JP3650752B2 - ハイスループットで生化学反応を実施するための方法および装置 - Google Patents
ハイスループットで生化学反応を実施するための方法および装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3650752B2 JP3650752B2 JP2001504498A JP2001504498A JP3650752B2 JP 3650752 B2 JP3650752 B2 JP 3650752B2 JP 2001504498 A JP2001504498 A JP 2001504498A JP 2001504498 A JP2001504498 A JP 2001504498A JP 3650752 B2 JP3650752 B2 JP 3650752B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- well
- inner housing
- wells
- supply chamber
- supply
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/24—Stationary reactors without moving elements inside
- B01J19/2475—Membrane reactors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/12—Well or multiwell plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/34—Internal compartments or partitions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00049—Controlling or regulating processes
- B01J2219/00051—Controlling the temperature
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
- B01J2219/00281—Individual reactor vessels
- B01J2219/00286—Reactor vessels with top and bottom openings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
- B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
- B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
- B01J2219/00315—Microtiter plates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
- B01J2219/00423—Means for dispensing and evacuation of reagents using filtration, e.g. through porous frits
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00479—Means for mixing reactants or products in the reaction vessels
- B01J2219/00481—Means for mixing reactants or products in the reaction vessels by the use of moving stirrers within the reaction vessels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00479—Means for mixing reactants or products in the reaction vessels
- B01J2219/00484—Means for mixing reactants or products in the reaction vessels by shaking, vibrating or oscillating of the reaction vessels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00495—Means for heating or cooling the reaction vessels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00585—Parallel processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
- C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Description
【０００１】
本発明は、簡単で再現性のある条件下で異なるタンパク質を十分な収量で同時合成することを可能にするマルチチャンネル透析装置を用いる、生化学反応を実施するための方法および装置、特に、ポリペプチド生合成のため、および無細胞系でタンパク質のin vitroの転写および翻訳を１セットで行うための方法および装置に関する。
【０００２】
透析膜を用いた無細胞系でのin vitroタンパク質生合成の原理がここ数年分かってきている。その原理は、本質的に、適当な細孔サイズを有する膜を介して接続された２つの別個のチャンバー(一つは反応混合物用で、もう一つは供給溶液用)を用いるものである。タンパク質合成は反応チャンバーで生じる。供給チャンバーには、タンパク質生合成プロセスにおいて反応混合物中で消費される転写または翻訳に必要な全ての反応成分を含む溶液が含まれている。両チャンバーは半透膜により接続されていることから、反応チャンバー中で消費された反応成分は、供給チャンバーから供給される新たな成分で、必要があれば適当なポンピング装置を用いることによって連続的に補うことができる。したがって、合成は、静的系、すなわち分割されていない反応容器で起きる同じ反応と比べてかなり長い期間にわたって維持され得る。連続フローまたは連続交換の原理に基づく無細胞系in vitro生合成のための対応する方法は、例えば、米国特許第5,478,730号、ヨーロッパ特許0 593 757およびSpirinら, Science vol.242, 1988, p.1162-1164に記載されている。
【０００３】
例えば米国特許第5,478,730号公報で用いられている合成系は、ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAの供給源を含む。さらに、無細胞合成系は、本質的に、リボソーム、tRNA、アミノ酸、ATP、GTP、UTPおよびCTPを含む。DNAの転写およびtRNAの助けを借りたmRNAの翻訳により、各ポリペプチドが低分子量の副産物および廃棄物とともに生じる。これらは、合成系を含むスペースと供給スペースとを分離している半透膜を通って供給スペースに入り得る。供給スペースには、特にATP、GTPおよびアミノ酸を含む、供給媒体として作用する液体が含まれる。これらの成分は、生合成反応中に消費される材料を補給するために、半透膜を通って合成系に供給される。それらの分子量はカットオフ値よりも低いので、半透膜の通過が可能である。それと同時に、バリアのカットオフよりも低い分子量を有する、生化学反応による産物およびその他の物質が反応スペースから供給スペースに移行する。米国特許第5,478,730号公報によれば、半透膜は、例えば中空繊維膜の形態の限外濾過膜である。
【０００４】
米国特許第5,478,730号公報には、合成系および供給液体に適した組成物についての広範な追加情報が記載されている。この範囲まで、本発明は従来技術、特にこの米国特許公報および該公報で引用されている参考文献に言及する。その内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００５】
ヨーロッパ特許第0 593 757号には、対応するin vitro生合成法に対する転写および翻訳の組み合わせの適用が記載されており、この方法では本質的にRNAポリメラーゼが反応混合物にさらに加えられる。
【０００６】
さらに、種々の透析装置および膜が知られている。主な相違は、デザインがいわゆる１本のチューブであるということとマルチチャンネルであるということにある。in vitroタンパク質生合成に適した、以前に記載された市販の透析材料は、もっぱら１本のチューブの原理に基づくものである(例えば、EP 99 91 01 418.4; Promega Notes 1997)。これらの透析を用いた場合、ハイスループットは可能ではなく、特に、複雑な精製操作または封入体として合成されるタンパク質の変性などのその他の処置を行わずに異なるタンパク質を同時合成することはできない。１本のチューブに基づく透析装置のその他の欠点は、操作が技術的に難しく、時間がかかるということである。
