitszuleitungen, beispielsweise zu den Pipetten 7 auf dem Substrat 4 sowie eine elektrische Kontaktierung, insbesondere über entsprechende Elektroden, sind in 1 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt. Nicht dargestellt ist auch, dass an die Zellen durch alle Zugänge jeweils Substanzen angespült werden können, die auf die Membranen, Ionenkanäle oder Zellen wirken. Diese Substanzen können auch Gase sein. Der jeweilige Partialdruck der unterschiedlichen Gase kann dabei gezielt eingestellt oder gemessen werden, z.B. um mittels Sauerstoffpartialdruck anaeroben von aerobem Stoffwechsel zu unterscheiden oder zu bewirken oder mittels Stickstoffmonoxid (NO) spezifische Rezeptoren anzusprechen.
Die Vorrichtung 1 gemäß 1 kann in unterschiedlicher Weise erfindungsgemäß verwendet werden. So ist es zum einen beispielsweise möglich, Zellen, deren Membranen untersucht werden sollen, zwischen dem (ersten) Substrat 2 und dem (zweiten) Substrat 4 anzuordnen. Zum anderen ist es beispielsweise auch möglich, entsprechende Zellen auf der (Flach-)Seite des (ersten) Substrats 2 anzuordnen, die dem (zweiten) Substrat 4 abgewandt ist. In der gemäß 1 gewählten Darstellung liegen dabei die Zellen auf der Oberseite (oberen Flachseite) des (ersten) Substrats 2.
Die beiden zuletzt geschilderten Möglichkeiten werden im Zusammenhang mit den weiteren Figuren noch näher erläutert.
Die in 2 dargestellte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 11 unterscheidet sich von der in 1 dargestellten Ausführungsform im Wesentlichen nur dadurch, dass anstelle der in 1 dargestellten Mittel 5 und 6 andere Mittel 12 und 13 zum Ausrichten und Abstandhalten der beiden Substrate voneinander vorgesehen sind.
Bei den Mitteln 12 und 13 handelt es sich um eine der Ausnehmung 5 in 1 vergleichbare Ausnehmung 12 im Substrat 2. Diese Ausnehmung kann mit einer vertikal verschiebbaren Erhebung 13 auf dem Substrat 4 zusammenwirken, so dass der Abstand der beiden Substrate 2 und 4 zueinander bei der Vorrichtung 11 variabel einstellbar ist.
Sobald die beiden Substrate 2 und 4 so nahe aneinander herangeführt sind, dass das Mittel 13 auf dem Substrat 4 mit dem Mittel 12 auf dem Substrat 2 zusammenwirkt, wird zwischen den beiden Substraten ein Kanal 14 ausgebildet, der eine fluidische und/oder elektrische Kontaktierung der beiden Substrate 2 und 4 miteinander erlaubt. Die Breite (bzw. in der Darstellung gemäß 2 die Höhe) dieses Kanals 14 kann mit Hilfe der variabel einstellbaren Mittel 12 und 13 variiert und in gewünschter Weise eingestellt werden. Diese Einstellungsmöglichkeit ist in der 2 mit dem Doppelpfeil am Mittel 13 symbolisch dargestellt.
Weiter zeigt 2 bei der dort dargestellten Vorrichtung 11 die Möglichkeit der Anordnung und Immobilisierung von Zellen 15 zwischen den beiden Substraten 2 und 4. Dabei können innere oder äußere Membranen dieser Zellen 15 in einer solchen Anordnung durch eine entsprechende Patch-Clamp-Messung untersucht werden. Diese Möglichkeit ist in 2 bei der linken und der mittleren Zelle 15 dargestellt. Dort sind die entsprechenden beiden Zellen auf den jeweiligen Spitzen der beiden Pipetten 7 immobilisiert und für eine Patch-Clamp-Messung bereit.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung 11 zeigt 3. Wie in 2 unterscheidet sich Vorrichtung 11 von der Vorrichtung 1 gemäß 1 im Wesentlichen nur durch die Mittel zum Ausrichten und Abstandhalten der beiden Substrate 2 und 4.
Gemäß 3 sind die beiden Substrate 2 und 4 derart einander zugeordnet, dass sie fast vollständig miteinander zusammengefügt sind. Der (noch) resultierende schmale Abstand der beiden Substrate 2 und 4 voneinander kann mit Hilfe der Mittel 12 und 13 vorgegeben und eingestellt werden. Auch hier verbleibt zwischen dem (ersten) Substrat (2) und dem (zweiten) Substrat 4 ein Kanal 14, über den eine fluidische und/oder elektrische Kontaktierung möglich ist.
In der Ausführung gemäß 3 haben die auf dem Substrat 4 ausgebildeten pipettenartigen Kanäle 7 die ihnen zugeordneten Öffnungen/Poren 3 durchstoßen, wobei die Spitzen dieser pipettenartigen Kanäle, wie in 3 dargestellt, vorzugsweise über die obere Flachseite des Substrats 2 hinausragen können.
