KR0131166B1 - 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 제조에 필요한 조직을 세포로부터 추출하여 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 이때 사용되는 에너지원을 재생하여 순환시켜 사용하고, 원하는 단백질에 대한 흡착특이성이 높은 분리수단을 사용함으로써 무세포 단백질 제조를 보다 경제적이고 효율적으로 수행하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 생물세포(in vivo)시스템에서 나타나는 문제점을 해결할 수 있고, 단백질의 생산성 및 반응기의 운전시간의 증가에 따른 전체생산량이 종래 방법에 비해 크게 증가된다.

Description

무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법

제1도는 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 무세포 단백질 제조장치의 구조를 보여주는 블럭도이다.

제2도는 본 발명에 따른 단백질 합성 반응기에서 연속공정에 의해 제조되는 단백질의 양을 시간에 따라 나타낸 그래프이다.

제3도는 본 발명에 따른 단백질 합성 반응기에서 반연속공정에 의해 제조되는 단백질의 양을 시간에 따라 나타낸 그래프이다.

본 발명은 무세포(in vitro) 시스템에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로 특히 의약품, 식품, 농약, 환경제품, 산업화학제품, 일상생활용품 등과 관련된 산업분야에서 이용될 수 있는 단백질을 무세포시스템에서 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 단백질을 제조하기 위해 이용되는 방법은 크게 화학적인 방법과 생물학적인 방법이 있는데, 펩타이드 체인당 아미노산의 수가 적은 경우에는 화학적인 방법이 주로 이용되었고, 특히 펩타이드 체인당 아미노산의 수가 10개 미만인 경우에는 화학적인 합성방법을 이용하는 것이 생물학적인 방법에 비해 경제적이라고 알려져 있었다.

한편, 단백질을 생물학적으로 생산하는 경우 종래에는 주로 유전적으로 조작된 생물세포를 이용하는 생체(in vivo)시스템이었다. 이 경우 원하는 단백질의 분비특성에 따라 주로 다음과 같은 두가지 방법을 이용하였다.

즉, 세포내 단백질의 경우에는 세포를 배양하여 원하는 단백질이 세포내부에 축적된 다음 적절한 시점에서 세포를 파괴하여 단백질을 분리, 정제하는 방법을 이용하였으며, 세포외부로 분비되는 분비단백질의 경우에는 세포를 배양하여 적절한 시점에서 그 배양액을 분리하여 이로부터 단백질을 분리, 정제하였다.

생물세포를 기초로 하는 이러한 방법은 생물 세포에 의한 단백질의 과잉생산과 단백질의 분리 정제과정에서 다음과 같은 여러 가지 문제점을 가지고 있었다.

세포가 성장함에 따라 생산되는 단백질 분해효소 등에 의해 단백질이 분해 또는 변성되고, 단백질이 합성된 후에도 번역후과정(Post translation process)에 의한 탈아미노 반응, 산화반응 등으로 인해 원하는 단백질이 바람직하지 않게 변형되는 경우가 빈번하였다. 비천연형 아미노산이나 변형된 아미노산을 단백질에 도입하는 것도 불가능하거나 극히 어려웠다. 또한 세포에 독성효과를 미치는 단백질은 세포의 성장을 저해하고, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 생산되는 단백질의 농도에 따라 조절되어 일정 농도 이상으로 단백질을 생산하기가 곤란하였다. 인위적인 돌연변이를 통해 원하는 단백질을 과잉생산할 수 있는 세포를 이용한다고 해도 생체가 지니는 특성으로 인해 단백질의 생산에 한계가 있었다. 즉, 세포내부에 축적되거나 세포외부로 분비되는 단백질의 농도가 세포의 생존성에 영향을 미치는 경우가 일반적이고, 단백질의 과잉생산조건과 세포의 성장조건을 조화시키기가 매우 어려워서 원하는 단백질의 과잉생산은 매우 어려웠던 것이다.