【０００７】
さらに、下端に多孔質膜を有するウェルを含むマイクロタイタープレートが市販されている。いわゆるマルチチャンネルタイプは、細胞培養用途または濾過もしくは再緩衝プロセスにのみ適している(例えば、Milipore製の限外濾過膜；Pierce製のSlide-A-Lyzer(登録商標)MINI 透析ユニット)。しかし、これらのマルチチャンネル装置では、in vitro転写またはin vitro翻訳に用いられる、異なる濃度の液体の交換を行うことができない。それ故に、かかる装置は、例えば連続的な成分の供給および除去を利用したin vitroタンパク質合成用途に適していないのである。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、生化学反応を、高効率で、それと同時に簡単かつ再現性よく行うことを可能にする方法および装置を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、生化学反応を実施するための装置、特に無細胞系ポリペプチド生合成および／または天然構造を有する生物学的に活性なタンパク質の製造のための装置であって、
ウェルを有する内部ハウジングと、該内部ハウジングを取り囲む外部ハウジングと、供給チャンバーとを備えてなり、
内部ハウジングのウェルはそれぞれ生化学反応中製造系を含み、供給チャンバーは供給液体を含み、内部ハウジングのウェルと供給チャンバーとは半透膜で分離されており、
内部ハウジングが少なくとも２個のウェルを備え、該ウェルの下端は半透膜で密閉され、該ウェルの上端は供給チャンバーに含まれる供給液体から突き出ており、かつ内部ハウジングが、製造系および供給液体を振盪させてインキュベートするための手段に連結されていることを特徴とする、装置によって達成される。
【００１０】
本発明に適した外部ハウジングは、例えば、液体を保持することができるボール形または円筒形の容器であり、外形的により小さい内部ハウジングを内挿することができ、場合により固定することができる。内部ハウジングは、サイズおよび形状において外部ハウジングと釣り合うのであれば、いかなる外部寸法を有していてもよい。例えば、約10ml〜数リットルの容量の外部ハウジングには、円形、矩形または正方形のデザインが適している。内部ハウジングの形状は可能な限り外部ハウジングの形状と一致しているのが好都合である。さらに、内部ハウジングはマイクロタイタープレート(MTP)型であってもよい。このことにより、個々の操作ステップの簡単な自動化および促進が可能になる。
【００１１】
内部ハウジングは、１個または数個のウェルを有し、好ましくは２個以上、例えば６個、８個、12個、24個、48個、64個、96個、384個等のウェルを有する。しかしながら、原理上、数百〜数千個以上のウェルを有する、例えばブロックまたはマイクロタイタープレートの形態の内部ハウジングを本発明の装置に用いることも可能である。ウェルは、通常、ポリエチレンまたはポリプロピレンのような不活性材料から製造され、約50μlから最大数ミリリットル、すなわち10mlのオーダーの容量でデザインすることができる。下端が、半透膜、例えば３〜100キロダルトンの細孔サイズを有する透析膜で密閉されている円錐形のウェルが好都合である。本発明においては、原則的に、通常用いられている適当な細孔サイズの透析膜および限外濾過膜を用いることができる。約10〜14キロダルトンの細孔サイズを有する透析膜は、特に適していることが分かった。これにより、特にin vitro生合成中に生成する低分子量の干渉性阻害物質の分離が可能になる。ウェルの上方の開口部、すなわち供給チャンバーに含まれる供給液体から突き出ている内部ハウジングのウェルの一部分を密封するために、各ウェルは独立に、または全ウェルが一緒になって、キャップクロージャーまたは箔を備えていてもよい。あるいは、外部ハウジング全体を密封するために、クロージングカバーを取り付けてもよい。
【００１２】
本発明の装置における内部ハウジングのさらに好ましい実施形態は、複数のドリル穴を有するブロックの層から構成される。第１のブロック上に同じ穴形状を有する別の平らなブロックを配置する。その２つのブロックの間にフィルターまたは半透膜を配置する。第２の平らなブロックは、副産物または廃棄物の回収に適しており、よって副産物または廃棄物は供給チャンバーに達しないか、達したとしてもごくわずかである。このようにして、それぞれ膜により反応スペースと、いわゆる第２の供給もしくは透析チャンバーに分割されたウェルを有する内部ハウジングが得られる。内部ハウジングの両側を透析膜で密閉することで、交換に利用可能な領域が２倍になる一方、サンプルの容量はほとんど変更しなくてすむ。この実施形態の特定の利点は、供給液体中の不用成分の蓄積がほとんどないかかなり遅いことからin vitroでのタンパク質合成が持続するということであり、さらに、タンパク質合成の効率も増大する。
【００１３】
さらに、内部ハウジングの個々のウェルの壁を、in vitroで合成されたタンパク質およびペプチドと特異的に結合する成分でコーティングすることが好都合であることが分かった。適当な成分は、特に、タグ含有タンパク質の精製に適した成分である。よって、ウェル内のin vitroで合成されたタンパク質(タグ含有)を、そのコーティングされたマイクロタイタープレートにかかる様式で結合させることができ、続いて、場合により適当なバッファーで洗浄した後に直接精製するか、または適当な試薬により精製形態で溶出させることができる。いわゆるタンパク質タグとしては、例えば、in vitroで合成されたタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに結合し得るStrep-Tag II(8AA配列、ドイツ特許DE 42 37 113参照)が挙げられる。コーティング物質として、例えば、ストレプトアクチン、ストレプトアビジンまたはアビジンを用いることができる。適当な表面をコーティングする方法は当業者には公知である。あるいは、合成されたタグ含有タンパク質を、適切にコーティングされたガラスまたは磁気粒子を用いて個々のウェルの反応混合物から分離することも可能である。
【００１４】
本発明の装置は、反応溶液および供給溶液を十分に振盪させるか、または拡散させるために撹拌または振盪装置をさらに備えている。撹拌エレメントは、供給チャンバーおよび場合により反応が進行する各ウェル内にマグネティックスターラーの形態で配置するのが好都合であることが分かった。このことによって製造系、個々のウェル中の混合物、およびその周囲の供給溶液を同時に混合することができる。生化学反応中、一定温度、通常20℃〜37℃にするためには、装置全体を密閉可能なインキュベーター内に完全に入れるか、または温度制御インキュベーションフード下に保持するのが最も簡単である。さらに、振盪または撹拌装置と、サーモスタット装置を組み合わせて本発明で用いることができる。よって、反応混合物および供給溶液の混合を、適当な振動数の振盪または撹拌運動により同時に行うことができ、しかも一定温度で長期間にわたり行うことができる。
【００１５】
所望のタンパク質またはペプチドを十分な収量で得るためには、原則として、反応混合物を約20時間インキュベートすれば十分である。合成されるタンパク質、個々のプロセスのパラメーターの最適化および供給溶液の厳密な組成に依存するが、約6時間後にはウェル内の反応溶液250μl当たりタンパク質約25〜50μg(濃度100〜200μg/mlに対応)に達し得る。さらに、より長い時間インキュベートすると、それに応じて収量が多くなり、例えば、GFP(グリーン蛍光タンパク質)では最大500μg/mlの濃度が得られた。
【００１６】
本発明のさらに好ましい実施形態は、供給溶液の容量が内部ハウジングのウェルの数または合計容量により決定される場合である。本発明の目安として、供給溶液容量は、ウェル数の合計にウェル当たりの容量をかけたものの10倍量に等しい。
【００１７】
供給溶液の組成は、無細胞系in vitro生合成についての従来の対応する溶液の組成と本質的に一致する。さらに、当業者であれば、無細胞系タンパク質合成用の供給溶液が、リボソーム画分のタイプおよび品質、すなわち無細胞系in vitro生合成に真核系または原核系のどちらが基本として用いられるかどうかに特に依存する通常の最適化手段に付されることは分かるであろう。さらに、供給溶液が、スルフィド基を還元する試薬と、例えば、大腸菌(E.coli)系溶解物の場合、大腸菌ポリメラーゼの阻害剤と、場合により１種または数種の適当な殺菌剤とを含むのが好都合であることが分かった。
【００１８】
