JPH07298893A - 無細胞システムにおける蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 蛋白質の製造に必要な組織を細胞から抽出し
て無細胞システムで蛋白質を製造する方法を提供する。 【構成】 製造時に使われるエネルギー源を再生して循
環させて使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段を使用することにより無細胞蛋白質製造
をより経済的で効率的に遂行するための方法よりなって
いる。 【効果】 生体（in vivo ）システムで現れる問題点を
解決することができ、蛋白質の生産性および反応器の運
転時間の増加による全体生産量が従来方法に比して大い
に増加される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、無細胞システム（cell
-free system）で蛋白質を製造する方法に係り、特に医
薬品、食品、農薬、環境製品、産業化学製品、日用品な
どに関連した産業分野で用いられる蛋白質を無細胞シス
テムで製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般的に蛋白質を製造するために用いら
れる方法には大きく化学的な方法と生物学的な方法があ
るが、１ペプチド鎖当たりのアミノ酸の数が少ない場合
には化学的な方法が主に用いられ、特に１ペプチド鎖当
たりのアミノ酸の数が１０個未満である場合には化学的
な合成方法を用いることが生物学的な方法に比して経済
的であると知られていた。

【０００３】一方、蛋白質を生物学的に生産する場合、
従来には主に遺伝学的に操作された生物細胞を利用する
生体（in vivo ）システムであった。この場合、目的と
する蛋白質の分泌特性によって主に次のような二種の方
法を用いた。即ち、細胞内の蛋白質の場合には細胞を培
養して目的とする蛋白質が細胞内部に蓄積されたのち適
切な時点で細胞を破壊して蛋白質を分離、精製する方法
を利用し、細胞外部に分泌される分泌蛋白質の場合には
細胞を培養して適切な時点でその培養液を分離してこれ
から蛋白質を分離、精製する方法を用いていた。

【０００４】生物細胞に基づくこのような方法は生物細
胞による蛋白質の過剰生産と蛋白質の分離精製過程で次
のような色々な問題点を持っていた。

【０００５】すなわち、細胞が成長するにつれ生産され
る蛋白質分解酵素等によって蛋白質が分解または変性さ
れたり、蛋白質が合成された後にも翻訳後過程（Post t
ranslation process）による脱アミノ反応、酸化反応な
どにより目的とする蛋白質が望ましくなく変形される場
合が頻繁であった。非天然型アミノ酸や変形されたアミ
ノ酸を蛋白質に導入することも不可能であったり極めて
難しかった。また、細胞に毒性効果を及ぼす蛋白質は細
胞の成長を妨げ、目的とする蛋白質をエンコードする遺
伝子の発現が生産される蛋白質の濃度によって調節され
て一定な濃度以上に蛋白質を生産することが困難であっ
た。人為的な突然変異を通じて目的とする蛋白質を過剰
生産し得る細胞を用いるとしても生体が持っている特性
のために蛋白質の生産に限界があった。即ち、細胞内部
に蓄積されたり細胞外部へ分泌される蛋白質の濃度が細
胞の生存性に影響を及ぼす場合が一般的であり、蛋白質
の過剰生産条件と細胞の成長条件を調和させることがと
ても難しく目的とする蛋白質の過剰生産は極めて難しい
ものであった。

【０００６】さらに、分離、精製過程では大部分の蛋白
質が不溶性であるまたは不安定で細胞自体の蛋白質分解
酵素によって分解されることにより封入体に蓄積され分
離過程で損なわれる比率が高く、膜蛋白質の場合には分
離がさらに難しかった。また、医薬品や食品などに用い
られる蛋白質の場合には感染性因子やエンドトキシン
（endotoxins) が混入されることを防止するために分
離、精製過程で徹底的な管理が要求された。そのゆえ、
目的とする蛋白質の分離、精製効率が低く蛋白質生産の
収率、比生産速度および生産量が極めて低調であり、蛋
白質製品の価格が非常に高価なものとなった。

【０００７】かかる問題点を解決するために生物細胞を
その自体に基づかず、つまり無細胞システムにおいて、
即ち細胞から抽出した細胞抽出システムに基づく生体外
(invitro)システムにおいて蛋白質を製造する方法が導
入された。

【０００８】しかしながら、従来の回分式の無細胞シス
テムにおける蛋白質の生産方法は、ｍＲＮＡの要求量が
大きく、反応器の運転時間が１時間以内と短く、細胞抽
出物の基本活性が極めて低く、さらに、核酸分解酵素や
蛋白質分解酵素などによる悪影響が大きくてエネルギー
源自体またはそれによって生産された生成物または副産
物による阻害を防止することが難しいという数多くの問
題を有していた。その上、蛋白質の生産性がとても低か
った。

