ES2260016T3 - Estuche para llevar a cabo reacciones bioquimicas con un elevado rendimiento. - Google Patents
Estuche para llevar a cabo reacciones bioquimicas con un elevado rendimiento.Info
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Abstract
Estuche para la realización de las síntesis proteínicas in vitro que consta de los siguientes componentes 1) una solución de abastecimiento, que contiene una sustancia tampón a pH 7 y 8, iones de potasio 150 hasta 400 mM, iones de magnesio 10 hasta 50 mM, nucleótidos trifosfato, aminoácidos y una sustancia reductora de los grupos sulfuro, 2) un compuesto rico en energía 3) una fracción de ARNt 4) una polimerasa de ARN y 5) un lisado libre de células, que se caracteriza por que los componentes que se diferencian de los componentes de la solución de abastecimiento se presentan en recipientes separados.
Description
Estuche para llevar a cabo reacciones
bioquímicas con un elevado rendimiento.
La presente invención se refiere a un método
para llevar a cabo reacciones bioquímicas, en particular para la
biosíntesis de polipéptidos o bien para la transcripción in
vitro y la traslación de proteínas en un sistema sin células
con ayuda de un dispositivo de diálisis de canal múltiple, donde es
posible la síntesis de distintas proteínas una tras otra con un
rendimiento suficiente y en unas condiciones sencillas y
reproducibles.
El principio de la biosíntesis de proteínas
in vitro sin células mediante el empleo de membranas de
diálisis se conoce desde hace muchos años y consiste básicamente en
que dos cámaras separadas (una para la mezcla de reacción, una para
la solución de abastecimiento) están unidas a través de una membrana
con un tamaño de poros adecuado. En la cámara de reacción tiene
lugar la síntesis de proteínas. En la cámara de abastecimiento se
encuentra una solución con el conjunto de componentes de reacción
necesarios para la transcripción o traslación, los cuales se
consumen en la mezcla de reacción durante la biosíntesis proteínica.
Condicionado por el hecho de que ambas cámaras están unidas por una
membrana semipermeable, pueden los componentes de reacción gastados
o consumidos en la cámara de reacción, si fuera preciso por medio
del correspondiente dispositivo de bombeo, ser sustituidos por
componentes nuevos de la cámara de abastecimiento, por lo que la
síntesis se mantiene durante un periodo de tiempo claramente
superior en comparación al sistema estático, es decir, a una
reacción que tiene lugar en un recipiente de reacción no dividido.
Los métodos correspondientes para la biosíntesis in vitro
libre de células según el principio del "flujo continuo" o del
"intercambio continuo" se han descrito, por ejemplo, en US
5.478.730, EP 0 593 757 y por Spirin y cols. en Science vol. 242,
1988, pág. 1162-1164.
El sistema de síntesis empleado según la patente
US 5.478.730 contiene, por ejemplo, una fuente de ADN y de mARN,
que codifica el polipéptido. Además en el sistema de síntesis libre
de células se encuentran básicamente los ribosomas, tARN, los
aminoácidos, ATP, GTP, UTP y CTP. La transcripción del ADN o bien la
traslación del mARN con ayuda del tARN conduce a la producción del
polipéptido correspondiente, por lo que se forman al mismo tiempo
productos secundarios y sustancias de deshecho con un peso molecular
bajo. Estas pueden, a través de una membrana semipermeable, que
separa la zona en la que se encuentra el sistema de síntesis de una
zona de abastecimiento, pasar a la zona de abastecimiento. La zona
de abastecimiento contiene un líquido que actúa como medio de
abastecimiento, en el cual se encuentran en particular ATP, GTP y
aminoácidos. Estos componentes son conducidos al sistema de
síntesis a través de la membrana semipermeable para poder compensar
el consumo durante la reacción de biosíntesis. El paso a través de
la membrana semipermeable es posible porque su peso molecular se
encuentra por debajo de su límite de permeabilidad. Al mismo tiempo
los productos de la reacción bioquímica y otras sustancias, cuyo
peso molecular se encuentra por debajo del límite de permeabilidad
de la barrera, pasan de la zona de reacción a la zona de
abastecimiento. La membrana semipermeable es según la patente US
5.478.730, por ejemplo, una membrana de ultrafiltración en forma de
fibras huecas de membrana.
