DE10047390A1

DE10047390A1 - Hochdurchsatzverfahren zum Screening von organischen Verbindungen auf einem Array von planaren lipiden Doppelschichten

Info

Publication number: DE10047390A1
Application number: DE2000147390
Authority: DE
Inventors: Vladimir Mirsky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-09-26
Filing date: 2000-09-26
Publication date: 2002-04-11

Abstract

Die vorlioegende Erfindung betrifft ein Hochdurchsatzverfahren zum Screening von organischen Verbindungen und zur Untersuchung von Effekten dieser Verbindungen auf biologischen Membranen und Komponenten biologischer Membranen. Außerdem betrifft die Erfindung eine Anordnung für die Realisierung dieser Hochdurchsatzverfahren. Die Anordnung besteht aus einem Array von planaren lipiden Doppelschichten und einem elektrischen System, welches eine schnelle Messung der elektrischen Parameter dieser Schichten erlaubt, wobei die planaren lipiden Doppelschichten durch Adsorption oder Einfügung von biologischen Molekülen modifiziert sein können. Die Erfindung kann genutzt werden für die Untersuchung von Membranpermeabilität, photodynamischen Effekten, Adsorption auf Membranen, Effekten auf Ionenkanälen, Effekten auf lipolytischen Enzymen, Hemmung von Enzymen- und Ionenkanälen und anderen Effekten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hochdurchsatzverfahren zum Screening von organischen Verbindungen und zur Untersuchung von Effekten dieser Verbindungen auf biologischen Membranen und Komponenten biologischer Membranen. Außerdem betrifft die Erfindung eine Anordnung für die Realisierung dieser Hochdurchsatzverfahren.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung eines Arrays mit planaren lipiden Doppelschichten

Die Anordnung für die Herstellung des Array von planaren lipiden Doppelschichten besteht aus zwei Platinen (Abb. 1a, b). Die untere Platine hat eine Unterlage aus Glas (1), auf der Ag/AgCl-Elektroden (2) aufgebracht sind. Auf der Platine befindet sich eine perforierte Kunststoffschicht (3) mit Hohlräumen, so daß die Ag/AgCl-Elektrode (2) sich auf dem Boden der Hohlräume befindet.

Die zweite, obere Platine besteht ebenfalls aus zwei perforierten Kunststoffschichten (5 und 7), zwischen welchen sich eine perforierte Platine aus silberbeschichtetem Platin (6) befindet. Die Oberfläche dieser Platine, die in den Hohlraum hineinragt, wurde elektrochemisch chloriert.

Die Hohlräume in der ersten, unteren Platine werden mit einem Elektrolyt, z. B. physiologische Lösung, aufgefüllt und der obere Teil der Folien wird mit einer lipiden Lösung (4), z. B. Phosphatidylcholin aus Sojabohnen in Dekan, 20 mg/ml, beschichtet. Dann wird die obere Platine, die ebenfalls mit dieser Lipidlösung beschichtet ist, aufgesetzt. Die Hohlräume der oberen Platine werden anschließend mit einem Elektrolyt aufgefüllt. Nach einigen Minuten wird eine spontane Bindung der planaren lipiden Doppelschichten (8), die oberen und untere elektrolyt-ausgefüllte Hohlräume trennen, stattfinden. Dieser Prozess kann durch Kapazitäts- oder Leitfähigkeitsmessungen beobachtet werden. Die Hohlräume, wo keine planare lipide Doppelschichten gebildet werden, werden bei der weiteren Untersuchung von Effekten von organischen Verbindungen nicht berücksichtigt.

Beispiel 2 Untersuchung von Antibiotika mit ionophorischen Eigenschaften Leitfähigkeitserhöhung

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen-Phosphatidylcholin in Dekan (30 mg/ml) und die Messung der Leitfähigkeit der lipiden Doppelschichten wurden durchgeführt. Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM TRIS, pH 7.8. Zugabe von 5 µL Valinomycin in Ethanol (bis endgültige Konzentration 10 µM), bzw. nur 5 µL Ethanol. Beobachtet wird eine starke Erhöhung der Leitfähigkeit von lipiden Doppelschichten, zu welchen Valinomycin zugeführt wurde, welche durch die Ionophoreneigenschaft des Antibiotikas Valinomycin hervorgerufen wird.

