Der
Säugetiermagen
und insbesondere der Magen des Menschen besitzen mehrere Funktionen. Zunächst nimmt
der Magen zerkaute und geschluckte Speisen auf, sezerniert Magensaft,
welcher sich mit dem Mageninhalt vermischt und ihn chemisch verändert. Des
Weiteren wird der Mageninhalt physikalisch zerkleinert und nach
weiteren chemischen und physikalischen Umwandlungsvorgängen zur weiteren
Verdauung und Resorption in den Bereich des Duodenums überführt.
Der
Magen des Menschen sezerniert täglich etwa
2 bis 3 Liter Magensaft in das Lumen. Dieser Magensaft enthält Ionen,
Makromoleküle,
Schleim und insbesondere – neben
bestimmten Hormonen – Säure. Die
Säure des
Magens wird im Wesentlichen gebildet von Chlorwasserstoffsäure oder
HCl und führt
zu einer bemerkenswerten Wasserstoffionenkonzentration des Magensafts
im Bereich von pH = 1. Die Magensäure dient der Denaturierung
von Eiweißen
unter Aktivierung von Pepsinogen zu Pepsin zur Hydrolyse der Eiweiße. Zusätzlich wirkt
der niedrige pH-Wert bakterizid.
Die
Magensäure
wird von den sogenannten Belegzellen oder Parietalzellen der Mucosa
oder Schleimhaut des Magens in das Lumen des Magens abgegeben. Aufgrund
der physiologischen Bedeutung der Magensäure für den Verdauungsvorgang besteht
seit langem ein In teresse daran, den endogen aufgrund von Krankheit
oder exogen aufgrund von Stress oder anderen Umweltbedingungen abnormal
sich entwickelnden Sezernierungsvorgang der Säure untersuchen oder gar steuern
zu können.
Bekannt
ist, dass bei der Sezernierung von Salzsäure oder Chlorwasserstoffsäure im Magen
die sogenannte H+-K+-ATPase
wesentlich ist. Diese transportiert Protonen H+ aus
der Belegzelle der Magenschleimhaut in das Magenlumen und führt dabei zu
einer Aufnahme von Kaliumkationen K+ aus
dem Magenlumen in die Belegzelle hinein. Durch die H+-K+-ATPase wird ein aktiver Transportprozess
gegen einen bestehenden Ionengradienten vermittelt. Dieser Prozess
erfordert Energie, welche aus der Hydrolyse von Adenosintriphosphat
ATP zu Adenosindiphosphat ADP unter Abspaltung anorganischen Phosphats
Pi gewonnen wird: ATP → ADP + Pi.
Gegebenenfalls
ist die H+-K+-ATPase
in einen übergeordneten
Wirkortkomplex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer H+-K+-ATPase-Proteinmoleküle zu einem
Oligomer sein. Es können
aber auch andere, ggf. enzymatische Komponenten vorhanden sein,
die in Kooperation mit der H+-K+-ATPase
vorliegen. Diese können
auch räumlich
beabstandet vorliegen.
Eine
genaue Kenntnis der stofflichen und energetischen Bedingungen ist
wünschenswert,
um regulierende Maßnahmen
für die
Steuerung der Säureproduktion
und Sezernierung im Magen auffinden zu können, und es wurden bereits
verschiedene Untersuchungs- und Testmöglichkeiten ersonnen, um das Problem
des Auffindens geeigneter Wirkstoffe wie Inhibitoren oder Modulatoren
für die
H+-K+-ATPase und den damit
im Zusammenhang stehenden Wirkortkomplex zu lösen.
Entsprechend
sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen
bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ
und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.
Auch
ist es wünschenswert,
vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren,
z.B. an der H+-K+-ATPase,
an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise
dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.
Übliche Experimente
am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner
aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die
damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.
Folglich
wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine
isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe
auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren
selbst möglich
ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere
biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in
isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum
Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen
oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen
und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig,
dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine geringe Empfindlichkeit
dabei aber eine hohe Fehleranfälligkeit
zukommen.
Es
sind aber auch elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel
die sogenannten Patch Clamp-Technik oder Voltage Clamp-Technik, bei welchen
zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung
zugänglich
sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen
ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die
durch die Zellen über
die darin enthaltenen Organellen und/oder Proteine oder dergleichen
vermittelt werden, gemessen. Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit
sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden dahingehend
nachteilig, dass sie oft eine nur geringe Reproduzierbarkeit der
Ergebnisse liefern, aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes
und ihrer Störanfälligkeit
für einen
schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet
sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden
Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter
Signalanteile aufweisen. Außerdem
ist die Anwendung der Patch Clamp-Technik oder Voltage Clamp-Technik bei der H+-K+-ATPase auf Grund
der Elektroneutralität
des durch die H+-K+-ATPase
vermittelten Transports kaum oder nicht möglich.
Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen H+-K+-RTPase-Assay
zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art
und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb,
unter vertretbaren Kosten möglich
ist.
Gelöst wird
die Aufgabe bei einem Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes
erfindungsgemäß durch
die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1. Weiterhin sind Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoff oder Wirkstoff komplex
gemäß Anspruch
23, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch
24, ein Testkit zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
gemäß Anspruch
25, ein Screeningverfahren zum Identifizieren gemäß Anspruch
26, sowie Verwendungen des Verfahrens, des Testkits sowie des Arzneimittels
gemäß den Ansprüchen 27,
28 bzw. 29. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen
abhängigen
Unteransprüche.
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes,
welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher
einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthält,
oder eines Teils davon modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren
weist folgende Schritte auf:
- (a) Bereitstellen
einer Mehrzahl Primärträger, welche
den Wirkortkomplex, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer
Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
- (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder
im Oberflächenbereich
eines Isolationsbereichs einer als Sekun därträger dienenden Biosensorelektrode
in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegenüber den
Primärträgern mittels des
Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
- (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes
(W),
- (d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen
des potenziellen Wirkstoff komplexes (W) mit dem Wirkortkomplex der
Primärträger oder
Teilen davon, und
- (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses
des potenziellen Wirkstoff komplexes (W) oder eines Teils davon
auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils
davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes
oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen
Aktion über
die Biosensorelektrode als Sekundärträger.
