-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie und der Molekularbiologie.
Sie betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur zellfreien
Synthese von Polypeptiden und Proteinen.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Peptide,
Polypeptide und Proteine (im Folgenden unter dem Begriff Proteine
zusammengefasst) sind eine Stoffklasse mit zentraler Bedeutung für Biochemie,
Molekularbiologie und Biotechnologie. Bei Proteinen wird zwischen
löslichen
globulären
Proteinen und unlöslichen
Membranproteinen unterschieden. Die Herstellung pharmakologisch
aktiver globulärer
Proteine, die für
therapeutische Zwecke eingesetzt werden können, ist ein wichtiges Tätigkeitsfeld
der biotechnologischen Industrie. Globuläre Proteine finden auch bei
diagnostischen und analytischen Verfahren Verwendung, z. B. beim
Nachweis von Krankheitserregern. Membranproteine sind integrale
Bestandteile zellulärer
Membranen und vermitteln die Übertragung
von Signalen und den Transport von Stoffen durch zelluläre Membranen.
Defekte in Membranproteinen sind Ursache vieler Krankheiten. Die
Erforschung der Struktur, Funktion und pharmakologischen Beeinflussbarkeit
von Membranproteinen ist ein wichtiger Gegenstand der pharmakologischen
Industrie.
-
Im
lebenden Organismus werden Proteine im Zytoplasma der Zellen durch
einen als Translation bezeichneten Prozess erzeugt. Bei der Translation
werden die Grundbausteine der Proteine, die Aminosäuren, an
Ribosomen zusammengeführt
und durch Peptidbindungen zu langen Ketten verknüpft. Die Reihenfolge der Aminosäuren in
den Proteinen wird durch die Messenger-RNA (mRNA) bestimmt. Durch
Einschleusen von Genen in Zellen kann die Synthese spezifischer
mRNA-Spezies und damit spezifischer Proteine künstlich induziert werden.
-
Die
Proteinsynthese kann auch außerhalb
der Zelle durchgeführt
werden. Dazu werden die für
die Proteinsynthese erforderlichen hochmolekularen Komponenten aus
Zellen durch Herstellung zytosolischer Zellextrakte gewonnen und
diese zytosolischen Extrakte mit den außerdem notwendigen niedermolekularen
Komponenten (z. B. Aminosäuren
oder energiereiche Triphosphate wie ATP und GTP) angereichert. Anfangs
konnten so nur Proteine hergestellt werden, die von der mRNA der
Ausgangszellen (endogene RNA) kodiert waren. Für eine Reihe von in-vitro-Translationssystemen
(d.h. kompletten Systemen für
die die zellfreie Proteinsynthese) wurden Methoden gefunden, die
endogene mRNA durch exogene mRNA zu ersetzen und so spezifische
Proteine darzustellen. Die Ausgangszellen für diese Translationssysteme
sind Escherichia coli, Weizenkeime und Kaninchen-Retikulozyten,
wobei unterschiedliche Verfahren angewendet werden, um die endogene mRNA
zu entfernen.
-
Im
Vergleich zu den auf intakten Zellen basierenden Verfahren der Proteinsynthese
besitzt die zellfreie Proteinsynthese eine Reihe von Vorteilen,
insbesondere in Bezug auf die Herstellungsgeschwindigkeit spezifischer
Proteine sowie den Durchsatz und die Flexibilität der Verfahren und Vorrichtungen.
Die Herstellung von Zellgiften wird durch die zellfreien Verfahren überhaupt
erst ermöglicht.
Die effiziente Markierung von Proteinen für Nuklear-Magnet-Resonanz-
und Röntgenstudien
mit speziellen Isotopen wird erleichtert.
-
Bei
den zellfreien Verfahren der Proteinsynthese unterscheidet man zwischen
statischen „Batch"-Systemen und kontinuierlich
betreibbaren Systemen. In Batch-Systemen findet die Herstellung
der Proteine in einem abgeschlossenen Volumen statt, in dem sich
alle für
die Proteinsynthese erforderlichen hoch- und niedermolekularen Komponenten
befinden. Durch die Entstehung von Nebenprodukten sowie den Verbrauch
der Ausgangsstoffe, wie z. B. der Aminosäuren, kommt die Reaktion zum
Erliegen. In kontinuierlich betriebenen Systemen werden die Ausgangssubstanzen,
auch Reaktionsedukte genannt, und die Reaktionsprodukte dem System
kontinuierlich zugefügt
bzw. entnommen. Es gibt auch kombinierte Systeme, bei denen z. B.
nur die Edukte zugeführt
werden.