Beispiel 3 Untersuchung von Antibiotika mit kanalbildenden Eigenschaften

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Ei-Phosphatidylcholin mit Cholesterol (3 : 1) in Dekan (20 mg/ml) und die Messung der Leitfähigkeit der lipiden Doppelschichten wurden durchgeführt. Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM TRIS, pH 7.8. Zugabe von 5 µL Nystatin (Mycostatin) in Ethanol, bzw. nur 5 µL Ethanol. Beobachtet wird eine starke Erhöhung der Leitfähigkeit von lipiden Doppelschichten, zu welchen Nystatin zugeführt wurde, die durch die Bildung von Ionenkanälen des Antibiotikas Nystatin (Mycostatin) hervorgerufen wird. Die Kanäle werden auch durch Strommessungen bei konstanter Membranspannung (20 mV) als diskrete Stromwerte beobachtet.

Beispiel 4 Untersuchung von photodynamischen Effekten organischer Verbindungen

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen-Phosphatidylcholin in Dekan (50 mg/ml) und die Messung der Leitfähigkeit (mit Gleichstrom, 25 mV) der lipiden Doppelschichten. Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM K₂HPO₄, pH 6.7. Zugabe von 5 µL Haematoporphyrin dimethylether in diesem Elektrolyt (bis endgültige Konzentration 2 µM), bzw. nur 5 µL Elektrolyt. Beobachtet wird ein starkes Wachstum der Leitfähigkeit von lipiden Doppelschichten nach Beleuchtung durch weißes Licht (200 mW/cm²) (Abb. 2). Leitfähigkeit der anderen lipiden Doppelschichten, bei welchen Haematoporphyrin dimethylether nicht zugeführt wurde, bleibt unverändert. Die Zeit zwischen dem Anfang der Beleuchtung und Anfang des Leitfähigkeitwachstums charakterisiert die Effektivität der photodynamischen Wirkung. Bei ähnlichen Versuchen mit Haematoporphyrin dibuthylether wurde diese Zeit kürzer.

Beispiel 5 Untersuchung von membranaktivem Desinfektionsmittel

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen-Phosphatidylcholin in Dekan (30 mg/ml) und die Messung der Leitfähigkeit (mit Wechselstrom, 15 mV, 0.01 Hz) der lipiden Doppelschichten. Elektrolyt: 50 mM KCl, 5 mM K₂HPO₄, pH 7.0. Zugabe von 5 µL NaClO in Wasser (bis entgültige Konzentration 12 mg/L), bzw. nur 5 µL Wasser. Beobachtet wird ein starkes Wachstum der Leitfähigkeit von lipiden Doppelschichten, zu welchen Desinfektionsmittel NaClO zugeführt wurde (Abb. 3a). Leitfähigkeit der anderen lipiden Doppelschichten, bei welchen NaClO nicht zugeführt wurde, bleibt unverändert. Die Oxydierung von NaClO durch Zugabe des Überschusses von Na₂S₂O₃ führt zu einer Blockierung des Wachstums der Leitfähigkeit.

Ähnlicher Versuch bei Zugabe von 9 mg/L NaClO zu planaren lipiden Doppelschichten aus Dioleylphosphatidylcholin (Kurve 1), Palmitoyloleylphosphatidylcholin (Kurve 2) bzw. Diphytanoylphosphatidylcholin (Kurve 3) sind auf Abb. 3b dargestellt.

Die Abb. 3c zeigt die Änderung der durch Nonactin verursachten Leitfähigkeit (2 Ohm^-1cm^-2) der lipiden Doppelschichten nach Zugabe von NaClO (12 mg/L) und späterer Zugabe des Überschusses von Na₂S₂O₃.