本発明において、転写／翻訳の共役反応に特に好適な供給溶液は、例えばHepesのような適当なバッファー系に、約150〜400mMのカリウムイオン、約10〜50mMのマグネシウムイオン、十分な量の4種のヌクレオチド三リン酸(ATP、CTP、GTPおよびUTP)および全ての天然アミノ酸、約20〜80mMのアセチルリン酸ならびにスルフィド基を還元する試薬としてのジチオトレイトールを含み、場合によりEDTA、グリセロール、1種または数種の殺菌剤（例えば、リファンピシンまたはアジ化ナトリウム、好ましくは、大腸菌由来のリボソーム画分の場合、大腸菌ポリメラーゼを失活させるリファンピシンなどのRNAポリメラーゼ阻害剤）を含む。転写／翻訳反応用の典型的な反応混合物は、適切な成分を供給溶液と同様の量含む。さらに、本発明における反応混合物は、例えば大腸菌溶解物などの各真核性または原核性リボソーム画分、所望のタンパク質をコードするプラスミド形態のDNA、約１〜10U/μlのRNAポリメラーゼおよび約200〜800μg/mlのtRNAを含み、場合によりさらに補助物質、例えばRNアーゼ阻害剤などを含む。
【００１９】
本発明のさらなる主題は、本発明の装置を用いて、１種の生化学反応、特に数種の生化学反応を同時に実施する方法である。ここで、供給チャンバー内の供給液体は、生化学反応中に外部印加圧にさらされず、したがって供給チャンバーと内部ハウジングの個々のウェルの溶液の間の分子交換は本質的に拡散に基づくものである。
【００２０】
本発明の方法およびその方法に適した装置は、特に、合成のスループットが高い自動化用途に適している。
【００２１】
本発明はさらに、対応する装置を用いて、無細胞系において、タンパク質のin vitroの転写および翻訳を1セットで実施するための反応キットまたはin vitroでタンパク質合成を実施するための反応キットに関する。このキットは、本質的に、供給溶液と、反応混合物用の溶液とを含んでなる。これらの溶液は、液体形態で存在してもよく、凍結乾燥状態で存在してもよい。供給溶液は、本質的に、pH７〜８に調節するバッファーとして作用する物質、約150〜400mMのカリウムイオン、約10〜50mMのマグネシウムイオン、ヌクレオチド三リン酸（ATP、CTP、GTPおよびUTP）、約20種の異なるアミノ酸ならびにスルフィド基を還元する物質を含む。さらに、安定剤または好ましくない反応を防止するためのインヒビターのような追加の補助物質を供給溶液に添加してもよい。反応混合物の溶液は、上記の供給溶液の溶液に一致し、さらに、無細胞系溶解物、すなわち原核性または真核性リボソーム画分、tRNAおよびRNAポリメラーゼ(その起源は、リボソーム画分のものとは異なるものである)を含む。本発明によれば、反応を実施する直前まで、供給溶液の成分とは異なった反応混合物溶液成分を混合しない、すなわち、それらはそれぞれ別個の容器に存在するのが好ましい。このことは、供給溶液ならびにアセチルリン酸などの反応溶液に加えられることになる高エネルギー化合物にも同様にあてはまる。これにより、反応キットの貯蔵寿命および適合性がさらに改善される。
【００２２】
本発明を下記の実施例によってさらに説明する。
【００２３】
実施例１
本発明による無細胞系タンパク質生合成法を、大腸菌溶解物および２つのモデルタンパク質（CATおよびGFP）を用いて、以下により詳細に説明する。
【００２４】
無細胞系タンパク質生合成は、転写と翻訳の共役形態で実施される。ここで、転写により得られるmRNAはプラスミド上にコードされるが、このプラスミドの遺伝子配列にはウイルスRNAポリメラーゼ（例えば、SP6、T3またはT7 RNAポリメラーゼ）のプロモーターが含まれている。
【００２５】
in vitroでの転写により得られたmRNAは、転写と翻訳の共役系に存在する大腸菌溶解物の助けを借りて対応するタンパク質に翻訳される。
【００２６】
A) 反応成分：
プラスミド：
pM-GFPまたはpIVEX-GFPは、突然変異GFPcycle3(27キロダルトン)(Nature Biotechnology, 1996, 14, p.315-319)の形態のオワンクラゲ(Aequorea victoria)由来のグリーン蛍光タンパク質の配列を含み、このGFPcycle3突然変異体のコード領域を、pTU58に野生型GFP配列の代わりにクローニングした(Science, 1994, 263, 802)。pHM-CATは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質(22.5キロダルトン)の配列を含む。
【００２７】
構築物：pCAT3(Promega)由来の挿入断片(NcoI-BamHI)をpHM19に挿入した(FU Berlin, "Instit. f. Biochemie", Dr.Stiege)。
【００２８】
大腸菌 S30 溶解物：
大腸菌A19株から、Zubay(Annu. Rev. Genet. 7, 267, 1973)の改良法により溶解物を調製した。
【００２９】
溶解物バッファー：100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、14mMの酢酸マグネシウム、60mMの酢酸カリウム、0.5mMのジチオトレイトール
反応および供給溶液の組成：
転写／翻訳反応混合物：
185Mの酢酸カリウム、15mMの酢酸マグネシウム、4％のグリセロール、2.06mMのATP、1.02mMのCTP、1.64mMのGTP、1.02mMのUTP、257μMの各アミノ酸(合計20種)、10.8μg/mlの葉酸、1.03mMのEDTA、100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、１μg/mlのリファンピシン、0.03％のアジ化ナトリウム、40mMのアセチルリン酸、大腸菌MRE600由来の480μg/mlのtRNA、2mMのジチオトレイトール、10mMのMESNA(メルカプトエタンスルホン酸)、70mMの水酸化カリウム、0.1U/μlのRNアーゼ阻害剤、15μg/mlのプラスミド、220μl/mlの大腸菌A19溶解物、２U/μlのT7 RNAポリメラーゼ。
【００３０】
供給溶液：
185mMの酢酸カリウム、15mMの酢酸マグネシウム、４％のグリセロール、2.06mMのATP、1.02mMのCTP、1.64mMのGTP、1.02mMのUTP、257μMの各アミノ酸(合計20種)、10.8μg/mlの葉酸、1.03mMのEDTA、100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、１μg/mlのリファンピシン、0.03％のアジ化ナトリウム、40mMのアセチルリン酸、2mMのジチオトレイトール、10mMのMESNA(メルカプトエタンスルホン酸)、70mMの水酸化カリウム、220μl/mlの上記溶解物バッファー。
【００３１】
B) 装置：
ここに記載した実施例では、マイクロタイタープレートの形態のマルチチャンネル透析器を用いた。マイクロタイタープレートの個々のウェルの底部には、それぞれ、10キロダルトンのカットオフ容量を有する透析膜が備えられている。ウェル当たりの最大反応容量は200μｌであった。供給溶液用のハウジングの容量は200mlであった。
【００３２】
C) 振盪、カバー：
振盪装置：Flow laboratories, タイプ：振盪数ステップ4.5のTitertek(登録商標)
インキュベーションフード：Edmund Buhler, タイプ：TH25, 温度30℃
D) 手順：
1) GFPを含むpM-GFPまたはpIVEX-GFPの発現のために、
2) CATを含むpHM-CATの発現のために、
上記組成の反応混合物をそれぞれ別々にピペッティングした。
【００３３】
各混合物は8.4mlの容量で調製し、その200μlを合計40ウェルにピペッティングした(超過量として0.4ml)。すなわち、１つの混合物およびタンパク質につき40ウェルにピペッティングした。
【００３４】
上記組成の供給溶液200mlを供給チャンバーにピペッティングした。すなわち、両方の反応混合物に共通の供給溶液を用いた。
【００３５】
マイクロタイタープレートを接着箔で密封した後、該装置をインキュベーションフード下に置いた振盪装置に取り付けた。
【００３６】
振盪数を調節し、インキュベーション温度を30℃に調節した後、反応混合物を20時間インキュベートした。
【００３７】
E) 評価
1) GFPの発現
サンプルをKontron Company製の分光蛍光計(タイプ：TEGIMENTA、SFM25)を用いて測定した。
【００３８】
395nmの波長で励起した。
【００３９】
放出速度580〜430nm。
【００４０】
放出最大は510nmである。
【００４１】
Roche Diagnostics製のrGFP(組換えGFP、カタログNo.1814524)を標準物質として用いた。
【００４２】
サンプルを溶解物バッファーで1:200に希釈し、標準物質を１μg/mlと２μg/mlに希釈した。
【００４３】
表１：