La patente americana 5.478.730 contiene otras
explicaciones detalladas sobre las composiciones adecuadas del
sistema de síntesis y del líquido de abastecimiento. En este
sentido, la presente invención se refiere al estado de la técnica
ya conocido, como el que se deduce de esta patente americana y de
las citas bibliográficas mencionadas. Su contenido hace referencia
al contenido de la presente comunicación.
La patente europea 0 593 757 describe la
utilización de la transcripción acoplada y la traslación para el
método de biosíntesis in vitro correspondiente, donde
básicamente se añadía a la mezcla de reacción una
ARN-Polimerasa.
Además se conocen diversos dispositivos o
membranas de diálisis. Se establecen diferencias básicamente entre
equipos "multicanal" y de "tubo único". Los materiales de
diálisis descritos o bien disponibles en el comercio y adecuados
para la biosíntesis in vitro de proteínas se basan
exclusivamente en el principio del "tubo único" (por ejemplo,
EP 99 91 01 418.4; Promega Notes 1997). Un rendimiento mayor o bien
la síntesis de distintas proteínas una tras otra no es posible
mediante este medio de diálisis sin unas medidas costosas de
purificación o bien sin otras medidas como, por ejemplo, las
proteínas originadas como "cuerpos de inclusión" por la
desnaturalización. Además los dispositivos para la diálisis se
encuentran relacionados con el principio del "tubo único" con
el inconveniente de que su manipulación es costosa desde el punto de
vista técnico y de tiempo.
En el comercio se ofrecen además placas de
microvaloración con cavidades, que están provistas de una membrana
porosa en un extremo inferior. Los mencionados equipos
"multicanal" son adecuados exclusivamente para aplicaciones de
cultivo celular o bien para procesos de filtración o en los que
intervienen las soluciones tampón (por ejemplo, membranas de
ultrafiltración de Milipore;
Slide-A-Lyzer®MINI Diálisis Unit de
Pierce). Un intercambio entre líquidos de diferentes
concentraciones, como los que se emplean en la transcripción in
vitro o la traslación in vitro no es posible con estos
dispositivos "multi-canal", por lo que estos
aparatos no son adecuados para las aplicaciones de síntesis
proteínica in vitro, por ejemplo con una adición o extracción
continua de componentes.
Además se conocen combinaciones de reactivos o
de soluciones que son adecuadas para la realización de síntesis de
proteínas in vitro. Según la US 5.593.856, los componentes
correspondientes se encuentran en dos soluciones madre antes de
iniciarse la reacción, un medio de reacción y un extracto libre de
células. Los trifosfatos de nucleótido y el compuesto rico en
energía (por ejemplo, fosfato de acetilo) se encuentran en una misma
solución. Además se describen soluciones de reacción y de
abastecimiento, en las cuales se presentan todos los componentes
necesarios para la síntesis proteínica in vitro,
preferiblemente en un recipiente de reacción (WO 99/50436). A
partir de la tecnología existente hoy en día no se puede deducir
ningún datos sobre que combinaciones de reactivos o de soluciones
son adecuadas para el almacenamiento.
La invención tiene por tanto el cometido de
conseguir combinaciones de soluciones o reactivos que sean adecuadas
para la realización de la síntesis proteínica in vitro y al
mismo tiempo para el almacenamiento.