Beispiel 6 Untersuchung der Phospholipasenaktivität und Phospholipasenhemmung

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen-Phosphatidylcholin in Dekan (20 mg/ml), Elektrolyt: 50 mM KCl, 5 mM TRIS, 10 µM EDTA, pH 8.0. Gemessen wurde das Potential (U), das dem Minimum der 2. Oberschwingung von kapazitivem Strom entspricht (Abb. 4a). Eine solche Kompensation der 2. Oberschwingung entspricht dem Potentialprofil ohne elektrischem Feld in der Membran (Abb. 4a: ϕ_s ist Oberflächenpotential; ϕ_d ist Dipolpotential; ϕ_b = ϕ_s + ϕ_d; Δϕ_b ist der Unterschied von Grenzflächenpotentialen ϕ_b auf beiden Membranengrenzflächen; bei Kompensation U = Δϕ_b). Zugabe von Phospholipase A₂ führt zu leichter Potentialverschiebung. Ohne CaCl₂, das ein Co-Faktor von Phospholipase ist, gibt es keine Lipolyse. Die Zugabe von CaCl₂ (2 mM) startet den Lipolysenprozess. Komplexierung von CaCl₂ durch Zugabe des Überschusses von EDTA hemmt den Lipolysenprozess (Abb. 4b).

Ähnliche Untersuchung mit Phospholipase C (Abb. 4c Kurven a, b) oder mit o- Phenantrolin modifizierte Phospholipase C (Abb. 4c, Kurve c). Die Pfeile zeigen die Zugabe von Phospholipase. Elektrolyt: 10 mM KCl, 2 mM TRIS, 350 µM EDTA, 700 µM CaCl₂, pH 7.02 (Kurve a), 10 mM KCl, 2 mM TRIS, 350 µM EDTA, pH 7.02 (Kurve b, c.). Die lipiden Doppelschichten des Arrays, an denen keine Phospholipase zugeführt wurde, haben keine Effekte hinsichtlich einer Änderung des Grenzflächenpotentials gezeigt.

Beispiel 7 Elektrostatische Untersuchung der Adsorption von membranaktiven Substanzen

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Dioleylphosphatidylcholin in Dekan (20 mg/ml), Elektrolyt: 100 mM KCl, 2 mM Imidazol, pH 8.0. Gemessen wurden die Änderungen von Oberflächen- (ϕ_s, Kurve 2) und Dipolpotentialen (ϕ_d, Kurve 3) durch die Untersuchung von Stromrelaxation in Anwesenheit von hydrophoben Ionen (Tetraphenylborat). Die Kurve 1 zeigt die Grenzflächenpotentialänderung (ϕ_b = ϕ_s + ϕ_d). Die Pfeile zeigen die Zugaben von 0.5, 1.0, 2.3 und 3.6 mg/L Oleinsäure (Abb. 5).

Beispiel 8 Untersuchung von Ionenkanälen, die durch Einfügung von Proteinen in lipiden Doppelschichten induziert sind

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen Phosphatidylcholin in Dekan (33 mg/mL) und aus einer Protonenpumpe (1 mg/mL). Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM MES, pH 6.3. Der Strom wird unter konstanten Potentialbedingungen gemessen (Abb. 6).

Beispiel 9 Untersuchung von Ionenpumpen, die als Proteoliposomen auf lipiden Doppelschichten adsorbiert wurden