得られた40個の値のうちの10個の値（全て同一レンジである)を代表例として示す。
【００４４】
図１：
選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのGFPの量(μg)として表１に示した値をグラフにして表した図である。
【００４５】
【表１】
2) CAT の発現
サンプルを機器(タイプ：LKB2150)を用いてHPLC分析により測定した。
【００４６】
Roche Diagnostics製のCAT酵素、カタログNo.1485156を標準物質として用いた。
【００４７】
表２
得られた40個の値のうちの10個の値（全て同一レンジである)を代表例として示す。
【００４８】
図２：
選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのCATの量(μg)として表２に示した値をグラフにして表した図である。
【００４９】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのGFPの量(μg)として表１に示した値をグラフにして表した図である。
【図２】 選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのCATの量(μg)として表２に示した値をグラフにして表した図である。
本発明は、簡単で再現性のある条件下で異なるタンパク質を十分な収量で同時合成することを可能にするマルチチャンネル透析装置を用いる、生化学反応を実施するための方法および装置、特に、ポリペプチド生合成のため、および無細胞系でタンパク質のin vitroの転写および翻訳を１セットで行うための方法および装置に関する。
【０００２】
透析膜を用いた無細胞系でのin vitroタンパク質生合成の原理がここ数年分かってきている。その原理は、本質的に、適当な細孔サイズを有する膜を介して接続された２つの別個のチャンバー(一つは反応混合物用で、もう一つは供給溶液用)を用いるものである。タンパク質合成は反応チャンバーで生じる。供給チャンバーには、タンパク質生合成プロセスにおいて反応混合物中で消費される転写または翻訳に必要な全ての反応成分を含む溶液が含まれている。両チャンバーは半透膜により接続されていることから、反応チャンバー中で消費された反応成分は、供給チャンバーから供給される新たな成分で、必要があれば適当なポンピング装置を用いることによって連続的に補うことができる。したがって、合成は、静的系、すなわち分割されていない反応容器で起きる同じ反応と比べてかなり長い期間にわたって維持され得る。連続フローまたは連続交換の原理に基づく無細胞系in vitro生合成のための対応する方法は、例えば、米国特許第5,478,730号、ヨーロッパ特許0 593 757およびSpirinら, Science vol.242, 1988, p.1162-1164に記載されている。
【０００３】
例えば米国特許第5,478,730号公報で用いられている合成系は、ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAの供給源を含む。さらに、無細胞合成系は、本質的に、リボソーム、tRNA、アミノ酸、ATP、GTP、UTPおよびCTPを含む。DNAの転写およびtRNAの助けを借りたmRNAの翻訳により、各ポリペプチドが低分子量の副産物および廃棄物とともに生じる。これらは、合成系を含むスペースと供給スペースとを分離している半透膜を通って供給スペースに入り得る。供給スペースには、特にATP、GTPおよびアミノ酸を含む、供給媒体として作用する液体が含まれる。これらの成分は、生合成反応中に消費される材料を補給するために、半透膜を通って合成系に供給される。それらの分子量はカットオフ値よりも低いので、半透膜の通過が可能である。それと同時に、バリアのカットオフよりも低い分子量を有する、生化学反応による産物およびその他の物質が反応スペースから供給スペースに移行する。米国特許第5,478,730号公報によれば、半透膜は、例えば中空繊維膜の形態の限外濾過膜である。
【０００４】
米国特許第5,478,730号公報には、合成系および供給液体に適した組成物についての広範な追加情報が記載されている。この範囲まで、本発明は従来技術、特にこの米国特許公報および該公報で引用されている参考文献に言及する。その内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００５】
ヨーロッパ特許第0 593 757号には、対応するin vitro生合成法に対する転写および翻訳の組み合わせの適用が記載されており、この方法では本質的にRNAポリメラーゼが反応混合物にさらに加えられる。
【０００６】
さらに、種々の透析装置および膜が知られている。主な相違は、デザインがいわゆる１本のチューブであるということとマルチチャンネルであるということにある。in vitroタンパク質生合成に適した、以前に記載された市販の透析材料は、もっぱら１本のチューブの原理に基づくものである(例えば、EP 99 91 01 418.4; Promega Notes 1997)。これらの透析を用いた場合、ハイスループットは可能ではなく、特に、複雑な精製操作または封入体として合成されるタンパク質の変性などのその他の処置を行わずに異なるタンパク質を同時合成することはできない。１本のチューブに基づく透析装置のその他の欠点は、操作が技術的に難しく、時間がかかるということである。
【０００７】
さらに、下端に多孔質膜を有するウェルを含むマイクロタイタープレートが市販されている。いわゆるマルチチャンネルタイプは、細胞培養用途または濾過もしくは再緩衝プロセスにのみ適している(例えば、Milipore製の限外濾過膜；Pierce製のSlide-A-Lyzer(登録商標)MINI 透析ユニット)。しかし、これらのマルチチャンネル装置では、in vitro転写またはin vitro翻訳に用いられる、異なる濃度の液体の交換を行うことができない。それ故に、かかる装置は、例えば連続的な成分の供給および除去を利用したin vitroタンパク質合成用途に適していないのである。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、生化学反応を、高効率で、それと同時に簡単かつ再現性よく行うことを可能にする方法および装置を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、生化学反応を実施するための装置、特に無細胞系ポリペプチド生合成および／または天然構造を有する生物学的に活性なタンパク質の製造のための装置であって、
ウェルを有する内部ハウジングと、該内部ハウジングを取り囲む外部ハウジングと、供給チャンバーとを備えてなり、
内部ハウジングのウェルはそれぞれ生化学反応中製造系を含み、供給チャンバーは供給液体を含み、内部ハウジングのウェルと供給チャンバーとは半透膜で分離されており、
内部ハウジングが少なくとも２個のウェルを備え、該ウェルの下端は半透膜で密閉され、該ウェルの上端は供給チャンバーに含まれる供給液体から突き出ており、かつ内部ハウジングが、製造系および供給液体を振盪させてインキュベートするための手段に連結されていることを特徴とする、装置によって達成される。
【００１０】
本発明に適した外部ハウジングは、例えば、液体を保持することができるボール形または円筒形の容器であり、外形的により小さい内部ハウジングを内挿することができ、場合により固定することができる。内部ハウジングは、サイズおよび形状において外部ハウジングと釣り合うのであれば、いかなる外部寸法を有していてもよい。例えば、約10ml〜数リットルの容量の外部ハウジングには、円形、矩形または正方形のデザインが適している。内部ハウジングの形状は可能な限り外部ハウジングの形状と一致しているのが好都合である。さらに、内部ハウジングはマイクロタイタープレート(MTP)型であってもよい。このことにより、個々の操作ステップの簡単な自動化および促進が可能になる。
【００１１】
内部ハウジングは、１個または数個のウェルを有し、好ましくは２個以上、例えば６個、８個、12個、24個、48個、64個、96個、384個等のウェルを有する。しかしながら、原理上、数百〜数千個以上のウェルを有する、例えばブロックまたはマイクロタイタープレートの形態の内部ハウジングを本発明の装置に用いることも可能である。ウェルは、通常、ポリエチレンまたはポリプロピレンのような不活性材料から製造され、約50μlから最大数ミリリットル、すなわち10mlのオーダーの容量でデザインすることができる。下端が、半透膜、例えば３〜100キロダルトンの細孔サイズを有する透析膜で密閉されている円錐形のウェルが好都合である。本発明においては、原則的に、通常用いられている適当な細孔サイズの透析膜および限外濾過膜を用いることができる。約10〜14キロダルトンの細孔サイズを有する透析膜は、特に適していることが分かった。これにより、特にin vitro生合成中に生成する低分子量の干渉性阻害物質の分離が可能になる。ウェルの上方の開口部、すなわち供給チャンバーに含まれる供給液体から突き出ている内部ハウジングのウェルの一部分を密封するために、各ウェルは独立に、または全ウェルが一緒になって、キャップクロージャーまたは箔を備えていてもよい。あるいは、外部ハウジング全体を密封するために、クロージングカバーを取り付けてもよい。