【０００９】上記問題を考慮して、近年、連続工程によ
って無細胞システムで蛋白質を生産する方法がアレキサ
ンダー スピリーンらによって提案された。この方法に
より蛋白質生産が２０時間以上行うことが可能になり蛋
白質の生産速度も回分式に比して大きく増加されたが、
それでも生産量は５ピコモル／ピコモルｍＲＮＡに過ぎ
なかった（アレキサンダー エス スピリーン(Alexand
er S. Spirin) ら、アコンティニュアス セル−フリー
トランスレーション システム ケーパブル オブ
ポリペプチド イン ハイ イールド(A contiuous cel
l-free translatoin system capable of polypeptides
in high yield)、サイエンス(Science) 、２４２巻（１
９８８年）、１１６２〜１１６４）。続けて、彼らは研
究を重ね転写−翻訳をカップリングさせた無細胞システ
ムで連続工程によって蛋白質を４μｇ／ｍｌ／時間の生
産性で生産してこれを電気泳働後、オートラジオグラフ
ィー法によって確認した（アレキサンダー エス スピ
リーン(Alexander S. Spirin) ら、ジーン エックスプ
レッション イン ア セル−フリー システムオン
ザ プレパラティブ スケール(Gene expression in a
cell-free system on the preparative scale)、ジーン
(Gene)、８４巻（１９８９年）、４６３〜４６６）。

【００１０】アレキサンダー スピリーンらは連続工程
によって主に反応器の運転時間を増加させることにより
蛋白質の総生産量を増加させる方向に研究を進行した
が、反応器内の反応物質の濃度が増加するにつれ効率的
な混合が阻害され、また、反応液の流れが反応器の出口
に設けられた分離膜（membrane）に対して垂直方向にの
みなるようにしたので詰まり（plugging) 現象が発生す
る等の問題が生じ最大運転時間が１００時間を越えなか
った。

【００１１】次に、ナカノヒデオらは、限外濾過膜を用
いて濃縮させた小麦胚芽抽出物を使用することにより既
存の方法に比して蛋白質の生産速度を増加させる単純フ
ェドバッチ（simple fed-batch）方法を提案した（ヒデ
オ ナカノ(Hideo Nakano)ら、バイオサイ バイオテク
バイオケム(Biosci. Biotech. Biochem.) 、５８
（４）、６３１〜６３４、１９９４年）。この方法によ
ると、蛋白質生産速度はスピリーンらの方法に比して５
倍位向上し約３０μｇ／ｍｌ／時間に達したが、運転時
間は６時間位に過ぎなく蛋白質の総生産量もスピリーン
らの連続システムに比して落ちた。

【００１２】このように従来の方法による蛋白質の生産
性や総生産量はすべて産業化には達しない水準であっ
た。そのため、蛋白質の生産速度もさらに増加させ全運
転時間を延長させることにより蛋白質の全生産量を増や
し、高いエネルギー源を再生して使用することにより費
用を節減させる必要性が切実に要求された。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、蛋白質の生産性と生産量との両方を改善した無
細胞システムにおける蛋白質の製造方法を提供すること
である。

【００１４】本発明の他の目的は、無細胞システムで蛋
白質を製造する方法において、エネルギー源として使用
されるＡＴＰおよびＧＴＰのようなヌクレオチドを別途
のエネルギー再生手段によって再生させて蛋白質合成反
応器内へ循環させて再使用することにより無細胞蛋白質
製造をより経済的に遂行するための方法を提供すること
である。

【００１５】本発明のさらなる他の目的は、無細胞シス
テムで蛋白質を製造する方法において、目的とする蛋白
質に対する吸着特異性が高い分離手段を使用して生産さ
れた蛋白質を吸着させることにより蛋白質の回収率と転
換率を増加させて目的とする蛋白質を効果的に得るため
の方法を提供することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、無細胞シ
ステムにおける蛋白質の製造方法において、細胞を培養
した後粉砕して目的とする蛋白質の生産に必要な組織を
含む細胞抽出物を製造する段階、および前記細胞抽出物
と共に遺伝情報源、蛋白質合成のための第１エネルギー
源として作用するＡＴＰ及びＧＴＰ、第１エネルギー源
の反応器内で原位置に（in situ ）再生させるために必
要な第２エネルギー源としての高エネルギー燐酸化合物
または炭水化物またはこれらの誘導体、基質としてのア
ミノ酸および多孔性固体物質を含む反応培地（reaction
medium ）を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的
とする蛋白質を製造する段階からなることを特徴とする
無細胞システムにおける蛋白質の製造方法によって達成
される。