또한 분리, 정제과정에서 대부분의 단백질이 불용성이거나 불안정하여 세포 자체의 단백질 분해효소에 의해 분해되거나 봉입체에 축적되며 분리과정에서 손실되는 비율이 높고, 막단백질의 경우에는 분리가 더욱 어려웠다. 또한 의약품이나 식품 등에 이용되는 단백질의 경우에는 감염성 인자나 엔도톡신이 혼입되는 것을 방지하기 위해 분리, 정제과정에서 철저한 관리가 요구되었다. 그러므로, 원하는 단백질의 분리, 정제 효율이 낮고 단백질 생산의 수율, 비생산속도, 생산량이 극히 저조하여 이들 단백질 제품의 가격이 매우 높았다.

이러한 문제를 해결하기 위해 생물세포 자체를 기초로 하지 아니하는 즉, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법이 도입되었다.

종래의 회분식의 무세포 단백질 생산방법에서는 mRNA의 요구량이 크고, 반응기의 운전시간이 1시간 이내로 짧고 세포추출물의 기본 활성이 매우 낮았으며, 핵산분해효소, 단백질 분해효소 등에 의한 악영향이 크고 에너지원 자체 또는 그것에 의해 생산된 생성물 또는 부산물에 의한 저해를 방지하기가 여전히 어려웠다. 따라서 단백질의 생산성이 극히 낮았다.

그리하여 연속공정에 의해 무세포시스템에서 단백질을 생산하는 방법이 알렉산더 스피린 등에 의해 제안되었다. 이 방법에 의해 단백질 생산이 20시간 이상 이루어질 수 있었고 단백질 생산속도도 회분식에 비해 크게 증가되기는 하였지만 5pmol/pmolmRNA에 불과했다. (Alexander S. Spirin et al., A continuous cell-free translation systerm capable of producing polypeptides in high yield. Science 242(1998) 463-466). 이어서 이들은 연구를 거듭하여 전사-번역을 커플링시킨 무세포시스템에서 연속공정에 의해 단백질을 4㎍/㎖/hr의 생산성으로 생산하여 이를 전기영동 후 오토라디오그래프법에 의해 확인하였다. Alexander S. Spirin et al., Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. Gene 84 (1989) 436-466).

알렉산더 스피린 등은 연속공정에 의해 주로 반응기의 운전시간을 증가시킴으로써 단백질의 총생산량을 증가시키는 방향으로 연구를 진행하였으나 반응기내의 반응물질들의 농도가 증가함에 따라 효율적인 혼합이 저해되고 반응액의 흐름이 반응기 출구에 설치된 분리막(membrane)에 대하여 수직방향으로만 이루어지도록 하였기 때문에 막힘현상이 발생하는 등의 문제가 있어서 최대 운전시간이 100시간을 채 넘지 못했다.

이어서, 히데오 나까노 등은 한외여과막을 이용하여 농축시킨 밀배아 추출물을 사용함으로써 기존의 방법에 비해 단백질의 생산속도를 증가시키는 단순유가 (simple fed-batch) 방법을 제안하였다(Hideo Nakano et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58 (4), 631-634, 1994). 이 방법에 따르면, 단백질 생산속도는 스피린 등의 방법에 비해 5배 정도 증가되어 약 30㎍/㎖/hr에 이르렀으나 운전시간은 6시간 정도에 그쳤고 단백질의 총생산량도 스피린의 연속시스템에 비하여 떨어졌다.

이와같이 종래의 방법에 의한 단백질 생산성이나 총생산량은 모두 산업화에 미치지 못하는 수준이었다. 그러므로, 단백질의 생산속도도 더 증가시키고 전체 운전시간을 증가시킴으로써 단백질의 전체 생산량을 증가시키고, 값비싼 에너지원을 재생하여 사용함으로써 비용을 절감시킬 필요성이 절실히 요구되었다.