-
In
der europäischen
Patentanmeldung
EP1316617 wird
ein kombiniertes System beschrieben. In Löcher, z. B. in einer Titerplatte,
wird auf eine Reaktionsphase eine Zufuhrphase geschichtet, aus der
Reaktionsedukte durch Diffusion in die Reaktionsphase dringen können. Durch
die Schichtung kann die die Zufuhrphase erneuert werden.
-
Kommerziell
erhältlich
sind kontinuierliche Systeme zur zellfreien Proteinsynthese, wie
sie z. B. in der europäischen
Patentanmeldung
EP 1061128 oder
im US-Patent
US 6670173 beschrieben
werden. Die Systeme umfassen eine Zufuhrkammer und eine Reaktionskammer,
die durch eine semipermeable Membran getrennt sind. In der Zufuhrkammer
befinden sich alle Komponenten, die während der Proteinsynthese in
der Reaktionskammer verbraucht werden und ersetzt werden müssen. Es
handelt sich hierbei um niedermolekulare Stoffe wie Aminosäuren, die
die semipermeable Membran durchdringen können. Die höhermolekularen Stoffe, wie
die synthetisierten Proteine und die Komponenten des Translationsapparats
(z. B. Ribosomen), befinden sich in der Reaktionskammer und können die
Membran nicht passieren. Findet der Austausch der Komponenten zwischen
Reaktions- und Zufuhrkammer lediglich passiv durch Diffusion statt,
so spricht man von Continuous-Exchange-Systemen.
In diesen Systemen kommen Dialysemembranen als semipermeable Membranen
zum Einsatz. Bei Continuous-Flow-Systemen werden die Lösung in
Zufuhr- und Reaktionskammer stetig ersetzt. Wegen des auf die Membran
ausgeübten
Drucks muss für
Continuous-Flow-Systeme
eine erhöhte Membranstabilität gewährleistet
werden.
-
Die
existierenden Systeme für
die zellfreie Proteinsynthese haben auch eine Reihe von Nachteilen. Die
Effizienz, mit der Proteine gewünschter
Funktionalität
dargestellt werden, ist gering. Reste endogener mRNA im verwendeten
zytosolischen Extrakt erzeugen unerwünschte Proteine. Es können ausschließlich lösliche Proteine,
nicht aber Membranproteine erzeugt werden. Auf der Reaktionsseite
sind zusätzlich
zu den erzeugten Proteinen die verschiedenen Komponenten des Translationsapparats
vorhanden. Im Anschluss an die Synthese müssen die Proteine aufgereinigt
werden. Bei Systemen mit Membranen treten Probleme durch Membranverstopfung
auf sowie Haltbarkeits- und Stabilitätsprobleme der Membran.
-
Die
Aufreinigung von Proteinen ist ein aufwändiger Prozess, bei dem Verfahren
der Filtration, Zentrifugation und Chromatographie eingesetzt werden
müssen.
Ein Großteil
der Produktionskosten biotechnologisch hergestellter Proteine entfällt auf
die Aufreinigung.
-
Kurzfassung
-
Die
Erfindung hat die Aufgabe spezifische Proteine hoher Reinheit herzustellen.
-
Die
Erfindung hat weiter die Aufgabe die Analyse bzw. das Screening
spezifischer Proteine zu vereinfachen.
-
Diese
Aufgaben gelten insbesondere für
lösliche
Proteine sowie für
Membranproteine.
-
Diese
und andere Aufgaben löst
die Erfindung durch eine Vorrichtung, die eine oder mehrere Poren umfasst.
Die Poren wiederum enthalten ein oder mehreren Translokase-Proteine.
Die eingesetzten Translokase-Proteine bilden nanoskopische Kanäle, die
je nach Herkunft nichtgefaltete, teilweise gefaltete oder vollständig gefaltete
Proteine transportiert. Das von Translokase-Proteinen gebildete,
protein-transportierende System wird im Folgenden als Translokationssystem
bezeichnet.