【００１７】本発明は、前記第１エネルギー源の分解産
物がミトコンドリアまたは光合成組織を用いた別途のエ
ネルギー再生手段によって第１エネルギー源として再生
された後、前記蛋白質合成反応器に循環される段階をさ
らに含むことを特徴とする方法を示すものである。本発
明はまた、前記分離膜が前記蛋白質合成反応器の出口に
設けられ、その外面に接している溶液を交換しながら透
析運転することを特徴とする方法を示すものである。本
発明はまた、前記多孔性固体物質が０．１〜１０００μ
ｍの直径、１０〜１０００ｍ² ／ｇの表面積を有してお
り、その外形が多様であることを特徴とする方法を示す
ものである。本発明はさらに、前記多孔性固体物質が多
孔性キトサン（chitosan) 、多孔性セルロース （cell
ulose ）、多孔性ゼラチン（gelatine）、多孔性コラー
ゲン（collagen）およびそれらの誘導体を含む高分子物
質またはアルミナ（alumina ）、シリカ（silica) 、チ
タニア(titania) 、ジルコニア(zirconia)、モリブデナ
(molybdena）、バナジウムオキサイド(vanadium oxide
）、コバルトオキサイド（cobalt oxide) 、これらの
混合物および様々な形態のゼオライト(zeolites)を含む
無機酸化物であることを特徴とする方法を示すものであ
る。本発明はさらに、目的とする蛋白質に対する吸着性
が高い物質で充填されたカラムを有する蛋白質分離手段
によって目的とする蛋白質を分離する段階をさらに含ん
でいることを特徴とする方法を示すものである。

【００１８】

【作用】本発明の無細胞システムにおける蛋白質の製造
方法は、細胞を培養した後粉砕して目的とする蛋白質の
生産に必要な組織を含む細胞抽出物を製造する段階、お
よび前記細胞抽出物と共に遺伝情報源、蛋白質合成のた
めの第１エネルギー源として作用するＡＴＰ、ＧＴＰ、
第１エネルギー源の反応器内で原位置に（in situ ）再
生させるために必要な第２エネルギー源としての高エネ
ルギー燐酸化合物または炭水化物またはこれらの誘導
体、基質としてのアミノ酸および多孔性固体物質を含む
反応培地を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的と
する蛋白質を製造する段階からなることを特徴とするも
のである。

【００１９】本発明によると、無細胞システムで蛋白質
を製造する際、使われるエネルギー源を再生して循環し
て使用し、目的とする蛋白質に対する吸着特異性が高い
分離手段を使用することにより無細胞蛋白質の製造をよ
り経済的で効率的に遂行することができ、蛋白質の生産
性及び反応器の運転時間の増加による全体生産量も非常
に増加されるものである。

【００２０】以下、添付した図面に基づき本発明を詳細
に説明する。

【００２１】本発明の一実施態様によると、本発明にお
いて用いられる細胞抽出物は、蛋白質合成の活性が最も
良い状態の細胞（大腸菌、枯草菌などのような各種微生
物細胞、小麦胚芽、米胚芽、麦胚芽などの食物細胞、Ｃ
ＨＯ（Chinese Hamster Ovary)細胞、ハイブリドーマ
（hybridoma)細胞、網状赤血球(reticulocyte)等のよう
な動物細胞）を用いて細胞培養をした後、細胞を粉砕し
て蛋白質合成に妨害となる成分を取り除き、蛋白質合成
に必須な成分を高濃度、高収率で分離、精製することに
より製造される。この際、限外濾過膜を用いた圧縮濾過
方法は、細胞抽出物を濃縮させることにより蛋白質比生
産速度を高めることができるため、好ましい。また、濃
縮段階前にポリエチレングリコールを添加して沈殿物を
取り除くことにより蛋白質比生産速度が大きく増加され
得るので好ましい。

【００２２】また、本発明において使用される細胞抽出
物は、蛋白質分解酵素や核酸分解酵素が生産できないよ
うに予め遺伝学的に操作した細胞から抽出されるもので
もよい。

【００２３】また、蛋白質合成に必要な機具としてｔＲ
ＮＡは前記細胞抽出物に含まれているものをそのまま使
用することもでき、別途に準備したものを添加すること
もできる。

【００２４】本発明における細胞抽出物の反応培地への
添加濃度は、細胞抽出物溶液自体の濃度が１／１００希
釈液の２８０ｎｍの波長における吸光度が０．５〜５の
範囲に調節されたものである際には、５〜４０容量％、
好ましくは１０〜２５容量％である。