따라서 본 발명의 목적은 단백질의 생산성과 생산량을 모두 개선시킨, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 에너지원으로 사용되는 ATP 및 GTP와 같은 뉴클레오티드를 별도의 에너지재생수단에 의해 재생시켜 단백질 합성 반응기내로 순환시켜 재사용함으로써 무세포 단백질 제조를 보다 경제적으로 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 원하는 단백질에 대한 흡착특이성이 높은 분리수단을 사용하여 생산된 단백질을 흡착시킴으로써 단백질의 회수율과 전환율을 증가시켜 원하는 단백질을 효과적으로 얻기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따르면, 세포를 배양한 후 분쇄하여 원하는 단백질의 생산에 필요한 조직을 포함하는 세포추출물을 제조하는 단계; 및 상기 세포추출물과 함께 유전정보원, 단백질 합성을 위한 제1에너지원으로 작용하는 ATP, GTP, 제1에너지원을 반응기 내에서 바로(in situ) 재생시키는데 필요한 제2에너지원으로서의 고에너지 인산화합물, 탄수화물 또는 이들의 유도체, 기질로서 아미노산 혼합물(여기에서 아미노산은 통상적으로 사용되는 20종의 L-형 아미노산을 의미함) 및 직경이 0.1 내지 1000㎛이고 비표면적인 10내지 1000㎡/g인 다공성 고체물질을 포함하는, 반응배지를 분리막형 단백질 합성 반응기에 공급하여 원하는 단백질을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따르면, 무세포 단백질 합성 시스템에 별도로 부가되는 에너지 재생수단에 의해 제1에너지원을 재생시켜 단백질 합성 반응기내로 순환시키는 단계를 더 포함하는, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따르면, 무세포 단백질 합성 시스템에 별도로 부가되는 단백질 분리수단에 의해 원하는 단백질만을 선택적으로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 세포 추출물은 단백질 합성의 활성이 가장 좋은 상태의 세포(대장균, 고초균 등과 같은 각종 미생물 세포, 밀배아, 쌀배아, 보리배아 등의 식물세포, CHO(chinese Hamster Ovary)세포, 하이브리도마세포, 레티큘로사이트 등과 같은 동물세포)를 이용하여 세포배양을 한 후 세포를 분쇄하여 단백질 합성에 방해가 되는 성분들을 제거하고 단백질 합성에 필수적인 성분들을 고농도, 고수율로 분리정제함으로써 제조된다. 이때 한외여과막을 이용한 압축여과방법에 의해 세포추출물을 농축시킴으로써 단백질 비생산속도를 높일 수 있다. 또한, 농축단계 전에 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 침전물을 제거함으로써 단백질 비생산속도가 크게 증가될 수 있다.

여기에서 단백질 분해효소나 핵산 분해효소를 생산하지 못하도록 미리 유전적으로 조작한 세포들을 사용할 수도 있다.

또한 단백질 합성에 필요한 기구로서 tRNA는 상기 세포추출물에 포함되어 있는 것을 그대로 사용할 수도 있고 별도로 준비한 것을 첨가할 수도 있다.

상기 유전정보원으로는, 특정 단백질에 대한 DNA 및/또는 mRNA, mRNA 모노머를 반응시스템에 첨가하여 DNA-mRNA전사, mRNA복제, mRNA번역 등이 단독으로 또는 조합하여 수행되도록 한다. 따라서, 반응시스템의 운전을 전사-번역 연결 시스템, RNA복제-번역 연결시스템, 전사-RNA복제-번역 연결시스템 또는 번역 비연결시스템 등으로 할 수 있다. 즉, 반응 시스템의 운전을 번역 비연결시스템으로 하는 경우에는 특정 단백질에 대한 mRNA만을 단백질 합성 반응기에 넣어주는 것으로 족하며, 전사-RNA복제-번역 연결시스템으로 하는 경우에는 특정 단백질에 대한 DNA 및 mRNA, RNA 단량체(ATP, GTP, CTP, UTP)와 RNA 폴리머라아제와 같은 필요한 효소들을 상기 단백질 합성 반응기에 넣어준다. 핵산 분해효소의 활성을 저해하기 위해서는 통상의 방법으로 mRNA의 3' 말단에 특정배열을 갖는 올리고디옥시뉴클레오티드를 물리적으로 또는 화학적으로 결합시키거나 mRNA의 인산기에 결합되어 있는 산소의 일부를 유황원자로 대치시킨 것을 사용할 수 있다.

