ES2229587T3 - Procedimiento y dispositivo para llevar a cabo reacciones bioquimicas con alto rendimiento. - Google Patents

Procedimiento y dispositivo para llevar a cabo reacciones bioquimicas con alto rendimiento.

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ES2229587T3
ES2229587T3 ES99111762T ES99111762T ES2229587T3 ES 2229587 T3 ES2229587 T3 ES 2229587T3 ES 99111762 T ES99111762 T ES 99111762T ES 99111762 T ES99111762 T ES 99111762T ES 2229587 T3 ES2229587 T3 ES 2229587T3
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Abstract

Dispositivo para llevar a cabo las biosíntesis de polipéptidos libres de células, basado en una carcasa externa, que encierra una carcasa interior con unas cavidades incorporadas y una cámara de abastecimiento, donde las cavidades de la carcasa interior durante la reacción bioquímica contienen respectivamente un sistema productor, la cámara de abastecimiento contiene un líquido de abastecimiento durante la reacción bioquímica y las cavidades de la carcasa interior y la cámara de abastecimiento están separadas por una membrana semipermeable, que se caracteriza por que la carcasa interior presenta al menos dos cavidades, cuyos extremos inferiores están cerrados por una membrana semipermeable y cuyos extremos superiores sobresalen del líquido de abastecimiento contenido en la cámara de abastecimiento, y está unida a los medios para el desplazamiento y atemperado de los sistemas productores así como al líquido de abastecimiento, donde los medios para el desplazamiento están configurados de talforma que la mezcla del sistema productor y de la solución de abastecimiento se realiza de forma simultánea.

Description

Procedimiento y dispositivo para llevar a cabo reacciones bioquímicas con alto rendimiento.
La presente invención hace referencia a un procedimiento así como a un dispositivo para llevar a cabo reacciones bioquímicas, en particular para la biosíntesis de polipéptidos o bien para la transcripción in vitro acoplada y la traslación de proteínas a un sistema libre de células con ayuda de un dispositivo de diálisis "multicanal", donde sea posible la síntesis de distintas proteínas en unas condiciones simples y reproducibles.
El principio de la biosíntesis proteínica in vitro libre de células mediante el empleo de las membranas de diálisis se conoce desde hace años y consiste básicamente en que dos cámaras separadas (una para la mezcla de reacción, una para la solución de abastecimiento) están unidas a través de una membrana con un tamaño de poro adecuado. En la cámara de reacción se realiza la síntesis de las proteínas. En la cámara de abastecimiento o de alimentación existe una solución con todos los componentes de reacción necesarios para la transcripción o traslación, que son consumidos durante el proceso de biosíntesis de las proteínas en la mezcla de reacción. Teniendo en cuenta el hecho de que ambas cámaras están en contacto a través de una membrana semipermeable, los componentes de reacción gastados en la cámara de reacción pueden ser reemplazados, a través del correspondiente dispositivo de bombeo, por nuevos componentes de la cámara de abastecimiento, de tal forma que la síntesis transcurre en un periodo de tiempo claramente superior en comparación con el sistema estático, es decir se mantiene una reacción que tiene lugar en un recipiente de reacción correspondiente. Los procedimientos para la biosíntesis in vitro libre de células según el principio del "flujo continuo" o bien "intercambio continuo" se han descrito en las patentes US 5.478.730, EP 0 593 757 y por Spirin y cols., en Science vol. 242, 1988, pág. 1162-1164.