El cometido se resuelve mediante un estuche de
reacción para realizar la síntesis proteínica in vitro o bien
para la transcripción y translación in vitro acopladas de
proteínas en un sistema libre de células con el dispositivo
correspondiente. El estuche consta básicamente de una solución de
abastecimiento y de una solución para los lotes de reacción. Las
soluciones pueden presentarse en forma líquida así como en un estado
liofilizado de manera que los componentes diferentes de los
componentes de la solución de abastecimiento se presentan en
recipientes separados. La solución de abastecimiento contiene
esencialmente una sustancia tampón entre pH 7 y pH 8,
aproximadamente 150 hasta 400 mM en iones de potasio,
aproximadamente 10 hasta 50 mM en iones de magnesio, nucleótidos
como los trifosfatos (ATP, CP, GTP y UTP), aproximadamente 20
aminoácidos distintos y una sustancia reductora de los grupos
sulfuro. Además se pueden añadir a la solución de abastecimiento
otras sustancias auxiliares como estabilizadores o inhibidores para
evitar reacciones no deseadas. La solución para los lotes de
reacción equivale a la solución de la solución de abastecimiento
anteriormente mencionada e incluye además un lisado libre de
células, es decir, una fracción de ribosomas eucariótica o
procariótica, tARN y una ARN-polimerasa, cuyo
origen es distinto del de la fracción de ribosomas. Según la
invención se prefiere especialmente que los componentes de la
solución para los lotes de reacción distintos de los componentes de
la solución de abastecimiento se mezclan justo antes de llevar a
cabo la reacción, es decir se presenten en recipientes distintos.
Lo mismo sirve tanto para los compuestos ricos en energía que se van
a añadir a la solución de abastecimiento como también a la solución
de reacción, como por ejemplo, el fosfato de acetilo. Mejora de
esta forma la capacidad de almacenamiento y la capacidad de
adaptación del estuche de
reacción.
reacción.
Otro objetivo de la invención es un dispositivo
para llevar a cabo las reacciones bioquímicas, en particular para
la biosíntesis de polipéptidos libre de células y /o para la
fabricación de proteínas activas desde el punto de vista biológico
y de estructura natural, que conste de una carcasa exterior, que
encierre una carcasa interior con unas cavidades incorporadas y una
cámara de abastecimiento, donde las cavidades de la carcasa
interior durante la reacción bioquímica contengan un sistema
productor, la cámara de abastecimiento contenga un líquido de
abastecimiento y las cavidades de la carcasa interior y la cámara de
abastecimiento estén separadas por una membrana semipermeable, que
se caracterice por que la carcasa interior presente al menos dos
cavidades, cuyos extremos inferiores estén cerrados con la membrana
semipermeable y cuyos extremos superiores sobresalgan del líquido
de abastecimiento contenido en la cámara de abastecimiento, y esté
unido a unos medios para el movimiento y el atemperado de los
sistemas productores así como del líquido de abastecimiento.
Como carcasas exteriores se consideran, por
ejemplo, los recipientes en forma de cilindro, que son capaces de
absorber el líquido y en los cuales se emplea una carcasa interior,
pequeña, de forma geométrica que se puede fijar. La carcasa
interior puede tener cualquier dimensión externa según el tamaño y
la forma que corresponda a la carcasa exterior. Por ejemplo, son
adecuadas las configuraciones redondas, rectangulares o cuadradas
para las carcasas exteriores con volúmenes de aproximadamente 10 ml
hasta varios litros. Es preferible que la carcasa interior se
adapte a la geometría de la carcasa exterior. Además en el caso de
la carcasa interior puede tratarse de un formato MTP de placas de
microvaloración. De este modo es posible una automatización o
aceleración simple de cada una de las etapas de trabajo.