Es
ist somit ein Kerngedanke der vorliegenden Erfindung, die Wirkungsweise
eines potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoff komplexes dadurch
zu identifizieren, dass der qualitative Einfluss und/oder der quantitative
Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoff komplexes durch
Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt werden, welche durch den
Wirkortkomplex oder eines Teils davon und insbesondere durch die
H+-K+-ATPase vermittelt
werden, oder jeweils eine Änderung
der elektrischen Aktion über
die Biosensorelektrode als Sekundärträger detektiert werden.
Es
ist ein weiterer Kerngedanke der vorliegenden Erfindung, dass dabei
Primärträger, welche den
Wirkortkomplex im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
bereitgestellt und verwendet werden, wobei die Primärträger mit
den Wirkortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode
und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht
und dort insbesondere angelagert werden. Durch die mechanische und
elektrische Isolation der Biosensorelektrode als Sekundär träger gegenüber dem
vorgesehenen Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels
des Isolationsbereiches findet zum einen keine direkte Wechselwirkung
der Elektrode mit dem zu untersuchenden Wirkortkomplex und insbesondere nicht
mit der H+-K+-ATPase statt. Zum
anderen ermöglicht
die elektrische Abdichtung der Biosensorelektrode gegenüber dem
Messmedium auf einfache Art und Weise das Ableiten eines elektrischen
Signals aufgrund der elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder
eines Teils davon. Auch kann der Isolationsbereich der Biosensorelektrode
eine vergleichsweise natürliche
Umgebung für
die Primärträger und
insbesondere für
den Wirkortkomplex darstellen, im Gegensatz zu den meisten Elektrodenmaterialien.
Bei
der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen
vielfältige
Möglichkeiten.
Es
wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als
Sekundärträger verwendet wird,
bei welcher ein elektrisch leitfähiger
und festkörperartiger
Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird,
welcher gegenüber
dem Messmedium und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs
in Form einer festkörperunterstützten Membran,
welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer
organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils
zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen
organischen Verbindung.
Bei
einer anderen Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet
wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen
wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht
darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Bei
einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet
wird, bei welcher der ei ne Elektrode der Biosensorelektrode als
Sekundärträger abdeckende
Bereich des Isolationsbereichs als eine Membranstruktur nach Art
einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran
oder Bilayermembran – nachfolgend
synonym auch als Biosensormembran oder SSM (Solid Supported Membrane)
bezeichnet – ausgebildet
wird oder ist, insbesondere mit einer Fläche von etwa A ≈ 0,1 – 50 mm2 und mit einer spezifischen elektrischen
Leitfähigkeit
von etwa Gm ≈ 1 – 100 nS/cm2 und/oder
mit einer spezifischen Kapazität
von etwa Cm ≈ 10 – 1000 nF/cm2.
Im
Hinblick auf die Primärträger, welche
den Wirkortkomplex und insbesondere die H+-K+-ATPase im Bereich ihrer Membran enthalten
sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen
Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen werden kann.
Zum
Beispiel bietet es sich gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
an, dass als Primärträger jeweils
eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, ein Oozyt,
ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, insbesondere
Membranfragmente, oder Verbände
davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere in
gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter
Form, verwendet wird.
Es
ist auch möglich,
dass als Primärträger jeweils
ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird.
In
der Praxis wird eine Mehrzahl oder Vielzahl Primärträger verwendet.
Bevorzugt
wird, dass als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein
Oligomer einer H+-K+-ATPase
verwendet wird.
Ferner
ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet
wird, welcher auf der H+-K+-ATPase
basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiermagens stammt oder genetisch
aus einem solchen abgeleitet wird, insbesondere aus den Parietalzellen
der Magenschleimhaut.
In
vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex aus
dem Organismus Schwein, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesen
genetisch abgeleitet wird.
Besonders
vorteilhaft im Hinblick auf eine Signaldetektion ist, wenn gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Wirkortkomplex oder ein Teil davon zumindest zum Teil im Primärträger eine
Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet wird. Denkbar sind
aber auch membranständige,
die Membran aber nicht durchspannende Wirkortkomplexe.
Im
Hinblick auf das eigentliche Identifizierungsverfahren über die
Detektion einer elektrischen Aktion bieten sich vielfältige Möglichkeiten
an.
So
ist es vorgesehen, dass als elektrische Aktion verwendet wird ein
durch den Wirkortkomplex oder durch einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom
oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial. Der erzeugte elektrische
Strom oder das erzeugte elektrische Potenzial werden jeweils erzeugt
durch Ladungstransport, Stofftransport, Ladungsverschiebung, Stoffverschiebung,
Konformationsänderungen des
Wirkortkomplexes oder eines Teils davon, Ligandenbindung oder Ligandenfreigabe
durch den Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder durch Ligandenanlagerung
oder Ligandenfreigabe durch den Wirkortkomplex oder eines Teils
davon. Denkbar sind auch beliebige Kombinationen dieser Prozesse
im Hinblick auf den Wirkortkomplex oder eines Teils davon.
Auch
bei den enzymatischen Eigenschaften ergeben sich im Hinblick auf
das erfindungsgemäße Verfahren
vielfältige
Möglichkeiten.
So
ist es vorgesehen, dass als enzymatische Eigenschaften verwendet
werden die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes
oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon
an den bzw. von dem Wirkortkomplex oder einen bzw. einem Teil davon,
der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder
eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon durch
den Wirkortkomplex oder einen Teil davon, die chemische Umsetzung
oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder
des Messmediums oder eines Teils davon, die Konformationsänderung
oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon sowie
mit diesen Prozessen im Zusammenhang stehende Funktionalitäten des
Wirkortkomplexes oder eines Teils davon. Auch hier sind wieder beliebige
Unterkombinationen der zuvor beschriebenen Prozesse im Hinblick
auf den Wirkstoffkomplex, das Messmedium oder den Wirkortkomplex
oder Teile davon denkbar.
Bevorzugt
wird beim erfindungsgemäßen Verfahren
die Verwendung eines wässrigen
Messmediums und insbesondere einer wässrigen Elektrolytlösung als
Messmedium.
Bei
einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes ist es vorgesehen, dass
die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durchgeführt werden durch:
- – Zumischen
oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer
Vorstufe davon,
- – Austauschen
des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
- – chemisches
oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder
eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer
Vorstufe davon.