-
Durch
die Vorrichtung werden Translokationssysteme, wie sie in biologischen
Zellen vorkommen oder durch gentechnische Verfahren gezielt hergestellt
werden können,
in künstliche
Systeme integriert und auf diese Weise für die Herstellung oder Aufreinigung
von Proteinen genutzt.
-
An
den Poren werden zwei Bereiche, der cis-Bereich und der trans-Bereich,
mit Hilfe von Translokationssystemen derart von einander abgetrennt,
dass ausschließlich
Proteine, die aufgrund spezifischer molekularer Signale von den
Translokationssystemen erkannt werden, vom cis-Bereich in den trans-Bereich übertreten
können.
-
Durch
die Aufteilung der Vorrichtung in den cis-Bereich und trans-Bereich
können
im cis-Bereich die für
die Herstellung der Proteine notwendigen Substanzen zugeführt werden.
Nach Synthese der Proteine und ihrem Transport in den trans-Bereich
stehen die hergestellten Proteine im trans-Bereich zur Verfügung.
-
Werden
Poren verwendet, deren Querschnitt kleiner als der des Translokationssystems
ist, kann die Trennung in den cis-Bereich und in den trans-Bereich
durch das Translokationssystem allein vorgenommen werden.
-
Durch
Einsatz des Sec61-Komplexes, der ein zentraler Bestandteil der Protein-Translokase
des endoplasmatischen Retikulums von Säugetieren ist, als Translokationssystem,
können
lösliche
eukaryontische Proteine hergestellt werden. Dabei wird durch Zugabe
eines geeigneten Translationssystems zum cis-Bereich die Synthese
von Proteinen, die Kopplung der protein-synthetisierenden Ribosomen
an den Sec61-Komplexe, und
die Translokation der Proteinen in den trans-Bereich während ihrer
Synthese induziert.
-
Werden
Poren verwendet, deren Querschnitt größer als der der Translokationssysteme
ist, können
die Poren durch bimolekulare Lipidmembranen oder andere Membranen
in den cis-Bereich und trans-Bereich
aufgetrennt werden.
-
Nach
Integration des Sec61-Komplexes in die bimolekularen Lipidmembranen
kann in Abhängigkeit vom
eingesetzten Translationssystem entweder die Synthese von Membranproteinen
und ihr Einbau in die bimolekularen Lipidmembranen oder die Synthese
löslicher
Proteine und ihre Freisetzung in den trans-Bereich induziert werden.
-
Durch
den Einbau der Membranproteine in die bimolekularen Lipidmembranen
wird eine Analyse der hergestellten Proteine am Ort ihrer Synthese,
z. B. mit lichtmikroskpischen Methoden, ermöglicht.
-
Der
trans-Bereich kann so gestaltet werden, dass er ein verschlossenes
Behältnis
bildet, in dem sich hergestellte lösliche Proteine anreichern
können
und zur weiteren Untersuchung zur Verfügung stehen.
-
Der
trans-Bereich kann auch so ausgestaltet sein, dass ein continuous-flow System ermöglicht wird, bei
dem im cis-Bereich stetig neue Ausgangsstoffe zugeführt werden
und im trans-Bereich die hergestellten Proteine abgeführt werden.
-
Die
Poren sind in einem Trägerkörper eingebracht.
Das Material des Trägerkörpers kann
je nach Verwendungszweck unter anderem Kunststoff, Metall, Keramik,
Glas oder Silizium umfassen.
-
Ist
bei einseitig geschlossenen Poren der Trägerkörper zumindest teilweise aus
einem transparenten Material gefertigt, so können optische Untersuchungen
am Inhalt der Poren durchgeführt
werden, insbesondere lichtmikroskopische Untersuchungen.
-
Um
die Haftung der Translokase-Proteine und/oder der Membranen am Trägerkörper zu
ermöglichen oder
zu verbessern, können
eine oder mehrere Schichten auf den Trägerkörper aufgebracht werden, z.
B. kann auf dem Trägerkörper eine
Goldschicht aufgebracht und mit einer Lipidschicht bedeckt werden.
-
Außer den
hergestellten Proteinen befinden sich in der Lösung des trans-Bereichs lediglich
Chaperone (Faltungskatalysatoren), die eventuell von den hergestellten
Proteinen wieder abgetrennt werden müssen.