Das Bakteriorhodopsin wird als purpure Membranen (purple membranes) aus dem Halobacterium halobium isoliert. Purpure Membranen werden dann mittels Ultraschallbearbeitung in die Liposomen aus Sonjabohnen-Phosphatidylcholin (in Elektrolyt 100 mM KCl, 10 mM MES, pH 6.15) eingefügt. Die Bildung von lipiden Doppelschichten wird aus Sojabohnen-Phosphatidylcholin in Dekan (30 mg/mL) durchgeführt (Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM MES, pH 6.15). Nachdem der Bildungsvorgang der lipiden Doppelschichten abgeschlossen ist, werden die Liposome mit Bakteriorhodopsin (Proteoliposomen) zugegeben. Durch die weitere Zugabe von 10 mM CaCl₂ in das Elektrolyt kommt es zu einer starken Bindung von Liposomen an die planaren lipiden Doppelschichten. Dieses System kann man zu funktionelle Untersuchung von Ionenpumpen (in diesem Fall Bakteriorhodopsin) verwenden. Dieses Systems als elektrische Schalltung ist in Abb. 7a dargestellt. Die Beleuchtung von Membranen führt zu elektrischen Strom bzw. Potential. Einen typischen zeitlichen Verlauf des Stroms nach Ein- (on) und Ausschlaten (off) des Lichts sieht man in Abb. 7b links. Die Erhöhung der Protonenleitfähigkeit der Membranen durch Zugabe von Protonophor FCCP fürht zu der Erhöhung von stationärem Strom (Abb. 7b rechts). Die Bearbeitung mit Ether führt zur Hemmung der photoelektrischen Aktivität. Auch eine molekularbiologische Modifizierung von Bakteriorhodopsin ändert die photoelektrische Aktivität. Solche ein Vorgang wurde auch durch die direkte calcium-induzierte Adsorption purpuren Membranen auf lipiden Doppelschichten durchgeführt, die Ergebnisse sind ähnlich. Das Bestrahlen mit kurzen Lichtblitzen erlaubt die Untersuchung von Ladungsbewegungen in der Ionenpumpe und den Einfluß von verschiedenen Verbindungen auf diesen Prozeß.

Beipiel 10 Untersuchung von Ionenpumpen, die in lipiden Doppelschichten eingefügt wurden

Die Bildung von lipiden Doppelschichten aus Sojabohnen Phosphatidylcholin in Dekan (33 mg/mL) und aus einer Protonenpumpe (Bakteriorhodopsin), 1 mg/mL. Der Übergang von Bakteriorhodopsin in eine organische Phase wurde durch die Bearbeitung mit Kalzium erreicht. Elektrolyt: 100 mM KCl, 10 mM MES, pH 6.3. Die Beleuchtung von Membranen führt zu elektrischen Strom bzw. Potential. Einen typischen zeitlichen Verlauf des Stroms nach Ein- (on) und Ausschlaten (off) des Lichts sieht man in Abb. 8. Das Bestrahlen mit kurzen Lichtblitzen erlaubt die Untersuchung von Ladungsbewegungen in der Ionenpumpe und den Einfluß von verschiedenen Verbindungen auf diesen Prozeß. Die Hemmung von Bakteriorhodopsin durch eine chemische Modifizerung führt zu einer niedrigeren Photoaktivität.