Das
bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon
direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein
zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders
einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach
das jeweilige Messmedium ausgetauscht wird, vorzugsweise in kontinuierlicher Art
und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst
durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren
im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von
Strahlung erfolgen. Denkbar ist dabei auch, dass die Strahlung,
insbesondere Licht, selbst in Form eines Wirkstoffes eingesetzt
wird und somit also als treibende Kraft für die im Wirkortkomplex ablaufenden
Prozesse dient.
Besonders
vorteilhaft gestaltet sich jedoch das erfindungsgemäße Verfahren
dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und
daran angelagerten Primärträgern in
einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder
angeströmt
wird. Auf diese Art und Weise lässt
sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung
im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht
realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen
eines Fließsystems
auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung verschiedene
Versuchsbedingungen einstellen.
Vorzugsweise
wird dabei eine Strömungsgeschwindigkeit
oder Fließgeschwindigkeit
des Messmediums im Bereich von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s verwendet.
Besonders ökonomisch
und für
eine statistische Auswertung zugänglich
gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren
dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird,
insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums,
ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.
Wichtig
ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren ggf. das Vergleichen
der Aktion des Wirkort komplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex
mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex
nicht zugegen ist. Für
ein derartiges Vorgehen bieten sich verschiedene Verfahrensprotokolle
an.
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass in den Verfahrens schritten (c), (d) und/oder
(e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
- (f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in
ein erstes oder nicht-aktivierendes Messmedium und Detektieren einer
elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e),
- (g) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein zweites oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer
elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e),
- (h) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein drittes oder Test-Messmedium und Detektieren einer elektrischen
Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder Test-Messmedium
dem zweiten oder aktivierenden Messmedium entsprechend gewählt wird
und der Wirkstoffkomplex (W), ein Teil oder eine Vorstufe davon
hinzugefügt und/oder
freigesetzt werden.
Beliebige
Kombinationen der Schritte (f), (g), (h) ggf. mit Wiederholungen
sind denkbar.
Es
kann der Wirkstoffkomplex auch sowohl im aktivierenden als auch
im nicht-aktivierenden Messmedium zugesetzt oder dort freigesetzt
werden.
Auch
ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder
der sie tragenden Primärträger mit
dem Wirkstoffkomplex denkbar.
Des
Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (g) und (i)
ein Waschschritt durchgeführt
wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den
Primärträgern in
ein viertes und Waschmedium.
Ferner
ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (i) bei einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
Bei
einer anderen alternativen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass als Messmedium und insbesondere als das
erste oder nicht-aktivierende Messmedium, als zweites oder aktivierendes
Messmedium und/oder als drittes oder Test-Messmedium Messmedien
verwendet werden, welche in wässriger
Lösung enthalten:
- – etwa
25 mmol/l Imidazol,
- – etwa
3mmol/l MgCl2,
- – etwa
pH=6,
wobei insbesondere kaliumfreie Messmedien verwendet
werden. Des Weiteren ist es vorgesehen, dass bei einer anderen alternativen
Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens
als Messmedium und insbesondere als zweites oder aktivierendes Messmedium
und als drittes oder Test-Messmedium Medien mit Adenosintriphosphat
oder ATP verwendet werden, insbesondere mit einer Konzentration
im Bereich von etwa 15 mmol/l.
Gemäß einem
weiteren Aspekt schafft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff
oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzymatische Eigenschaft
eines Typs einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins enthaltenden
Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird
oder wurde.
Des
Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen
eines Arzneimittels mit den Schritten:
- – Identifizieren
eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine – ggf. bestimmte – enzymatische
Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes, welcher einen Typ eines H+-K+-ATPase- Proteins enthält, oder
eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet
modifiziert, und zwar mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens,
- – Herstellen
und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines
Teils und/oder eines Derivats davon,
- – ggf.
Auf reinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder
Derivats,
- – ggf.
Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen
Trägersubstanz.
Des
Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes. Dieser Testkit weist
auf:
- – mindestens
einen Primärträger,
- – einen
Messbereich,
- – ein
erstes oder nicht-aktivierendes Messmedium, ein zweites oder aktivierendes
Messmedium, ein drittes oder Test-Messmedium zur Aufnahme eines
potenziellen Wirkstoffkomplexes und
- – mindestens
einen potenziellen Wirkstoffkomplex zur Zugabe zum dritten oder
Test-Messmedium.
Erfindungsgemäß wird auch
ein Screeningverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum
Identifizieren:
- – eines unbekannten Wirkstoffs,
Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden
von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren
einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher
einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthält,
und insbesondere der humanen H+-K+-ATPase.
Des
Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit
erfindungsgemäß verwendet
zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren
oder Modulatoren eines Typs einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthaltenden Wirkortkomplexes und insbesondere der humanen H+-K+-ATPase.
Des
Weiteren wird das Arzneimittel erfindungsgemäß verwendet zur Inhibition,
partiellen oder temporären
Inhibition oder Modulation eines Typs einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins enthaltenden Wirkstoffkomplexes
oder eines Teils davon und insbesondere der humanen H+-K+-ATPase.
Auf
der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden
und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten
weiter erläutert:
Durch
das erfindungsgemäße Vorgehen
kann eine amperometrische und/oder potenziometrische, pharmakologische
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung durchgeführt werden. Dabei wird ein
Sekundärträger in Form
einer Biosensorelektrode vorgesehen, welcher z. B. einen elektrisch
leitfähigen
und festkörperartigen
Elektrodenbereich aufweist. Ferner wird eine Mehrzahl Primärträger vorgesehen,
welche in unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft des Sekundärträgers angeordnet
werden und welche die zu einer elektrischen Aktion aktivierbaren
und Wirkortkomplexe, basierend auf der H+-K+-ATPase aufweisen.
Darüber hinaus
ist ein z. B. wässriges
Messmedium vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet
werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primärträgern und
gegenüber
den biologischen Einheiten elektrisch und mechanisch, also räumlich isoliert.
Als
Primärträger sind
jeweils eukariontische Zellen, prokariontische Zellen, Oozyten,
Bakterien, Viren, Organellen oder Bestandteile, Membranfragmente
oder Verbände
davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, in gereinigter,
mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen. Alternativ
oder zusätzlich
sind als Primärträger Vesikel,
Liposomen oder mizelläre
Strukturen vorgesehen.
Maßgeblich
beim erfindungsgemäßen Vorgehen
ist auch das Vorsehen einer Biosensorelektrode, auch als Sensoranordnung
bezeichnet.