Bei einer Ausführung wie in 3 sind auch Substrate 2 einsetzbar, bei denen die Öffnungen und Poren 3 im ursprünglichen Zustand noch nicht oder noch nicht vollständig ausgebildet sind. In solchen Fällen handelt es sich also um eine Ausführung, bei der das Substrat 2 perforierbar ist. Dann wird die eigentliche Öffnung/Pore 3 erst dann (fertig) ausgebildet, wenn der zugehörige pipettenartige Kanal 7 das perforierbare Substrat 2, hier in vertikaler Richtung, durchstößt.
Bei der Ausführung gemäß 3 sind an der oberen Flachseite des Substrats 2, d.h. auf der dem Substrat 4 eigentlich abgewandten Seite, Zellen 15 angeordnet oder immobilisiert. Dabei stehen gemäß 3 diejenigen drei Zellen 15 für eine Patch-Clamp-Messung bereit, die auf der jeweiligen Spitze der Kanäle 7 festgelegt sind. In der Darstellung gemäß 3 sind dies die Zelle 15 links außen und die beiden rechts angeordneten Zellen 15.
4 zeigt schließlich eine weitere Anwendung, bei der ebenfalls die erfindungsgemäße Vorrichtung 11 eingesetzt werden kann. Bei dieser Ausführung ist mit Hilfe der Mittel 12 und 13 ein vergleichsweise großer Abstand zwischen dem (ersten) Substrat 2 und dem (zweiten) Substrat 4 eingestellt. Der daraus resultierende Kanal 14 ist also vergleichsweise breit (bzw. hoch in der Darstellung gemäß 4).
Trotzdem kann auch in solchen Fällen eine erfindungsgemäße Messung durchgeführt werden, und zwar über die beiden Flüssigkeitsbrücken, die in der 4 als ovale Bereiche 16 dargestellt sind. Auf diese Weise wird ein fluidischer Kontakt zwischen der Flüssigkeit, die sich in den pipettenartigen Kanälen 7 befindet, und den Zellen/Zellmembranen mit Hilfe dieser Bereiche 16 bereitgestellt. Diese Kontaktierung erfolgt dann durch das Substrat 2 hindurch, ohne dass die Kanäle 7, wie beispielsweise bei der Ausführung gemäß 3, direkt mit der Zelle bzw. deren Membran in Kontakt gebracht werden müssen.
Die elektrische Kontaktierung erfolgt bei der Ausführung gemäß 4, genauso wie bei den Ausführungen gemäß den 1 bis 3, durch Elektroden, die auf dem Substrat 4 und/oder in den Kanälen 7 vorgesehen sind, und mit Hilfe von Elektroden, die sich oberhalb des Substrats 2 befinden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 02/10747 A2 [0002]
US 2006/0194255 A1 [0003]
WO 02/03058 A2 [0031]

Claims

Vorrichtung (1; 11) zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen – wie elektrochemischer Gradient, Potential, Widerstand, Ladung und deren Verschiebung oder Veränderung – an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle, aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung – mindestens ein erstes plattenartiges oder folienartiges Substrat (2) aus mindestens einem ersten Material aufweist, das durchgehende Öffnungen oder Poren (3) besitzt oder das perforierbar ist, und auf dem Zellen (15), einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können, – mindestens ein zweites plattenartiges oder folienartiges Substrat (4) aus mindestens einem zweiten Material aufweist, dem Messelemente (3) zugeordnet sind oder auf dem sich Messelemente befinden, wobei das erste Substrat (2) und das zweite Substrat (4) zumindest während des Messvorgangs für die Bestimmung der entsprechenden Messgrößen, vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten, einander zugeordnet sind, insbesondere miteinander verbunden oder miteinander verbindbar, vorzugsweise zusammengefügt oder zusammenfügbar, sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar, ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche Mittel (5, 6; 12, 13) zum Ausrichten und/oder zum Abstandhalten der beiden Substrate bei deren Zuordnung vorgesehen sind, wobei es sich bei diesen Mitteln vorzugsweise um insbesondere zueinander passende Vertiefungen, Ausnehmungen, Erhebungen und dergleichen im ersten Substrat und/oder im zweiten Substrat handelt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Zuordnung der beiden Substrate mindestens ein Kanal (14) ausgebildet ist, der fluidisch und/oder elektrisch kontaktierbar ist, wobei vorzugsweise mit Hilfe des Kanals der Abstand der beiden Substrate einstellbar, insbesondere hydraulisch oder pneumatisch einstellbar, ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats oder des zweiten Substrats zwischen 0,1 µm und 1 mm, vorzugsweise zwischen 0,1 µm und 100 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 20 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 10 µm, beträgt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats kleiner ist als die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des zweiten Substrats, wobei vorzugsweise die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats das 0,2-fache bis 0,8-fache, insbesondere das 0,3-fache bis 0,6-fache der Gesamtdicke oder Gesamthöhe des zweiten Substrats beträgt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser bzw. die größte Querschnittsabmessung der Öffnung oder Pore im ersten Substrat zwischen 0,01 µm und 1 mm, vorzugsweise zwischen 0,01 µm und 100 µm, insbesondere zwischen 0,01 µm und 20 µm, insbesondere zwischen 0,1 µm und 20 µm, beträgt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Material des ersten Substrats um ein dielelektrisches Material, insbesondere um Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Aluminiumoxid, Glas und/oder um einen Kunststoff handelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Material des ersten Substrates um ein Metall, eine mit Metall beschichtete Folie und/oder einen leitfähigen Kunststoff handelt, wobei vorzugsweise die Gesamtdicke oder Gesamthöhe des ersten Substrats zwischen 1 µm und 20 µm beträgt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Substrat aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Materialien aufgebaut ist, wobei vorzugsweise mindestens eine den Zellen oder den ähnlichen Strukturen zugewandte Schicht aus mindestens einem ersten Material besteht.