【００２５】本発明において使用する遺伝情報源として
は、特定蛋白質に対するＤＮＡおよび／またはｍＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡ単量体(monomer) を反応システムに添加し
て、ＤＮＡ−ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ複製、ｍＲＮＡ翻
訳等が単独にまたは組合せて遂行されるようにする。し
たがって、反応システムの運転を転写−翻訳連結システ
ム、ＲＮＡ複製−翻訳連結システム、転写−ＲＮＡ複製
−翻訳連結システムまたは翻訳非連結システムなどにす
ることができる。即ち、反応システムの運転を翻訳非連
結システムとする場合には特定蛋白質に対するｍＲＮＡ
のみを蛋白質合成反応器に入れることで充分であり、転
写−ＲＮＡ複製−翻訳連結システムとする場合には特定
蛋白質に対するＤＮＡおよびｍＲＮＡ、ＲＮＡ単量体
（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）とＲＮＡポリメラ
ーゼのような必要な酵素を前記蛋白質合成反応器に入れ
る。核酸分解酵素の活性を阻害するためには、通常の方
法でｍＲＮＡの３′末端に特定配列を有するオリゴデオ
キシヌクレオチド(oilgo deoxynucleotide) を物理的に
または化学的に結合したりｍＲＮＡの燐酸基に結合され
ている酸素の一部を硫黄原子で置換させたものを使用す
ることがてきる。

【００２６】本発明における遺伝情報源は、反応培地に
おける遺伝情報源の濃度が、遺伝情報源がＤＮＡの場合
には、１ピコモル〜１００ナノモル、好ましくは１〜２
０ナノモルとなり、ｍＲＮＡの場合には、１ナノモル〜
１００マイクロモル、好ましくは０．１〜１０マイクロ
モルになるように、蛋白質合成反応器に添加される。

【００２７】本発明において用いられる第１エネルギー
源としては、ＡＴＰとＧＴＰを使用し、使用したＡＴＰ
とＧＴＰが分解されて生成したＡＤＰとＧＤＰからＡＴ
ＰとＧＴＰを反応器内で原位置に再生産するための第２
エネルギー源としては高エネルギー燐酸化合物や炭水化
物またはこれらの誘導体を使用する。この際、第２エネ
ルギー源によって定められる特定キナーゼまたはスクシ
ニル補酵素Ａ合成酵素またはスクシニルチオキナーゼ(s
uccinylthiokinase)が共に使用される。高エネルギー燐
酸化合物の例にはホスホエノールピルビン酸（phosphoe
nolpyruvate ）、ホスホクレアチン（phosphocreatine
）、アセチル燐酸塩（acetylphosphate)およびポリ燐
酸塩(polyphosphate) 等がある。アルファ−ケトグルタ
ル酸塩（α-keto glutarate ）のような炭水化物がＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ再生のためのエネルギー源として使用される
時発生されたＮＡＤＨがピルビン酸塩（pyruvate) から
乳酸塩（lactate ）を生産したりその他の有用な用途に
用いられることもできる。

【００２８】本発明における第１エネルギー源は、反応
培地における第１エネルギー源の濃度が、第１エネルギ
ー源がＡＴＰの場合には、０．２〜４ミリモル、好まし
くは０．５〜３ミリモルとなり、ＧＴＰの場合には、１
マイクロモル〜１．５ミリモル、好ましくは０．５〜１
ミリモルになるように、蛋白質合成反応器に添加され
る。

【００２９】本発明における第２エネルギー源は、反応
培地における第２エネルギー源の濃度が１〜８０ミリモ
ル、好ましくは５〜３０ミリモルになるように、蛋白質
合成反応器に添加される。

【００３０】本発明において使用される多孔性固体物質
は、表面積が多様で気孔の大きさと構造も多様で、ま
た、物理化学的な性質および表面の酸度−塩基度も多様
であるが、望ましくは０．１〜１０００μｍの直径、１
０〜１０００ｍ² ／ｇの表面積を有しており、外形が粒
子、平板、巻物、蜂の巣状などである多孔性固体物質が
使用される。このような多孔性固体物質の例としては高
分子物質と無機酸化物がある。高分子物質としては、多
孔性キトサン、多孔性セルロース、多孔性ゼラチン、多
孔性コラーゲンおよびその誘導体または多孔性金属化合
物などが使用され、無機酸化物としては、アルミナ、シ
リカ、チタニア、ジルコニア、モリブデナ(molybdena)
、バナジウムオキサイド(vanadium oxide)、コバルト
オキサイド(cobalt oxide)またはこれらの混合物または
様々な形態のゼオライト（zeolites)等が使用される。
また、色々な種類の無機化合物でドーピングされたり色
々な有機物質によって変形されたものを使用されてもよ
い。本発明の具体的な実施態様によると、多孔性固体物
質を使用することにより反応自体が改善され蛋白質の生
産速度が大いに増加され、分離膜の詰まり現象が非常に
防止されるにつれ全体の運転時間が大いに増えるにした
がって全体生産量を向上することができる。