Diese
bildet einen Sekundärträger, der
im Folgenden auch als Sensorelektrodeneinrichtung bezeichnet wird.
Diese Sensorelektrodeneinrichtung zur amperometrischen und/oder
potenziometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
selbst also weist mindestens einen elektrisch leitfähigen Elektrodenbereich
auf. Die Sensorelektrodeneinrichtung ist ausgebildet, im Betrieb
in einem wässrigen
Messmedium angeordnet zu werden. Des Weiteren ist die Sensorelektrodeneinrichtung
ausgebildet, eine Mehrzahl oder Vielzahl Primärträger mit dem zu einer elektrischen
Aktion aktivierbaren Wirkortkomplex, also mit der H+-K+-ATPase in unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft, insbesondere des Elektrodenbereichs, anzuordnen.
Dabei wird der Elektrodenbereich festkörperartig ausgebildet. Des Weiteren
ist der Elektrodenbereich ausgebildet, gegenüber dem vorzusehenden Messmedium
und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch isoliert zu sein. Das heißt, der Elektrodenbereich hat
keinen direkten mechanischen Kontakt zum Messmedium, zum Primärträger und
bei nicht membrangängigen
Wirkstoffkomplexen auch nicht zum Wirkstoffkomplex.
Es
ist eine andere Kernidee der vorliegenden Erfindung, einen Elektrodenbereich
der Sensoranordnung und insbesondere der Sen sorelektrodeneinrichtung
zu verwenden, welcher festkörperartig
oder festkörperunterstützt ausgebildet
ist. Dadurch werden der Sensorelektrodeneinrichtung und insbesondere
dem vorgesehenen Elektrodenbereich davon eine besonders hohe mechanische
Stabilität
gegeben, wodurch ein besonders robuster und störunanfälliger Betrieb im Rahmen des
Verfahrens oder einer Wirkort- und/oder Wirkstofftestung möglich ist.
Erst
durch die Festkörperunterstützung wird eine
Aktivierung des Wirkortkomplexes und der H+-K+-ATPase durch einen Konzentrationssprung
auf einfache und zuverlässige
Art und Weise möglich. Dies
kann insbesondere im Rahmen eines schnellen und/oder kontinuierlichen
Lösungsaustauschs
erfolgen, wodurch – insbesondere
bei amperometrischen Messungen – ein
hoher Signalpegel und somit eine hohe Empfindlichkeit erreichbar
sind. Aufgrund der Robustheit durch die Festkörperunterstützung sind auch eine leichtere
Handhabung und ein bequemer Einbau möglich.
Ein
weiterer Kernaspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen
Elektrodenbereich zu verwenden, welcher im Betrieb gegenüber dem Messmedium
und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch, also räumlich
isoliert ausgebildet ist. Durch diese Maßnahme wird erreicht, dass
die Sensorelektrodeneinrichtung zum Beispiel als kapazitiv gekoppelte
Elektrode eingesetzt werden kann. Dies hat insbesondere im Hinblick
auf das Signal-zu-Rauschverhältnis,
also im Hinblick auf die Nachweisgenauigkeit erhebliche Vorteile.
Des Weiteren ist bei der kapazitiven Kopplung der Elektrodenbereich
der Sensorelektrodeneinrichtung an keiner chemischen Umsetzung beteiligt,
wie das zum Beispiel bei einer typischen elektrochemischen Halbzelle
der Fall wäre.
Ein
weiterer Kernaspekt der Erfindung sind die Auswahl und die Verwendung
der den Wirkortkomplex und die H+-K+-ATPase tragenden Primärträger. Die Primärträger können jeweils
eukariontische Zellen, prokariontische Zellen, Oozyten Bakterien,
Viren, Organellen oder Bestandteile, insbesondere Membranfragmente,
oder Verbände
davon sein, und zwar in nativer Form oder in abge wandelter Form, insbesondere
in gereinigter, molekularbiologisch und/oder mikrobiologisch geänderter
Form. Alternativ oder zusätzlich
sind als Primärträger Vesikel,
Liposomen oder mizelläre
Strukturen denkbar.
Der
Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese
kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich
ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.
Andererseits
kann der Elektrodenbereich einen Träger aufweisen, der insbesondere
festkörperartig
ausgebildet ist. Dann ist es möglich,
dass die Elektrode jeweils als Materialbereich oder Materialschicht
auf einem Oberflächenbereich
oder der Oberfläche
dieses Trägers
ausgebildet ist, insbesondere in zusammenhängender Art und Weise. Dabei
ist es dann insbesondere vorgesehen, dass die Elektrode durch die
Festkörperunterstützung durch
den Träger mechanische
Stabilität
erlangt. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass gegebenenfalls
hochwertige Materialien zum Beispiel als dünne Schicht auf dem Träger aufgebracht
werden können,
so dass sich in betriebswirtschaftlicher Hinsicht die Möglichkeit
einer Einwegsensorelektrodeneinrichtung bietet, die zu erschwinglichen
Preisen herstellbar und auf dem Markt verwertbar ist. Gegebenenfalls
kann der Träger,
insbesondere der Elektrodenbereich, wiederverwendet werden, wobei
insbesondere ein erneuerter Isolationsbereich, z.B. eine neue Thiolschicht,
notwendig werden kann.
Vorzugsweise
weist die Elektrode mindestens ein metallisches Material auf oder
ist aus einem solchen Material gebildet. Dabei wird vorteilhafterweise
insbesondere ein chemisch inertes Edelmetall verwendet, vorzugsweise
Gold. Denkbar sind insbesondere auch Platin oder Silber.
Andererseits
kann es auch vorteilhaft sein, dass eine nicht oder nicht rein metallische
Elektrode verwendet wird, zum Beispiel aus mindestens einem leitfähigen Metalloxid.
Es bietet sich zum Beispiel Indiumzinnoxid an, weil dieses gegenüber Strahlung zu mindest
im sichtbaren Bereich und im UV-Bereich vergleichsweise unempfindlich
ist, insbesondere wegen der höheren
optischen Transparenz in diesem Bereich, zumindest im Vergleich
zu reinen Metallelektroden, welche einen starken Photoeffekt zeigen.