-
Die
Vorrichtung kann so aufgebaut werden, dass der Trägerkörper eine
erste Kammer mit den cis-Bereichen von einer zweiten Kammer mit
den trans-Bereichen abtrennt. Durch diese Anordnung wird die Herstellung
von Proteinen ermöglicht,
bei der kontinuierlich oder diskontinuierlich Stoffe in die erste
Kammer zugeführt oder
aus der ersten Kammer abgeführt
werden können
oder bei der Stoffe kontinuierlich oder diskontinuierlich aus der
zweiten Kammer abgeführt
oder der zweiten Kammer zugeführt
werden können.
-
Beim
Gebrauch der Vorrichtung können
durch Ribosomen und Nukleinsäuren
in der ersten Kammer Proteine hergestellt werden, die dann in der
zweiten Kammer zur Verfügung
stehen.
-
Durch
Zugabe eines Translationssystems für die Erzeugung globulärer Proteine
des endoplasmatischen Retikulums zum cis-Bereich wird ein Verfahren
geschaffen, das im trans-Bereich spezifische Proteine hoher Reinheit
zur Verfügung
stellen kann.
-
Durch
Zugabe eines Translationssystems zur Erzeugung von Membranproteinen
zum cis-Bereich, wird ein Verfahren für die Herstellung von Membranproteinen
geschaffen. Die Membranproteine werden in die bimolekularen Lipidmembranen
eingebaut und können
dort analysiert werden.
-
Werden
Membranproteine hergestellt, so können diese in der Membran in
vitro untersucht werden, z. B. bezüglich ihrer Transporteigenschaften
für Substanzen,
die im cis-Bereich zugeführt
werden und in den trans-Bereich eindringen.
-
Beschreibung
der Zeichnungen
-
1a zeigt
schematisch den Herstellungsprozess von Membranproteinen.
-
1b zeigt
schematisch den Herstellungsprozess von löslichen globulären Proteinen
-
2a zeigt
eine durch ein Translokationssystem getrennte Pore
-
2b zeigt
eine durch eine Membran, in die ein Translokationssystem integriert
ist, getrennte Pore
-
3a bis
d zeigen das Herstellungsverfahren für die Trennung einer beidseitig
offenen Pore in einen cis- und einen trans-Bereich
-
4a bis
d zeigen das Herstellungsverfahren für die Trennung einer einseitig
geschlossenen Pore in einen cis- und einen trans-Bereich. In 4d1 und 4e sind
zwei unterschiedliche Verfahren für unterschiedliche Porengrößen gezeigt.
-
Detaillierte
Erfindungsbeschreibung
-
Grundlage
der Erfindung ist eine in 1 gezeigte
Pore 10, die mit einem Translokationssystem 20 verschlossen
ist. Das Translokationssystem 20 kann in eine bimolekulare
Lipidmembran 30 eingebaut sein. Das Translokationssystem 20 kann
auch mit einem Translationssystems 40, mit dem spezifische
Proteine 70 dargestellt werden können, gekoppelt sein. Die erzeugten
Proteine 70 werden durch das Translokationssystem 20,
entweder in die Membran 30 eingebaut, wie in 1a gezeigt,
oder durch die Membran hindurch befördert, wie in 1b gezeigt.
-
Ein
Beispiel für
eine Kombination von Translationssystem 40 und Translokationssystem 20 ist
der Komplex, der aus Ribosomen, die mit der Synthese eines Proteins
gerade beginnen (ribosome nacent chaine complex) und dem Sec61-Komplex
besteht. Für
die korrekte Faltung der neusynthetisierten Proteine 70 sind Chaperone 60 erforderlich.
Die Translokation kann sowohl während
der Synthese, d.h. kotranslational, erfolgen, wie in 1 gezeigt. Sie kann aber auch nach Abschluß der Synthese,
d.h. posttranslational, erfolgen. In diesem Fall bindet das fertige
Proteinmolekül
an den Sec61-Komplex und wird durch ihn hindurch transportiert.
-
1a zeigt,
wie beim Einbau eines Membranproteins 80 in die Membran 30 der
Schritt der Translokation nur partiell durchgeführt wird. Das Membranprotein 80 wird
während
des Translokationsprozesses seitwärts aus dem Sec61 Komplex 100 in
die Membran 30 überführt.