【００１２】
本発明の装置における内部ハウジングのさらに好ましい実施形態は、複数のドリル穴を有するブロックの層から構成される。第１のブロック上に同じ穴形状を有する別の平らなブロックを配置する。その２つのブロックの間にフィルターまたは半透膜を配置する。第２の平らなブロックは、副産物または廃棄物の回収に適しており、よって副産物または廃棄物は供給チャンバーに達しないか、達したとしてもごくわずかである。このようにして、それぞれ膜により反応スペースと、いわゆる第２の供給もしくは透析チャンバーに分割されたウェルを有する内部ハウジングが得られる。内部ハウジングの両側を透析膜で密閉することで、交換に利用可能な領域が２倍になる一方、サンプルの容量はほとんど変更しなくてすむ。この実施形態の特定の利点は、供給液体中の不用成分の蓄積がほとんどないかかなり遅いことからin vitroでのタンパク質合成が持続するということであり、さらに、タンパク質合成の効率も増大する。
【００１３】
さらに、内部ハウジングの個々のウェルの壁を、in vitroで合成されたタンパク質およびペプチドと特異的に結合する成分でコーティングすることが好都合であることが分かった。適当な成分は、特に、タグ含有タンパク質の精製に適した成分である。よって、ウェル内のin vitroで合成されたタンパク質(タグ含有)を、そのコーティングされたマイクロタイタープレートにかかる様式で結合させることができ、続いて、場合により適当なバッファーで洗浄した後に直接精製するか、または適当な試薬により精製形態で溶出させることができる。いわゆるタンパク質タグとしては、例えば、in vitroで合成されたタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに結合し得るStrep-Tag II(8AA配列、ドイツ特許DE 42 37 113参照)が挙げられる。コーティング物質として、例えば、ストレプトアクチン、ストレプトアビジンまたはアビジンを用いることができる。適当な表面をコーティングする方法は当業者には公知である。あるいは、合成されたタグ含有タンパク質を、適切にコーティングされたガラスまたは磁気粒子を用いて個々のウェルの反応混合物から分離することも可能である。
【００１４】
本発明の装置は、反応溶液および供給溶液を十分に振盪させるか、または拡散させるために撹拌または振盪装置をさらに備えている。撹拌エレメントは、供給チャンバーおよび場合により反応が進行する各ウェル内にマグネティックスターラーの形態で配置するのが好都合であることが分かった。このことによって製造系、個々のウェル中の混合物、およびその周囲の供給溶液を同時に混合することができる。生化学反応中、一定温度、通常20℃〜37℃にするためには、装置全体を密閉可能なインキュベーター内に完全に入れるか、または温度制御インキュベーションフード下に保持するのが最も簡単である。さらに、振盪または撹拌装置と、サーモスタット装置を組み合わせて本発明で用いることができる。よって、反応混合物および供給溶液の混合を、適当な振動数の振盪または撹拌運動により同時に行うことができ、しかも一定温度で長期間にわたり行うことができる。
【００１５】
所望のタンパク質またはペプチドを十分な収量で得るためには、原則として、反応混合物を約20時間インキュベートすれば十分である。合成されるタンパク質、個々のプロセスのパラメーターの最適化および供給溶液の厳密な組成に依存するが、約6時間後にはウェル内の反応溶液250μl当たりタンパク質約25〜50μg(濃度100〜200μg/mlに対応)に達し得る。さらに、より長い時間インキュベートすると、それに応じて収量が多くなり、例えば、GFP(グリーン蛍光タンパク質)では最大500μg/mlの濃度が得られた。
【００１６】
本発明のさらに好ましい実施形態は、供給溶液の容量が内部ハウジングのウェルの数または合計容量により決定される場合である。本発明の目安として、供給溶液容量は、ウェル数の合計にウェル当たりの容量をかけたものの10倍量に等しい。
【００１７】
供給溶液の組成は、無細胞系in vitro生合成についての従来の対応する溶液の組成と本質的に一致する。さらに、当業者であれば、無細胞系タンパク質合成用の供給溶液が、リボソーム画分のタイプおよび品質、すなわち無細胞系in vitro生合成に真核系または原核系のどちらが基本として用いられるかどうかに特に依存する通常の最適化手段に付されることは分かるであろう。さらに、供給溶液が、スルフィド基を還元する試薬と、例えば、大腸菌(E.coli)系溶解物の場合、大腸菌ポリメラーゼの阻害剤と、場合により１種または数種の適当な殺菌剤とを含むのが好都合であることが分かった。
【００１８】
本発明において、転写／翻訳の共役反応に特に好適な供給溶液は、例えばHepesのような適当なバッファー系に、約150〜400mMのカリウムイオン、約10〜50mMのマグネシウムイオン、十分な量の4種のヌクレオチド三リン酸(ATP、CTP、GTPおよびUTP)および全ての天然アミノ酸、約20〜80mMのアセチルリン酸ならびにスルフィド基を還元する試薬としてのジチオトレイトールを含み、場合によりEDTA、グリセロール、1種または数種の殺菌剤（例えば、リファンピシンまたはアジ化ナトリウム、好ましくは、大腸菌由来のリボソーム画分の場合、大腸菌ポリメラーゼを失活させるリファンピシンなどのRNAポリメラーゼ阻害剤）を含む。転写／翻訳反応用の典型的な反応混合物は、適切な成分を供給溶液と同様の量含む。さらに、本発明における反応混合物は、例えば大腸菌溶解物などの各真核性または原核性リボソーム画分、所望のタンパク質をコードするプラスミド形態のDNA、約１〜10U/μlのRNAポリメラーゼおよび約200〜800μg/mlのtRNAを含み、場合によりさらに補助物質、例えばRNアーゼ阻害剤などを含む。
【００１９】
本発明のさらなる主題は、本発明の装置を用いて、１種の生化学反応、特に数種の生化学反応を同時に実施する方法である。ここで、供給チャンバー内の供給液体は、生化学反応中に外部印加圧にさらされず、したがって供給チャンバーと内部ハウジングの個々のウェルの溶液の間の分子交換は本質的に拡散に基づくものである。
【００２０】
本発明の方法およびその方法に適した装置は、特に、合成のスループットが高い自動化用途に適している。
【００２１】
本発明はさらに、対応する装置を用いて、無細胞系において、タンパク質のin vitroの転写および翻訳を1セットで実施するための反応キットまたはin vitroでタンパク質合成を実施するための反応キットに関する。このキットは、本質的に、供給溶液と、反応混合物用の溶液とを含んでなる。これらの溶液は、液体形態で存在してもよく、凍結乾燥状態で存在してもよい。供給溶液は、本質的に、pH７〜８に調節するバッファーとして作用する物質、約150〜400mMのカリウムイオン、約10〜50mMのマグネシウムイオン、ヌクレオチド三リン酸（ATP、CTP、GTPおよびUTP）、約20種の異なるアミノ酸ならびにスルフィド基を還元する物質を含む。さらに、安定剤または好ましくない反応を防止するためのインヒビターのような追加の補助物質を供給溶液に添加してもよい。反応混合物の溶液は、上記の供給溶液の溶液に一致し、さらに、無細胞系溶解物、すなわち原核性または真核性リボソーム画分、tRNAおよびRNAポリメラーゼ(その起源は、リボソーム画分のものとは異なるものである)を含む。本発明によれば、反応を実施する直前まで、供給溶液の成分とは異なった反応混合物溶液成分を混合しない、すなわち、それらはそれぞれ別個の容器に存在するのが好ましい。このことは、供給溶液ならびにアセチルリン酸などの反応溶液に加えられることになる高エネルギー化合物にも同様にあてはまる。これにより、反応キットの貯蔵寿命および適合性がさらに改善される。
【００２２】
本発明を下記の実施例によってさらに説明する。
【００２３】
実施例１
本発明による無細胞系タンパク質生合成法を、大腸菌溶解物および２つのモデルタンパク質（CATおよびGFP）を用いて、以下により詳細に説明する。
【００２４】
無細胞系タンパク質生合成は、転写と翻訳の共役形態で実施される。ここで、転写により得られるmRNAはプラスミド上にコードされるが、このプラスミドの遺伝子配列にはウイルスRNAポリメラーゼ（例えば、SP6、T3またはT7 RNAポリメラーゼ）のプロモーターが含まれている。
【００２５】
in vitroでの転写により得られたmRNAは、転写と翻訳の共役系に存在する大腸菌溶解物の助けを借りて対応するタンパク質に翻訳される。
【００２６】
A) 反応成分：
プラスミド：