【００３１】本発明における多孔性固体物質は、反応培
地における多孔性固体物質の濃度が０．５〜２０重量
％、好ましくは１〜５重量％になるように、蛋白質合成
反応器に添加される。

【００３２】本発明による蛋白質を製造する段階におい
て、遺伝情報源、前記第１，２エネルギー源、アミノ酸
及び多孔性固体物質以外にも塩、イオン性基が結合され
ている高分子物質、ｃＡＭＰ、蛋白質分解酵素阻害剤、
核酸分解酵素阻害剤、蛋白質合成阻害剤に対する阻害
剤、酸化還元調節剤、非変性界面活性剤、緩衝成分、ス
ペルミン、スペルミジンおよびキナーゼ等の、蛋白質合
成反応に必要な他の物質を蛋白質合成反応器に添加する
ことができる。

【００３３】前記塩の例としては、酢酸または硫酸のカ
リウム、マグネシウム、アンモニウムおよびマンガン塩
などが挙げられ、塩中の一部はアミノ酸を対陰イオンと
して有していてもよい。

【００３４】前記イオン性基が結合されている高分子物
質としては、例えば、ポリエチレングリコール、デキス
トラン、ジエチルアミノエチル、第四アミノエチル（qu
aternary aminoethyl)等が挙げられる。

【００３５】前記酸化還元調節剤としては、ジチオトレ
イトール、アスコルビン酸、グルタチオンおよびこれら
の酸化物よりなる群中から選ばれた少なくとも一つが用
いられる。また、トリトン（Triton) Ｘ−１００のよう
な非変性界面活性剤を０〜０．５Ｍの濃度で添加しても
よい。

【００３６】前記スペルミン、スペルミジンは蛋白質合
成性能の向上のために、ｃＡＭＰは遺伝子発現調節剤と
してそれぞれ添加される。従来には、ポリエチンレング
リコールを用いる場合にはスペルミンとスペルミジンを
通常使用しなかったが、本発明では相乗効果のためにこ
の物質を適切な濃度で組合わせて添加してもよい。

【００３７】上記他の物質は、単独あるいは組み合わせ
て反応培地に添加してもよく、その添加量は、スペルミ
ンおよび／またはスペルミジンを用いる場合には反応培
地における濃度が１マイクロモル〜３ミリモル、好まし
くは０．１〜１．５ミリモルになるように、さらに、ポ
リエチンレングリコールを用いる場合には反応培地にお
ける濃度が０．５〜４重量％、好ましくは１〜２．５重
量％になるように、調節される。

【００３８】反応培地のうち特定成分の濃度を変化しよ
うとする場合にはこれによって他の成分の濃度も変化さ
せなければならない場合がある。例えば、ヌクレオチド
とエネルギー源の濃度は他の成分の濃度によって調節さ
れる。反応システムとして供給される成分の濃度は時間
によっても変化し得る。例えば、供給溶液におけるアミ
ノ酸の濃度は連続培養を数時間進行した後に増加する。
前記ポリエチレングリコールのような有機化合物と多孔
性固体物質は０〜１０％の濃度で添加してもよい。

【００３９】本発明において蛋白質合成反応器に使用す
る分離膜としては、イオン性、非イオン性、親水性、疎
水性、極性および非極性など色々な種類中から適切なも
のを選択して使用することができる。この際、表面層に
蛋白質が吸着しない性質を有する分離膜が好ましく使用
される。なお、以下の実施例においては、アミコン社製
のＹＭ−１００タイプの分離膜を使用した。

【００４０】反応システムは回分式、運転時間が延長さ
れた形態の回分式、半連続フェドバッチ（fed-batch)式
または連続式で運転されることができ、用途によって運
転方式を異にして運転することが望ましい。回分式でな
い場合、供給溶液の濃度は、必要であれば、一時的に相
違してもよい。

【００４１】蛋白質合成反応器内のｐＨと温度は、それ
ぞれ、ｐＨが５〜１０、温度が２０〜５０℃の範囲内で
調節されることが望ましく、ｐＨが６〜９、温度が２５
〜４０℃の範囲内で調節されることがより望ましい。

【００４２】反応溶液の流動方向は、前記分離膜に対し
て垂直および／または接線方向とする。第１エネルギー
源を再循環させ分離膜の詰まり現象を防止するには接線
方向の流れが効果的で、これは同時に垂直流れ上に重な
る。分離膜に垂直である流れは陽圧ポンプまたは真空吸
入ポンプによって得られる。