El sistema de traslación empleado según la patente US 5.478.730 contiene por ejemplo una columna de mRNA, que codifica el polipéptido. Además en el sistema de síntesis libre de células hallamos ribosomas, tRNA, aminoácidos, ATP y GTP. La traslación de la mRNA con ayuda de la tRNA conduce a la producción del correspondiente polipéptido, donde se forman al mismo tiempo productos secundarios y residuos con bajo peso molecular. Estos pueden pasar a través de una membrana semipermeable, que separa la zona, en la cual se encuentra el sistema de síntesis, de una zona de abastecimiento, al área de abastecimiento. El área de abastecimiento contiene un líquido que actúa como medio de abastecimiento del ATP, GTP y los aminoácidos. Estos componentes pasan al sistema de síntesis a través de la membrana semipermeable, para reemplazar su consumo durante la reacción de biosíntesis. El paso a través de la membrana semipermeable es posible porque su peso molecular se sitúa por debajo de su límite de paso. Al mismo tiempo, los productos de la reacción bioquímica y otras sustancias cuyo peso molecular es inferior al límite de la barrera pasan de la zona de reacción a la zona de abastecimiento. La membrana semipermeable es según la patente americana 5.478.730, por ejemplo, una membrana de ultrafiltración en forma de fibras huecas de membrana.
La patente americana 5.478.730 contiene otras explicaciones acerca de las composiciones adecuadas del sistema de síntesis y del fluido de abastecimiento. La presente invención hace referencia a la situación de la técnica ya conocida, como la que se deduce de la patente americana y a los puntos de la literatura citados en ella.
La patente europea 0 593 757 describe el uso de la transcripción acoplada y de la traslación para el correspondiente proceso de biosíntesis in vitro, donde básicamente se ha añadido a la mezcla de reacción una RNA-polimerasa.
Además se conocen diversos dispositivos o membranas de diálisis. Se establecen diferencias básicamente en las denominadas versiones "tubo individual" y "multicanal". Los materiales de diálisis adecuados para la biosíntesis proteínica in vitro y que se obtienen en el comercio se basan exclusivamente en el principio del "tubo individual" (por ejemplo, EP 99 91 01 418.4; Promega Notes 1997; D.-M.Kim y C.-Y. Choi, Biotechnol. Prog. Vol. 12, 1996, pág. 645-649). Una producción elevado o bien la síntesis de diferentes proteínas una tras otra, además sin las costosas medidas de limpieza, no es posible por medio de este medio auxiliar de diálisis. Los dispositivos de diálisis según el principio del "tubo individual" tienen el inconveniente de que son caros de manipular desde el punto de vista técnico y de tiempo.
Además se describen o bien se ofrecen en el comercio unas placas de microvaloración con unas cavidades que en un extremo inferior están provistas de una membrana porosa. Las llamadas versiones "multicanal" se emplean exclusivamente para aplicaciones de cultivos celulares o bien para procesos de filtración o bien de estabilización del pH (por ejemplo, membranas de ultrafiltración de Milipore; Unidad de diálisis Slide-A-Lyzer® MINI de Pierce; WO 97/04074). Un intercambio entre líquidos de distintas concentraciones, como los que se emplean en la transcripción in vitro o bien traslación in vitro, no es posible con estos dispositivos "multicanal", porque éstos no son adecuados para las aplicaciones de la síntesis proteínica in vitro, por ejemplo con una adición o bien toma continuada de componentes.
La invención se basa por tanto en el cometido de hallar un procedimiento y un dispositivo con los cuales sea posible la realización de la biosíntesis de polipéptidos libre de células con elevada efectividad y a su vez de un modo simple y reproducible.
El cometido se resuelve mediante un dispositivo para realizar las biosíntesis de polipéptidos libres de células, que consta de una carcasa exterior, que encierra una carcasa interior con unas cavidades incorporadas y una cámara de abastecimiento, donde las cavidades de la carcasa interior y la cámara de abastecimiento se separan por medio de una membrana semipermeable, que se caracteriza por que la carcasa interior presenta al menos dos cavidades, cuyos extremos inferiores se cierran con la membrana semipermeable y cuyos extremos superiores sobresalen del líquido de abastecimiento contenido en la cámara de abastecimiento, y con unos medios para el desplazamiento y el atemperado del sistema productor, de tal forma que la mezcla del sistema producido y de la solución de abastecimiento se realiza de forma simultánea.