Der
Träger
zur Aufnahme der Elektrode weist also vorteilhafterweise ein elektrisch
isolierendes Material auf oder ist aus einem solchen gebildet. Des
Weiteren oder alternativ ist es von Vorteil, dass das Material des
Trägers
im Wesentlichen chemisch inert ist. Vorteilhafterweise bietet sich
als Material ein Glas oder dergleichen an. Dabei kann die Form die einer
Platte oder dergleichen sein. Die chemische Inertheit verhindert
eine Veränderung
sowohl des Trägers
als auch eine Verunreinigung des Messmediums während des Messprozesses. Durch
die Wahl eines elektrisch isolierenden Trägers wird gewährleistet,
dass sämtliche
Messsignale im Wesentlichen aus dem Bereich der Elektrode stammen.
Eine
besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt
sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des
Trägers
abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei
um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die
Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine
Schichtstärke
von etwa 10 bis 200 nm.
Zwischen
der Materialschicht für
die Elektrode und der Oberfläche
des Trägers
kann gegebenenfalls eine Haftschicht von Vorteil sein. Insbesondere beim
Aufbringen einer Goldelektrode auf Glas ist eine zwischenliegende
Haftschicht z.B. aus Chrom oder Titan von Vorteil. Die Haftschicht
hat vorteilhafterweise eine vergleichsweise geringe Schichtdicke,
vorzugsweise von etwa 5 nm bis etwa 20 nm.
Zur
Ausbildung der kapazitiven Elektrode und der dazu notwendigen Isolation
des Elektrodenbereichs von Messmedium und/oder von den Primärträgern ist
also vorzugsweise mindestens ein Isolationsbereich ausgebildet,
durch welchen im Betrieb der Elektroden bereich, insbesondere die
Elektrode, im Wesentlichen elektrisch isolierbar ist, insbesondere
in Bereichen davon, welche im Betrieb zum mechanischen Kontakt mit
dem Messmedium und/ oder mit den Primärträgern vorgesehen sind.
Bevorzugten
wird der Isolationsbereich schichtartig ausgebildet. Dabei besteht
der Isolationsbereich zumindest zum Teil aus einer Abfolge von Monoschichten,
wobei die Monoschichten als spontan selbstorganisierende Schichten
ausgebildet sind.
Es
ist von Vorteil, dass als Unterschicht des Isolationsbereichs eine
Schicht aus einer organischen Thioverbindung als unterster und der
Elektrode zugewandter Bereich des Isolationsbereichs vorgesehen
ist, vorzugsweise aus einem langkettigen Alkanthiol, insbesondere
aus Oktadekanthiol. Ferner ist als Oberschicht des Isolationsbereiches
eine Schicht aus einer amphiphilen organischen Verbindung, insbesondere
aus einem Lipid, als oberster und von der Elektrode abgewandter
Bereich oder Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs vorgesehen.
Es
kann also von Vorteil sein, den Isolationsbereich zumindest teilweise
schichtartig, insbesondere mehrschichtig, auszubilden. Dadurch werden die
Isolationswirkung verstärkt
und die Herstellung vereinfacht. Um im Betrieb eine möglichst
hohe Rate angelagerter und/oder angeordneter Primärträger im Bereich
der Sensorelektrodeneinrichtung zu erhalten, ist es gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Sensorelektrodeneinrichtung
vorgesehen, dass zumindest der Oberflächenbereich des Isolationsbereichs
derart abgestimmt ausgebildet ist, dass eine Anlagerung und/oder
Anordnung von Primärträgern am
Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs begünstigt
wird, insbesondere in mit der Oberfläche der Primärträger kompatibler
Art und Weise. Das bedeutet, dass je nach Oberflächenbeschaffenheit der Primärträger der
Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs der Sensorelektrodeneinrichtung entsprechend
angepasst ausgebildet ist, so dass sich die Primärträger begünstigt am Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs anlagern und dort auch verbleiben.
Im
Hinblick auf eine besonders ausgeprägte kapazitive Kopplung der
Sensorelektrodeneinrichtung im Messbetrieb ist es vorgesehen, dass
der Isolationsbereich zumindest teilweise als Monoschicht, Monolage
und/oder als Abfolge davon ausgebildet ist. In diesem Fall ist die
auf die Fläche
bezogene spezifische elektrische Kapazität der Elektrodengrenzschicht
besonders hoch. Besonders einfach gestaltet sich die Anordnung und
Ausbildung der erfindungsgemäßen Sensoranordnung,
wenn die Schicht oder die Schichten des Isolationsbereichs als sich spontan
selbstorganisierende Schichten oder als Self-Assembling-Schichten
ausgebildet sind oder werden. Dabei werden in vorteilhafter Art
und Weise die Neigung und das Bestreben bestimmter, im Wesentlichen
flüssiger
oder flüssig
gelöster
Ausgangsstoffe ausgenutzt, auf einer Oberfläche unter Einfluss der Wechselwirkung
mit der Struktur der Oberfläche spontan
und selbstorganisierend eine geordnete und/oder schichtartige Struktur
auszubilden, die unter bestimmten Umständen und bei bestimmten Stoffklassen
zur Ausbildung besonders dünner
und gegebenenfalls einlagiger Schichten oder Monoschichten, insbesondere
von Molekülen,
führt.
Dabei
ist es also von Vorteil, wenn als Unterschicht oder als unterster
und der Elektrode zugewandter Bereich des Isolationsbereichs eine
Schicht aus einer organischen Thioverbindung vorgesehen ist. Im
Hinblick auf die elektrischen Eigenschaften bietet sich dabei vorzugsweise
die Verwendung eines langkettigen Alkanthiols und/oder an. Besonders bevorzugt
ist dabei die Zugrundelegung eines C18-Alkans, also Oktadekanthiol.
Bei
dieser Vorgehensweise wird ausgenutzt, dass auf bestimmten Edelmetalloberflächen, zum Beispiel
Gold, Silber und Platin, aus einer organischen Lösung, welche entsprechende
Thioverbindung in Lösung
enthält,
aufgrund einer spezifischen Wechselwirkung der Thiogruppe mit den
Oberflächenatomen
der Edelmetallelektrode eine kovalent gebundene Monoschicht auf
der Elektrodenoberfläche
entstehen kann, die bei entsprechender Geometrie der Thioverbindung
eine hexagonal dichte Packung auszubilden vermag, wodurch eine besonders geringe
Restleitfähigkeit
der Edelmetalloberfläche
in Bezug auf das vorzusehende Messmedium realisierbar ist.