La carcasa interior presenta una o varias
cavidades, siendo preferible una cifra de dos o más, por ejemplo,
seis, ocho, doce, 24, 48, 64, 96, 384 etc. Sin embargo, se emplean
básicamente carcasas interiores, por ejemplo, en forma de bloques o
de placas de microvaloración, que presentan varios cientos hasta
1000 o varias cavidades para el dispositivo conforme a la
invención. Las cavidades son en general de un material inerte, como
por ejemplo polietileno o polipropileno, y pueden disponer de
volúmenes de aproximadamente 50 \mul hasta varios mililitros, es
decir, del orden de 10 ml. Se prefieren las cavidades de tipo
cónico, que están cerradas por su extremo inferior con una membrana
semipermeable, como por ejemplo una membrana de diálisis con un
tamaño de poros de 3 hasta 100 kilo dalton. En principio se pueden
emplear todas las membranas de ultrafiltración o de diálisis
corrientes con un tamaño de poro determinado. Son especialmente
adecuadas las membranas de diálisis con un tamaño de poros de unos
10 hasta 14 kilo dalton. Con este tipo de membranas se pueden
separar las sustancias inhibidoras, de bajo peso molecular,
especialmente nocivas, que se forman en la biosíntesis in
vitro. Para la impermeabilización de las aberturas superiores
de las cavidades, es decir, de la parte de las cavidades de la
carcasa interior que sobresale del líquido de abastecimiento
contenido en la cámara de abastecimiento, puede disponerse cada
cavidad o bien todas las cavidades juntas de una tapa o lámina de
cierre. Alternativamente la tapa o cubierta de cierre puede servir
también para impermeabilizar la carcasa
exterior.
exterior.
Otra forma de ejecución preferida de la carcasa
interior del dispositivo conforme a la invención consta de una capa
de bloques con una multitud de orificios o agujeros. Sobre un primer
bloque se encuentra otro bloque plano con la misma geometría de
orificios. Entre ambos bloques se introduce una membrana
semipermeable o bien un filtro. El segundo bloque más plano es
adecuado para recoger los productos secundarios o materiales de
deshecho, que no llegan o bien solamente en una cantidad muy baja a
la zona de abastecimiento. Como resultado de todo ello se obtiene
una carcasa interior con cavidades, que se subdividen por medio de
una membrana en una zona de reacción y en una segunda zona de
abastecimiento o cámara de diálisis. Mediante el cierre por ambos
lados de la carcasa interior a través de las membranas de diálisis
se duplica por un lado la superficie disponible para el intercambio
y por otro lado apenas se producen cambios de volumen en las
muestras. Resulta especialmente preferida esta forma de
funcionamiento, en la que el líquido de mantenimiento que se
conserva en la síntesis proteínica in vitro retrasa la
acumulación de componentes no válidos por lo que la efectividad de
la síntesis proteínica aumenta.
Además se ha comprobado que es preferible que
las paredes de cada una de las cavidades o pocillos("wells")
de la carcasa interior estén revestidas de componentes enlazados de
forma específica a las proteínas o péptidos sintetizados in
vitro. Los componentes correspondientes son en particular los
adecuados para la limpieza de las proteínas que contienen
"tag". La proteína sintetizada in vitro en los pocillos
(que contiene tag es decir una marca)puede de este modo
enlazarse a la placa de microvaloración revestida y seguidamente
puede ser purificada, si fuera preciso tras el lavado con el tampón
adecuado o bien ser eluida en forma más ácida mediante los reactivos
adecuados. Como marca proteínica mencionada se especifica por
ejemplo la Strep-Tag II (secuencia 8AS, ver DE 42
37 113), que se enlaza a un C ó N terminal de la proteína
sintetizada in vitro. Como sustancias de revestimiento
pueden emplearse, por ejemplo, la estreptactina, estreptavidina o
avidina. Los métodos para el revestimiento de las superficies
correspondientes son conocidos en principio por el técnico. De un
modo alternativo, también es posible separar las proteínas
sintetizadas que llevan una marca o distintivo por medio de
partículas magnéticas o de vidrio de la mezcla de reacción de cada
una de las cavidades.
Además el dispositivo conforme a la invención
está equipado con un dispositivo de agitación para garantizar un
movimiento o una difusión suficientes de la solución o soluciones de
reacción y de la solución de abastecimiento. Se ha demostrado que
lo más preferible es que en cada una de las cavidades en las que
transcurre una reacción se introduzca un elemento agitador en forma
de un agitador magnético. De este modo se garantiza una mezcla
simultánea del sistema producido o bien de las mezclas en cada una
de las cavidades y de la solución de abastecimiento. Para el
mantenimiento de una temperatura constante durante la reacción
bioquímica, que en general oscila entre 20 y 37ºC, se coloca todo
el dispositivo en un incubador que se puede cerrar o bien se
mantiene bajo una campana de incubación atemperable. Además se
emplean un aparato de agitación junto con un aparato de
termostatizado. La mezcla de las mezclas de reacción, así como
también de la solución de abastecimiento puede realizarse por tanto
simultáneamente a los movimientos de agitación a una frecuencia
adecuada así como durante un periodo de tiempo largo a una
temperatura constante.