상기 제1에너지원으로는, ATP와 GTP를 사용하며, 사용한 ATP와 GTP가 분해되어 생성된 AOP와 GOP로부터 ATP와 GTP에 반응기 내에서 바로 재생산하기 위한 제2에너지원으로서는 고에너지 인산화합물이나 탄수화물 또는 이들의 유도체를 사용한다. 이때 제2에너지원에 따라 결정되는 특정 카이나아제 또는 썩시닐 코엔자임 A 합성효소 또는 썩시닐치오카이나아제가 함께 사용된다. 고 에너지 인산화합물의 예로는 포스포이놀파이루베이트, 포스포크레아틴, 아세틸포스페이트 및 폴리포스페이트 등이 있다. 알파-케토글루타레이트와 같은 탄수화물이 ATP, GTP 재생을 위한 에너지원으로 사용될 때 발생된 NADH가 파이루베이트로부터 락테이트를 생산하거나 그밖의 유용한 용도로 이용될 수도 있다.

상기 다공성 고체물질은 표면적이 다양하고 기공의 크기와 구조가 다양하며, 물리화학적 성질 및 표면의 산도-염기도도 다양하다. 바람직하기로는 0.1-1,000㎛의 직경, 10-1000㎡/gr의 표면적을 가지고 있고, 외형이 입자, 평판, 두루말이, 벌집 모양 등인 다공성 고체물질이 사용된다. 이러한 다공성 고체물질의 예로는 고분자물질과 무기산화물이 있다. 고분자물질로는 다공성 키토산, 다공성 셀룰로오스, 다공성 젤라틴, 다공성 콜라겐 및 그들의 유도체 또는 다공성 금속화합물 등이 사용되며, 무기산화물로는 알루미나, 실리카, 티타니아, 지르코니아, 몰리브데나, 바나둠 옥사이드, 코발트 옥사이드 또는 이들의 혼합물 또는 여러가지 형태의 제오라이트 등이 사용된다. 또한 여러 가지 종류의 무기화합물로 도핑되거나 여러 가지 유기물질에 의해 변형된 것도 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 다공성 고체물질을 사용함으로써 반응자체가 개선되어 단백질의 생산속도가 크게 증가되고, 분리막의 막힘현상이 크게 방지됨에 따라 전체 운전시간이 크게 증가되고 따라서 전체생산량이 증가되었다.

상기 단백질을 제조하는 단계에 있어서, 유전정보원, 상기 제1, 제2에너지원, 아미노산 및 다공성 고체물질 외에도 염, 이온성 그룹이 결합되어 있는 고분자물질, cAMP, 단백질 분해효소 저해제, 핵산분해효소저해제, 단백질합성저해제에 대한 저해제, 산화환원 조절제, 비변성계면활성제, 완충성분, 스퍼민, 스퍼미딘 및 카이나아제를 포함하는 단백질 합성 반응에 필요한 물질이 단백질 합성 반응기에 첨가될 수 있다.

상기 염의 예로는 초산 또는 황산의 칼륨, 마그네슘, 암모늄 및 망간염 등이 있으며, 염중의 일부는 아미노산을 카운터 음이온으로서 가지고 있다.

상기 이온성그룹이 결합되어 있는 고분자물질은 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 디에틸아미노에틸, 쿼터너리 아미노에틸 및 아미노에틸 등이다.