Andererseits
ist es vorgesehen, dass als Oberschicht oder als oberster und von
der Elektrode abgewandter Bereich oder Oberflächenbereich des Isolationsbereichs
eine Schicht einer amphiphilen organischen Verbindung vorgesehen
ist, insbesondere eines Lipids und/oder dergleichen.
Durch
dieses Vorgehen wird ebenfalls eine Anordnung und Strukturierung
der Oberfläche
des Isolationsbereichs erzwungen. Die amphiphilen Verbindungen besitzen
zumindest einen Bereich, der polar ausgebildet ist, so dass sich
im Messmedium, welches insbesondere wässrige Natur besitzt, eine
gewisse partielle Lösbarkeit
ergibt. Andererseits besitzen amphiphile organische Verbindungen
einen unpolaren oder hydrophoben Bereich, dessen Anordnung in einem
wässrigen
Messmedium energetisch weniger bevorzugt ist. Durch diese Phänomene bildet
sich bevorzugt eine Schichtstruktur aus, bei welcher die polaren
oder wasserlöslichen
Bereiche der amphiphilen Verbindung dem wässrigen Messmedium zugeordnet
sind, wogegen sich die unpolaren oder hydrophoben Bereiche der amphiphilen
organischen Verbindung vom wässrigen
Messmedium abgewandt anordnen. Es kann sich somit eine Monoschicht
ausbilden, die insbesondere den Oberflächenbereich des Elektrodenbereichs
bildet. Dies geschieht bevorzugt in Kombination mit einer Alkanthiolmonoschicht
als Unterschicht, so dass sich als Isolationsbereich zumindest teilweise
eine Doppelschicht zweier Monoschichten oder Monolagen ergibt.
Die
so ausgebildete Abfolge zweier Monoschichten hat gewisse strukturelle Ähnlichkeiten
mit bestimmten Membranstrukturen, die aus biologischen Systemen
bekannt sind, so dass man der so ausgebildeten Abfolge zweier Monoschichten – nämlich der
der Elektrode zugewandten Alkanthiolmonoschicht und der darüber angeordneten
Lipidmonoschicht – eine
gewisse Membranstruktur zuordnen kann. Aufgrund des zugrundeliegenden
Festkörperträgers bezeichnet
man diese Membranstruktur auch als festkörperunterstützte Membran SSM (SSM : Solid
Supported Membrane). Diese Membranstruktur oder Biosensormembran
hat im Hinblick auf die Anordnung und Eigenschaft der erfindungsgemäßen Sensorelektrodeneinrich tung
als kapazitiv gekoppelte Elektrode besonders günstige Eigenschaften.
Insbesondere
weist derjenige Bereich, welcher durch den die Elektrode isolierenden
und/oder abdeckenden Bereich des Isolationsbereichs definiert wird,
die eben beschriebene Membranstruktur in vorteilhafter Weise auf.
Dabei ist es von Vorteil, dass diese Membranstruktur zumindest teilweise
eine spezifische elektrische Leitfähigkeit von etwa Gm ≈ 1 – 100 nS/cm2 besitzt. Des Weiteren ergibt sich in vorteilhafter
Weise eine spezifische elektrische Kapazität von etwa Cm ≈ 10 – 1000 nF/cm2. Schließlich ist alternativ oder ergänzend eine
Fläche
für die
Membranstruktur von etwa A ≈ 0,1 – 50 mm2 vorgesehen.
Die
hohe spezifische Kapazität
Cm ist von besonderem Vorteil im Hinblick
auf eine durchzuführende
amperometrische Wirkstofftes tung, bei welcher initiierte elektrische
Aktionen der im Wesentlichen biologischen Einheiten als elektrische
Ströme,
nämlich als
Verschiebungsströme
oder kapazitive Ströme
gemessen werden.
Im
Hinblick auf das Signalrauschverhältnis ist ein entsprechender
Abdichtwiderstand im Bereich von wenigen Nanosiemens von besonderem
Vorteil.
Dieser
kann auch durch Aufbringen einer Teflonschicht, zum Beispiel direkt
auf die Metallelektrode, erreicht werden. Ein derartiges Vorgehen
ist zum Beispiel für
potenziometrische Wirkstofftestungen vollständig ausreichend, da es hier
nicht auf eine hohe elektrische Kapazität ankommt, sondern wegen der
Spannungsmessung auf den hohen Abdichtwiderstand.
Besonders
einfache geometrische Verhältnisse
ergeben sich, insbesondere im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit
der Messergebnisse, wenn der Träger,
die Elektrode und/oder der Isolationsbereich und/oder deren Ober-
oder Grenzflächenbereiche zumindest
teilweise im Wesentlichen planar ausgebildet sind, insbesondere
auch auf mikroskopischer Ebene oder Skala. Die Planarität gewährleistet,
dass bestimmte Feldstärkeeffekte
an Kanten oder Spitzen, die zum Durchbruch des Abdichtwiderstands
führen könnten, ausbleiben.
Des Weiteren ergibt sich im Hinblick auf den Austausch des vorzusehenden Messmediums
im Betrieb der Vorteil einer homogenen Grenzflächenverteilung. Etwaige Protuberanzen oder
Kavitäten
würden
an der Grenzfläche
zwischen dem Isolationsbereich und dem Messmedium zu Konzentrationsinhomogenitäten führen, die
sich unter Umständen
nachteilig auf erreichte Nachweis- oder Messergebnisse auswirken könnten. Die
Planarität,
insbesondere der metallischen Grenzflächen, kann durch entsprechende
Herstellungsverfahren, zum Beispiel durch epitaktisches Aufwachsen,
Annealen oder dergleichen gewährleistet
werden.
Zur
externen Kontaktierung der Sensoranordnung, zum Beispiel mit einem äußeren Messkreis oder
dergleichen, ist ein Kontaktbereich vorgesehen, wobei insbesondere
eine entsprechende Isolation zur Vermeidung sonstiger Kurzschlüsse, insbesondere
in Bezug auf das Messmedium, ausgebildet ist.