En general es suficiente con incubar
la(s) mezcla(s) de reacción durante un periodo de unas
24 horas y obtener la proteína o los péptidos deseados en cantidad
suficiente. Dependiendo de la proteína a sintetizar o de la
optimización de cada uno de los parámetros del proceso o bien de la
composición exacta de la solución de abastecimiento se pueden
conseguir después de aproximadamente unas 6 horas cerca de 25 hasta
50 \mug de proteínas /250 \mul de solución de reacción en una
cavidad (pocillo), lo que equivale a una concentración de 100 hasta
200 \mug/ml. Mediante unos tiempos de incubación prolongados se
pueden conseguir además mejores rendimientos, por ejemplo, para GFP
(Green Fluorescent Protein) se han obtenido concentraciones de hasta
500 \mug/ml.
Otra forma de trabajo preferida de la invención
consiste en que se determina el volumen de la solución de
abastecimiento según el número o el volumen total de cavidades de la
carcasa interior. Como directriz sirve el que el volumen de la
solución de abastecimiento es igual a la suma del número de
cavidades y equivale al volumen por cavidad multiplicado por el
factor 10.
La composición de la solución de abastecimiento
equivale básicamente a las soluciones correspondientes para la
biosíntesis in vitro libre de células de la tecnología
actual. El técnico sabe además que las soluciones de abastecimiento
para la síntesis proteínica libre de células se basan en
determinadas medidas de optimización habituales, en particular
dependen del tipo y de las características de la fracción de
ribosomas empleada, es decir si, por ejemplo, se emplea un sistema
eucariótico o bien un sistema procariótico como fundamento de la
biosíntesis in vitro libre de células. Se ha demostrado que
lo preferible es que la solución de abastecimiento contenga un
medio reductor de los grupos sulfuro así como, en el caso de un
lisado de base E. coli, un inhibidor para las polimerasas de
E. coli, y si fuera preciso una o varias sustancias
bactericidas adecuadas.
Una solución de abastecimiento especialmente
preferida para una reacción de
transcripción-traslación acoplada engloba en un
sistema tampón adecuado como, por ejemplo, Hepes, aproximadamente
150 hasta 400 mM de iones de potasio, aproximadamente 10 hasta 50
mM de iones de magnesio, cantidades suficientes de los cuatro
nucleótidos (ATTP, CTP, GTP y UTP) así como un conjunto de
aminoácidos de origen natural, aproximadamente 20 hasta 80 mM de
acetilfosfato, dititreitol como reactivo reductor de los grupos
sulfuro así como si fuera preciso EDTA, glicerina, una o varias
sustancias bactericidas como, por ejemplo, rifampicina o azita
sódica y preferiblemente en el caso de una fracción de ribosomas a
base de E. coli, un inhibidor de polimerasas de ARN como, por
ejemplo, la rifampicina para desactivar las polimerasas de E.
coli. Un lote de reacción típico para una reacción de
transcripción-traslación contiene los
correspondientes componentes en cantidades comparables como la
solución de abastecimiento. Además un lote de reacción según la
invención contiene la fracción de ribosomas eucariótica o
procariótica correspondiente como, por ejemplo, un lisado de E.
coli, el ADN codificado para la proteína deseada en forma de un
plásmido, aproximadamente 1 hasta 10 U/\mul de una
polimerasa-ARN, aproximadamente 200 hasta 800
\mug/ml de un ARNt así como otras sustancias auxiliares como los
inhibidores de la ribonucleasa
\newpage
Otro objetivo de la invención es un método para
realizar una y en particular varias reacciones bioquímicas que
transcurran en paralelo por medio del dispositivo conforme a la
invención, de forma que durante la reacción bioquímica el líquido
de abastecimiento no esté sometido a una presión externa en la
cámara de abastecimiento, de manera que el intercambio molecular
entre la cámara de abastecimiento y las soluciones de cada una de
las cavidades de la carcasa interior se base esencialmente en la
difusión.