-
Für die Herstellung
des Translationssystem 40 stehen die Verfahren zur Verfügung, die
für die
zellfreie Proteinsynthese bereits entwickelt wurden. Bei der Erfindung
wird das Translokationssystem 20 so an der Pore 10 angebracht,
dass der Durchlass durch die Pore 10 versperrt ist. Dadurch
wird an der Pore 10 eine Trennung in einen cis-Bereich 50 und
in einen trans-Bereich 60 vorgenommen. Die Trennung an
der Pore kann auf verschiedene Weise hergestellt werden.
-
Durch
die Trennung der Pore 10 in den cis-Bereich 50 und
in den trans-Bereich 60 kann
das Translokationssystem 20 auch verwendet werden, um vom
Translokationssystem 20 erkannte Prä-Proteine, d.h. signalsequenz-haltigen
Proteine, zu filtrieren. Dafür
ist eine Triebkraft erforderlich. Als Triebkraft kann eine elektrischen
Spannungsdifferenz, ein ATP-abhängiger
Motor oder eine ATP-abhängigen
Drehknarre dienen. Die Prä-Proteine
werden dabei im cis-Bereich 50 der Pore 10 hinzugefügt und nur
spezifische Proteine können durch
das Translokationssystem 20 in den trans-Bereich 60 übertreten.
Die spezifischen Proteine können
auf Grund molekularer Signale erkannt werden.
-
Die
Poren 10 sind in einen Trägerkörper 90 eingebracht.
Dieser Trägerkörper 90 kann
je nach Anwendungszweck aus Materialien wie Kunststoff, Metall,
Keramik, Glas oder Silizium bestehen. Eine Lochfolie ist ein Beispiel
für einen
geeigneten Trägerkörper 90.
-
In 2 sind zwei Möglichkeiten für die Trennung
in den cis-Bereich 50 und in den trans-Bereich 60 an
der Pore 10 dargestellt. 2a zeigt
den Fall, in dem die Pore 10 kleiner als das Translokationssystem 20 ist.
Wie in 2a gezeigt, reicht es dann aus,
das Translokationssystem 20 in die Pore 10 oder
am Eingang 12 oder Ausgang 14 der Pore 10 anzubringen.
Beispielhaft sind hier Verfahren für das Anbringen des Sec61-Apparats
angegeben, bei denen die Pore 10 mit dem Sec61p-Komplex 100 verschlossen
wird.
-
In 3a bis
e ist das Einbringen des Sec61p-Komplex 100 in die Poren 10 gezeigt.
Der Durchmesser des Sec61p-Komplexes 100 beträgt etwa
10 nm. Die Poren 10 sollten eine Größe von etwa 15 nm haben. Als Trägerkörper 90 können Folien
dienen. Folien mit geeigneter Porengröße lassen sich z. B. durch
zweistufiges Anodisieren von Aluminiumfolien herstellen (H. Masuda
und K. Fukada, Ordered metal nanohole arrays made by a two-step
replication of honeycomb structures of anodic alumina. Science 268,
1466–1468,
1995) und sind kommerziell erhältlich
(Whatman – „Anopore
Inorganic Membranes").
Andere Materialien, die mit geeigneten Poren 10 vorliegen
oder in denen Poren 10 der gewünschten Größe erzeugt werden können, sind
ebenfalls denkbar.
-
3b zeigt,
wie die Lochfolie 90, um den Sec61p-Komplex 100 später in die
Poren 10 der Lochfolien 90 einbauen zu können, mit
einer Metallschicht 110 beschichtet wird, vorzugsweise
durch Bedampfung mit einer dünnen
Goldschicht.
-
Durch
Immersion der Gold bedampften Lochfolie 90 mit einem negativ
geladenen Mercapto-Lipid, das kovalent mit Gold reagiert, wird eine
selbstassemblierte, negativ geladene, monomolekulare Schicht (SAM) 120 auf
einer Oberfläche 92 der
Lochfolie 90 erzeugt, wie in 3c dargestellt.