상기 산화환원 조절제는 디치오스레이톨, 아스코르빈산, 글루타치온 및 이들의 산화물로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나이다. 또한 트리톤 X-100과 같은 비변성계면활성제를 0-0.5M의 농도로 첨가한다.

상기 스퍼민, 스퍼미딘은 단백질 합성성능의 향상을 위해, cAMP는 유전자발현조절제로서 각각 첨가된다. 종래에는, 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 경우에는 스퍼민과 스퍼미딘을 통상 사용하지 않았으나 본 발명에서는 상승효과를 위하여 이들 물질을 적절한 농도로 조합하여 첨가하였다.

반응배지 준 특정 성분의 농도를 변화시키고자 하는 경우에는 이에 따라 다른 성분의 농도도 변화시켜야 하는 경우가 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드와 에너지원의 농도는 다른 성분의 농도에 따라서 조절된다. 반응 시스템으로 공급되는 성분의 농도는 시간에 따라서도 변화될 수 있다. 예를 들어 공급용액에서의 아미노산의 농도는 연속배양을 수시간 진행한 후에 증가될 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜과 같은 유기화합물과 다공성 고체물질은 0-10%의 농도로 첨가된다.

단백질 합성 반응기에 사용되는 분리막으로는 이온성, 비이온성, 친수성, 소수성, 극성 및 비극성 등 여러 종류 중에서 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다.

반응시스템은 회분식, 운전시간이 연장된 형태의 회분식, 반연속유가식, 또는 연속식으로 운전될 수 있으며 용도에 따라 운전방식을 달리하여 운전하는 것이 바람직하다. 회분식이 아닌 경우 공급용액의 농도는 필요에 따라 일시적으로 달라질 수 있다.

단백질 합성 반응기의 pH와 온도는 각각 pH 5-10, 온도 20-50℃, 범위에서 조절되는 것이 바람직하며, pH 6-9, 온도 25-40℃ 범위로 조절되는 것이 보다 바람직하다.

반응용액의 유동 방향은 상기 분리막에 대해 수직 및 또는 접선방향으로 한다. 제1에너지원을 재순환시키고 분리막의 막힘현상을 방지하는데는 접선흐름이 효과적이며 이는 동시에 수직흐름상에 겹쳐진다. 분리막에 수직인 흐름은 양압펌프 또는 진공흡입펌프에 의해 이루어진다.

연속반응공정에서 단백질 분리수단을 이용하는 경우, 단백질 합성 반응기의 출구분리막을 통해 빠져 나오는 생성물은 곧 바로 단백질 분리수단으로 연결될 수 있다.

반연속공정의 경우에는 단백질 합성 반응기의 출구에 설치된 분리막의 외부는 소정의 순서로 순환하는 소정의 용액과 접촉하며 이러한 용액에는 단백질 합성 저해제에 대해 흡착특이성을 가진 흡착제를 포함하는 물질 외에도 아미노산이나 뉴클레오티드와 같은 기질이 포함된다. 이 경우 단백질 합성 반응기는 투석방식 또는 투석여과 방식 또는 반유가식으로 운전된다. 또한, 단백질 합성 반응기로 공급되는 공급액은 동일한 분리막을 통해 또는 별도의 유입구를 통해 공급된다. 이때 합성된 단백질은 단백질 합성 반응기내에 축적된 후 반응이 정지된 다음 통상의 분리, 정제 방법에 의해 분리, 정제된다.

분리막의 외면과 접촉하는 용액은 순차적으로 변화되며, 회분탱크형의 교반을 하거나 분리막에 대한 접선 방향의 흐름을 수반한 교반을 수행한다. 단백질 합성 반응기는 내주 교반장치 또는 외부교반장치에 의해 교반된다.