El método conforme a la invención o bien el
dispositivo apropiado para ello se adapta especialmente a las
aplicaciones automatizadas con un rendimiento de síntesis
elevado.
Mediante los ejemplos siguientes se explica
detalladamente la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El método conforme a la invención para la
biosíntesis proteínica libre de células se explica a continuación
con detalle con un lisado de E. coli en dos proteínas modelo
(CAT y GFP):
La biosíntesis proteínica libre de células se
lleva a cabo en forma de una transcripción y traslación acoplada,
en la que se codifica el ARNm de un plásmido que se va a
transcribir, cuya secuencia genética contiene un promotor para una
polimerasa de ARN (por ejemplo, SP6-, T3- o bien
T7-ARN-polimerasa).
El ARNm transcrito in vitro es trasladado
con ayuda del lisado de E. coli que se encuentra en un
sistema acoplado a la proteína correspondiente.
Plásmidos: pM-GFP o
pIVEX-GFP contienen la secuencia para la proteína
Verde Fluorescente de Aequorea victoria en forma de un mutante
GFPryde3(27 kilodalton)(Nature Biotechnology, 1996,
14.p.315-319); la región codificada del mutante
GFPcycle3 se clonaba en pTU58 en lugar de la secuencia GFP de
referencia (Science, 1994, 263,
802).
802).
pHM-CAT contiene la secuencia
para la proteína cloroanfenicol-acetiltransferasa
(22,5 kilodalton).
Construcción: Un separador
(Ncol-BamH) de pCAT3 (Promega) se insertaba en pHM19
(FU Berlin, Instituto de Bioquímica Dr. Stiege)
Lisado de E.coli S30: El lisado se
preparaba con una cepa A-19 de E. coli
conforme a un método modificado según Zubay (Annu.Rev.Genet.7, 267,
1973).
Solución tampón de lisado:
Hepes-KOH 100 mM pH 7,6/30ºC, acetato de magnesio 14
mM, acetato de potasio 60 mM, ditiotreito 0,5 mM
Acetato potásico 185 mM, acetato de magnesio 15
mM, 4% de glicerina, ATP 2,06 mM, CTP 1,02 mM, GTP 1,64 mM, UTP
1,02 mM, 257 \muM por aminoácido (en total 20), 10,8 \mug/ml de
ácido fólico, EDTA 1,03 mM, Hepes-KOH 100 mM pH
7,6/30ºC, 1 \mug/ml de rifampicina, 0,03% de azita sódica, fosfato
de acetilo 40 mM, 480 \mug/ml de ARNt de E. coli MRE600,
ditiotreitol 2 mM, MESNA 10 mM (ácido mercaptoetanosulfónico),
hidróxido potásico 70 mM, 0,1 u/ \mul de inhibidor de
ribonucleasa, 15 \mug/ml de plásmido, 220 \mul/ml de E.
coli lisado A19, 2 U/ \mul de ARN T7 polimerasa,
Acetato potásico 185 mM, acetato de magnesio 15
mM, 4% de glicerina, ATP 2,06 mM, CPT 1,0 mM, GTP 1,64 mM, UTP 1,02
mM, 257 \muM por aminoácido (en total 20), 10,8 \mug/ml de ácido
fólico, EDTA 1,03 mM, Hepes-KOH 100 mM pH 7,6/30ºC,
1 \mug/ml de rifampicina, 0,03% de azita sódica, acetilfosfato 40
mM, ditiotreitol 2 mM, MESNA 10 mM (ácido mercaptoetanosulfónico),
hidróxido potásico 70 mM, tampón de lisado como el descrito
con
220 \mul/ml.
220 \mul/ml.