In 3d ist gezeigt, wie der Trägerkörper 90 mit einer
wässrigen
Lösung 140 des
durch Detergenzien 130 solubilisierten Sec61-Komplex 100 durchströmt wird,
so dass die solubilisierten Sec61p-Komplexe 100 an den
Eingängen 12 der
Poren 10 haften bleiben und durch den Kontakt zwischen
SAM 120 und Detergenz 130 in die Poren 10 eingepasst
werden. Alternativ kann, wie in 3e dargestellt,
der Sec61-Komplex 100 auch mit positiv geladenen Lipiden 160 in
Liposomen 150 rekonstituiert werden. Eine Suspension rekonstituierer
Liposomen 150 kann auf den SAM 120 der Lochfolie 90 aufgebracht
werden. Die positiv geladenen Lipide 160 der Liposomen
binden stark an den SAM 120 auf der Oberfläche 92 und
bilden spontan Membranen, die die Poren 10 der Lochfolie 90 überspannen
und den Sec61p-Komplex 100 enthalten.
-
Einseitig
geschlossene Poren 10 können
in Trägerkörpern 90 aus
verschiedenen Materialien realisiert werden. Vorzugsweise ist das
Material, das die Poren verschliesst optisch transparent, um z.
B. mikroskopische Untersuchungen an den Proteinen im trans-Bereich
zu ermöglichen.
Transparenz kann durch eine sehr geringe Dicke des eingesetzten
Materials oder seine optischen Eigenschaften erzielt werden. Zum
Einsatz können
Folien oder andere Werkstücke
kommen, die aus Kunststoff, z. B. Polycarbonat, anodisiertem Aluminium
oder anderen Metallen, Glas oder glasähnlichen Feststoffen oder Silizium
gefertigt sind.
-
In 4 ist
das Anbringen des Translokationssystems 20 an die Poren 10 gezeigt.
In dieser Ausführungsform
sind die Poren 10 am „Ausgang" 14' geschlossen.
Die Poren 10 werden, wie in 4a gezeigt,
als Vertiefungen 16 im Trägerkörper 90 ausgebildet,
die Vertiefungen 16 haben meist Durchmesser von zwischen 50
nm und 100 μm
bei Tiefen von 0.1 μm
bis 100 μm.
Die Dimensionen der Poren 10 können dem Einsatzzweck angepasst
werden.
-
Die
einseitig geschlossenen Poren 10 können auch durch Aufbringen
einer Lochfolie 90 auf einen Träger hergestellt werden. Die
Lochfolie 90 aus 4 muss nicht
identisch mit der Lochfolie 90 aus 3 sein. Sogenannte
Track-Etched-Filter können
z. B. auf Deckgläser
geklebt werden. Alternativ können
die einseitig geschlossene Poren 10 durch die an sich bekannten
Techniken der Mikro- und Nanostrukturierung direkt hergestellt werden.
Die Anordnung der Poren 10 kann zufällig oder regelmäßig sein.
Die Flächendichte
der Poren kann zwischen 1 je Trägerkörper und
1012/m2 liegen.
-
Vorzugsweise
ist der Aufbau der Poren 10 derart, dass der trans-Bereich 60 durch
die geschlossene Seite 14' hindurch
mit dem Lichtmikroskop mit handelsüblichen Objektiven betrachtet
werden kann.
-
Um
Poren mit einer bimolekularen Lipidmembran zu verschliessen, die
den Sec61-Komplex enthält, wird
ein Trägerkörper 90 mit
einseitig geschlossenen Poren 10 mit einer physiologischen
Pufferlösung 170 bedeckt,
vgl. 4. Dann wird der mit Pufferlösung 170 bedeckte
Trägerkörper 90 mit
einer dünnen
Schicht einer geeigneten Lipidlösung
bedeckt, vergl. 4c. Die Teile der
Lipidschicht, die die Poren überspannen,
dünnen spontan
zu bimolekularen Lipidmembran (BLM) 180 aus. Durch Zugabe
einer Suspension von rekonstituierten Liposomen 150, die
den Sec61p-Komplex 100 enthalten, wird die Fusion der rekonstituierten
Liposomen 150 mit den BLMs 180 bewirkt und Sec61p-Komplexe 150 in
die BLMs 180 eingefügt,
vergl. 4d. Alternativ zu rekonstituierten
Liposomen kann der in einem geeigneten Detergenz solubilisierte
Sec61-Komplex zu den, mit BLMs überspannten
Poren gegeben werden, um den Sec61-Komplex in die BLMs einzufügen.