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Messelementen, die dem zweiten Substrat zugeordnet sind oder sich auf diesem befinden, um Elektroden und/oder um Biosensoren handelt, wobei vorzugsweise die Elektroden planar oder insbesondere in Form dreidimensionaler Körper wie Nadel, Zylinder, Pyramide, Würfel, Tetraeder, Prisma, Pilzform u.a. ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Elektroden die Kontaktierung von Flüssigkeitsbrücken, die Messung von Sauerstoff oder anderen gelösten Gasen, die Messung des pH-Wertes oder die Messung von extrazellulären Potentialen vermittelt wird, und die extrazelluläre Stimulation mit Spannungs- und/oder Strompulsen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem zweiten Substrat als Messelement mindestens ein Kanal (7), vorzugsweise eine Vielzahl von Kanälen, nach Art einer Patch-Clamp-Pipette ausgebildet sind, die vom zweiten Substrat im Wesentlichen vertikal abragen, und durch deren Inneres zumindest während des Messvorgangs eine fluidische, insbesondere mikrofluidische, Kontaktierung möglich ist.
Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle nach Art einer Patch-Clamp-Pipette auf dem zweiten Substrat eine Länge bzw. Höhe zwischen 0,1 µm und 1 mm, einen äußeren Durchmesser bzw. eine äußere größte Querschnittsabmessung zwischen 0,1 µm und 1 mm, und eine Wandstärke zwischen 0,01 µm und 500 µm aufweisen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zweiten Material des zweiten Substrats mindestens teilweise um einen Halbleiter oder insbesondere um ein dielektrisches Material handelt, das insbesondere zur Ausbildung eines sogenannten Gigaseals geeignet ist, wobei es sich bei dem zweiten Material vorzugsweise um Silicium, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Aluminiumoxid und/oder Glas handelt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Substrat aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Materialien aufgebaut ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass nur die auf dem zweiten Substrat vorgesehenen Kanäle nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mindestens teilweise aus dem Halbleiter oder insbesondere mindestens teilweise aus dem dielektrischen Material bestehen, wobei vorzugsweise nur der Bereich der Enden der vom zweiten Substrat abragenden Kanäle, d.h. die Spitzen der sogenannten Patch-Clamp-Pipetten, aus diesem Material gefertigt sind.
Verbund aus zwei plattenartigen oder folienartigen Substraten zur Verwendung bei der Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, wobei ein erstes Substrat (2) aus mindestens einem ersten Material durchgehende Öffnungen oder Poren (3) besitzt oder perforierbar ist, und auf diesem Substrat Zellen (15), einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können, und ein zweites Substrat (4) aus mindestens einem zweiten Material, dem Messelemente (7) zugeordnet sind oder auf dem sich Messelemente befinden, vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten, einander zugeordnet sind, insbesondere miteinander reversibel oder irreversibel verbunden, vorzugsweise zusammengefügt, sind.
Verbund nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar, ist.
Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen – wie elektrochemischer Gradient, Potential, Widerstand, Ladung und deren Verschiebung oder Veränderung – an Membranen, die Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, insbesondere an Membranen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, dadurch gekennzeichnet, dass zwei plattenartige oder folienartige Substrate vorgesehen sind, wobei ein erstes Substrat aus mindestens einem ersten Material durchgehende Öffnungen oder Poren besitzt oder perforierbar ist, und auf diesem Substrat Zellen, einzeln oder im Gewebeverbund, oder ähnliche Strukturen zumindest vorübergehend aufgebracht oder dauerhaft kultiviert werden können, und wobei einem zweiten Substrat aus mindestens einem zweiten Material Messelemente zugeordnet sind oder sich Messelemente auf diesem Substrat befinden, und wobei das erste Substrat und das zweite Substrat für den zur Bestimmung der Messgrößen vorgesehenen Messvorgang, vorzugsweise an einander gegenüberliegenden Flachseiten, entweder bereits im einander zugeordneten, insbesondere im miteinander verbundenen Zustand bereitgestellt oder unmittelbar vor dem Messvorgang einander zugeordnet, insbesondere miteinander verbunden werden.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand der beiden Substrate vor und/oder während des Messvorgangs einstellbar, vorzugsweise variabel einstellbar, ist.