pM-GFPまたはpIVEX-GFPは、突然変異GFPcycle3(27キロダルトン)(Nature Biotechnology, 1996, 14, p.315-319)の形態のオワンクラゲ(Aequorea victoria)由来のグリーン蛍光タンパク質の配列を含み、このGFPcycle3突然変異体のコード領域を、pTU58に野生型GFP配列の代わりにクローニングした(Science, 1994, 263, 802)。pHM-CATは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質(22.5キロダルトン)の配列を含む。
【００２７】
構築物：pCAT3(Promega)由来の挿入断片(NcoI-BamHI)をpHM19に挿入した(FU Berlin, "Instit. f. Biochemie", Dr.Stiege)。
【００２８】
大腸菌 S30 溶解物：
大腸菌A19株から、Zubay(Annu. Rev. Genet. 7, 267, 1973)の改良法により溶解物を調製した。
【００２９】
溶解物バッファー：100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、14mMの酢酸マグネシウム、60mMの酢酸カリウム、0.5mMのジチオトレイトール
反応および供給溶液の組成：
転写／翻訳反応混合物：
185Mの酢酸カリウム、15mMの酢酸マグネシウム、4％のグリセロール、2.06mMのATP、1.02mMのCTP、1.64mMのGTP、1.02mMのUTP、257μMの各アミノ酸(合計20種)、10.8μg/mlの葉酸、1.03mMのEDTA、100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、１μg/mlのリファンピシン、0.03％のアジ化ナトリウム、40mMのアセチルリン酸、大腸菌MRE600由来の480μg/mlのtRNA、2mMのジチオトレイトール、10mMのMESNA(メルカプトエタンスルホン酸)、70mMの水酸化カリウム、0.1U/μlのRNアーゼ阻害剤、15μg/mlのプラスミド、220μl/mlの大腸菌A19溶解物、２U/μlのT7 RNAポリメラーゼ。
【００３０】
供給溶液：
185mMの酢酸カリウム、15mMの酢酸マグネシウム、４％のグリセロール、2.06mMのATP、1.02mMのCTP、1.64mMのGTP、1.02mMのUTP、257μMの各アミノ酸(合計20種)、10.8μg/mlの葉酸、1.03mMのEDTA、100mMのHepes-KOH pH7.6/30℃、１μg/mlのリファンピシン、0.03％のアジ化ナトリウム、40mMのアセチルリン酸、2mMのジチオトレイトール、10mMのMESNA(メルカプトエタンスルホン酸)、70mMの水酸化カリウム、220μl/mlの上記溶解物バッファー。
【００３１】
B) 装置：
ここに記載した実施例では、マイクロタイタープレートの形態のマルチチャンネル透析器を用いた。マイクロタイタープレートの個々のウェルの底部には、それぞれ、10キロダルトンのカットオフ容量を有する透析膜が備えられている。ウェル当たりの最大反応容量は200μｌであった。供給溶液用のハウジングの容量は200mlであった。
【００３２】
C) 振盪、カバー：
振盪装置：Flow laboratories, タイプ：振盪数ステップ4.5のTitertek(登録商標)
インキュベーションフード：Edmund Buhler, タイプ：TH25, 温度30℃
D) 手順：
1) GFPを含むpM-GFPまたはpIVEX-GFPの発現のために、
2) CATを含むpHM-CATの発現のために、
上記組成の反応混合物をそれぞれ別々にピペッティングした。
【００３３】
各混合物は8.4mlの容量で調製し、その200μlを合計40ウェルにピペッティングした(超過量として0.4ml)。すなわち、１つの混合物およびタンパク質につき40ウェルにピペッティングした。
【００３４】
上記組成の供給溶液200mlを供給チャンバーにピペッティングした。すなわち、両方の反応混合物に共通の供給溶液を用いた。
【００３５】
マイクロタイタープレートを接着箔で密封した後、該装置をインキュベーションフード下に置いた振盪装置に取り付けた。
【００３６】
振盪数を調節し、インキュベーション温度を30℃に調節した後、反応混合物を20時間インキュベートした。
【００３７】
E) 評価
1) GFPの発現
サンプルをKontron Company製の分光蛍光計(タイプ：TEGIMENTA、SFM25)を用いて測定した。
【００３８】
395nmの波長で励起した。
【００３９】
放出速度580〜430nm。
【００４０】
放出最大は510nmである。
【００４１】
Roche Diagnostics製のrGFP(組換えGFP、カタログNo.1814524)を標準物質として用いた。
【００４２】
サンプルを溶解物バッファーで1:200に希釈し、標準物質を１μg/mlと２μg/mlに希釈した。
【００４３】
表１：
得られた40個の値のうちの10個の値（全て同一レンジである)を代表例として示す。
【００４４】
図１：
選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのGFPの量(μg)として表１に示した値をグラフにして表した図である。
【００４５】
【表１】
サンプルを機器(タイプ：LKB2150)を用いてHPLC分析により測定した。
【００４６】
Roche Diagnostics製のCAT酵素、カタログNo.1485156を標準物質として用いた。
【００４７】
表２
得られた40個の値のうちの10個の値（全て同一レンジである)を代表例として示す。
【００４８】
図２：
選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのCATの量(μg)として表２に示した値をグラフにして表した図である。
【００４９】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのGFPの量(μg)として表１に示した値をグラフにして表した図である。
【図２】 選択したウェルにおける、反応溶液１ml当たりのCATの量(μg)として表２に示した値をグラフにして表した図である。
Claims (13)
- 複数の無細胞系ポリペプチド生合成反応および／または天然構造を有する複数の生物学的に活性なタンパク質の無細胞系での製造のための装置であって、
ウェルを有する内部ハウジングと、供給チャンバーと、該内部ハウジングおよび該供給チャンバーを取り囲む外部ハウジングとを備えてなり、
内部ハウジングのウェルはそれぞれ、生化学反応の間、製造系を含み、供給チャンバーは、生化学反応の間、供給液体を含み、内部ハウジングのウェルと供給チャンバーとは半透膜で分離されており、
内部ハウジングは少なくとも２個のウェルを備え、該ウェルの下端は半透膜で密閉され、該ウェルの上端は供給チャンバーに含まれる供給液体から突き出ており、かつ内部ハウジングは、製造系および供給液体を振盪および／または撹拌してインキュベートするための手段に連結されており、該手段が製造系の混合と供給液体の混合とを同時に実施できるように構成されていることを特徴とする、装置。 - 内部ハウジングが２〜約100個のウェルを有する、請求項１に記載の装置。
- ウェルの側壁が、in vitroで合成されるタンパク質と特異的に結合する成分でコーティングされている、請求項１または２に記載の装置。
- ウェルが、結合するポリペプチドを精製するのに適した成分でコーティングされている、請求項３に記載の装置。
- ウェルがストレプトアクチン、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされている、請求項３または４に記載の装置。
- 内部ハウジングのウェルの容量がそれぞれ50μl〜10mlであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
- 供給溶液の容量が、ウェルの容量の合計の５〜20倍である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
- 半透膜が、３〜100kDaの細孔サイズを有する透析膜または限外濾過膜である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
- 内部ハウジングの上向きのウェル開口部を密閉するために、各ウェルが独立に、もしくは全ウェルが一緒になってキャップクロージャーもしくは箔を備えているか、またはクロージングカバーが外部ハウジングを密封するように存在している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