-
Bei
Porendurchmesser bis zu 500 nm kann die Entstehung des BLM 180 mit
dem Sec61p-Komplex 100 direkt durch Auftragen der rekonstituierten
Liposome 150, die den Sec61p-Komplex 100 enthalten,
auf die Poren 10 mit der gebildeten BLM 180 bewirkt
werden. Dies ist in 4e gezeigt. Dazu sollten in
den Liposomenmembranen und auf der Oberfläche komplementäre Liganden,
wie z. B. Biotin und Strepavidin platziert werden. Die rekonstituierten
Liposomen 150 binden dann spontan an die Poren 10, öffnen sich
und bilden die Pore 10 überspannende
bimolekulare Lipidmembrane 180.
-
Nach
Erstellung der Trennung in den cis-Bereich 50 und in den
trans-Bereich 60 wird
im cis-Bereich 50 das Translationssystem 40 zugeführt. Das
Translationssystem 40 umfasst Ribosomen, die je nach Anwendungszweck
für die
Erzeugung eines löslichen
Proteins 70 oder eines Membranproteins 80 programmiert
sind, und alle anderen für
die Proteinsynthese erforderlichen Komponenten wie z. B. Aminosäuren, ATP.
Wiederum nur als Beispiel dienend wird bei Verwendung des Sec61p-Komplexes 100 bei
der Zuführung
des Translationssystems 40 die Kopplung der Ribosomen mit
dem Sec61p-Komplex 100 initiiert.
-
Vom
Translationssystem 40 erzeugte Proteine 70 werden
nun vom Translokationssystem 20 bereits während des
Translationsprozesses (cotranslational) oder nach vollendetem Translationsprozess
durch die Membran 30 transloziert oder im Falle von Membranproteinen 80 durch
das Translokationssystem in die Membran 30 eingebaut. Der
Translationsvorgang kann z. B. durch den Sec61p-Komplex 100 als
Translokationssystem 20 vorgenommen werden. Der Translokationsvorgang
kann in drei Schritten dargestellt werden, der Membranassoziation
des Vorstufenproteins, der Membraninsertion und der kompletten Translokation.
Am Translokationsvorgang sind aminoterminale Signalpeptide in den
Vorstufeproteinen sowie lösliche
Proteine des Cytosols (SRP oder molekulare Chaperone) sowie eine
Proteintranslokase beteiligt. Der heterotrimere Sec61p-Komplex 100 ist
die Hauptkomponente der Proteintranslokase. In der Regel werden
Signalpeptide während
des Translokationsvorgangs durch Signalpetidasen vom Vorstufenprotein
abgespalten. Der Einbau des Membranproteins 80 erfolgt
ohne die Vollendung des Translokationsvorgangs, und häufig bleiben
die Signalpeptide am Membranprotein 80 und stellen die
Transmembranregionen des Membranproteins 80 dar. Sogenannte
tailanchored Membranproteine 80 können nur posttranslational
eingebaut werden. Sie werden über ein
carboxyterminales Ende in die Membran 30 inseriert.
-
Um
die Faltung der Proteine 70 in die korrekte Tertiärstruktur
nach der Translokation zu erzielen, können in die Lösung auf
der cis-Seite 50 Faltungskatalysatoren und Chaperone wie
z. B. PDI und PPI eingebracht werden.
-
Findet
die Proteinsynthese in den einseitig geschlossenen Poren 10 statt,
so reichern sich bei der Herstellung löslicher Proteine 70 im
trans-Bereich 60 die erzeugten Proteine 70 an.
Nach einer ausreichenden Inkubationszeit stehen die Proteine 70 in
den einseitig geschlossenen Poren 10 zur Untersuchung zur
Verfügung.
Einem sich dabei durch die unterschiedlichen Konzentrationen der
löslichen
Proteine 70 im cis-Bereich 50 und im trans-Bereich 60 einstellenden
ersten osmotischen Druck kann gegebenenfalls durch eine Veränderung
von Stoffkonzentrationen im cis-Bereich 50 entgegengewirkt
werden. Es können
hierbei Stoffe, z. B. Proteine, auf der Seite des cis-Bereichs 50 hinzugefügt werden,
die nicht in den trans-Bereich 60 eindringen können. Durch
das Hinzufügen
der Stoffe kann ein zweiter osmotischer Druck aufgebaut werden,
der dem ersten osmotischen Druck entgegenwirkt.