에너지원 재생수단을 별도로 이용하는 경우 탄수화물, 유기산, 알데히드, 알콜과 같은 고에너지 물질 및 필요한 효소와 함께 미토콘드리아를 사용하거나, 크로마토포어나 클로로클라스트와 같은 광합성조직을 광에너지와 함께 사용할 수 있다. 또한 에너지원 재생수단은 적절한 크기의 세공과 이온특성을 갖는 막(membrane)을 갖출 수 있다. 에너지원 재생수단에 사용하는 광합성조직으로는 식물 또는 미생물에서 분리한 것을 사용한다.

상기 단백질 합성 반응기에서 원하는 단백질을 제조한 후, 생산된 단백질의 선택적인 분리를 위해 이용되는 단백질 분리수단은 원하는 단백질에 대한 항체가 고정화되어 있는 입자를 충전하거나 기타 특이적 흡착을 할 수 있는 물질이 고정화되어 있는 입자를 충전하고 있으며 적절한 크기의 세공을 갖는 막을 장착하고 있을 수 있으며, 통상 컬럼의 태로 되어 있다.

분리수단과 에너지재생수단이 모두 이용되는 경우에는, 원하는 단백질에 대한 흡착특이성이 높은 분리수단에 의해 생산된 단백질이 선택적으로 흡착되고 잔여성분들은 상기 에너지 재생수단을 거쳐 단백질 합성 반응기로 재순환된다.

제1도에 도시된 블럭도에 따르면, 단백질 분리수단이 시스템에 포함되어 있는 경우에는 반응기의 생성물이 두 개의 컬럼으로 이루어진 단백질 분리수단으로 보내진다. 이들 두 흡착컬럼들은 전체 시스템의 연속적인 운전을 위해서 교대로 사용될 수 있다. 또한 에너지재생수단이 더 포함되어 있는 경우에는 단백질 분리수단으로부터의 용출액은 이 에너지재생수단을 통과하여 다시 단백질 합성 반응기로 순환된다. 이와같이 제1도에 도시된 시스템을 구성하는 각 수단들은 모두 다 사용될 수도 있고 일부만 사용될 수도 있으며 연결된 순서와 배관을 달리하여 사용될 수도 있다

단백질 합성 반응기에서 생산되는 단백질의 확인은, 전기영동을 실시한 후 생산된 단백질의 양이 적은 경우에는 오토라디오그래피 방법에 의하여 수행하고 (기질로서 루이신의 탄소원자를 C₁₄로 표지하고 합성된 단백질에 도입된 루이신 -C₁₄을 확인). 단백질의 양이 많은 경우에는 쿠마씨 블루 염색법(Coomassie blue staining)에 의하여 수행하였으며, 정량분석은 통상의 분석방법인 라우리(Lowry)방법에 의하여 실시했다.

본 발명은 이하 실시예와 첨부된 도면에 의해 보다 상세히 설명된다.

실시예 1 : 세포추출물의 제조

LB배지에 대장균을 접종하여 하룻밤 동안 배양한 종배양액을 초산칼륨 75mM, 이스트 추출물 10g/l, 포도당 50g/l, 및 비타민 0.5g/l가 포함된 배지가 들어 있는 51의 발효조에 넣어 30℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 적절한 시점에서 세포를 회수한 다음 프렌치 프레스, 초음파기 또는 그밖의 통상의 방법을 이용하여 세포를 분쇄하였다. 이것을 4℃, 30,000g에서 5분간 원심분리하여 그 상등액을 트리스완충용액(pH7.6)에 대해 투석을 실시했다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 유기물질을 최종농도가 5%가 되도록, 투석된 세포추출물에 첨가한 다음 다시 그 상등액을 한외여과막을 이용한 압력여과법에 의해 농축하여 단백질 합성에 사용되는 세포추출물을 얻었다.