En el ejemplo aquí descrito se empleaba un
dializador multi-canal en forma de una placa de
microvaloración. Las bases de cada una de las cavidades de la placa
de microvaloración (pocillos) se dotaban de una membrana de
diálisis con un volumen de 10 kilo-dalton. El
volumen de reacción máximo por pocillo era de 200 \mul. La
carcasa para la solución de abastecimiento tenía una capacidad de
200 ml.
Agitador: Flow Laboratories, tipo:
Titertek® con la frecuencia de agitación nivel 4,5
Campana de incubación: Edmund Bühler,
tipo: TH25, con la temperatura de 30ºC.
Se pipeteaban los lotes de reacción por separado
según la composición anteriormente indicada:
- 1)
- Para la expresión de GFP con pM-GFP o con pIVEX-GFP
- 2)
- Para la expresión de CAT con pHM-CAT
Para cada lote se empleaba un volumen de 8,4 ml
y de este volumen se pipeteaban 200 \mul en un total de 40
pocillos (0,4 ml como sobredosis), es decir 40 pocillos por lote y
proteína.
Para la cámara de abastecimiento se pipeteaban
200 ml de solución de abastecimiento según la composición
anteriormente indicada. Es decir se empleaba una solución de
abastecimiento total para ambos lotes de reacción.
Tras recubrir la placa de microvaloración con
una lámina adhesiva se fijaba el dispositivo al agitador, lo que se
producía bajo la campana de incubación.
Tras ajustar la frecuencia de agitación y la
temperatura de incubación de 30ºC se realizaba una incubación de 20
horas de los lotes de reacción.
La medición de las muestras se llevaba a cabo
con un fluorímetro espectral de Fa. Kontron, tipo: TEGIMENTA,
SFM25. La excitación se efectuaba a una longitud de onda de 395
nm.
La velocidad de emisión a 580 hasta 430 nm
El máximo de emisión se situaba a 510 nm
Como estándar se empleaba el GFPr (GFP
recombinante) de Roche Diagnostics, nº catálogo 1814524.
Las muestras se diluían con la solución tampón
de lisado 1:200, el estándar a 1 \mug/ml y 2 \mug/ml.
Tabla
1
Se visualizan 10 valores de los 40 obtenidos
(todos en el mismo sector) como selección representativa.
Figura
1
Evaluación gráfica de los valores obtenidos en
la tabla 1 en \mug de GFP/ ml de solución de reacción en los
pocillos seleccionados como ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Número de pocillos | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| \mug GFP /ml vol. reactivo | 366 | 365 | 362 | 356 | 369 | 371 | 365 | 367 | 361 | 365 |
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de las muestras se realizaba sobre
el análisis HPLC con el aparato tipo: LKB 2150.
Como estándar se empleaba un enzima CAT de Roche
Diagnostics, número de catálogo 1485156.
\newpage
Tabla
2
Se visualizan 10 valores de los 40 obtenidos
(todos se encuentran en el mismo sector) como selección
representativa.
Figura
2
Evaluación gráfica de los valores contenidos en
la tabla 2 en \mug CAT/ml de solución de reacción en los pocillos
seleccionados como ejemplo.
| Número de pocillos | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| \mug CAT /ml solución de reacción | 233 | 230 | 233 | 235 | 228 | 231 | 227 | 228 | 229 | 232 |
Claims (2)
1. Estuche para la realización de las síntesis
proteínicas in vitro que consta de los siguientes
componentes
- 1)
- una solución de abastecimiento, que contiene una sustancia tampón a pH 7 y 8, iones de potasio 150 hasta 400 mM, iones de magnesio 10 hasta 50 mM, nucleótidos trifosfato, aminoácidos y una sustancia reductora de los grupos sulfuro,
- 2)
- un compuesto rico en energía
- 3)
- una fracción de ARNt
- 4)
- una polimerasa de ARN y
- 5)
- un lisado libre de células, que se caracteriza porque los componentes que se diferencian de los componentes de la solución de abastecimiento se presentan en recipientes separados.
2. Estuche conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza porque, el origen de la
ARN-polimerasa es distinto del de la fracción de
ribosomas del lisado libre de células.
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