【００４３】連続反応工程で蛋白質分離手段を用いる場
合、蛋白質合成反応器の出口に設けられた分離膜を通じ
て出て来る生成物は直ぐ蛋白質分離手段に連結され得
る。また、半連続工程の場合には、蛋白質合成反応器の
出口に設けられた分離膜の外部は所定の順序で循環する
所定の溶液と接触しこのような溶液には蛋白質合成阻害
剤に対して吸着特異性を有した吸着剤を含む物質以外に
もアミノ酸やヌクレオチドのような基質が含まれる。こ
の場合、蛋白質合成反応器は透折方式または透折濾過方
式または半フェドバッチ（fed-batch)式で運転される。
また、蛋白質合成反応器に供給される供給液は同一な分
離膜を通じて別途の流入口を通じて供給される。この
際、合成された蛋白質は蛋白質合成反応器内に蓄積され
反応が停止した後、通常の分離、精製方法によって分
離、精製される。

【００４４】分離膜の外面と接触する溶液は順次に変化
され、回分タンク型の攪拌をしたり分離膜に対する接線
方向の流れを伴った攪拌を遂行する。蛋白質合成反応器
は内部攪拌装置または外部攪拌装置によって攪拌され
る。

【００４５】本発明において、エネルギー源再生手段を
別途に用いる場合、炭水化物、有機酸、アルデヒド、ア
ルコールのような高エネルギー物質および必要な酵素と
共にミトコンドリアを使用したり、色素体やクロロプラ
ストのような光合成組織を光エネルギーと共に使用する
ことができる。また、エネルギー源再生手段には適切な
大きさの細孔とイオン特性を有する膜が備えられる。エ
ネルギー源再生手段に使用される光合成組織としては植
物または微生物から分離したものを使用することができ
る。

【００４６】前記蛋白質合成反応器で目的とする蛋白質
を製造した後、生産された蛋白質の選択的な分離のため
に用いられる蛋白質分離手段には、目的とする蛋白質に
対する抗体が固定化されている粒子が充填されたりその
他の特異的吸着をし得る物質が固定化されている粒子が
充填されており、適切な大きさの細孔を有する膜を装着
していることができ、通常のカラムの形態よりなってい
る。

【００４７】分離手段とエネルギー再生手段が全部用い
られる場合には、目的とする蛋白質に対する吸着特異性
が高い分離手段によって生産された蛋白質が選択的に吸
着され残余成分は前記エネルギー再生手段を経て蛋白質
合成反応器へ再循環される。

【００４８】図１は、本発明の望ましい実施態様におけ
る方法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示
すブロック図である。図１に示したブロック図におい
て、蛋白質分離手段がシステムに含まれている場合には
反応器の生成物が二つのカラムよりなる蛋白質分離手段
に送られる。この場合、二つの吸着カラムは全体システ
ムの連続的な運転のために交互に使用され得る。また、
エネルギー再生手段がさらに含まれている場合には蛋白
質分離手段からの溶出液はこのエネルギー再生手段を通
過して再び蛋白質合成反応器に循環される。このよう
に、図１に示したシステムを構成する各手段は、全部を
使用してもよいし、または、システムの一部のみを使用
してもよく、さらに、連結された順序と配管を異にして
使用されることもできる。

【００４９】蛋白質合成反応器で生産される蛋白質の確
認は、電気泳働を施した後生産された蛋白質の量が少な
い場合にはオートラジオグラフィー方法によって遂行し
（基質としてロイシンの炭素原子を¹⁴Ｃで標識し合成さ
れた蛋白質に導入されたロイシン−¹⁴Ｃを確認）、蛋白
質の量が多い場合にはクーマシーブルー染色法（Coomas
sie blue staining ）によって遂行したが、定量分析は
通常の分析方法であるローリー法（Lowry method）によ
って施した。

【００５０】

【実施例】本発明を以下の実施例と添付された図面によ
ってより詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、以下
の実施例によっては限定されず、本発明の範囲を逸脱し
ない限りその変形例が当業者に可能なことは無論であ
る。

【００５１】実施例１：細胞抽出物の製造 ＬＢ培地に大腸菌を接種して一晩の間培養した種培養液
を酢酸カリウム７５ｍＭ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、ブド
ウ糖５０ｇ／ｌ及びビタミン０．５ｇ／ｌが含まれた培
地が入っている５リットルの醗酵槽に入れて３０℃で一
晩培養した。細胞を回収した後フレンチプレス(French
press)、超音波器またはその他の通常の方法を用いて細
胞を粉砕した。これを４℃、３０，０００×ｇで５分間
遠心分離してその上澄み液をトリス緩衝溶液（ｐＨ７．
６）に対して透折を施した。ポリエチレングリコールの
ような有機物質を最終濃度が５％になるように、透折さ
れた細胞抽出物に添加した後さらにその上澄み液を限外
濾過膜を用いた圧力濾過法によって濃縮して蛋白質合成
に使われる細胞抽出物を得た。