- 内部ハウジングのウェルが、同一の孔形状を有する複数のブロックと、該ブロックの間に固定された膜から構成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置によって１種以上の無細胞系ポリペプチド生合成反応を同時に実施するための方法であって、供給チャンバー内の供給液体が生化学反応中に外部印加圧にさらされず、したがって供給チャンバーと内部ハウジングの個々のウェルとの間の分子交換が本質的に拡散に基づくものであることを特徴とする、方法。
- 請求項１に記載の装置を用いた請求項１１に記載の方法であって、供給液体および場合により内部ハウジングの各ウェル内の製造系が、生化学反応中にマグネティックスターラーエレメントによって撹拌されることを特徴とする、方法。
- 下記の成分：
1) pH７〜８に調節するバッファーとして作用する物質、150〜400mMのカリウムイオン
、10〜50mMのマグネシウムイオン、ヌクレオチド三リン酸、アミノ酸およびスルフィド基を還元する物質を含む溶液、
2) 高エネルギー化合物、
3) tRNA画分、ならびに、場合により、
4) RNAポリメラーゼおよび／または
5) 無細胞系溶解物
を含んでなる、請求項１１または１２に記載の方法によって１種以上の無細胞系ポリペプチド生合成反応を実施するためのキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99111762.3 | 1999-06-18 | ||
| EP99111762A EP1061128B1 (de) | 1999-06-18 | 1999-06-18 | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen mit hohem Durchsatz |
| PCT/EP2000/005378 WO2000078444A2 (de) | 1999-06-18 | 2000-06-10 | Verfahren und vorrichtung zur durchführung biochemischer reaktionen mit hohem durchsatz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003502146A JP2003502146A (ja) | 2003-01-21 |
| JP3650752B2 true JP3650752B2 (ja) | 2005-05-25 |
Family
ID=8238383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001504498A Expired - Fee Related JP3650752B2 (ja) | 1999-06-18 | 2000-06-10 | ハイスループットで生化学反応を実施するための方法および装置 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1061128B1 (ja) |
| JP (1) | JP3650752B2 (ja) |
| AT (2) | ATE279511T1 (ja) |
| CA (1) | CA2340712C (ja) |
| DE (2) | DE59910840D1 (ja) |
| ES (2) | ES2229587T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000078444A2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003534113A (ja) * | 2000-04-21 | 2003-11-18 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | 二相性反応容器および使用法 |
| DE102005013608A1 (de) * | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Vorrichtung und Verfahren für die zellfreie analytische und präparative Proteinsynthese |
| GB0919702D0 (en) * | 2009-11-11 | 2009-12-30 | Ashe Morris Ltd | Improved agitated cell reactor |
| US10287542B2 (en) | 2012-11-30 | 2019-05-14 | Bioneer Corporation | Apparatus for automatically preparing cell-free proteins and method for preparing proteins using same |
| US11421226B2 (en) * | 2018-10-17 | 2022-08-23 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Programmable artificial cell |
| EP3725880A1 (en) * | 2019-04-15 | 2020-10-21 | ETH Zurich | Method and kit for the purification of functional risc-associated small rnas |
| WO2023106291A1 (ja) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | 国立大学法人東京工業大学 | タンパク質結晶材料の製造 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8102316L (sv) * | 1981-04-10 | 1982-10-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Anordning for genomforande av analyser |
| DE8717464U1 (ja) * | 1987-07-11 | 1988-12-29 | Boehringer Ingelheim Kg, 6507 Ingelheim, De | |
| US5362624A (en) * | 1988-05-25 | 1994-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable reaction vessel therefor |
| US5478730A (en) * | 1988-12-21 | 1995-12-26 | Institute Of Protein Research | Method of preparing polypeptides in cell-free translation system |
| DE4237113B4 (de) * | 1992-11-03 | 2006-10-12 | "Iba Gmbh" | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins |
| US5462874A (en) * | 1993-06-23 | 1995-10-31 | Wolf; Martin L. | Dialyzed multiple well tissue culture plate |
| KR0131166B1 (ko) * | 1994-05-04 | 1998-04-11 | 최차용 | 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법 |
| JP3686917B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2005-08-24 | 独立行政法人理化学研究所 | 微量検体のためのインキュベーター |
| DE59810647D1 (de) * | 1997-07-31 | 2004-03-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen |
| RU2148649C1 (ru) * | 1998-03-31 | 2000-05-10 | Институт белка РАН | Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления |
-
1999
- 1999-06-18 DE DE1999510840 patent/DE59910840D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-18 ES ES99111762T patent/ES2229587T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-18 AT AT99111762T patent/ATE279511T1/de active