Como cámara exterior se emplean recipientes en forma de cilindro o de cáscara que son adecuados para la toma de líquido y en los cuales se emplea una carcasa interior, pequeña geométrica y si es preciso que puede fijarse. La carcasa interior puede tener cualquier dimensión externa siempre que se adapte a la carcasa exterior. Por ejemplo son adecuadas las disposiciones redondas, rectangulares o cuadradas para las carcasas exteriores con unos volúmenes de aproximadamente 10 ml hasta varios litros. Es preferible que la carcasa interior se adapte a la geometría de la carcasa exterior.
La carcasa interior presenta una o varias cavidades, siendo preferible un número de dos o de más, por ejemplo, seis, ocho, 24, 64, 96, 384 etc. Se utilizan sin embargo carcasas interiores, por ejemplo en forma de placas de microvaloración, que presentan más de cien hasta 1000 o más cavidades para el dispositivo conforme a la invención. Las cavidades se fabrican en general a base de un material inerte, como por ejemplo el polietileno, y pueden servir para volúmenes de aproximadamente 50 \mul hasta varios mililitros, es decir del orden de 10 ml. Se prefieren las cavidades de forma cónica que en el lado inferior están cerradas con una membrana semipermeable, como por ejemplo, una membrana de diálisis con un tamaño de poro de 3 hasta 100 kilo Dalton. En principio pueden emplearse todas las membranas habituales para diálisis o bien ultrafiltración con el correspondiente tamaño de poro. Estas membranas de diálisis con un tamaño de poro entre unos 10 y 14 kilo Dalton han demostrado ser especialmente adecuadas. De este modo pueden separarse las sustancias inhibidoras, de bajo peso molecular, que se forman en la biosíntesis in vitro.
Además se ha comprobado que resulta preferible que las distintas cavidades ("pozos") de la carcasa interior se revistan de proteínas sintetizadas in vitro o bien de componentes enlazados de forma específica a los péptidos. Los componentes correspondientes son aquellos que son adecuados especialmente para la limpieza de las proteínas que contienen tag. La proteína sintetizada in vitro en el pozo (que contiene tag) se une por ejemplo a la placa de microvaloración y puede limpiarse directamente, o si es preciso lavando con el tampón adecuado, o bien puede eluirse mediante los reactivos apropiados de una forma más limpia. Por ejemplo aquí se hace referencia a la llamada Protein-tag Strep-Tag II (secuencia 8AS, ver DE 4237113), donde la proteína sintetizada in vitro puede estar enlazada al N terminal o al C terminal. Como sustancias de revestimiento pueden emplearse por ejemplo la estreptactina, estreptavidina o avidina. El procedimiento para el revestimiento de las superficies correspondientes es bien conocido. Otra alternativa posible consiste en separar las proteínas sintetizadas que llevan tag por medio de la partícula magnética o de vidrio revestida del modo correspondiente de la mezcla de reacción de cada una de las cavidades.
Además el dispositivo conforme a la invención se equipa con un dispositivo de agitación o vibración para garantizar un movimiento o bien difusión de la(s) solución(es) de reacción y de la solución de abastecimiento. Se prefiere que en cada cavidad de la cámara de abastecimiento en la que transcurre la reacción se disponga un elemento de agitación en forma de un agitador magnético. Para garantizar una temperatura constante durante la reacción bioquímica, que en general oscile entre 20 y 37ºC, se colocará todo el dispositivo en un incubador que pueda cerrarse o bien se mantendrá bajo una campana de incubación atemperable. Según la invención se pueden emplear además aparatos combinados de agitación o vibración. La mezcla de las mezclas de reacción así como de la solución de abastecimiento puede efectuarse simultáneamente a los movimientos de sacudida o agitación a una frecuencia adecuada así como durante un periodo de tiempo largo a una temperatura constante.
Generalmente es suficiente incubar la(s) mezcla(s) de reacción durante un periodo de tiempo de unas 20 horas para mantener las proteínas o péptidos deseados en una producción suficiente. Dependiendo de la proteína sintetizada o de la optimización de cada uno de los parámetros del proceso o bien de la composición exacta de la solución de abastecimiento pueden obtenerse incluso al cabo de unas 6 horas aproximadamente 25 hasta 50 \mug de proteína /250 \mul de solución de reacción en una cavidad(pozo), lo que equivale a una concentración de 100 hasta 200 \mug /ml. Mediante unos tiempos de incubación prolongados se pueden conseguir mejores rendimientos, es decir, para concentraciones GPF se obtienen hasta 500 \mug/ml.