실시예 2 : 연속반응에 의한 단백질 제조

상기 실시예 1에서 얻은 세포추출물 0.25ml(라우리방법에 의해 측정된 단백질의 총량이 세포 추출물 용액 1ml당 30㎎ 포함되어 있는 세포추출물 용액), ATP 2.6mM, GTP 0.8mM, 통상적인 20종의 L-형 아미노산 혼합물 1mM(각각의 아미노산에 대한 농도임), 초산칼륨 210mM, 초산암모늄 80mM, 초산마그네슘 16mM, cAMP 0.67mM, 디티오스레이톨 2mM, 포스포이놀파이류베이트 24mM, PEP 카이나아제 12㎍/㎖, 폴리에틸렌글리콜 2%, 알루미나 30㎎/㎖, mRNA 50mM 트리스아세테이트 완충용액 (pH 7.6) 및 통상의 단백질 합성에 필요한 물질을 분리막형 단백질 합성 반응기에 넣고 반응액을 1VVH의 속도로 공급하여 연속공정을 실시했다. 단백질 합성 반응기의 pH는 7.6에서, 온도는 37℃로 유지하고 서서히 교반하였다. 생산되는 단백질을 연속적으로 회수하여 전기영동 후 오토라디오그래피 및 쿠마씨 블루 염색법에 의해 단백질을 확인하고 라우리 방법에 따라 그 양을 측정했다. 그 결과가 제2도에 나타나 있다. 제2도의 그래프에서 x-축은 연소공정의 운전시간을 나타내며, y-축은 반응기 용적 1ml 당의 단백질의 총생산량을 나타낸다. 제2도의 그래프에 나타나 있는 바와 같이 120시간 이상 연속공정의 운전이 이루어졌으며, 이때의 단백질의 평균생산성은 1.2㎎/㎖,/h이었다.

실시예 3 : 반연속반응의 경우 단백질 생산량 측정

반연속반응공정을 이용한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재되어 있는 단백질 제조방법과 동일한 방법으로 단백질을 제조하여 그 양을 측정하였다. 그 결과가 제3도에 나타나 있으며, 제3도의 그래프로부터 50시간 이상 단백질 생산이 이루어졌으며 그 총생산량은 60㎎/㎖임을 알 수 있다.

실시예 4 : 다공성 고체물질의 첨가효과

실시예 2에 기재되어 있는 단백질 제조방법과 동일한 방법을 이용하여 다공성 고체물질의 하나로서 알루미나의 첨가량을 달리함으로써 그 효과를 시험하였다. 감마 알루미나를 30㎎/㎖의 농도로 첨가한 경우에 단백질의 생산이 최대임을 하기 표 1을 통해 알 수 있다. 또한 이 경우 반응기의 운전시간도 120시간 이상으로 증가되었다.

이로부터 다공성 고체물질이 단백질 합성 반응 자체를 촉진시키며 분리막의 막힘현상을 방지하는데 매우 효과적인 것으로 추정된다.

실시예 5 : 폴리엔틸렌 글리콜의 첨가 효과

세포추출물을 제조하는 단계에서 농축과정 전에 폴리에틸렌글리콜을 2%의 농도로 첨가한 후 원심분리를 통해 침전물이 제거된 세포추출물을 사용하여 실시예2에 기재되어 있는 단백질 제조방법과 동일한 방법으로 단백질을 제조하여 그 양을 측정했다. 그 결과가 표 2에 나타나 있다.

상기 표 2로부터 폴리에틸렌글리콜을 첨가한 경우 단백질 생산성이 크게 증가되는 것을 알 수 있다.

실시예 6 : 에너지원의 재생

광합성 미생물로서, ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 분양받은 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum) (ATCC 11170)을 파쇄한 후 분리한 크로마토포어를 사용하여 에너지물질인 ATP를 ADP로부터 재생하였다. 그 결과는 표 3에 기재되어 있다.