- 1999-06-18 EP EP99111762A patent/EP1061128B1/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-06-10 JP JP2001504498A patent/JP3650752B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-10 EP EP00935201A patent/EP1126912B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-10 AT AT00935201T patent/ATE322336T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-10 WO PCT/EP2000/005378 patent/WO2000078444A2/de active IP Right Grant
- 2000-06-10 DE DE50012526T patent/DE50012526D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-10 CA CA002340712A patent/CA2340712C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-10 ES ES00935201T patent/ES2260016T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59910840D1 (de) | 2004-11-18 |
| WO2000078444A3 (de) | 2001-04-26 |
| EP1061128B1 (de) | 2004-10-13 |
| EP1126912B1 (de) | 2006-04-05 |
| ATE322336T1 (de) | 2006-04-15 |
| JP2003502146A (ja) | 2003-01-21 |
| EP1126912A1 (de) | 2001-08-29 |
| DE50012526D1 (de) | 2006-05-18 |
| ES2229587T3 (es) | 2005-04-16 |
| ATE279511T1 (de) | 2004-10-15 |
| WO2000078444A2 (de) | 2000-12-28 |
| ES2260016T3 (es) | 2006-11-01 |
| EP1061128A1 (de) | 2000-12-20 |
| CA2340712C (en) | 2005-05-10 |
| CA2340712A1 (en) | 2000-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100749053B1 (ko) | 무세포 단백질 합성방법 | |
| Garamella et al. | The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: a platform for cell-free synthetic biology | |
| EP1244810B1 (en) | Methods and systems for monitoring intracellular binding reactions | |
| US20020172968A1 (en) | Biochips comprising nucleic acid/protein conjugates | |
| EP1068348B1 (en) | Method of preparing polypeptides in cell-free system and device for its realization | |
| US6783957B1 (en) | Method for synthesis of polypeptides in cell-free systems | |
| US20030036643A1 (en) | Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries | |
| RU2615446C2 (ru) | Прибор для автоматизированного бесклеточного получения белков и способ получения белков с применением данного прибора | |
| JP3650752B2 (ja) | ハイスループットで生化学反応を実施するための方法および装置 | |
| US7863015B2 (en) | Method and device for carrying out biochemical reactions with a high throughput | |
| Schoborg et al. | Cell‐Free Protein Synthesis: An Emerging Technology for Understanding, Harnessing, and Expanding the Capabilities of Biological Systems | |
| US20060257997A1 (en) | High throughput synthesis system and synthesizer for automatically performing the system | |
| US7192767B2 (en) | Matrix reactor and a method for producing products in said reactor | |
| JPH05236987A (ja) | 非天然型アミノ酸組み込み蛋白質とその製造法及び試薬キット | |
| Spirin | Cell-free protein synthesis | |
| EP2511378A1 (en) | Method and device for synthesizing protein from dna molecule captured in microchamber | |
| EP2876159B1 (en) | Molecular engineering method for in vitro evolution of membrane protein | |
| Fletcher et al. | Advantages and Applications of the Batch-Formatted E. coli Cell-Free Expression System |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040218 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040301 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040423 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050208 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050221 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090225 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090225 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100225 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110225 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110225 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120225 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120225 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130225 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130225 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140225 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |