JPH07298893A - 無細胞システムにおける蛋白質の製造方法 - Google Patents
無細胞システムにおける蛋白質の製造方法Info
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- JPH07298893A JPH07298893A JP6201075A JP20107594A JPH07298893A JP H07298893 A JPH07298893 A JP H07298893A JP 6201075 A JP6201075 A JP 6201075A JP 20107594 A JP20107594 A JP 20107594A JP H07298893 A JPH07298893 A JP H07298893A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 蛋白質の製造に必要な組織を細胞から抽出し
て無細胞システムで蛋白質を製造する方法を提供する。 【構成】 製造時に使われるエネルギー源を再生して循
環させて使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段を使用することにより無細胞蛋白質製造
をより経済的で効率的に遂行するための方法よりなって
いる。 【効果】 生体(in vivo )システムで現れる問題点を
解決することができ、蛋白質の生産性および反応器の運
転時間の増加による全体生産量が従来方法に比して大い
に増加される。
て無細胞システムで蛋白質を製造する方法を提供する。 【構成】 製造時に使われるエネルギー源を再生して循
環させて使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段を使用することにより無細胞蛋白質製造
をより経済的で効率的に遂行するための方法よりなって
いる。 【効果】 生体(in vivo )システムで現れる問題点を
解決することができ、蛋白質の生産性および反応器の運
転時間の増加による全体生産量が従来方法に比して大い
に増加される。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、無細胞システム(cell
-free system)で蛋白質を製造する方法に係り、特に医
薬品、食品、農薬、環境製品、産業化学製品、日用品な
どに関連した産業分野で用いられる蛋白質を無細胞シス
テムで製造する方法に関するものである。
-free system)で蛋白質を製造する方法に係り、特に医
薬品、食品、農薬、環境製品、産業化学製品、日用品な
どに関連した産業分野で用いられる蛋白質を無細胞シス
テムで製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】一般的に蛋白質を製造するために用いら
れる方法には大きく化学的な方法と生物学的な方法があ
るが、1ペプチド鎖当たりのアミノ酸の数が少ない場合
には化学的な方法が主に用いられ、特に1ペプチド鎖当
たりのアミノ酸の数が10個未満である場合には化学的
な合成方法を用いることが生物学的な方法に比して経済
的であると知られていた。
れる方法には大きく化学的な方法と生物学的な方法があ
るが、1ペプチド鎖当たりのアミノ酸の数が少ない場合
には化学的な方法が主に用いられ、特に1ペプチド鎖当
たりのアミノ酸の数が10個未満である場合には化学的
な合成方法を用いることが生物学的な方法に比して経済
的であると知られていた。
【0003】一方、蛋白質を生物学的に生産する場合、
従来には主に遺伝学的に操作された生物細胞を利用する
生体(in vivo )システムであった。この場合、目的と
する蛋白質の分泌特性によって主に次のような二種の方
法を用いた。即ち、細胞内の蛋白質の場合には細胞を培
養して目的とする蛋白質が細胞内部に蓄積されたのち適
切な時点で細胞を破壊して蛋白質を分離、精製する方法
を利用し、細胞外部に分泌される分泌蛋白質の場合には
細胞を培養して適切な時点でその培養液を分離してこれ
から蛋白質を分離、精製する方法を用いていた。
従来には主に遺伝学的に操作された生物細胞を利用する
生体(in vivo )システムであった。この場合、目的と
する蛋白質の分泌特性によって主に次のような二種の方
法を用いた。即ち、細胞内の蛋白質の場合には細胞を培
養して目的とする蛋白質が細胞内部に蓄積されたのち適
切な時点で細胞を破壊して蛋白質を分離、精製する方法
を利用し、細胞外部に分泌される分泌蛋白質の場合には
細胞を培養して適切な時点でその培養液を分離してこれ
から蛋白質を分離、精製する方法を用いていた。
【0004】生物細胞に基づくこのような方法は生物細
胞による蛋白質の過剰生産と蛋白質の分離精製過程で次
のような色々な問題点を持っていた。
胞による蛋白質の過剰生産と蛋白質の分離精製過程で次
のような色々な問題点を持っていた。
【0005】すなわち、細胞が成長するにつれ生産され
る蛋白質分解酵素等によって蛋白質が分解または変性さ
れたり、蛋白質が合成された後にも翻訳後過程(Post t
ranslation process)による脱アミノ反応、酸化反応な
どにより目的とする蛋白質が望ましくなく変形される場
合が頻繁であった。非天然型アミノ酸や変形されたアミ
ノ酸を蛋白質に導入することも不可能であったり極めて
難しかった。また、細胞に毒性効果を及ぼす蛋白質は細
胞の成長を妨げ、目的とする蛋白質をエンコードする遺
伝子の発現が生産される蛋白質の濃度によって調節され
て一定な濃度以上に蛋白質を生産することが困難であっ
た。人為的な突然変異を通じて目的とする蛋白質を過剰
生産し得る細胞を用いるとしても生体が持っている特性
のために蛋白質の生産に限界があった。即ち、細胞内部
に蓄積されたり細胞外部へ分泌される蛋白質の濃度が細
胞の生存性に影響を及ぼす場合が一般的であり、蛋白質
の過剰生産条件と細胞の成長条件を調和させることがと
ても難しく目的とする蛋白質の過剰生産は極めて難しい
ものであった。
る蛋白質分解酵素等によって蛋白質が分解または変性さ
れたり、蛋白質が合成された後にも翻訳後過程(Post t
ranslation process)による脱アミノ反応、酸化反応な
どにより目的とする蛋白質が望ましくなく変形される場
合が頻繁であった。非天然型アミノ酸や変形されたアミ
ノ酸を蛋白質に導入することも不可能であったり極めて
難しかった。また、細胞に毒性効果を及ぼす蛋白質は細
胞の成長を妨げ、目的とする蛋白質をエンコードする遺
伝子の発現が生産される蛋白質の濃度によって調節され
て一定な濃度以上に蛋白質を生産することが困難であっ
た。人為的な突然変異を通じて目的とする蛋白質を過剰
生産し得る細胞を用いるとしても生体が持っている特性
のために蛋白質の生産に限界があった。即ち、細胞内部
に蓄積されたり細胞外部へ分泌される蛋白質の濃度が細
胞の生存性に影響を及ぼす場合が一般的であり、蛋白質
の過剰生産条件と細胞の成長条件を調和させることがと
ても難しく目的とする蛋白質の過剰生産は極めて難しい
ものであった。
【0006】さらに、分離、精製過程では大部分の蛋白
質が不溶性であるまたは不安定で細胞自体の蛋白質分解
酵素によって分解されることにより封入体に蓄積され分
離過程で損なわれる比率が高く、膜蛋白質の場合には分
離がさらに難しかった。また、医薬品や食品などに用い
られる蛋白質の場合には感染性因子やエンドトキシン
(endotoxins) が混入されることを防止するために分
離、精製過程で徹底的な管理が要求された。そのゆえ、
目的とする蛋白質の分離、精製効率が低く蛋白質生産の
収率、比生産速度および生産量が極めて低調であり、蛋
白質製品の価格が非常に高価なものとなった。
質が不溶性であるまたは不安定で細胞自体の蛋白質分解
酵素によって分解されることにより封入体に蓄積され分
離過程で損なわれる比率が高く、膜蛋白質の場合には分
離がさらに難しかった。また、医薬品や食品などに用い
られる蛋白質の場合には感染性因子やエンドトキシン
(endotoxins) が混入されることを防止するために分
離、精製過程で徹底的な管理が要求された。そのゆえ、
目的とする蛋白質の分離、精製効率が低く蛋白質生産の
収率、比生産速度および生産量が極めて低調であり、蛋
白質製品の価格が非常に高価なものとなった。
【0007】かかる問題点を解決するために生物細胞を
その自体に基づかず、つまり無細胞システムにおいて、
即ち細胞から抽出した細胞抽出システムに基づく生体外
(invitro)システムにおいて蛋白質を製造する方法が導
入された。
その自体に基づかず、つまり無細胞システムにおいて、
即ち細胞から抽出した細胞抽出システムに基づく生体外
(invitro)システムにおいて蛋白質を製造する方法が導
入された。
【0008】しかしながら、従来の回分式の無細胞シス
テムにおける蛋白質の生産方法は、mRNAの要求量が
大きく、反応器の運転時間が1時間以内と短く、細胞抽
出物の基本活性が極めて低く、さらに、核酸分解酵素や
蛋白質分解酵素などによる悪影響が大きくてエネルギー
源自体またはそれによって生産された生成物または副産
物による阻害を防止することが難しいという数多くの問
題を有していた。その上、蛋白質の生産性がとても低か
った。
テムにおける蛋白質の生産方法は、mRNAの要求量が
大きく、反応器の運転時間が1時間以内と短く、細胞抽
出物の基本活性が極めて低く、さらに、核酸分解酵素や
蛋白質分解酵素などによる悪影響が大きくてエネルギー
源自体またはそれによって生産された生成物または副産
物による阻害を防止することが難しいという数多くの問
題を有していた。その上、蛋白質の生産性がとても低か
った。
【0009】上記問題を考慮して、近年、連続工程によ
って無細胞システムで蛋白質を生産する方法がアレキサ
ンダー スピリーンらによって提案された。この方法に
より蛋白質生産が20時間以上行うことが可能になり蛋
白質の生産速度も回分式に比して大きく増加されたが、
それでも生産量は5ピコモル/ピコモルmRNAに過ぎ
なかった(アレキサンダー エス スピリーン(Alexand
er S. Spirin) ら、アコンティニュアス セル−フリー
トランスレーション システム ケーパブル オブ
ポリペプチド イン ハイ イールド(A contiuous cel
l-free translatoin system capable of polypeptides
in high yield)、サイエンス(Science) 、242巻(1
988年)、1162〜1164)。続けて、彼らは研
究を重ね転写−翻訳をカップリングさせた無細胞システ
ムで連続工程によって蛋白質を4μg/ml/時間の生
産性で生産してこれを電気泳働後、オートラジオグラフ
ィー法によって確認した(アレキサンダー エス スピ
リーン(Alexander S. Spirin) ら、ジーン エックスプ
レッション イン ア セル−フリー システムオン
ザ プレパラティブ スケール(Gene expression in a
cell-free system on the preparative scale)、ジーン
(Gene)、84巻(1989年)、463〜466)。
って無細胞システムで蛋白質を生産する方法がアレキサ
ンダー スピリーンらによって提案された。この方法に
より蛋白質生産が20時間以上行うことが可能になり蛋
白質の生産速度も回分式に比して大きく増加されたが、
それでも生産量は5ピコモル/ピコモルmRNAに過ぎ
なかった(アレキサンダー エス スピリーン(Alexand
er S. Spirin) ら、アコンティニュアス セル−フリー
トランスレーション システム ケーパブル オブ
ポリペプチド イン ハイ イールド(A contiuous cel
l-free translatoin system capable of polypeptides
in high yield)、サイエンス(Science) 、242巻(1
988年)、1162〜1164)。続けて、彼らは研
究を重ね転写−翻訳をカップリングさせた無細胞システ
ムで連続工程によって蛋白質を4μg/ml/時間の生
産性で生産してこれを電気泳働後、オートラジオグラフ
ィー法によって確認した(アレキサンダー エス スピ
リーン(Alexander S. Spirin) ら、ジーン エックスプ
レッション イン ア セル−フリー システムオン
ザ プレパラティブ スケール(Gene expression in a
cell-free system on the preparative scale)、ジーン
(Gene)、84巻(1989年)、463〜466)。
【0010】アレキサンダー スピリーンらは連続工程
によって主に反応器の運転時間を増加させることにより
蛋白質の総生産量を増加させる方向に研究を進行した
が、反応器内の反応物質の濃度が増加するにつれ効率的
な混合が阻害され、また、反応液の流れが反応器の出口
に設けられた分離膜(membrane)に対して垂直方向にの
みなるようにしたので詰まり(plugging) 現象が発生す
る等の問題が生じ最大運転時間が100時間を越えなか
った。
によって主に反応器の運転時間を増加させることにより
蛋白質の総生産量を増加させる方向に研究を進行した
が、反応器内の反応物質の濃度が増加するにつれ効率的
な混合が阻害され、また、反応液の流れが反応器の出口
に設けられた分離膜(membrane)に対して垂直方向にの
みなるようにしたので詰まり(plugging) 現象が発生す
る等の問題が生じ最大運転時間が100時間を越えなか
った。
【0011】次に、ナカノヒデオらは、限外濾過膜を用
いて濃縮させた小麦胚芽抽出物を使用することにより既
存の方法に比して蛋白質の生産速度を増加させる単純フ
ェドバッチ(simple fed-batch)方法を提案した(ヒデ
オ ナカノ(Hideo Nakano)ら、バイオサイ バイオテク
バイオケム(Biosci. Biotech. Biochem.) 、58
(4)、631〜634、1994年)。この方法によ
ると、蛋白質生産速度はスピリーンらの方法に比して5
倍位向上し約30μg/ml/時間に達したが、運転時
間は6時間位に過ぎなく蛋白質の総生産量もスピリーン
らの連続システムに比して落ちた。
いて濃縮させた小麦胚芽抽出物を使用することにより既
存の方法に比して蛋白質の生産速度を増加させる単純フ
ェドバッチ(simple fed-batch)方法を提案した(ヒデ
オ ナカノ(Hideo Nakano)ら、バイオサイ バイオテク
バイオケム(Biosci. Biotech. Biochem.) 、58
(4)、631〜634、1994年)。この方法によ
ると、蛋白質生産速度はスピリーンらの方法に比して5
倍位向上し約30μg/ml/時間に達したが、運転時
間は6時間位に過ぎなく蛋白質の総生産量もスピリーン
らの連続システムに比して落ちた。
【0012】このように従来の方法による蛋白質の生産
性や総生産量はすべて産業化には達しない水準であっ
た。そのため、蛋白質の生産速度もさらに増加させ全運
転時間を延長させることにより蛋白質の全生産量を増や
し、高いエネルギー源を再生して使用することにより費
用を節減させる必要性が切実に要求された。
性や総生産量はすべて産業化には達しない水準であっ
た。そのため、蛋白質の生産速度もさらに増加させ全運
転時間を延長させることにより蛋白質の全生産量を増や
し、高いエネルギー源を再生して使用することにより費
用を節減させる必要性が切実に要求された。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、蛋白質の生産性と生産量との両方を改善した無
細胞システムにおける蛋白質の製造方法を提供すること
である。
目的は、蛋白質の生産性と生産量との両方を改善した無
細胞システムにおける蛋白質の製造方法を提供すること
である。
【0014】本発明の他の目的は、無細胞システムで蛋
白質を製造する方法において、エネルギー源として使用
されるATPおよびGTPのようなヌクレオチドを別途
のエネルギー再生手段によって再生させて蛋白質合成反
応器内へ循環させて再使用することにより無細胞蛋白質
製造をより経済的に遂行するための方法を提供すること
である。
白質を製造する方法において、エネルギー源として使用
されるATPおよびGTPのようなヌクレオチドを別途
のエネルギー再生手段によって再生させて蛋白質合成反
応器内へ循環させて再使用することにより無細胞蛋白質
製造をより経済的に遂行するための方法を提供すること
である。
【0015】本発明のさらなる他の目的は、無細胞シス
テムで蛋白質を製造する方法において、目的とする蛋白
質に対する吸着特異性が高い分離手段を使用して生産さ
れた蛋白質を吸着させることにより蛋白質の回収率と転
換率を増加させて目的とする蛋白質を効果的に得るため
の方法を提供することである。
テムで蛋白質を製造する方法において、目的とする蛋白
質に対する吸着特異性が高い分離手段を使用して生産さ
れた蛋白質を吸着させることにより蛋白質の回収率と転
換率を増加させて目的とする蛋白質を効果的に得るため
の方法を提供することである。
【0016】
【課題を解決するための手段】上記諸目的は、無細胞シ
ステムにおける蛋白質の製造方法において、細胞を培養
した後粉砕して目的とする蛋白質の生産に必要な組織を
含む細胞抽出物を製造する段階、および前記細胞抽出物
と共に遺伝情報源、蛋白質合成のための第1エネルギー
源として作用するATP及びGTP、第1エネルギー源
の反応器内で原位置に(in situ )再生させるために必
要な第2エネルギー源としての高エネルギー燐酸化合物
または炭水化物またはこれらの誘導体、基質としてのア
ミノ酸および多孔性固体物質を含む反応培地(reaction
medium )を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的
とする蛋白質を製造する段階からなることを特徴とする
無細胞システムにおける蛋白質の製造方法によって達成
される。
ステムにおける蛋白質の製造方法において、細胞を培養
した後粉砕して目的とする蛋白質の生産に必要な組織を
含む細胞抽出物を製造する段階、および前記細胞抽出物
と共に遺伝情報源、蛋白質合成のための第1エネルギー
源として作用するATP及びGTP、第1エネルギー源
の反応器内で原位置に(in situ )再生させるために必
要な第2エネルギー源としての高エネルギー燐酸化合物
または炭水化物またはこれらの誘導体、基質としてのア
ミノ酸および多孔性固体物質を含む反応培地(reaction
medium )を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的
とする蛋白質を製造する段階からなることを特徴とする
無細胞システムにおける蛋白質の製造方法によって達成
される。
【0017】本発明は、前記第1エネルギー源の分解産
物がミトコンドリアまたは光合成組織を用いた別途のエ
ネルギー再生手段によって第1エネルギー源として再生
された後、前記蛋白質合成反応器に循環される段階をさ
らに含むことを特徴とする方法を示すものである。本発
明はまた、前記分離膜が前記蛋白質合成反応器の出口に
設けられ、その外面に接している溶液を交換しながら透
析運転することを特徴とする方法を示すものである。本
発明はまた、前記多孔性固体物質が0.1〜1000μ
mの直径、10〜1000m2 /gの表面積を有してお
り、その外形が多様であることを特徴とする方法を示す
ものである。本発明はさらに、前記多孔性固体物質が多
孔性キトサン(chitosan) 、多孔性セルロース (cell
ulose )、多孔性ゼラチン(gelatine)、多孔性コラー
ゲン(collagen)およびそれらの誘導体を含む高分子物
質またはアルミナ(alumina )、シリカ(silica) 、チ
タニア(titania) 、ジルコニア(zirconia)、モリブデナ
(molybdena)、バナジウムオキサイド(vanadium oxide
)、コバルトオキサイド(cobalt oxide) 、これらの
混合物および様々な形態のゼオライト(zeolites)を含む
無機酸化物であることを特徴とする方法を示すものであ
る。本発明はさらに、目的とする蛋白質に対する吸着性
が高い物質で充填されたカラムを有する蛋白質分離手段
によって目的とする蛋白質を分離する段階をさらに含ん
でいることを特徴とする方法を示すものである。
物がミトコンドリアまたは光合成組織を用いた別途のエ
ネルギー再生手段によって第1エネルギー源として再生
された後、前記蛋白質合成反応器に循環される段階をさ
らに含むことを特徴とする方法を示すものである。本発
明はまた、前記分離膜が前記蛋白質合成反応器の出口に
設けられ、その外面に接している溶液を交換しながら透
析運転することを特徴とする方法を示すものである。本
発明はまた、前記多孔性固体物質が0.1〜1000μ
mの直径、10〜1000m2 /gの表面積を有してお
り、その外形が多様であることを特徴とする方法を示す
ものである。本発明はさらに、前記多孔性固体物質が多
孔性キトサン(chitosan) 、多孔性セルロース (cell
ulose )、多孔性ゼラチン(gelatine)、多孔性コラー
ゲン(collagen)およびそれらの誘導体を含む高分子物
質またはアルミナ(alumina )、シリカ(silica) 、チ
タニア(titania) 、ジルコニア(zirconia)、モリブデナ
(molybdena)、バナジウムオキサイド(vanadium oxide
)、コバルトオキサイド(cobalt oxide) 、これらの
混合物および様々な形態のゼオライト(zeolites)を含む
無機酸化物であることを特徴とする方法を示すものであ
る。本発明はさらに、目的とする蛋白質に対する吸着性
が高い物質で充填されたカラムを有する蛋白質分離手段
によって目的とする蛋白質を分離する段階をさらに含ん
でいることを特徴とする方法を示すものである。
【0018】
【作用】本発明の無細胞システムにおける蛋白質の製造
方法は、細胞を培養した後粉砕して目的とする蛋白質の
生産に必要な組織を含む細胞抽出物を製造する段階、お
よび前記細胞抽出物と共に遺伝情報源、蛋白質合成のた
めの第1エネルギー源として作用するATP、GTP、
第1エネルギー源の反応器内で原位置に(in situ )再
生させるために必要な第2エネルギー源としての高エネ
ルギー燐酸化合物または炭水化物またはこれらの誘導
体、基質としてのアミノ酸および多孔性固体物質を含む
反応培地を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的と
する蛋白質を製造する段階からなることを特徴とするも
のである。
方法は、細胞を培養した後粉砕して目的とする蛋白質の
生産に必要な組織を含む細胞抽出物を製造する段階、お
よび前記細胞抽出物と共に遺伝情報源、蛋白質合成のた
めの第1エネルギー源として作用するATP、GTP、
第1エネルギー源の反応器内で原位置に(in situ )再
生させるために必要な第2エネルギー源としての高エネ
ルギー燐酸化合物または炭水化物またはこれらの誘導
体、基質としてのアミノ酸および多孔性固体物質を含む
反応培地を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的と
する蛋白質を製造する段階からなることを特徴とするも
のである。
【0019】本発明によると、無細胞システムで蛋白質
を製造する際、使われるエネルギー源を再生して循環し
て使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性が高い
分離手段を使用することにより無細胞蛋白質の製造をよ
り経済的で効率的に遂行することができ、蛋白質の生産
性及び反応器の運転時間の増加による全体生産量も非常
に増加されるものである。
を製造する際、使われるエネルギー源を再生して循環し
て使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性が高い
分離手段を使用することにより無細胞蛋白質の製造をよ
り経済的で効率的に遂行することができ、蛋白質の生産
性及び反応器の運転時間の増加による全体生産量も非常
に増加されるものである。
【0020】以下、添付した図面に基づき本発明を詳細
に説明する。
に説明する。
【0021】本発明の一実施態様によると、本発明にお
いて用いられる細胞抽出物は、蛋白質合成の活性が最も
良い状態の細胞(大腸菌、枯草菌などのような各種微生
物細胞、小麦胚芽、米胚芽、麦胚芽などの食物細胞、C
HO(Chinese Hamster Ovary)細胞、ハイブリドーマ
(hybridoma)細胞、網状赤血球(reticulocyte)等のよう
な動物細胞)を用いて細胞培養をした後、細胞を粉砕し
て蛋白質合成に妨害となる成分を取り除き、蛋白質合成
に必須な成分を高濃度、高収率で分離、精製することに
より製造される。この際、限外濾過膜を用いた圧縮濾過
方法は、細胞抽出物を濃縮させることにより蛋白質比生
産速度を高めることができるため、好ましい。また、濃
縮段階前にポリエチレングリコールを添加して沈殿物を
取り除くことにより蛋白質比生産速度が大きく増加され
得るので好ましい。
いて用いられる細胞抽出物は、蛋白質合成の活性が最も
良い状態の細胞(大腸菌、枯草菌などのような各種微生
物細胞、小麦胚芽、米胚芽、麦胚芽などの食物細胞、C
HO(Chinese Hamster Ovary)細胞、ハイブリドーマ
(hybridoma)細胞、網状赤血球(reticulocyte)等のよう
な動物細胞)を用いて細胞培養をした後、細胞を粉砕し
て蛋白質合成に妨害となる成分を取り除き、蛋白質合成
に必須な成分を高濃度、高収率で分離、精製することに
より製造される。この際、限外濾過膜を用いた圧縮濾過
方法は、細胞抽出物を濃縮させることにより蛋白質比生
産速度を高めることができるため、好ましい。また、濃
縮段階前にポリエチレングリコールを添加して沈殿物を
取り除くことにより蛋白質比生産速度が大きく増加され
得るので好ましい。
【0022】また、本発明において使用される細胞抽出
物は、蛋白質分解酵素や核酸分解酵素が生産できないよ
うに予め遺伝学的に操作した細胞から抽出されるもので
もよい。
物は、蛋白質分解酵素や核酸分解酵素が生産できないよ
うに予め遺伝学的に操作した細胞から抽出されるもので
もよい。
【0023】また、蛋白質合成に必要な機具としてtR
NAは前記細胞抽出物に含まれているものをそのまま使
用することもでき、別途に準備したものを添加すること
もできる。
NAは前記細胞抽出物に含まれているものをそのまま使
用することもでき、別途に準備したものを添加すること
もできる。
【0024】本発明における細胞抽出物の反応培地への
添加濃度は、細胞抽出物溶液自体の濃度が1/100希
釈液の280nmの波長における吸光度が0.5〜5の
範囲に調節されたものである際には、5〜40容量%、
好ましくは10〜25容量%である。
添加濃度は、細胞抽出物溶液自体の濃度が1/100希
釈液の280nmの波長における吸光度が0.5〜5の
範囲に調節されたものである際には、5〜40容量%、
好ましくは10〜25容量%である。
【0025】本発明において使用する遺伝情報源として
は、特定蛋白質に対するDNAおよび/またはmRN
A、mRNA単量体(monomer) を反応システムに添加し
て、DNA−mRNA転写、mRNA複製、mRNA翻
訳等が単独にまたは組合せて遂行されるようにする。し
たがって、反応システムの運転を転写−翻訳連結システ
ム、RNA複製−翻訳連結システム、転写−RNA複製
−翻訳連結システムまたは翻訳非連結システムなどにす
ることができる。即ち、反応システムの運転を翻訳非連
結システムとする場合には特定蛋白質に対するmRNA
のみを蛋白質合成反応器に入れることで充分であり、転
写−RNA複製−翻訳連結システムとする場合には特定
蛋白質に対するDNAおよびmRNA、RNA単量体
(ATP、GTP、CTP、UTP)とRNAポリメラ
ーゼのような必要な酵素を前記蛋白質合成反応器に入れ
る。核酸分解酵素の活性を阻害するためには、通常の方
法でmRNAの3′末端に特定配列を有するオリゴデオ
キシヌクレオチド(oilgo deoxynucleotide) を物理的に
または化学的に結合したりmRNAの燐酸基に結合され
ている酸素の一部を硫黄原子で置換させたものを使用す
ることがてきる。
は、特定蛋白質に対するDNAおよび/またはmRN
A、mRNA単量体(monomer) を反応システムに添加し
て、DNA−mRNA転写、mRNA複製、mRNA翻
訳等が単独にまたは組合せて遂行されるようにする。し
たがって、反応システムの運転を転写−翻訳連結システ
ム、RNA複製−翻訳連結システム、転写−RNA複製
−翻訳連結システムまたは翻訳非連結システムなどにす
ることができる。即ち、反応システムの運転を翻訳非連
結システムとする場合には特定蛋白質に対するmRNA
のみを蛋白質合成反応器に入れることで充分であり、転
写−RNA複製−翻訳連結システムとする場合には特定
蛋白質に対するDNAおよびmRNA、RNA単量体
(ATP、GTP、CTP、UTP)とRNAポリメラ
ーゼのような必要な酵素を前記蛋白質合成反応器に入れ
る。核酸分解酵素の活性を阻害するためには、通常の方
法でmRNAの3′末端に特定配列を有するオリゴデオ
キシヌクレオチド(oilgo deoxynucleotide) を物理的に
または化学的に結合したりmRNAの燐酸基に結合され
ている酸素の一部を硫黄原子で置換させたものを使用す
ることがてきる。
【0026】本発明における遺伝情報源は、反応培地に
おける遺伝情報源の濃度が、遺伝情報源がDNAの場合
には、1ピコモル〜100ナノモル、好ましくは1〜2
0ナノモルとなり、mRNAの場合には、1ナノモル〜
100マイクロモル、好ましくは0.1〜10マイクロ
モルになるように、蛋白質合成反応器に添加される。
おける遺伝情報源の濃度が、遺伝情報源がDNAの場合
には、1ピコモル〜100ナノモル、好ましくは1〜2
0ナノモルとなり、mRNAの場合には、1ナノモル〜
100マイクロモル、好ましくは0.1〜10マイクロ
モルになるように、蛋白質合成反応器に添加される。
【0027】本発明において用いられる第1エネルギー
源としては、ATPとGTPを使用し、使用したATP
とGTPが分解されて生成したADPとGDPからAT
PとGTPを反応器内で原位置に再生産するための第2
エネルギー源としては高エネルギー燐酸化合物や炭水化
物またはこれらの誘導体を使用する。この際、第2エネ
ルギー源によって定められる特定キナーゼまたはスクシ
ニル補酵素A合成酵素またはスクシニルチオキナーゼ(s
uccinylthiokinase)が共に使用される。高エネルギー燐
酸化合物の例にはホスホエノールピルビン酸(phosphoe
nolpyruvate )、ホスホクレアチン(phosphocreatine
)、アセチル燐酸塩(acetylphosphate)およびポリ燐
酸塩(polyphosphate) 等がある。アルファ−ケトグルタ
ル酸塩(α-keto glutarate )のような炭水化物がAT
P、GTP再生のためのエネルギー源として使用される
時発生されたNADHがピルビン酸塩(pyruvate) から
乳酸塩(lactate )を生産したりその他の有用な用途に
用いられることもできる。
源としては、ATPとGTPを使用し、使用したATP
とGTPが分解されて生成したADPとGDPからAT
PとGTPを反応器内で原位置に再生産するための第2
エネルギー源としては高エネルギー燐酸化合物や炭水化
物またはこれらの誘導体を使用する。この際、第2エネ
ルギー源によって定められる特定キナーゼまたはスクシ
ニル補酵素A合成酵素またはスクシニルチオキナーゼ(s
uccinylthiokinase)が共に使用される。高エネルギー燐
酸化合物の例にはホスホエノールピルビン酸(phosphoe
nolpyruvate )、ホスホクレアチン(phosphocreatine
)、アセチル燐酸塩(acetylphosphate)およびポリ燐
酸塩(polyphosphate) 等がある。アルファ−ケトグルタ
ル酸塩(α-keto glutarate )のような炭水化物がAT
P、GTP再生のためのエネルギー源として使用される
時発生されたNADHがピルビン酸塩(pyruvate) から
乳酸塩(lactate )を生産したりその他の有用な用途に
用いられることもできる。
【0028】本発明における第1エネルギー源は、反応
培地における第1エネルギー源の濃度が、第1エネルギ
ー源がATPの場合には、0.2〜4ミリモル、好まし
くは0.5〜3ミリモルとなり、GTPの場合には、1
マイクロモル〜1.5ミリモル、好ましくは0.5〜1
ミリモルになるように、蛋白質合成反応器に添加され
る。
培地における第1エネルギー源の濃度が、第1エネルギ
ー源がATPの場合には、0.2〜4ミリモル、好まし
くは0.5〜3ミリモルとなり、GTPの場合には、1
マイクロモル〜1.5ミリモル、好ましくは0.5〜1
ミリモルになるように、蛋白質合成反応器に添加され
る。
【0029】本発明における第2エネルギー源は、反応
培地における第2エネルギー源の濃度が1〜80ミリモ
ル、好ましくは5〜30ミリモルになるように、蛋白質
合成反応器に添加される。
培地における第2エネルギー源の濃度が1〜80ミリモ
ル、好ましくは5〜30ミリモルになるように、蛋白質
合成反応器に添加される。
【0030】本発明において使用される多孔性固体物質
は、表面積が多様で気孔の大きさと構造も多様で、ま
た、物理化学的な性質および表面の酸度−塩基度も多様
であるが、望ましくは0.1〜1000μmの直径、1
0〜1000m2 /gの表面積を有しており、外形が粒
子、平板、巻物、蜂の巣状などである多孔性固体物質が
使用される。このような多孔性固体物質の例としては高
分子物質と無機酸化物がある。高分子物質としては、多
孔性キトサン、多孔性セルロース、多孔性ゼラチン、多
孔性コラーゲンおよびその誘導体または多孔性金属化合
物などが使用され、無機酸化物としては、アルミナ、シ
リカ、チタニア、ジルコニア、モリブデナ(molybdena)
、バナジウムオキサイド(vanadium oxide)、コバルト
オキサイド(cobalt oxide)またはこれらの混合物または
様々な形態のゼオライト(zeolites)等が使用される。
また、色々な種類の無機化合物でドーピングされたり色
々な有機物質によって変形されたものを使用されてもよ
い。本発明の具体的な実施態様によると、多孔性固体物
質を使用することにより反応自体が改善され蛋白質の生
産速度が大いに増加され、分離膜の詰まり現象が非常に
防止されるにつれ全体の運転時間が大いに増えるにした
がって全体生産量を向上することができる。
は、表面積が多様で気孔の大きさと構造も多様で、ま
た、物理化学的な性質および表面の酸度−塩基度も多様
であるが、望ましくは0.1〜1000μmの直径、1
0〜1000m2 /gの表面積を有しており、外形が粒
子、平板、巻物、蜂の巣状などである多孔性固体物質が
使用される。このような多孔性固体物質の例としては高
分子物質と無機酸化物がある。高分子物質としては、多
孔性キトサン、多孔性セルロース、多孔性ゼラチン、多
孔性コラーゲンおよびその誘導体または多孔性金属化合
物などが使用され、無機酸化物としては、アルミナ、シ
リカ、チタニア、ジルコニア、モリブデナ(molybdena)
、バナジウムオキサイド(vanadium oxide)、コバルト
オキサイド(cobalt oxide)またはこれらの混合物または
様々な形態のゼオライト(zeolites)等が使用される。
また、色々な種類の無機化合物でドーピングされたり色
々な有機物質によって変形されたものを使用されてもよ
い。本発明の具体的な実施態様によると、多孔性固体物
質を使用することにより反応自体が改善され蛋白質の生
産速度が大いに増加され、分離膜の詰まり現象が非常に
防止されるにつれ全体の運転時間が大いに増えるにした
がって全体生産量を向上することができる。
【0031】本発明における多孔性固体物質は、反応培
地における多孔性固体物質の濃度が0.5〜20重量
%、好ましくは1〜5重量%になるように、蛋白質合成
反応器に添加される。
地における多孔性固体物質の濃度が0.5〜20重量
%、好ましくは1〜5重量%になるように、蛋白質合成
反応器に添加される。
【0032】本発明による蛋白質を製造する段階におい
て、遺伝情報源、前記第1,2エネルギー源、アミノ酸
及び多孔性固体物質以外にも塩、イオン性基が結合され
ている高分子物質、cAMP、蛋白質分解酵素阻害剤、
核酸分解酵素阻害剤、蛋白質合成阻害剤に対する阻害
剤、酸化還元調節剤、非変性界面活性剤、緩衝成分、ス
ペルミン、スペルミジンおよびキナーゼ等の、蛋白質合
成反応に必要な他の物質を蛋白質合成反応器に添加する
ことができる。
て、遺伝情報源、前記第1,2エネルギー源、アミノ酸
及び多孔性固体物質以外にも塩、イオン性基が結合され
ている高分子物質、cAMP、蛋白質分解酵素阻害剤、
核酸分解酵素阻害剤、蛋白質合成阻害剤に対する阻害
剤、酸化還元調節剤、非変性界面活性剤、緩衝成分、ス
ペルミン、スペルミジンおよびキナーゼ等の、蛋白質合
成反応に必要な他の物質を蛋白質合成反応器に添加する
ことができる。
【0033】前記塩の例としては、酢酸または硫酸のカ
リウム、マグネシウム、アンモニウムおよびマンガン塩
などが挙げられ、塩中の一部はアミノ酸を対陰イオンと
して有していてもよい。
リウム、マグネシウム、アンモニウムおよびマンガン塩
などが挙げられ、塩中の一部はアミノ酸を対陰イオンと
して有していてもよい。
【0034】前記イオン性基が結合されている高分子物
質としては、例えば、ポリエチレングリコール、デキス
トラン、ジエチルアミノエチル、第四アミノエチル(qu
aternary aminoethyl)等が挙げられる。
質としては、例えば、ポリエチレングリコール、デキス
トラン、ジエチルアミノエチル、第四アミノエチル(qu
aternary aminoethyl)等が挙げられる。
【0035】前記酸化還元調節剤としては、ジチオトレ
イトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよびこれら
の酸化物よりなる群中から選ばれた少なくとも一つが用
いられる。また、トリトン(Triton) X−100のよう
な非変性界面活性剤を0〜0.5Mの濃度で添加しても
よい。
イトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよびこれら
の酸化物よりなる群中から選ばれた少なくとも一つが用
いられる。また、トリトン(Triton) X−100のよう
な非変性界面活性剤を0〜0.5Mの濃度で添加しても
よい。
【0036】前記スペルミン、スペルミジンは蛋白質合
成性能の向上のために、cAMPは遺伝子発現調節剤と
してそれぞれ添加される。従来には、ポリエチンレング
リコールを用いる場合にはスペルミンとスペルミジンを
通常使用しなかったが、本発明では相乗効果のためにこ
の物質を適切な濃度で組合わせて添加してもよい。
成性能の向上のために、cAMPは遺伝子発現調節剤と
してそれぞれ添加される。従来には、ポリエチンレング
リコールを用いる場合にはスペルミンとスペルミジンを
通常使用しなかったが、本発明では相乗効果のためにこ
の物質を適切な濃度で組合わせて添加してもよい。
【0037】上記他の物質は、単独あるいは組み合わせ
て反応培地に添加してもよく、その添加量は、スペルミ
ンおよび/またはスペルミジンを用いる場合には反応培
地における濃度が1マイクロモル〜3ミリモル、好まし
くは0.1〜1.5ミリモルになるように、さらに、ポ
リエチンレングリコールを用いる場合には反応培地にお
ける濃度が0.5〜4重量%、好ましくは1〜2.5重
量%になるように、調節される。
て反応培地に添加してもよく、その添加量は、スペルミ
ンおよび/またはスペルミジンを用いる場合には反応培
地における濃度が1マイクロモル〜3ミリモル、好まし
くは0.1〜1.5ミリモルになるように、さらに、ポ
リエチンレングリコールを用いる場合には反応培地にお
ける濃度が0.5〜4重量%、好ましくは1〜2.5重
量%になるように、調節される。
【0038】反応培地のうち特定成分の濃度を変化しよ
うとする場合にはこれによって他の成分の濃度も変化さ
せなければならない場合がある。例えば、ヌクレオチド
とエネルギー源の濃度は他の成分の濃度によって調節さ
れる。反応システムとして供給される成分の濃度は時間
によっても変化し得る。例えば、供給溶液におけるアミ
ノ酸の濃度は連続培養を数時間進行した後に増加する。
前記ポリエチレングリコールのような有機化合物と多孔
性固体物質は0〜10%の濃度で添加してもよい。
うとする場合にはこれによって他の成分の濃度も変化さ
せなければならない場合がある。例えば、ヌクレオチド
とエネルギー源の濃度は他の成分の濃度によって調節さ
れる。反応システムとして供給される成分の濃度は時間
によっても変化し得る。例えば、供給溶液におけるアミ
ノ酸の濃度は連続培養を数時間進行した後に増加する。
前記ポリエチレングリコールのような有機化合物と多孔
性固体物質は0〜10%の濃度で添加してもよい。
【0039】本発明において蛋白質合成反応器に使用す
る分離膜としては、イオン性、非イオン性、親水性、疎
水性、極性および非極性など色々な種類中から適切なも
のを選択して使用することができる。この際、表面層に
蛋白質が吸着しない性質を有する分離膜が好ましく使用
される。なお、以下の実施例においては、アミコン社製
のYM−100タイプの分離膜を使用した。
る分離膜としては、イオン性、非イオン性、親水性、疎
水性、極性および非極性など色々な種類中から適切なも
のを選択して使用することができる。この際、表面層に
蛋白質が吸着しない性質を有する分離膜が好ましく使用
される。なお、以下の実施例においては、アミコン社製
のYM−100タイプの分離膜を使用した。
【0040】反応システムは回分式、運転時間が延長さ
れた形態の回分式、半連続フェドバッチ(fed-batch)式
または連続式で運転されることができ、用途によって運
転方式を異にして運転することが望ましい。回分式でな
い場合、供給溶液の濃度は、必要であれば、一時的に相
違してもよい。
れた形態の回分式、半連続フェドバッチ(fed-batch)式
または連続式で運転されることができ、用途によって運
転方式を異にして運転することが望ましい。回分式でな
い場合、供給溶液の濃度は、必要であれば、一時的に相
違してもよい。
【0041】蛋白質合成反応器内のpHと温度は、それ
ぞれ、pHが5〜10、温度が20〜50℃の範囲内で
調節されることが望ましく、pHが6〜9、温度が25
〜40℃の範囲内で調節されることがより望ましい。
ぞれ、pHが5〜10、温度が20〜50℃の範囲内で
調節されることが望ましく、pHが6〜9、温度が25
〜40℃の範囲内で調節されることがより望ましい。
【0042】反応溶液の流動方向は、前記分離膜に対し
て垂直および/または接線方向とする。第1エネルギー
源を再循環させ分離膜の詰まり現象を防止するには接線
方向の流れが効果的で、これは同時に垂直流れ上に重な
る。分離膜に垂直である流れは陽圧ポンプまたは真空吸
入ポンプによって得られる。
て垂直および/または接線方向とする。第1エネルギー
源を再循環させ分離膜の詰まり現象を防止するには接線
方向の流れが効果的で、これは同時に垂直流れ上に重な
る。分離膜に垂直である流れは陽圧ポンプまたは真空吸
入ポンプによって得られる。
【0043】連続反応工程で蛋白質分離手段を用いる場
合、蛋白質合成反応器の出口に設けられた分離膜を通じ
て出て来る生成物は直ぐ蛋白質分離手段に連結され得
る。また、半連続工程の場合には、蛋白質合成反応器の
出口に設けられた分離膜の外部は所定の順序で循環する
所定の溶液と接触しこのような溶液には蛋白質合成阻害
剤に対して吸着特異性を有した吸着剤を含む物質以外に
もアミノ酸やヌクレオチドのような基質が含まれる。こ
の場合、蛋白質合成反応器は透折方式または透折濾過方
式または半フェドバッチ(fed-batch)式で運転される。
また、蛋白質合成反応器に供給される供給液は同一な分
離膜を通じて別途の流入口を通じて供給される。この
際、合成された蛋白質は蛋白質合成反応器内に蓄積され
反応が停止した後、通常の分離、精製方法によって分
離、精製される。
合、蛋白質合成反応器の出口に設けられた分離膜を通じ
て出て来る生成物は直ぐ蛋白質分離手段に連結され得
る。また、半連続工程の場合には、蛋白質合成反応器の
出口に設けられた分離膜の外部は所定の順序で循環する
所定の溶液と接触しこのような溶液には蛋白質合成阻害
剤に対して吸着特異性を有した吸着剤を含む物質以外に
もアミノ酸やヌクレオチドのような基質が含まれる。こ
の場合、蛋白質合成反応器は透折方式または透折濾過方
式または半フェドバッチ(fed-batch)式で運転される。
また、蛋白質合成反応器に供給される供給液は同一な分
離膜を通じて別途の流入口を通じて供給される。この
際、合成された蛋白質は蛋白質合成反応器内に蓄積され
反応が停止した後、通常の分離、精製方法によって分
離、精製される。
【0044】分離膜の外面と接触する溶液は順次に変化
され、回分タンク型の攪拌をしたり分離膜に対する接線
方向の流れを伴った攪拌を遂行する。蛋白質合成反応器
は内部攪拌装置または外部攪拌装置によって攪拌され
る。
され、回分タンク型の攪拌をしたり分離膜に対する接線
方向の流れを伴った攪拌を遂行する。蛋白質合成反応器
は内部攪拌装置または外部攪拌装置によって攪拌され
る。
【0045】本発明において、エネルギー源再生手段を
別途に用いる場合、炭水化物、有機酸、アルデヒド、ア
ルコールのような高エネルギー物質および必要な酵素と
共にミトコンドリアを使用したり、色素体やクロロプラ
ストのような光合成組織を光エネルギーと共に使用する
ことができる。また、エネルギー源再生手段には適切な
大きさの細孔とイオン特性を有する膜が備えられる。エ
ネルギー源再生手段に使用される光合成組織としては植
物または微生物から分離したものを使用することができ
る。
別途に用いる場合、炭水化物、有機酸、アルデヒド、ア
ルコールのような高エネルギー物質および必要な酵素と
共にミトコンドリアを使用したり、色素体やクロロプラ
ストのような光合成組織を光エネルギーと共に使用する
ことができる。また、エネルギー源再生手段には適切な
大きさの細孔とイオン特性を有する膜が備えられる。エ
ネルギー源再生手段に使用される光合成組織としては植
物または微生物から分離したものを使用することができ
る。
【0046】前記蛋白質合成反応器で目的とする蛋白質
を製造した後、生産された蛋白質の選択的な分離のため
に用いられる蛋白質分離手段には、目的とする蛋白質に
対する抗体が固定化されている粒子が充填されたりその
他の特異的吸着をし得る物質が固定化されている粒子が
充填されており、適切な大きさの細孔を有する膜を装着
していることができ、通常のカラムの形態よりなってい
る。
を製造した後、生産された蛋白質の選択的な分離のため
に用いられる蛋白質分離手段には、目的とする蛋白質に
対する抗体が固定化されている粒子が充填されたりその
他の特異的吸着をし得る物質が固定化されている粒子が
充填されており、適切な大きさの細孔を有する膜を装着
していることができ、通常のカラムの形態よりなってい
る。
【0047】分離手段とエネルギー再生手段が全部用い
られる場合には、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段によって生産された蛋白質が選択的に吸
着され残余成分は前記エネルギー再生手段を経て蛋白質
合成反応器へ再循環される。
られる場合には、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段によって生産された蛋白質が選択的に吸
着され残余成分は前記エネルギー再生手段を経て蛋白質
合成反応器へ再循環される。
【0048】図1は、本発明の望ましい実施態様におけ
る方法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示
すブロック図である。図1に示したブロック図におい
て、蛋白質分離手段がシステムに含まれている場合には
反応器の生成物が二つのカラムよりなる蛋白質分離手段
に送られる。この場合、二つの吸着カラムは全体システ
ムの連続的な運転のために交互に使用され得る。また、
エネルギー再生手段がさらに含まれている場合には蛋白
質分離手段からの溶出液はこのエネルギー再生手段を通
過して再び蛋白質合成反応器に循環される。このよう
に、図1に示したシステムを構成する各手段は、全部を
使用してもよいし、または、システムの一部のみを使用
してもよく、さらに、連結された順序と配管を異にして
使用されることもできる。
る方法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示
すブロック図である。図1に示したブロック図におい
て、蛋白質分離手段がシステムに含まれている場合には
反応器の生成物が二つのカラムよりなる蛋白質分離手段
に送られる。この場合、二つの吸着カラムは全体システ
ムの連続的な運転のために交互に使用され得る。また、
エネルギー再生手段がさらに含まれている場合には蛋白
質分離手段からの溶出液はこのエネルギー再生手段を通
過して再び蛋白質合成反応器に循環される。このよう
に、図1に示したシステムを構成する各手段は、全部を
使用してもよいし、または、システムの一部のみを使用
してもよく、さらに、連結された順序と配管を異にして
使用されることもできる。
【0049】蛋白質合成反応器で生産される蛋白質の確
認は、電気泳働を施した後生産された蛋白質の量が少な
い場合にはオートラジオグラフィー方法によって遂行し
(基質としてロイシンの炭素原子を14Cで標識し合成さ
れた蛋白質に導入されたロイシン−14Cを確認)、蛋白
質の量が多い場合にはクーマシーブルー染色法(Coomas
sie blue staining )によって遂行したが、定量分析は
通常の分析方法であるローリー法(Lowry method)によ
って施した。
認は、電気泳働を施した後生産された蛋白質の量が少な
い場合にはオートラジオグラフィー方法によって遂行し
(基質としてロイシンの炭素原子を14Cで標識し合成さ
れた蛋白質に導入されたロイシン−14Cを確認)、蛋白
質の量が多い場合にはクーマシーブルー染色法(Coomas
sie blue staining )によって遂行したが、定量分析は
通常の分析方法であるローリー法(Lowry method)によ
って施した。
【0050】
【実施例】本発明を以下の実施例と添付された図面によ
ってより詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、以下
の実施例によっては限定されず、本発明の範囲を逸脱し
ない限りその変形例が当業者に可能なことは無論であ
る。
ってより詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、以下
の実施例によっては限定されず、本発明の範囲を逸脱し
ない限りその変形例が当業者に可能なことは無論であ
る。
【0051】実施例1:細胞抽出物の製造 LB培地に大腸菌を接種して一晩の間培養した種培養液
を酢酸カリウム75mM、酵母抽出物10g/l、ブド
ウ糖50g/l及びビタミン0.5g/lが含まれた培
地が入っている5リットルの醗酵槽に入れて30℃で一
晩培養した。細胞を回収した後フレンチプレス(French
press)、超音波器またはその他の通常の方法を用いて細
胞を粉砕した。これを4℃、30,000×gで5分間
遠心分離してその上澄み液をトリス緩衝溶液(pH7.
6)に対して透折を施した。ポリエチレングリコールの
ような有機物質を最終濃度が5%になるように、透折さ
れた細胞抽出物に添加した後さらにその上澄み液を限外
濾過膜を用いた圧力濾過法によって濃縮して蛋白質合成
に使われる細胞抽出物を得た。
を酢酸カリウム75mM、酵母抽出物10g/l、ブド
ウ糖50g/l及びビタミン0.5g/lが含まれた培
地が入っている5リットルの醗酵槽に入れて30℃で一
晩培養した。細胞を回収した後フレンチプレス(French
press)、超音波器またはその他の通常の方法を用いて細
胞を粉砕した。これを4℃、30,000×gで5分間
遠心分離してその上澄み液をトリス緩衝溶液(pH7.
6)に対して透折を施した。ポリエチレングリコールの
ような有機物質を最終濃度が5%になるように、透折さ
れた細胞抽出物に添加した後さらにその上澄み液を限外
濾過膜を用いた圧力濾過法によって濃縮して蛋白質合成
に使われる細胞抽出物を得た。
【0052】実施例2:連続反応による蛋白質の製造 前記の実施例1から得た細胞抽出物、ATP 2.6m
M、GTP 0.8mM、各種アミノ酸 1mM、酢酸
カリウム 210mM、酢酸アモニウム 80mM、酢
酸マグネシウム 16mM、cAMP 0.67mM、
ジチオトレイトール 2mM、ホスホエノールピルビン
酸 24mM、PEPキナーゼ 12μg/ml、ポリ
エチレングリコール 2%、アルミナ 30mg/m
l、mRNA、50mM トリスアセテート緩衝溶液
(pH7.6)及び通常の蛋白質合成に必要な物質を分
離膜型蛋白質合成反応器に入れて反応液を1VVHの速
度で供給し連続工程を施した。蛋白質合成反応器のpH
は7.6で、温度は37℃で維持し徐々に攪拌した。生
産される蛋白質を連続的に回収して電気泳働後オートラ
ジオグラフィー及びクーマシーブルー染色法によって蛋
白質を確認しローリー法によってその量を測定した。
M、GTP 0.8mM、各種アミノ酸 1mM、酢酸
カリウム 210mM、酢酸アモニウム 80mM、酢
酸マグネシウム 16mM、cAMP 0.67mM、
ジチオトレイトール 2mM、ホスホエノールピルビン
酸 24mM、PEPキナーゼ 12μg/ml、ポリ
エチレングリコール 2%、アルミナ 30mg/m
l、mRNA、50mM トリスアセテート緩衝溶液
(pH7.6)及び通常の蛋白質合成に必要な物質を分
離膜型蛋白質合成反応器に入れて反応液を1VVHの速
度で供給し連続工程を施した。蛋白質合成反応器のpH
は7.6で、温度は37℃で維持し徐々に攪拌した。生
産される蛋白質を連続的に回収して電気泳働後オートラ
ジオグラフィー及びクーマシーブルー染色法によって蛋
白質を確認しローリー法によってその量を測定した。
【0053】その結果を図2に示す。ただし、図2のグ
ラフにおいて、x軸は連続工程の運転時間を示し、y軸
は反応器の容積1ml当たりの蛋白質の総生産量を示
す。図2のグラフに示されているように、120時間以
上連続工程の運転がなされ、この際の蛋白質の平均生産
性は1.2mg/ml/時間であった。
ラフにおいて、x軸は連続工程の運転時間を示し、y軸
は反応器の容積1ml当たりの蛋白質の総生産量を示
す。図2のグラフに示されているように、120時間以
上連続工程の運転がなされ、この際の蛋白質の平均生産
性は1.2mg/ml/時間であった。
【0054】実施例3:半連続的反応の場合における蛋
白質生産量の測定 半連続反応工程を用いたことを除いては実施例2と同一
な方法で蛋白質を製造してその量を測定した。結果を図
3に示す。図3のグラフから50時間以上蛋白質の生産
がなされ、その総生産量は60mg/mlであることが
分かる。
白質生産量の測定 半連続反応工程を用いたことを除いては実施例2と同一
な方法で蛋白質を製造してその量を測定した。結果を図
3に示す。図3のグラフから50時間以上蛋白質の生産
がなされ、その総生産量は60mg/mlであることが
分かる。
【0055】実施例4:多孔性固体物質の添加効果 多孔性固体物質の一つとしてのアルミナの添加量を異に
する以外は、実施例3と同一な方法を用いうことによ
り、その効果を試みた。結果を表1に示す。表1より、
ガンマアルミナを30mg/mlの濃度で添加した場合
に蛋白質の生産が最大であることが分かる。また、この
場合、反応器の運転時間も120時間以上に延長され
た。
する以外は、実施例3と同一な方法を用いうことによ
り、その効果を試みた。結果を表1に示す。表1より、
ガンマアルミナを30mg/mlの濃度で添加した場合
に蛋白質の生産が最大であることが分かる。また、この
場合、反応器の運転時間も120時間以上に延長され
た。
【0056】
【表1】
【0057】さらに、表1から、多孔性固体物質が蛋白
質合成反応自体を促進させながら分離膜の詰まり現象を
も非常に効果的に防止することが推定される。
質合成反応自体を促進させながら分離膜の詰まり現象を
も非常に効果的に防止することが推定される。
【0058】実施例5:ポリエチレングリコールの添加
効果 細胞抽出物を製造する段階で濃縮過程前にポリエチレン
グリコールを2%の濃度で添加した後、遠心分離を通じ
て沈殿物が取り除かれた細胞抽出物を使用した以外は、
実施例3と同一な方法で蛋白質を製造してその量を測定
した。結果を表2に示す。
効果 細胞抽出物を製造する段階で濃縮過程前にポリエチレン
グリコールを2%の濃度で添加した後、遠心分離を通じ
て沈殿物が取り除かれた細胞抽出物を使用した以外は、
実施例3と同一な方法で蛋白質を製造してその量を測定
した。結果を表2に示す。
【0059】
【表2】
【0060】表2からポリエチレングリコールを添加し
た場合に蛋白質の生産性が大きく増加されることが示さ
れる。
た場合に蛋白質の生産性が大きく増加されることが示さ
れる。
【0061】実施例6:エネルギー源の再生 光合成細菌ロドスピリルムルブルム(Rhodospirillum r
ubrum )を破砕した後分離した色素体(cromatophore)
を使用してエネルギー物質であるATPをADPから再
生した。その結果を表3に記載する。
ubrum )を破砕した後分離した色素体(cromatophore)
を使用してエネルギー物質であるATPをADPから再
生した。その結果を表3に記載する。
【0062】
【表3】
【0063】表3より、かなりの割合でATPがADP
から再生していることが分かる。
から再生していることが分かる。
【0064】実施例7:目的とする蛋白質の選択的な分
離 目的とする蛋白質の選択的な分離のためにこの蛋白質に
対する抗体(モノクローナルまたはポリクロナール抗
体)を通常の方法で固体粒子に化学的に固定化させて固
定相として使用して二つのカラムを準備した。一つのカ
ラムに対してブレイクスルー(breakthrough :溶液をカ
ラムに通過させる場合カラムの容量に該当する量の蛋白
質が吸着される時まではカラムの出口から溶出された溶
液で該当蛋白質を検出することができなく、その時まで
所要された時間をブレイクスルー時間という)に到達す
ると、他のカラムに溶液を流入させて吸着を始め、その
間先に吸着させたカラムで吸着蛋白質を溶出させカラム
を再生させた。このように、二つのカラムを交代に使用
することによりシステム全体の連続性を維持することが
できた。分離カラムの運転データは表4に示した。
離 目的とする蛋白質の選択的な分離のためにこの蛋白質に
対する抗体(モノクローナルまたはポリクロナール抗
体)を通常の方法で固体粒子に化学的に固定化させて固
定相として使用して二つのカラムを準備した。一つのカ
ラムに対してブレイクスルー(breakthrough :溶液をカ
ラムに通過させる場合カラムの容量に該当する量の蛋白
質が吸着される時まではカラムの出口から溶出された溶
液で該当蛋白質を検出することができなく、その時まで
所要された時間をブレイクスルー時間という)に到達す
ると、他のカラムに溶液を流入させて吸着を始め、その
間先に吸着させたカラムで吸着蛋白質を溶出させカラム
を再生させた。このように、二つのカラムを交代に使用
することによりシステム全体の連続性を維持することが
できた。分離カラムの運転データは表4に示した。
【0065】
【表4】
【0066】
【発明の効果】以上述べたように、本発明の無細胞シス
テムにおける蛋白質の製造方法を利用することにより、
蛋白質の合成に必要な組織を生物細胞から抽出して生体
外、即ち無細胞システムにより蛋白質を生産することが
でき、これにより生体システムで現れる様々な蛋白質合
成阻害沃素を回避することができ、さらに、多孔性固体
物質を使用することにより、分離膜の詰まり減少を大幅
に緩和させ蛋白質合成反応器の運転時間を増大させるこ
とができ、これにより蛋白質の全生産量を増大させるこ
とが可能である。
テムにおける蛋白質の製造方法を利用することにより、
蛋白質の合成に必要な組織を生物細胞から抽出して生体
外、即ち無細胞システムにより蛋白質を生産することが
でき、これにより生体システムで現れる様々な蛋白質合
成阻害沃素を回避することができ、さらに、多孔性固体
物質を使用することにより、分離膜の詰まり減少を大幅
に緩和させ蛋白質合成反応器の運転時間を増大させるこ
とができ、これにより蛋白質の全生産量を増大させるこ
とが可能である。
【0067】また、本発明による蛋白質合成反応器にさ
らにエネルギー再生手段を設けることによって、高価な
エネルギー源を再生して循環使用することができ、蛋白
質のコストを節減することが可能となる。
らにエネルギー再生手段を設けることによって、高価な
エネルギー源を再生して循環使用することができ、蛋白
質のコストを節減することが可能となる。
【0068】また、本発明による蛋白質合成反応器の出
口に分離膜を設けることによって、反応器内のタンパク
質合成阻害物質が分離膜と接し溶液内に透析され反応器
から除去され、その結果、蛋白質合成の効率が向上す
る。
口に分離膜を設けることによって、反応器内のタンパク
質合成阻害物質が分離膜と接し溶液内に透析され反応器
から除去され、その結果、蛋白質合成の効率が向上す
る。
【0069】また、本発明による蛋白質合成反応器にさ
らに蛋白質分離手段を設けることによって、一つのシス
テム内で目的とする蛋白質を効率的にかつただちに分離
精製することができ、蛋白質の生産性を向上させること
ができる。
らに蛋白質分離手段を設けることによって、一つのシス
テム内で目的とする蛋白質を効率的にかつただちに分離
精製することができ、蛋白質の生産性を向上させること
ができる。
【0070】さらに、本発明の無細胞システムにおける
蛋白質の製造方法によると、翻訳後変形過程がないので
生体(in vivo )システムで現れる望ましくない変形体
または宿主細胞に毒性効果を示す蛋白質のための問題を
避けることができるため、インシュリンや成長ホルモ
ン、α−インターフェロンおよび様々なワクチン(vacc
ine)等の蛋白質製剤が効率的に生産されうる。また、A
TPとGTPを再生して循環させ多孔性固体物質を使用
して反応器の運転時間を増加させ目的とする蛋白質に対
して吸着性が高いカラムを使用することにより蛋白質の
生産速度のみならず、総生産量が従来の方法に比べて大
きく向上されてペプチド鎖当たりのアミノ酸の数に関係
なく非常に経済的に蛋白質を製造することができる。
蛋白質の製造方法によると、翻訳後変形過程がないので
生体(in vivo )システムで現れる望ましくない変形体
または宿主細胞に毒性効果を示す蛋白質のための問題を
避けることができるため、インシュリンや成長ホルモ
ン、α−インターフェロンおよび様々なワクチン(vacc
ine)等の蛋白質製剤が効率的に生産されうる。また、A
TPとGTPを再生して循環させ多孔性固体物質を使用
して反応器の運転時間を増加させ目的とする蛋白質に対
して吸着性が高いカラムを使用することにより蛋白質の
生産速度のみならず、総生産量が従来の方法に比べて大
きく向上されてペプチド鎖当たりのアミノ酸の数に関係
なく非常に経済的に蛋白質を製造することができる。
【図1】図1は、本発明の望ましい実施態様における方
法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示すブ
ロック図である。
法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示すブ
ロック図である。
【図2】図2は、本発明の実施態様における蛋白質合成
反応器で連続工程によって製造される蛋白質の量を時間
によって示したグラフである。
反応器で連続工程によって製造される蛋白質の量を時間
によって示したグラフである。
【図3】図3は、本発明の他の実施態様における蛋白質
合成反応器で半連続工程によって製造される蛋白質の量
を時間によって示したグラフである。
合成反応器で半連続工程によって製造される蛋白質の量
を時間によって示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鄭 奎烈 大韓民国ソウル特別市冠岳區新林2洞402 番地現代アパート108棟1002號
Claims (6)
- 【請求項1】 無細胞システムにおける蛋白質の製造方
法において、 細胞を培養した後粉砕して目的とする蛋白質の生産に必
要な組織を含む細胞抽出物を製造する段階、および前記
細胞抽出物と共に遺伝情報源、蛋白質合成のための第1
エネルギー源として作用するATP及びGTP、第1エ
ネルギー源の反応器内で原位置に(in situ )再生させ
るために必要な第2エネルギー源としての高エネルギー
燐酸化合物または炭水化物またはこれらの誘導体、基質
としてのアミノ酸および多孔性固体物質を含む反応培地
を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的とする蛋白
質を製造する段階からなることを特徴とする無細胞シス
テムにおける蛋白質の製造方法。 - 【請求項2】 前記第1エネルギー源の分解産物がミト
コンドリアまたは光合成組織を用いた別途のエネルギー
再生手段によって第1エネルギー源として再生された
後、前記蛋白質合成反応器に循環される段階をさらに含
むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記分離膜が前記蛋白質合成反応器の出
口に設けられ、その外面に接している溶液を交換しなが
ら透析運転することを特徴とする請求項1に記載の方
法。 - 【請求項4】 前記多孔性固体物質が0.1〜1000
μmの直径、10〜1000m2 /gの表面積を有して
おり、その外形が多様であることを特徴とする請求項1
に記載の方法。 - 【請求項5】 前記多孔性固体物質が多孔性キトサン、
多孔性セルロース、多孔性ゼラチン、多孔性コラーゲン
およびそれらの誘導体を含む高分子物質またはアルミ
ナ、シリカ、チタニア、ジルコニア、モリブデナ、バナ
ジウムオキサイド、コバルトオキサイド、これらの混合
物および様々な形態のゼオライトを含む無機酸化物であ
ることを特徴とする請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 目的とする蛋白質に対する吸着性が高い
物質で充填されたカラムを有する蛋白質分離手段によっ
て目的とする蛋白質を分離する段階をさらに含んでいる
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR19940009850 | 1994-05-04 | ||
KR94P17978 | 1994-07-25 | ||
KR94P9850 | 1994-07-25 | ||
KR1019940017978A KR0131166B1 (ko) | 1994-05-04 | 1994-07-25 | 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07298893A true JPH07298893A (ja) | 1995-11-14 |
Family
ID=26630343
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6201075A Pending JPH07298893A (ja) | 1994-05-04 | 1994-08-25 | 無細胞システムにおける蛋白質の製造方法 |
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Country | Link |
---|---|
US (1) | US5593856A (ja) |
JP (1) | JPH07298893A (ja) |
KR (1) | KR0131166B1 (ja) |
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US7192767B2 (en) | 2000-03-08 | 2007-03-20 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Matrix reactor and a method for producing products in said reactor |
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JP2012513213A (ja) * | 2008-12-22 | 2012-06-14 | グレーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | 化合物の製造のための組成物および方法 |
US9469861B2 (en) | 2011-09-09 | 2016-10-18 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free preparation of carbapenems |
US9611487B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-04-04 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free system for converting methane into fuel and chemical compounds |
US9637746B2 (en) | 2008-12-15 | 2017-05-02 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways |
US9688977B2 (en) | 2013-08-05 | 2017-06-27 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered phosphoglucose isomerase proteins with a protease cleavage site |
US10006062B2 (en) | 2010-05-07 | 2018-06-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation |
US10036001B2 (en) | 2010-08-31 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Recombinant cellular iysate system for producing a product of interest |
JP2020507322A (ja) * | 2017-02-09 | 2020-03-12 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | 人工エネルギー再生システムを必要としない新規の無真核細胞発現システム |
US10858385B2 (en) | 2017-10-11 | 2020-12-08 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nucleoside triphosphate and ribonucleic acid production |
US10954541B2 (en) | 2016-04-06 | 2021-03-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
US11274284B2 (en) | 2015-03-30 | 2022-03-15 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
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---|---|---|---|---|
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RU2148649C1 (ru) * | 1998-03-31 | 2000-05-10 | Институт белка РАН | Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления |
JP2000175695A (ja) * | 1998-12-14 | 2000-06-27 | Inst Of Physical & Chemical Res | 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 |
US6994986B2 (en) | 1999-03-17 | 2006-02-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford University | In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism |
US6168931B1 (en) | 1999-03-17 | 2001-01-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced in vitro synthesis of biological macromolecules using a novel ATP regeneration system |
US6337191B1 (en) * | 1999-03-22 | 2002-01-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source |
RU2169154C2 (ru) | 1999-03-25 | 2001-06-20 | Институт белка РАН | Способ получения полипептидов в бесклеточной системе |
EA006162B1 (ru) * | 1999-05-11 | 2005-10-27 | Селлфри Сайенсиз Ко., Лтд. | Препарат для бесклеточного синтеза белка, способ синтеза белка с использованием данного препарата и устройство для его осуществления |
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ATE279511T1 (de) * | 1999-06-18 | 2004-10-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur durchführung biochemischer reaktionen mit hohem durchsatz |
AU7274801A (en) * | 2000-07-21 | 2002-02-05 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | General means of labeling protein by using wheat embryo cell-free protein synthesis system |
DE10137792A1 (de) * | 2001-08-06 | 2003-02-27 | Erdmann Volker | Verfahren zur Genexpression |
EP1477566B1 (en) * | 2002-01-31 | 2007-09-26 | CellFree Sciences Co., Ltd. | Germ extract for cell-free protein synthesis and process for producing the same |
NZ519011A (en) | 2002-09-01 | 2005-01-28 | Univ Waikato | Reaction process |
DE10256669B4 (de) | 2002-12-04 | 2006-03-09 | Universitätsklinikum Charité an der Humboldt-Universität zu Berlin Technologietransferstelle | Gemisch mindestens zweier Fusionsproteine sowie ihre Herstellung und Verwendung |
JP4477923B2 (ja) * | 2003-05-22 | 2010-06-09 | 独立行政法人理化学研究所 | 無細胞タンパク質合成用抽出液の製造方法及びその方法により製造される細胞抽出液 |
JP4590249B2 (ja) * | 2004-11-17 | 2010-12-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 糖タンパク質合成用の無細胞タンパク質合成システム |
CN108913592A (zh) * | 2018-07-09 | 2018-11-30 | 上海天引生物科技有限公司 | 一种器官体外保存与培养装置及其方法 |
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---|---|---|---|---|
ATE147104T1 (de) * | 1991-10-11 | 1997-01-15 | Promega Corp | Gekoppelte transkription und translation in zellfreien eukaryoten-extrakten |
-
1994
- 1994-07-25 KR KR1019940017978A patent/KR0131166B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-08-25 JP JP6201075A patent/JPH07298893A/ja active Pending
- 1994-08-25 US US08/296,230 patent/US5593856A/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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KR0131166B1 (ko) | 1998-04-11 |
US5593856A (en) | 1997-01-14 |
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