실시예 7 : 원하는 단백질의 선택적인 분리

원하는 단백질의 선택적 분리를 위하여 이 단백질에 대한 항체(모노클로날 또는 폴리클로날 항체)를 통상의 방법으로 고체입자에 화학적으로 고정화 시켜 고정층으로서 사용하여 두 개의 컬럼을 준비했다. 한 개의 컬럼에 대해 브레이크쓰루(Breakthrough: 용액을 컬럼에 통과시키는 경우 컬럼의 용량에 해당하는 양의 단백질이 흡착될 때까지는 컬럼의 출구로부터 용출된 용액에서 해당 단백질을 검출할 수 없으며, 그때까지 소요된 시간을 브레이트쓰루 시간이라 한다)에 도달하면, 다른 컬럼에 용액을 유입시켜 흡착을 시작하여 그동안 먼저 흡착시킨 컬럼에서 흡착단백질을 용출시키고 컬럼을 재생시켰다. 이와 같이 두 개의 컬럼을 번갈아 사용함으로써 시스템 전체의 연속성을 유지시킬 수 있었다. 분리컬럼의 운전데이타는 표 4에 나타나 있다.

본 발명의 범위는 상기 실시예로 한정되지 아니하며, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 그 변형예가 당업자들에게 가능함은 물론이다.

무세포시스템에서 단백질을 제조하는 본 발명의 방법에 따르면, 번역후 변형과정이 없기 때문에 생물세포(in vivo) 시스템에서 나타나는 바람직하지 아니한 변형체 또는 숙주세포에 독성효과를 나타내는 단백질로 인한 문제를 피할 수 있어서, 인슐린이나 성장호르몬, 알파-인터페론 및 여러 가지 백신 등의 단백질 제제가 효율적으로 생산될 수 있다. 또한 ATP와 GTP를 재생하여 순환시키고 다공성 고체물질을 사용하여 반응기의 운전시간을 증가시키고 원하는 단백질에 대해 흡착성이 높은 컬럼을 사용함으로써 단백질의 생산속도 뿐만 아니라 총생산량이 종래의 방법에 비해 크게 증가되어 펩타이드 체인당 아미노산의 수에 관계없이 매우 경제적으로 단백질을 제조할 수 있다.

Claims (6)

1. 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 세포를 배양한 후 분쇄하여 원하는 단백질의 생산에 필요한 조직을 포함하는 세포추출물을 제조하는 단계; 및 상기 세포추출물과 함께 유전정보원, 단백질 합성을 위한 제1에너지원으로 작용하는 ATP, GTP, 제1에너지원을 반응기 내에서 바로 (in situ) 재생시키는데 필요한 제2에너지원으로서의 고에너지 인산화합물 또는 탄수화물 또는 이들의 유도체, 기질로서 아미노산 혼합물(여기에서 아미노산은 통상적으로 사용되는 20종의 L-형아미노산을 의미함) 및 직경이 0.1 내지 1000㎛이고 비표면적이 10내지 1000㎡/g인 다공성 고체물질을 포함하는 반응배지를 분리막형 단백질 합성 반응기에 공급하여 원하는 단백질을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1에너지원의 분해산물이 미토콘드리아 또는 광합성조직을 이용한 별도의 에너지재생수단에 의해 제1에너지원을 재생된 다음 상기 단백질 합성 반응기로 순환되는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 분리막이 상기 단백질 합성 반응기의 출구에 설치되며, 그 외면에 접촉하고 있는 용액을 교환해 가면서 투석운전하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 다공성 고체물질이 다공성 키토산, 다공성 셀룰로오스, 다공성 젤라틴, 다공성 콜라겐 및 그들의 유도체로부터 선택되는 유기고분자물질인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 고체물질이 알루미나, 실리카, 티타니아, 지르코니아, 몰리브데나, 바나둠 옥사이드, 코발트 옥사이드, 이들의 혼합물 및 제오라이트로부터 선택되는 무기산화물인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 원하는 단백질에 대한 흡착성이 높은 물질로 충전된 컬럼을 포함하는 단백질 분리수단에 의해 원하는 단백질을 분리하는 단계를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.