Otra forma de ejecución preferida de la invención es cuando dependiendo del número o del volumen total de cavidades de la carcasa interior se estima el volumen de la solución de abastecimiento. Como norma sirve el que el volumen de la solución de abastecimiento sea igual a la suma del número de cavidades y al volumen por cavidad multiplicado por el factor 10.
La composición de la solución de abastecimiento corresponde básicamente a las soluciones correspondientes para la biosíntesis in vitro libre de células de la tecnología actual. Para el experto es habitual el que las soluciones de abastecimiento para la síntesis proteínica libre de células se basen en unas medidas de optimización determinadas, en particular en el tipo y la disposición de la fracción de ribosomas empleada, es decir si por ejemplo se emplea un sistema eucarióntico o procarióntico como base para la biosíntesis in vitro libre de células. Además se ha comprobado que resulta preferible que la solución de abastecimiento contenga un medio reductor así como - en el caso de un lisado de base E.coli - un inhibidor de la polimerasa y si se diera el caso una o varias sustancias bactericidas adecuadas.
Otro objetivo de la invención es un procedimiento para realizar una y especialmente varias reacciones bioquímicas en paralelo por medio del dispositivo conforme a la invención, mientras que en la reacción bioquímica el fluido de abastecimiento de la cámara no sea sometido a una presión externa, de manera que el intercambio molecular entre la cámara de abastecimiento y las soluciones de cada una de las cavidades de la carcasa interior se base esencialmente en la difusión.
El procedimiento conforme a la invención o bien el dispositivo adecuado para ello es especialmente apropiado para aplicaciones automatizadas con un rendimiento de síntesis elevado.
Ejemplo
El procedimiento conforme a la invención para la biosíntesis proteínica libre de células se aclara a continuación con un lisado de E.coli en dos proteínas modelo (CAT y GFP):
La biosíntesis proteínica libre de células se lleva a cabo en forma de una transcripción acoplada y una traslación, en la que el mRNA a transcribir se codifica en un plásmido, cuya secuencia genética contiene un promotor para una RNA-polimerasa viral (por ejemplo, SP6-, T3 ó T7-RNA-polimerasa).
La mRNA transcrita in vitro se traslada a la proteína correspondiente con ayuda del lisado de E.coli que se encuentra en un sistema acoplado.
A) Componentes de reacción Plásmidos
PM-GFP ó pIVEX-GFP contienen la secuencia para la proteína Verde Fluorescente de Aequorea victoria en forma de un mutante GFPciclo3 (27 kiloDalton)(Nature Biotechnology 1996, 14.p 315-319); la región codificada del Mutante GFPciclo3 se ha clonado en lugar de la secuencia GFP de tipo salvaje (Science, 1994, 263,802).
pHM-CAT contiene la secuencia para la proteína de cloroanfenicol-acetiltransferasa (22,5 kiloDalton).
Construcción: Un inserto (Ncol-BamH) de pCAT3 (Promega) se insertaba en pHM19 (FU Berlin, Institut f. Biochemie, Dr. Stiege).
Lisado de E.coli S30
El lisado se preparaba con una cepa A-19 de E.coli según un proceso modificado conforme a Zubay (Annu. Rev.Genet.7, 267,1973).
Tampón de lisado: Hepes-KOH 100 mM pH 7,6/30ºC, acetato de magnesio 14 mM, acetato potásico 60 mM, ditiotreitol 0,5 mM
Composición de la solución de reacción y de abastecimiento Lote de reacción transcripción /traslación
Acetato potásico 185 mM, acetato de magnesio 15 mM, 4% de glicerina, ATP 2,06 mM, CTP 1,02 mM, GTP 1,64 mM, UTP 1,02 mM, 257 \muM por aminoácido (en total 20), 10,8 \mug/ml de ácido fólico, EDTA 1,03 mM, Kepes-KOH 100 mM pH 7,6/30ºC, 1\mug/ml de rifampicina, 0,03% de azita sódico, fosfato de acetilo 40 mM, 480 \mug/ml de t RNA de E.coli MRE600, Ditiotreitol 2 mM, MESNA 10 mM (ácido mercaptoetanosulfónico), hidróxido de potasio 70 mM, 0,1 \mug/\mul de inhibidor de Rnasa, 15 \mug/\mul de plásmido, 220 \mul/ml de lisado de E.coli A19, 2 \mug/\mul de polimerasa T7 RNA.
Solución de abastecimiento
Acetato potásico 185 mM, acetato de magnesio 15 mM, 4% de glicerina, ATP 2,06 mM, CTP 1,02 mM, GTP 1,64 mM, UTP 1,02 mM, 257 \muM por aminoácido (en total 20), 10,8 \mug/ml de ácido fólico, EDTA 1,03 mM, Kepes-KOH 100 mM pH 7,6/30ºC, 1\mug/ml de rifampicina, 0,03% de azita sódico, fosfato de acetilo 40 mM, Ditiotreitol 2 mM, MESNA 10 mM (ácido mercaptoetanosulfónico), hidróxido de potasio 70 mM, tampón de lisado como se ha descrito antes con 220 \mum/ml.
B) Dispositivo
En el ejemplo aquí descrito se empleaba un dializador multi-canal en forma de una placa de microvaloración. Las bases de cada una de las cavidades de la placa de microvaloración (pocillos) se dotaban de una membrana de diálisis con un volumen cut-off de 10 kilo Dalton. El volumen máximo de reacción por pocillo era de 200 \mul. La carcasa para la solución de abastecimiento tenía una capacidad volumétrica de 200 ml.
C) Desplazamiento, recubrimiento
Dispositivo de agitación: Flow Laboratories, tipo: Titertek®, con la frecuencia de vibración nivel 4,5
Campana de incubación: Edmund Bühler, tipo: TH25, con la temperatura de 30ºC
D) Realización
Se pipeteaban unos lotes de reacción separados según la composición antes indicada:
1) Para la expresión del GFP con pM-GFP o bien con pIVEX-GFP
2) Para la expresión de CAT con pHM-CAT
Para cada lote se empleaba un volumen de 8,4 ml y de ellos 200 \mul se pipeteaban en un total de 40 pocillos (0,4 ml como sobredosis), es decir 40 pocillos por lote y proteína.
Para la cámara de abastecimiento se pipeteaban 200 ml de solución de abastecimiento según la composición anteriormente indicada. Es decir, se empleaba una solución de abastecimiento común para ambos lotes de reacción.
Tras impermeabilizar la placa de microvaloración con una lámina adhesiva se fijaba el dispositivo al aparato vibrador, que se encontraba bajo la campana de incubación.
Tras ajustar la frecuencia de agitación y la temperatura de incubación de 30ºC se efectuaba una incubación de 20 horas de los lotes de reacción.
E) Evaluación 1) Expresión del GFP
La medición de las muestras se realizaba con un fluorímetro espectral de Fa. Kontron, tipo: TEGIMENTA, SFM25.
La excitación se efectuaba a una longitud de onda de 395 nm.
La velocidad de emisión a 580 hasta 430 nm.
El máximo de la emisión se encuentra a 510 nm
Como estándar se empleaba el rGFP (GFP recombinante) de Roche Diagnostics, número de catálogo 1814524.
Las muestras se diluían con el tampón de lisado 1:200, el estándar se diluía a 1 \mug/ml y 2 \mug/ml.
Tabla 1
Se visualizan 10 valores de los 40 obtenidos (que todos están en la misma zona) como la selección representativa.
Figura 1
Evaluación gráfica de los valores que se encuentran en la tabla 1 en \mug de GFP/ml de solución de reacción en los pocillos seleccionados.
TABLA 1
Nº pocillo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
\mug GFP/ml vol.reac. 366 365 362 356 369 371 365 367 361 365
2) Expresión de CAT
La medición de las muestras se realizaba por medio del análisis de HPLC con el aparato tipo: LKB 2150.
Como estándar se empleaba un enzima CAT de RocheDiagnostics, número de catálogo 1485156.
Tabla 2
10 valores de los 40 obtenidos (que todos están en la misma zona) se visualizan como selección representativa.
Figura 2
La evaluación gráfica de los valores contenidos en la tabla 2 en \mug de CAT/ml de solución de reacción en los pocillos seleccionados.
TABLA 2
Nº pocillo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
\mug GFP/ml vol.reac. 233 230 233 235 228 231 227 228 229 232

Claims (12)

1. Dispositivo para llevar a cabo las biosíntesis de polipéptidos libres de células, basado en una carcasa externa, que encierra una carcasa interior con unas cavidades incorporadas y una cámara de abastecimiento, donde las cavidades de la carcasa interior durante la reacción bioquímica contienen respectivamente un sistema productor, la cámara de abastecimiento contiene un líquido de abastecimiento durante la reacción bioquímica y las cavidades de la carcasa interior y la cámara de abastecimiento están separadas por una membrana semipermeable, que se caracteriza porque la carcasa interior presenta al menos dos cavidades, cuyos extremos inferiores están cerrados por una membrana semipermeable y cuyos extremos superiores sobresalen del líquido de abastecimiento contenido en la cámara de abastecimiento, y está unida a los medios para el desplazamiento y atemperado de los sistemas productores así como al líquido de abastecimiento, donde los medios para el desplazamiento están configurados de tal forma que la mezcla del sistema productor y de la solución de abastecimiento se realiza de forma simultánea.
2. Dispositivo conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque la carcasa interior presenta entre dos y 1000 cavidades.
3. Dispositivo conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque las cavidades de las paredes laterales se recubren de uno de los componentes enlazados específicamente a las proteínas sintetizadas in vitro.
4. Dispositivo conforme a la reivindicación 3, que se caracteriza porque las cavidades se recubren de aquellos componentes que son apropiados para la limpieza de las proteínas que contienen tag.
5. Dispositivo conforme a la reivindicación 3 ó 4, que se caracteriza porque las cavidades se recubren de estreptactina, avidina o estreptavidina.
6. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1-5, que se caracteriza porque las cavidades de la carcasa interior presentan respectivamente un volumen entre 50 \mul y 10 ml.
7. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1-6, que se caracteriza porque el volumen de la solución de abastecimiento equivale a cinco hasta veinte veces la suma de los volúmenes de las cavidades.
8. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1-7, que se caracteriza porque la membrana semipermeable consiste en una membrana de diálisis o de ultrafiltración con un tamaño de poro de 3 hasta 100 kDa.
9. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1-8, que se caracteriza porque para impermeabilizar las aberturas de las cavidades de la carcasa interior, cada cavidad se recubre de una tapa de cierre o lámina o bien existe una tapa de cierre para impermeabilizar la carcasa exterior.
10. Dispositivo conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque la mezcla se lleva a cabo mediante un elemento de agitación o de vibración.
11. Procedimiento para realizar una o varias biosíntesis de polipéptidos libres de células por medio de un dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 1-10, que se caracteriza porque durante la biosíntesis de polipéptidos libre de células el líquido de abastecimiento de la cámara de abastecimiento no es sometido a una presión externa, de tal forma que el intercambio molecular entre la cámara de abastecimiento y cada una de las cavidades de la carcasa interior se basa esencialmente en la difusión.
12. Procedimiento conforme a la reivindicación 11 en relación con la reivindicación 10, que se caracteriza porque el líquido de abastecimiento y si se diera el caso el sistema producido en cada cavidad existente de la carcasa interior es desplazado durante la biosíntesis de polipéptidos libre de células por medio de un elemento de agitación magnética.
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