【００５２】実施例２：連続反応による蛋白質の製造 前記の実施例１から得た細胞抽出物、ＡＴＰ ２．６ｍ
Ｍ、ＧＴＰ ０．８ｍＭ、各種アミノ酸 １ｍＭ、酢酸
カリウム ２１０ｍＭ、酢酸アモニウム ８０ｍＭ、酢
酸マグネシウム １６ｍＭ、ｃＡＭＰ ０．６７ｍＭ、
ジチオトレイトール ２ｍＭ、ホスホエノールピルビン
酸 ２４ｍＭ、ＰＥＰキナーゼ １２μｇ／ｍｌ、ポリ
エチレングリコール ２％、アルミナ ３０ｍｇ／ｍ
ｌ、ｍＲＮＡ、５０ｍＭ トリスアセテート緩衝溶液
（ｐＨ７．６）及び通常の蛋白質合成に必要な物質を分
離膜型蛋白質合成反応器に入れて反応液を１ＶＶＨの速
度で供給し連続工程を施した。蛋白質合成反応器のｐＨ
は７．６で、温度は３７℃で維持し徐々に攪拌した。生
産される蛋白質を連続的に回収して電気泳働後オートラ
ジオグラフィー及びクーマシーブルー染色法によって蛋
白質を確認しローリー法によってその量を測定した。

【００５３】その結果を図２に示す。ただし、図２のグ
ラフにおいて、ｘ軸は連続工程の運転時間を示し、ｙ軸
は反応器の容積１ｍｌ当たりの蛋白質の総生産量を示
す。図２のグラフに示されているように、１２０時間以
上連続工程の運転がなされ、この際の蛋白質の平均生産
性は１．２ｍｇ／ｍｌ／時間であった。

【００５４】実施例３：半連続的反応の場合における蛋
白質生産量の測定 半連続反応工程を用いたことを除いては実施例２と同一
な方法で蛋白質を製造してその量を測定した。結果を図
３に示す。図３のグラフから５０時間以上蛋白質の生産
がなされ、その総生産量は６０ｍｇ／ｍｌであることが
分かる。

【００５５】実施例４：多孔性固体物質の添加効果 多孔性固体物質の一つとしてのアルミナの添加量を異に
する以外は、実施例３と同一な方法を用いうことによ
り、その効果を試みた。結果を表１に示す。表１より、
ガンマアルミナを３０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した場合
に蛋白質の生産が最大であることが分かる。また、この
場合、反応器の運転時間も１２０時間以上に延長され
た。

【００５６】

【表１】

【００５７】さらに、表１から、多孔性固体物質が蛋白
質合成反応自体を促進させながら分離膜の詰まり現象を
も非常に効果的に防止することが推定される。

【００５８】実施例５：ポリエチレングリコールの添加
効果 細胞抽出物を製造する段階で濃縮過程前にポリエチレン
グリコールを２％の濃度で添加した後、遠心分離を通じ
て沈殿物が取り除かれた細胞抽出物を使用した以外は、
実施例３と同一な方法で蛋白質を製造してその量を測定
した。結果を表２に示す。

【００５９】

【表２】

【００６０】表２からポリエチレングリコールを添加し
た場合に蛋白質の生産性が大きく増加されることが示さ
れる。

【００６１】実施例６：エネルギー源の再生 光合成細菌ロドスピリルムルブルム（Rhodospirillum r
ubrum ）を破砕した後分離した色素体（cromatophore)
を使用してエネルギー物質であるＡＴＰをＡＤＰから再
生した。その結果を表３に記載する。

【００６２】

【表３】

【００６３】表３より、かなりの割合でＡＴＰがＡＤＰ
から再生していることが分かる。

【００６４】実施例７：目的とする蛋白質の選択的な分
離 目的とする蛋白質の選択的な分離のためにこの蛋白質に
対する抗体（モノクローナルまたはポリクロナール抗
体）を通常の方法で固体粒子に化学的に固定化させて固
定相として使用して二つのカラムを準備した。一つのカ
ラムに対してブレイクスルー（breakthrough :溶液をカ
ラムに通過させる場合カラムの容量に該当する量の蛋白
質が吸着される時まではカラムの出口から溶出された溶
液で該当蛋白質を検出することができなく、その時まで
所要された時間をブレイクスルー時間という）に到達す
ると、他のカラムに溶液を流入させて吸着を始め、その
間先に吸着させたカラムで吸着蛋白質を溶出させカラム
を再生させた。このように、二つのカラムを交代に使用
することによりシステム全体の連続性を維持することが
できた。分離カラムの運転データは表４に示した。