-
Ist
der trans-Bereich 60 der Poren 10 mit einem durchsichtigen
Material abgeschlossen, so können lichtmikroskopische
Untersuchungsmethoden eingesetzt werden, um die Proteine 70 durch
das durchsichtige Material hindurch zu untersuchen. Sind die Poren 10 mit
Deckgläschen
abgeschlossen und werden für
die Untersuchung auf einen Objektträger aufgebracht, so ist bereits
eine Anpassung an das optische System von Standardmikroskopen erfolgt.
-
Anordnungen
von den einseitig geschlossenen Poren 10 können auch
in sogenannte Mikrotiterplatten eingebracht werden. Die Anordnungen
werden dann am Boden der Mikrokammern der Mikrotiterplatten befestigt.
Für die
Mikrotiterplatten mit den Poren 10 stehen dann die bekannten Verfahren
von Nanoliter-Pipettierautomaten zur Befüllung. Die Analytik der hergestellten
Proteine 70 kann in Parallelverfahren mit Mikrotiterplattenlesern
durchgeführt
werden. Bei der Analytik können
dann z. B. fluoreszenzmikroskopische Messungen von Konformationsänderungen
vorgenommen sowie andere funktionale Parameter bestimmt werden.
-
Sind
bei der Proteinsynthese Membranproteine 80 hergestellt
und in die Membran 30 eingebaut worden, so stehen diese
nun zur Untersuchung ihrer Eigenschaften zur Verfügung. Nach
der für
die Herstellung und Insertion in die Membran 30 benötigten Inkubationszeit,
kann z. B. in den cis-Bereich 50 ein Substrat eingebracht
werden und die Interaktion des Substrats mit den erzeugten Membranproteinen 80 beobachtet
werden. Diese Interaktion kann bei transparentem Abschluss der Poren 10 wiederum
mit lichtmikroskopischen Verfahren erfolgen, z. B. kann mit dem
OSTR-Vertahren der Transport von Substanzen, die fluoreszieren oder die
mit einem Fluoreszenzindikator detektiert werden können, durch
die Membranproteine 80 nachgewiesen werden. Bei geeignetem
Versuchsaufbau auch die Abhängigkeit
der Transportkinetik von elektrischen Potentialen vorgenommen werden.
Die Messungen an Membranproteinen 80 können, wie bereits für lösliche Proteine 70 beschrieben,
parallelisiert und automatisiert durchgeführt werden, sodass hierdurch
ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren für die Charakterisierung von
Membranproteinen 80 zur Verfügung gestellt wird.
-
Steht
nicht die Analyse von Proteinen 70 sondern die Proteinherstellung
an sich im Vordergrund, so kann, wie in 5 dargestellt,
eine Lochfolie 90 mit den durch den Sec61p-Komplex 100 verschlossenen
Poren 10 als Trennwand 190 in einer Herstellungsvorrichtung
mit zwei Kammern eingesetzt werden. In eine auf der cis-Seite liegende
cis-Kammer 200 werden die für die Translation der Proteine 70 notwendigen
Stoffe zugeführt.
Auf der trans-Seite befindet sich eine trans-Kammer 210.
Aus der trans-Kammer 210 können die hergestellten Proteine 70 entnommen
werden. Sowohl die Zufuhr von Stoffen wie auch die Abfuhr von Stoffen kann
kontinuierlich oder diskontinuierlich durch Zufuhrvorrichtungen 220 bzw.
Abfuhrvorrichtungen 230 verlaufen.
-
Für eine effiziente
Vorrichtung, die Proteine 70 möglichst hoher Konzentration
erzeugt, ist eine hohe Flächendichte
von Poren 10, eine große
Fläche
der Trennwand 190 mit den Poren 10 und eine hohe
Syntheserate vorteilhaft. Das Volumen der cis-Kammer 200 bzw.
der trans-Kammer 210 sollte dabei möglichst klein sein, was zu
einer Anordnung führt,
bei der die Trennwand 190 mit den Poren 10 zwischen
zwei flächigen
Abgrenzungen mit geringem Abstand zur Trennwand 190 eingebracht
ist.
-