Claims

1. Verfahren für Hochdurchsatzuntersuchung von Effekten für verschiedene organische Verbindungen auf biologischen Membranen und Komponenten biologischer Membranen, vorzugsweise auf Membranproteinen, bestehend aus parallelen, seriellen oder einer Kombination von seriellen und parallelen Messungen elektrischer Eigenschaften von Arrays von nicht modifizierten oder modifizierten planaren lipiden Doppelschichten, welche einen Durchmesser von 10 µm bis 1000 µm haben und Tenside oder Lipide, vorzugsweise Phospholipide, insbesondere Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin und hier insbesondere Diphytanoylphosphatidylcholin, sowie Cholesterol und oxidiertes Cholesterol, biotinilierte Lipide und Lipide mit Ni²⁺-bindungsgruppe beinhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messenden physikalischen Eigenschaften der planaren lipiden Doppelschichten elektrische Leitfähigkeit, elektrischer Widerstand, elektrische Kapazität, Transmembranenpotentialdifferenz, elektrischer Strom, Strom-Spannungs- Charakteristik, Grenzflächenpotential, Oberflächenpotential, Impedanz, Admittanz, Relaxationsstrom, Relaxationsladung, Stromoberschwingungen bzw. -harmoniken, Transmembranenpotentialdifferenz, die einem Minimum der 2. Stromoberschwingung entspricht, Grenzflächenspannung und die kinetische und gegenseitige Abhängigkeit aller dieser Messgrößen, sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrischen Messungen während der Zuführung von zu untersuchenden organischen Verbindungen durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, um mehr Informationen aus diesem Verfahren zu bekommen, werden zusätzliche chemische Verbindungen wie Säure, Basen, Salze, lipophile Ionen, Ionophoren, Protonophoren, künstliche und natürliche Neuromediatoren, ATP, cATP, künstliche und natürliche Hormone, Proteine, Peptide, Oligonukleitide, Nukleitide, DNS, RNS, PNS, Methabolyte, Inhibitoren sowie caged-Verbindungen, die unter chemischen und physikalischen Einflüssen, vorzugsweise Temperaturänderungen, pH-Änderungen, Bestrahlung durch elektromagnetische Energie, insbesondere UV-Licht und enzymatische Zerspaltung wirkende Substanzen ergeben, zugeführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, um mehr Informationen aus diesem Verfahren zu bekommen, wird eine Bestrahlung der planaren lipiden Doppelschichten durch elektromagnetische Energie durchgeführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß planare lipiden Doppelschichten adsorbierte oder inkorporierte biologische Moleküle, vorzugsweise Proteine, hier insbesondere Membranenproteine wie Ionenkanäle, Ionenpumpen und Rezeptoren, Proteinenkomplexe, Protein-Lipidkomplexe, Organellen und Zellen, beinhalten.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilität von planaren lipiden Doppelschichten durch Polymerisierung, Quervernetzung, Polymeradsorption, Adsorption von polyvalenten Ionen oder Benutzung von einer festen oder gel-artigen Unterlage, vorzugsweise organische hydrophobe oder wasserimprägnierte hydrophile Schichten auf Goldelektroden, erhöht wird, wodurch bei Benutzung einer hydrophoben Unterlage die planare lipide Doppelschicht durch eine planare lipide Monoschicht ersetzt werden kann.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge von planaren lipiden Doppelschichten für parallele, serielle oder Kombination von parallen und seriellen Messungen 10 bis 100.000, vorzugsweise 64 bis 1.540, beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Biomoleküle auf planare lipide Doppelschichten als isolierte Moleküle oder Protein-Lipidkomplexe, (Proteo)liposomen, Protein-Lipid-Vesicles, Membranen-Vesicles, Organellen und Zellen adsorbieren, wodurch die Adsorption durch Zuführung von polyvalenten Ionen, insbesondere Ca²⁺, oder durch Aufnahme von ionischen Tensiden in planare lipide Doppelschichten gefördert wird.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 auch wenn lipide Doppelschichten keine planare Form haben.

11. Anordnung für die Benutzung von Verfahren nach Anspruch 1, die eine Meßzelle für Array von planaren lipiden Doppelschichten, Multiplexer, Meßsystem, Steuerungssystem und System für die Datenerfassung umfaßt.

12. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle aus einem Array von n-Hohlräumen in einem dielektrischem Material, vorzugsweise nichtleitender Kunststoff, Glas, Silizium, mit Elektroden auf dem Boden oder Wänden, besteht und dabei jeder Hohlraum mindestens 2 Elektroden und eine planare lipide Doppelschicht zwischen den Elektroden enthält.

13. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle aus einem Array von, mit einem Elektrolyt gefüllten, Mikropipetten, vorzugsweise aus Glas, insbesondere Mikropipetten, die man für patch-clamp-Technik verwendet, die in entsprechende Arrays von, mit einem Elektrolyt gefüllte, Hohlräume, vorzugsweise Mikro- oder Nanotiterplatten mit Elektroden in jedem Hohlraum, eingtaucht werden, besteht.

14. Anordnung nach Ansprüchen 11 und 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden aus üblichen im Elektroden Materialien, vorzugsweise Ag, Ag/AgCl, Pt, Au, Pd, Cu mit oder ohne Salzbrücke, bestehen.