Besonders
vorteilhaft im Hinblick auf einen hohen Durchsatz bei entsprechend
durchzuführenden
Wirkort- und/oder Wirkstofftests ist es, wenn die erfindungsgemäße Sensoranordnung
so ausgebildet ist, dass sie, zumindest im Betrieb, gegenüber Flüssigkeitsströmungen mit
hohen Strömungsgeschwindigkeiten,
vorzugsweise im Bereich von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s im Wesentlichen konstante
mechanische, elektrische und/oder strukturelle Eigenschaften, insbesondere
im Bereich der Membranstruktur und/oder insbesondere im Hinblick
auf die Anlagerung und/oder Anordnung von Primärträgern, aufweist. Diese geforderte
und vorteilhafte Konstanz der mechanischen, elektrischen und/oder
strukturellen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Sensoranordnung und insbesondere
der darin vorgesehenen Membranstruktur ergibt sich bereits inhärent aus
den zuvor genannten Maßnahmen
zur Ausbildung der Elektrode und der die Elektrode abdeckenden Isolationsschichten,
insbesondere in Form von Self-Assembling-Monoschichten aus einem
Alkanthiol auf Gold mit einer entsprechenden Monoschicht aus Lipid
in einem wässrigen
Medium.
Es
ist vorgesehen, dass isolierte und ganze Zellen als Primärträger entsprechender
Wirkortkomplexe, welche zu einer elektrischen Aktion aktivierbar sind,
verwendet werden. Darüber
hinaus können auch
bestimmte Oozyten, Bakterien, Organellen oder Viren als Ganzes untersucht
werden. Ferner ist denkbar, durch bestimmte mikrobiologische oder
biochemische Maßnahmen
Bestandteile oder Fragmente von Zellen, Oozyten, Bakterien, Organellen
oder Viren, als Primärträger zu verwenden.
Weiterhin ist auch denkbar, Verbände
von Zellen, Bakterien oder dergleichen als Primärträger zu verwenden und diese
an die entsprechende Sensorelektrodeneinrichtung zur Ausbildung
einer erfindungsgemäßen Sensoranordnung
anzukoppeln.
Des
Weiteren besteht die Möglichkeit,
sämtliche
dieser vorgeschlagenen Primärträger in ihrer nativen
Form oder in einer abgewandelten Form zu verwenden. Dabei können zum
Beispiel eukari optische Zellen, prokariontische Zellen oder Bakterien verwendet
werden, die durch entsprechende Reinigungs-, mikrobiologische und/oder
molekularbiologische Verfahren abgeändert wurden, zum Beispiel
um bestimmte Proteine mit bestimmten gewünschten Eigenschaften bevorzugt
auszubilden.
Neben
den in natürlicher
Form bereits bereitstehenden Primärträgern in Form von Zellen, Bakterien
und dergleichen ist es auch denkbar, künstliche Primärträger zu erzeugen,
zum Beispiel in Form von Vesikeln, Liposomen, mizellären Strukturen
und/oder dergleichen. Diese werden dann gegebenenfalls mit entsprechenden
biologischen Einheiten, welche zu einer elektrischen Aktion aktivierbar
sind, versehen und/oder angereichert. Entsprechende Verfahren zur Rekonstitution
von Membranproteinen oder dergleichen in Vesikeln oder Liposomen
sind bekannt und können
hier in vorteilhafter Art und Weise ausgenutzt werden, um besonders
vorteilhafte Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
zu schaffen.
Die
Wirkortkomplexe und insbesondere die H+-K+-ATPase können jeweils in im Wesentlichen
nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter,
mikrobiologisch und/oder molekularbio logisch geänderter Form vorgesehen sein.
Zum einen können
dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch
untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder
gentechnisch initiierte Veränderungen
an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der
pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.
Besonders
vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines
jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen
werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage
und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich
auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen
und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträger.
Das
Nämliche
gilt auch für
die in dem Primärträger vorgesehenen
Wirkortkomplexe und die H+-K+-ATPase.
Hier sind Wirkortkomplexe und eine H+-K+-ATPase eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen
Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen,
physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen
Eigenschaften. Zusätzlich
sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick
auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit
in Bezug auf den jeweiligen Primärträger in etwa
einheitlich sein.
Zur
Erzielung einer möglichst
hohen Signalqualität
ist es von Vorteil, dass die Oberflächen der Primärträger und/oder
der Sekundärträger so ausgebildet
werden, dass eine Anlagerung und/oder Anordnung der Primärträger am Sekundärträger begünstigt wird.
Dadurch erhält
man eine besonders hohe Anzahl angelagerter Primärträger und/oder einen besonders
innigen Kontakt der Primärträger am Sekundärträger, wodurch
die elektrische Kopplung und somit das Signal-zu-Rauschverhältnis gesteigert werden.
Die
Anlagerung kann z.B. über
die sogenannte Lipid-Lipid-Wechselwirkung
zwischen Primärträger, z.B.
Vesikel, und dem Sekundärträger, z.B.
Lipid-Thiol-Biosensormembran, gesteuert sein. Es ist auch eine kovalente
Bindung oder eine spezifische Wech selwirkung der Primärträger an oder
mit der Oberfläche
der Sekundärträger denkbar,
letztere z.B. in Form eines Biotin-Streptavidin-Schemas oder im Sinne einer
His-Tag-Kopplung.
Dabei
ist es von besonderem Vorteil, wenn die Oberflächen der Primärträger und
der Sekundärträger entgegengesetzt
polar zueinander ausgebildet wird. Dies fördert die Anlagerungsrate der
Primärträger am Sekundärträger sowie
die Stärke
des Kontakts zwischen diesen.
Von
besonderem Vorteil ist es, wenn als Primärträger im Wesentlichen gleich
wirkende und/oder gleichartige Vesikel oder Liposomen, vorzugsweise aus
einem Lipid, verwendet werden, in und/oder an deren Membran Wirkortkomplexe
in vorzugsweise orientierter Form ein- und/oder angelagert sind.
Durch
die Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren
eines Wirkstoffkomplexes beschriebenen Sensoranordnung ergibt sich
in vorteilhafter Weise eine gegenüber der herkömmlichen
Vorgehensweise erheblich verlängerte Zeitspanne
für eine
Vielzahl von Testläufen
unter den verschiedensten Versuchsbedingungen, und zwar ohne Einbußen in der
Nachweisgenauigkeit, der Signalqualität oder sonstiger Eigenschaften
der Messsonde. Des Weiteren kann aufgrund der Robustheit der Sensoranordnung
mit höherer
Geschwindigkeit gearbeitet werden, dies betrifft sowohl die Handhabung
des eigentlichen Sensors als auch die Austauschgeschwindigkeit oder
Strömungsgeschwindigkeit
des fluiden Messmediums im Messbereich.
Vorteilhafterweise
sind, insbesondere über die
Austauscheinrichtung, über
das Messmedium die Messbedingungen, insbesondere die pharmakologischen
Bedingungen einstellbar und/oder änderbar, insbesondere in kontinuierlicher
Art und Weise, vorzugsweise nach Art eines kontinuierlichen Fließsystems.
Erfindungsgemäß ergibt
sich eine wohldefinierte Einstellbarkeit und/oder Änderbarkeit
der Messbedingungen und aufgrund der Stabilität der verwendeten Sensoranordnung
ein Austausch und/oder eine Änderung
des Messmediums auf leichte Art und Weise. Durch den Austausch können auch
entsprechende Änderungen
im Hinblick auf die Substratbedingungen oder sonstige Eigenschaften der
Messumgebung auf einfache Art und Weise und in kürzerer Zeit erreicht werden.
Insbesondere
bietet es sich an, als Austausch-/Mischeinrichtung ein Pumpensystem,
Perfusorsystem und/oder dergleichen zu verwenden, so dass die Sensorelektrodeneinrichtung
(der Sekundärträger) im
Rahmen eines Fließsystems
ständig vom
Messmedium umströmt
wird. In einem derartigen Fließsystem
können
dann durch externes Zumischen entsprechende zu untersuchende Messbedingungen
geschaffen werden.
Dabei
ist es insbesondere von Vorteil, dass im Messbereich Fließgeschwindigkeiten
oder Strömungsgeschwindigkeiten
von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s
erzeugbar sind, insbesondere gerade im Bereich, Nahbereich oder
der Nachbarschaft der Sensorelektrodeneinrichtung (der Sekundärträger) und/oder
insbesondere durch die vorgesehene Austausch-/Mischeinrichtung.
Der
Vorteil der hohen Fließ-
und/oder Strömungsgeschwindigkeiten
ergibt sich zum einen aufgrund der mechanischen Stabilität der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
und der ihr zugrundeliegenden Sensorelektrodeneinrichtung.
Darüber hinaus
ist es aber vorteilhaft, dass neben der Verwendung von ganzen Zellen,
Bakterien oder dergleichen, welche vergleichsweise groß ausgebildet
sind, in vorteilhafter Weise auch Vesikel und Liposomen sowie Membranfragmente
als Primärträger für die biologischen
Einheiten, insbesondere Membranproteine, eingesetzt werden können. Vesikel,
Liposomen, Membranfragmente und dergleichen sind vergleichsweise
klein ausgebildet und besitzen im Verhältnis zu ihrer Größe oder
ihrer Oberfläche eine
vergleichsweise stärkere
Neigung zur Anlagerung oder Adsorption an der Oberfläche der
Messsonde. Darüber
hinaus erfahren sie aufgrund ihrer geringeren Oberfläche im Bereich
der Strömung
des Messmediums im Vergleich zu ganzen Zellen oder dergleichen sehr viel
geringere Scherkräfte,
so dass sie auch bei höheren
Fließ- und/oder Strömungsgeschwindigkeiten
an der Sensorelektrodeneinrichtung im Rahmen der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
haften bleiben, so dass sich die Versuchsbedingungen oder Testbedingungen
nicht ändern.
Als
Messbereich kann einfach ein im Wesentlichen geschlossenes Gefäß oder eine
Gefäßeinrichtung
verwendet werden. Als Messraum kann zum Beispiel eine Art Kompartment
oder Küvette
verwendet werden, an deren Bodenbereich die Sensoranordnung in Form
einer erfindungsgemäß ausgebildeten
Sensoranordnung angeordnet ist.
Es
kann auch eine Mehrzahl integrierter Sensoranordnungen, vorzugsweise
in separaten, strömungsmäßig und
elektrisch voneinander entkoppelten und unabhängigen Vertiefungsbereichen
einer Mikroplatte oder Mikrotiterplatte vorgesehen sein, vorzugsweise
um 8, 12, 96 Messkanäle
auf einem Raster zu verwenden. Es ist also denkbar, dass eine Mehrzahl
von Sensoranordnungen vorgesehen wird, insbesondere um einen Parallelbetrieb
für mehrere unabhängige Testreihen
simultan durchzuführen.
Darüber hinaus
ist es vorgesehen, dass eine Austausch-/Mischeinrichtung und/oder ein Messraum
verwendet werden, welche für
die Mehrzahl von Sensoranordnungen unabhängig und/oder entkoppelt voneinander
entsprechende Messbedingungen auf definierte Art und Weise einstellen
und ändern. Es
kann sich bei dem Messraum zum Beispiel um eine Anordnung voneinander
strömungsmäßig getrennter
Küvetten
oder Kompartments handeln. Dabei kann auch eine gemeinsame Austausch-/Messeinrichtung
verwendet werden, über
welche für
alle Messräume
simultan dieselben Messbedingungen, zum Beispiel hinsichtlich des
Messmediums oder dergleichen, geschaffen werden. Wichtig dabei ist aber
die strömungsmäßige und
vor allem elektrische Entkopplung der voneinander getrennt zu betrachtenden
Messräume.
Insbesondere
ist es vorgesehen, eine Messanordnung für die erfindungsgemäße Vorrichtung zu
verwenden, bei welcher die Testvorgänge an Messsensoren in mehr
oder weniger miniaturisierter Form durchgeführt werden können. Zum
Beispiel kann ein Messraum verwendet werden, welcher dazu in Form
oder im Raster einer Mikroplatte oder Mikrotiterplatte oder dergleichen
ausgebildet ist, wobei eine Mehrzahl integrierter Sensoranordnungen,
vorzugsweise in separaten und strömungsmäßig und/oder elektrisch voneinander
entkoppelten, und/oder voneinander unabhängigen Vertiefungsbereichen
davon ausgebildet ist. Vorzugsweise können die Vertiefungsbereiche
und die darin vorgesehenen Sensoranordnungen in Form eines Rasters
auf einer derartigen Mikroplatte angeordnet sein, um eine Anordnung
von 4, 8, 12, 96 oder dergleichen parallelen Messkanälen zu realisieren.
Dabei können
dann entsprechend gängige
4-, 8- 12-, 96-kanalige Pipettierautomaten für die Probenzugabe zum Einsatz
kommen.