【００６５】

【表４】

【００６６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明の無細胞シス
テムにおける蛋白質の製造方法を利用することにより、
蛋白質の合成に必要な組織を生物細胞から抽出して生体
外、即ち無細胞システムにより蛋白質を生産することが
でき、これにより生体システムで現れる様々な蛋白質合
成阻害沃素を回避することができ、さらに、多孔性固体
物質を使用することにより、分離膜の詰まり減少を大幅
に緩和させ蛋白質合成反応器の運転時間を増大させるこ
とができ、これにより蛋白質の全生産量を増大させるこ
とが可能である。

【００６７】また、本発明による蛋白質合成反応器にさ
らにエネルギー再生手段を設けることによって、高価な
エネルギー源を再生して循環使用することができ、蛋白
質のコストを節減することが可能となる。

【００６８】また、本発明による蛋白質合成反応器の出
口に分離膜を設けることによって、反応器内のタンパク
質合成阻害物質が分離膜と接し溶液内に透析され反応器
から除去され、その結果、蛋白質合成の効率が向上す
る。

【００６９】また、本発明による蛋白質合成反応器にさ
らに蛋白質分離手段を設けることによって、一つのシス
テム内で目的とする蛋白質を効率的にかつただちに分離
精製することができ、蛋白質の生産性を向上させること
ができる。

【００７０】さらに、本発明の無細胞システムにおける
蛋白質の製造方法によると、翻訳後変形過程がないので
生体（in vivo ）システムで現れる望ましくない変形体
または宿主細胞に毒性効果を示す蛋白質のための問題を
避けることができるため、インシュリンや成長ホルモ
ン、α−インターフェロンおよび様々なワクチン（vacc
ine)等の蛋白質製剤が効率的に生産されうる。また、Ａ
ＴＰとＧＴＰを再生して循環させ多孔性固体物質を使用
して反応器の運転時間を増加させ目的とする蛋白質に対
して吸着性が高いカラムを使用することにより蛋白質の
生産速度のみならず、総生産量が従来の方法に比べて大
きく向上されてペプチド鎖当たりのアミノ酸の数に関係
なく非常に経済的に蛋白質を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の望ましい実施態様における方
法を施すための無細胞蛋白質の製造装置の構造を示すブ
ロック図である。

【図２】図２は、本発明の実施態様における蛋白質合成
反応器で連続工程によって製造される蛋白質の量を時間
によって示したグラフである。

【図３】図３は、本発明の他の実施態様における蛋白質
合成反応器で半連続工程によって製造される蛋白質の量
を時間によって示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鄭 奎烈 大韓民国ソウル特別市冠岳區新林２洞402 番地現代アパート108棟1002號

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無細胞システムにおける蛋白質の製造方
   法において、 細胞を培養した後粉砕して目的とする蛋白質の生産に必
   要な組織を含む細胞抽出物を製造する段階、および前記
   細胞抽出物と共に遺伝情報源、蛋白質合成のための第１
   エネルギー源として作用するＡＴＰ及びＧＴＰ、第１エ
   ネルギー源の反応器内で原位置に（in situ ）再生させ
   るために必要な第２エネルギー源としての高エネルギー
   燐酸化合物または炭水化物またはこれらの誘導体、基質
   としてのアミノ酸および多孔性固体物質を含む反応培地
   を分離膜型蛋白質合成反応器に供給して目的とする蛋白
   質を製造する段階からなることを特徴とする無細胞シス
   テムにおける蛋白質の製造方法。
2. 【請求項２】 前記第１エネルギー源の分解産物がミト
   コンドリアまたは光合成組織を用いた別途のエネルギー
   再生手段によって第１エネルギー源として再生された
   後、前記蛋白質合成反応器に循環される段階をさらに含
   むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記分離膜が前記蛋白質合成反応器の出
   口に設けられ、その外面に接している溶液を交換しなが
   ら透析運転することを特徴とする請求項１に記載の方
   法。
4. 【請求項４】 前記多孔性固体物質が０．１〜１０００
   μｍの直径、１０〜１０００ｍ² ／ｇの表面積を有して
   おり、その外形が多様であることを特徴とする請求項１
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記多孔性固体物質が多孔性キトサン、
   多孔性セルロース、多孔性ゼラチン、多孔性コラーゲン
   およびそれらの誘導体を含む高分子物質またはアルミ
   ナ、シリカ、チタニア、ジルコニア、モリブデナ、バナ
   ジウムオキサイド、コバルトオキサイド、これらの混合
   物および様々な形態のゼオライトを含む無機酸化物であ
   ることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 目的とする蛋白質に対する吸着性が高い
   物質で充填されたカラムを有する蛋白質分離手段によっ
   て目的とする蛋白質を分離する段階をさらに含んでいる
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。